专利名称：组合文库的多样性的产生的制作方法
生物技术演变方法，包括组合文库和噬菌体展示技术(PARMLEY&SMITH 1988；SCOTT&SMITH 1990；SMITH 1993)可用于寻找新的诊断配体，生物医学和药物应用的配体(综述；CORTESE 1996；COLLINS 1997)。已经将利用经验程序从不同的基因产物的大群体中选择具有所需的特征例如结合特性的分子的这些方法比作天然演变的过程。演变包括在一段时间内突变的产生，功能的选择和系统的自我复制的能力。特别是，天然系统利用重组将选定的群体中积累的突变重配以使突变的组合呈指数增加并且因此增加了群体中变异体的数目。近来仅仅将这称之为突变基因内导入重组的后一方面应用到生物技术的演变方法，虽然已经将它用于增加起始的噬菌体展示文库的大小(例如WATERHOUSE 1993；TSUUSHITA1996；SODOYER 1994；FISCH 1996)。STEMMER 1994a，1994b和1995告诉我们通过小重叠片段与(1994a，1994b)或不与(STEMMER1995)用于驱动PCR反应的引物寡核苷酸序列的混合物进行PCR扩增可以体外获得DNA分子的群体内的重组。该方法不适用于完全随机化(高度突变的)的序列内的重组，因为该方法依赖于在重组位点的重叠序列的高度同源性。但是STEMMER 1994b和CRAMERI 1996a证实体外重组对于分子演变的有效性，其中CRAMERI 1996b也证实了该方法与噬菌体展示的结合应用，即使该方法限制到低突变密度区域(他们的方法中约0.5-1％的碱基被突变)，因为他们声明现有的诱变方法中重组的优势似乎能增加分子演变的周期的数目(STEMMER1994b)。我们指出这是由于不言而喻的事实，通过在现有的突变体结构中导入碱基变化的诱变制备的许多变异体是附加的，即线性增加的功能，而突变的变异体之间的重组的应用产生了作为起始数目的变异体的指数函数关系的新的变异体。因此经典的噬菌体展示文库对于产生新的变异体有重大的缺点；例如为了包括十肽序列的所有可能的变异体，需要208＝2.56×1010不同的变异体。
MARKS1992声明在组合的文库中产生较高的特异性时，例如在形成在噬菌体展示文库中显示的免疫球蛋白的再改组的轻链和重链时获得较高特异性和结合常数的抗体时重组的重要性。这些作者没有说明例如通过允许重组的载体如何可以获得所有的轻链和重链在两种链的异源群体中的改组。重链和轻链是一个接一个地选择的，即首先在不变的轻链存在下从异源重链群体中选择最适的重链，然后通过制备新的文库，选择与预选择的最适重链结合的最适轻链。目前使用的包括共有的突变文库，体内诱变，易错PCR以及链改组的花费大量时间的依次的最适化方案概括于COLLINS 1997的图5和6。
噬菌体和噬菌体展示文库的总的背景技术制备含有极大量(106-1010)的变异体的基因文库。将变异基因区段融合到丝状噬菌体的外膜蛋白基因(例如M13，fd或fl)，将该融合基因插入到噬菌体或噬菌粒的基因组。噬菌粒定义为含有丝状噬菌体的包装和复制源的质粒。这后一特性允许当它存在于感染了丝状噬菌体的大肠杆菌宿主菌株(超感染)时，噬菌粒基因组包装到噬菌体外膜。经过包装产生的颗粒是噬菌体或噬菌粒，它们在分泌到培养基中的颗粒的表面提供融合蛋白质。这样的经过包装的颗粒能够将其基因组注射到新的宿主细菌，而它们分别被繁殖为噬菌体或噬菌粒。该系统的特异性在于事实由于包装发生在通常由单个变异体噬菌体/噬菌粒感染的单个的细胞中，繁殖所产生的颗粒含有编码在颗粒的表面提供的特定的变异体的基因。由于所显示的变异体蛋白质的特定的特性，例如结合到固定到表面的特定的靶分子对显示所需特性的克隆的亲和性选择的几个循环，随后进行富集的克隆的扩增导致具有这些特性的小量的不同的克隆的分离。然后通过对变异体基因的过度突变的区段的测序快速地阐明了这些变异体的一级结构。
产生组合的文库的效力有许多因素限制该技术的潜力。首先是在原始文库中产生的变异体的数目和多样性。通过电穿孔将连接的DNA制剂转化到大肠杆菌已经产生了许多文库。获得了约0.1-1×106重组体/微克连接的噬菌体DNA的效力。利用特定的λ载体获得了所报道的最高的克隆效力(107的重组体/微克插入的DNA)，在所述的载体中特异性的克隆位点处插入了单个的丝状噬菌体载体，由双倍的丝状噬菌体复制/包装源点(AMBERG 1993；HOGREFE 1993a+b)夹住。在体外λ包装混合物中包装到λ噬菌体外膜之后将该DNA构建体有效导入到大肠杆菌宿主。由M13-辅助噬菌体感染携带这样的杂合噬菌粒的菌株允许包装到丝状噬菌体外膜的插入物的切割和分泌。既不是AMBERG 1993也不是HOGREFE 1993a+b指示了在该程序期间该方法如何可用于中导入重组。虽然他们提到在用作为底物的连环体的构建期间通过使用IIs型限制性核酸内切酶可以改善效力，所述连环体用于体外包装，但是没有给出实施例并且在确定的五年之后，没有在文献中记载实施例。在我们的发明中描述的程序也使用了高效力的体外λ包装，但是通过使用粘粒载体使克隆载体的能力最大，载体粘粒中以单个的构建体可以插入许多(说是8个)拷贝的噬菌粒。该程序的令人惊奇的革新的方面是发现许多大高变的文库的从头合成的方案。一种类型是特别有效的，就是强迫使噬菌粒/粘粒载体整合到以相同方向定位的杂合连环体。不能确保该特性的该方案的任何变异形式不能有效地工作。
IIs型限制性核酸内切酶的使用SZYBALSKI 1991告诉我们有关IIs型限制性核酸内切酶的大量的新的应用，包括精确地修饰DNA，克隆的DNA的恢复，基因的组装，作为通用的限制性酶的应用，单链的DNA的裂解，点突变的检测，串联的扩增，影印扩增反应和甲基化的碱基的定位。他们没有给出任何说明关于这样的酶怎样可用于制备高度突变的区域内例如组合的文库内的重组。
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Waterhouse，P.，Griffiths，A.D.，Johnson，K.S.and Winter，G.(1993a)核酸研究.2265-2269根据第一个实施方案，本发明涉及基因库，其中所述的基因包括由下面的一个链的通式代表的双链DNA序列5＇B1B2B3...BnXn+1...Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3...Xn+a+bQn+a+b+1...Qn+a+b+j3＇其中n，a，b和j是整数，n＞3，a＞1，b＞3和j＞1，其中Xn+1...Xn+a+b是高变序列，B，X，Z和Q代表腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)，(i)Z代表G或T，G∶T的比例约1∶1，和/或(ii)Z代表C或T，C∶T的比例约为1∶1，和/或(iii)Z代表A或G，A∶G的比例约为1∶1，和/或(iv)Z代表A或C，A∶C的比例约为1∶1，以及其中亚序列B1...Bn和/或Qn+a+b+1...Qn+a+b+j代表限制性酶的识别位点，其中识别位点的定位使其裂解位点在裂解时产生包括命名为Z的两个碱基的粘性末端。
用由此描述的IIs型限制性酶对该序列进行限制性裂解，随后再连接导致位于裂解位点的5’和3’的高变区域的重组。这是该方法的精华，我们称之为“cosmix-plexing”。在该程序中将通过限制性酶裂解产生的片段以正确的方向再连接(“头—到—尾”)是必要的，从而选择四个文库((i)到(iv))的Z序列以确保其(见下文)仍然允许所有可能的氨基酸在裂解位点被编码。如果不确保该正确定向，正确再构建的融合蛋白质基因的百分数急剧降低，在λ包装的提取物中体外包装的分子的比例降低(这需要cos位点的正确的定向)，以及可以从粘粒连环体体内可切除的噬菌粒的拷贝数的比例降低(裂解需要连续的噬菌体复制源点的正确定向)。
正确定向 正确定向不正确定向(头到尾连接)5＇------>XGG/x----->-------->XCC/x---->------->XGG/Y---->3＇--------Y/CCy<----- ----------Y/GGy<--- --------Y/CCX<---
为了防止在前面的章节中提到的错误定向(头到头)产生的问题，在权利要求书提到的四个基因文库在cosmix-plexing期间必须保持分离开。事实上，对于重组体的形成，文库以16个独立的组起作用，他们不能互相重组四个文库保持独立，而每组含有四个可能的粘性末端例如具有Z＝G或T的文库(i)含有5＇---->XGT/Y---->，----->XGG/Y----->，---->XTG/Y---->，and ---->XTT/Y----->3′------y/CA x<---------y/CC x<----- -----y/AC x<----------y/AA x<----在混合不同的文库时产生错误定向的问题是有证据的，例如AC文库(iv)含有AA，AC，CA和CC序列，他们以错误定向分别与文库(i)产生的各个粘性末端配对。
本发明的特异性实施方案涉及基因库，其中亚序列B1...Bn或Qn+a+b+1...Qn+a+b+j代表限制性酶的识别位点，其中识别位点的定位使其裂解位点在裂解时产生包括命名为Z的两个碱基的粘性末端。
此外，一个特定的实施方案涉及基因库，其中粘性末端是由命名为Z的碱基形成的2个碱基对的单链末端。
此外，一个特定的实施方案涉及基因库，其中以展示载体的形式提供各个基因，特别是以M13噬菌体或类M13噬菌体或以噬菌粒形式提供。
本发明的另一个实施方案涉及本发明的一组四个基因库，其中基因库的特征如下—第一个基因库Z代表G或T，优选的是G∶T的比例约为1∶1；—第二个基因库Z代表C或T，优选的是C∶T的比例约为1∶1；—第三个基因库Z代表A或G，优选的是A∶G的比例约为1∶1；—第四个基因库Z代表A或C，优选的是A∶C的比例约为1∶1；本发明的一个特定的实施方案涉及一组四个基因库，其中各个基因以展示载体形式提供，特别是以M13噬菌体或类M13噬菌体或以噬菌粒形式提供。
本发明的另一个实施方案涉及基因库，其中所述的基因包括由下面的其链之一的通式代表的双链DNA序列5＇B1B2B3...BnXn+1...Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3...Xn+a+bQn+a+b+1...Qn+a+b+j3＇其中n，a，b和j是整数，n＞3，a＞1，b＞3和j＞1，其中Xn+1...Xn+a+b是高变序列且B，X，Z和Q代表腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)，其中包括Zn+a+1和Zn+a+2的四组寡核苷酸序列优选的是以(i)∶(ii)∶(iii)∶(iv)为约1∶1∶2∶2的比例存在，其中四组的特性如下第一组Zn+a+1代表G，Zn+a+2也代表G；第二组Zn+a+1代表C，Zn+a+2代表T；第三组Zn+a+1代表A，Zn+a+2代表A或C，优选的是A∶C的比例约为1∶1；和第四组Zn+a+1代表T，Zn+a+2代表C或G，优选的是C∶G的比例约为1∶1；和其中序列B1...Bn和/或Qn+a+b+1...Qn+a+b+j代表限制性酶的识别位点，其中识别位点的定位使其裂解位点在裂解时产生包括命名为Z的两个碱基的粘性末端。
本发明的一个特定的实施方案涉及基因库，其中四组寡核苷酸序列以(i)∶(ii)∶(iii)∶(iv)的比例为(0到1)∶(0到1)∶(0到1)∶(0到1)存在，条件是至少存在一个所述组。
此外，本发明的一个特定的实施方案涉及基因库，其中亚序列B1...Bn和/或Qn+a+b+1...Qn+a+b+j代表限制性酶的识别位点，其中识别位点的定位使其裂解位点在裂解时产生包括命名为Z的两个碱基的粘性末端。
此外，本发明的一个特定的所述方案涉及基因库，其中粘性末端是由命名为Z的两个碱基形成的2个碱基对单链末端。
本发明的另一个实施方案涉及基因库，其中所述的基因包括由下面的其链之一的通式代表的双链DNA序列5＇B1B2B3...BnXn+1...Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3...Xn+a+bQn+a+b+1...Qn+a+b+j3＇其中n，a，b和j是整数，n＞3，a＞1，b＞3和j＞1，其中Xn+1...Xn+a+b是高变序列，B，X，Z和Q代表腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)，其中包括Xn+a，Zn+a+1和Zn+a+2的下面的六组寡核苷酸序列优选的是以(i)∶(ii)∶(iii)∶(iv)∶(v)∶(vi)为约3∶4∶3∶4∶4∶1的比例存在，其中这六组的特性如下第一组Xn+a代表A，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1或Xn+a代表C，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1，Zn+a+1代表G，Zn+a+2代表G；
第二组Xn+a代表A，C，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1∶1，Zn+a+1代表C，Zn+a+2代表T；第三组Xn+a代表A，C和/或G，优选的比例是1∶1∶1，Zn+a+1代表A，Zn+a+2代表A；第四组Xn+a代表A，C，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1∶1，Zn+a+1代表A，Zn+a+2代表C；第五组Xn+a代表A，C，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1∶1，Zn+a+1代表T，Zn+a+2代表C；第六组Xn+a代表A，Zn+a+1代表T，Zn+a+2代表G。“单试管”方法问题应该研制允许不用保持独立的文库的cosmix-plexing方法。这将具有减少如前所述的筛选四个独立的文库中涉及的操作的优点并将节省时间和材料。在本发明的两个独立的方式中达到此目的。
答案在上面提到的序列内由IIs型限制性产生的粘性末端即ZZ内选择核苷酸的组合是可能的，其中所有的克隆存在于单个的文库并且其中去除了在连接期间错误定向的可能性，和与其相关的效力的相关的损失。同时，由可能产生的，并且不相互作用(重组)的不同的粘性末端数目定义的亚组的数目从如以前描述的该方法的形式的16个组降低到6。设计序列从理论上说从ZZ产生的2碱基对的单链粘性末端序列的组合如下
其中，具有反向的对称轴(回文AT，TA，GC，CG)的序列可以以两个方向配对并且由于上面给出的理由被从cosmix-plexing文库去除。剩余的12个序列实际上是6组互补对(例如CC+GG，AA+TT，CA+TG)。通过从各个对选择一个配对物(总共6个)，可以产生仅以正确的“头到尾”定向配对的单个组的粘性末端。实际上序列的选择考虑了密码子的惯用，假设选择了ZZ作为密码子的第2和第3位置。测定的是由单个或仅仅两个密码子编码的氨基酸(单个密码子甲硫氨酸(TG)和色氨酸(GG)；在去除回文序列之后，也只有单个密码子可有效地编码天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，组氨酸(His)和酪氨酸(Tyr)。为了编码天冬氨酸，天冬酰胺，组氨酸和酪氨酸，需要AC序列。选择AC序列具有缺陷必须避免互补序列GT。这是编码半胱氨酸的唯一的可能。但是，在高变的序列内包含半胱氨酸，根据环境的氧化还原作用的潜力，经常导致错误折叠和形成二聚体凝集体。因此决定制备其中去除了半胱氨酸密码子的一个组，但是其在许多应用中有巨大的用途，包括环化肽文库的形成。如果选择序列AA编码也允许终止密码子TAA的谷氨酸(Glu)，谷氨酰胺(Gln)和赖氨酸(Lys)，那么TT必须被去除。结果是也必须包含TC以致于可以编码苯丙氨酸(Phe)和异亮氨酸(Ile)。由于其它GG密码子编码精氨酸(Arg)和甘氨酸(Gly)，因此互补GA的去除没有后果。然后CC的去除没有后果，因为丙氨酸(Ala)，脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)可以被含有CT的密码子编码。这是选择下文命名为“组合A”的ZZ序列的理由。
为了完整性如果保留双链体AA，结果是包括TT，然后必须包括AG以编码谷氨酸，谷氨酰胺和赖氨酸。为了编码丙氨酸和脯氨酸，现在必须包括CT(组合B)或CA(组合C)。这导致包含AG和CT(组合B)，或CA和TG(组合C)作为互补配对。因此组合B和C不代表该问题的合适的答案。组合A 组合B组合C
粗线型显示所选择的序列。互补配对相邻。
表1遗传密码；根据组合A所选择使用的XZZ密码子以粗线型显示。
表2氨基酸的频率，比较选择的组合A(上面)和所有天然密码子的频率氨基酸 天然频率 组合AAla 4 1Arg 6 2Asp 2 1Asn 2 1Cys 2 0Glu 2 1Gln 2 1Gly 4 1His 2 1Ile 3 1Leu 6 3Lys 2 1Met 1 1Phe 2 1Pro 4 1Ser 6 1Thr 4 1Trp 1 1Tyr 2 1Val 4 2终止密码 3 1总数 21 6424根据组合A的一组四个寡核苷酸的制备通过制备四组核苷酸，根据组合A的需要可以制备基因文库，其中Xn+aZn+a+1Zn+a+2是i)NGGii)NCTiii)NA(A或C)iv)NT(C或G)其中N是C，G，A或T。
在这些寡核苷酸合成之后，将他们结合以获得单试管的cosmix-plexing基因文库，从而获得在表2中给出的相对密码子的频率，在最后的混合物中以1∶1∶2∶2的比例存在基因文库i)到iv)。如上面解释的，该混合物在具有2碱基对的单链粘性末端ZZ的IIs型限制性酶裂解的片段的再连接时总是给出正确的定向。
或者与组合A一致的一组六个寡核苷酸通过制备六组核苷酸，根据修饰的组合A制备基因文库，其中去除了终止和半胱氨酸密码子，并且其中其它各个氨基酸各由单个密码子代表，其中Xn+aZn+a+1Zn+a+2是i)(A，G或T)GG或(C，G或T)GGii) NCTiii) (A，G或C)AAiv) NACv)NTCvi) ATG在这些寡核苷酸合成之后，将他们结合以获得单试管的cosmix-plexing基因文库，从而获得各个氨基酸的等摩尔密码子频率，在最后的混合物中以3∶4∶3∶4∶4∶4∶1的比例存在基因文库i)到vi)。如上面解释的，该混合物在具有2个碱基对的单链粘性末端ZZ的IIs型限制性酶裂解的片段的再连接时总是给出正确的定向。
又，如利用前面的组，该单个试管文库代表在cosmix-plexing期间不能互相重组的六个亚组。
***下面的章节已经基本上进行了改变。最后的表不再是必要的。
在cosmix-plexing重组期间创建中央氨基酸密码子的考虑通过5’高变区段测定重组位点的氨基酸。在该位置代表的氨基酸组的定义如表2给出的各个亚组的定义。考虑在“代表性”文库中必须的克隆的数目为了在含有“n”个氨基酸的随机肽中包括所有可能的氨基酸序列，在一个文库中需要的克隆的基本数目是20n，即对于n＝9，209＝5.12×1011。事实上，以夸大的限制说95％，该数据必须是3倍高以允许进行样品的统计分析，即约1.5×1012。在实施时，由于例如用于产生文库的寡核苷酸的非随机的合成以及惯用的密码子代表(详细的讨论参见Collins1997)该数据更高。考虑由cosmix-plexing产生的重组的文库的数目cosmix-plexing方案是基于概念在起始的选择试验中，基于变化的区段的初始序列，富集克隆群体的含有结构元件的序列。甚至由于受起始文库的有限的大小的限制，最适序列不存在。通过提供大量的新的重组体，cosmix-plexing将增加仅仅找到这样的一个序列的可能性，其中将变化的部分的5’-和3’一半重配例如对于在该实施例中描述的高变非肽文库，编码远端的氨基的5个氨基酸的序列与编码远端羧基的4个氨基酸的序列重组。由于粘性末端基本上限制了重组到限定的亚组，其中一个亚组不能与任何其它亚组重组，但是所产生的重组体的实际数量低于由完全随机重组获得的数量。
对于所描述的起始4个试管的方案，使用了各含有4个亚组的4个独立的文库对于一组N克隆，随机重组将产生N2重组体，假设N2是低于或等于变异体的理论数(20n，见上文)，所述的变异体在高变区段被编码，或者说趋向于20n。
对于4个试管的方案，制备了各代表发生了重组的各个库的16个亚组。如果总的文库由N个克隆组成，那么在16个亚组的各个内形成的新的重组体的数量是(N/16)2。对于所有16个亚组的概括，可以产生的重组体的数量是16×(N)/16)2＝N2/16，又假设N2/16低于或等于变异体的理论数量(20n，见上文)，这些变异体是在高变区段编码的，或者说趋向于20n。
对于单试管方案，仅仅制备了各代表发生了重组的各个库的6个亚组。如果总的文库由N个克隆组成，那么在16个亚组的各个内形成的新的重组体的数量是(N/16)2。对于所有16个亚组的概括，可以产生的重组体的数量是16×(N/16)2＝N2/16，又假设N2/16低于或等于变异体的理论数量(20n，见上文)，这些变异体是在高变区段编码的，或者说趋向于20n。
不管是考虑操作的时间和经济，而且考虑在cosmix-plexing指导的重组期间从给定数量的克隆产生较大多样性的潜在性本发明的单个试管形式是优选的。
本发明的特异性实施方案涉及基因库，其中六组寡核苷酸序列以(i)∶(ii)∶(iii)∶(iv)∶(v)∶(vi)的比例为(0到1)∶(0到1)∶(0到1)∶(0到1)∶(0到1)∶(0到1)存在，条件是存在至少所述组之一。
此外，本发明的一个特定的实施方案涉及基因库，其中以展示载体的形式提供各个基因，特别是以M13噬菌体或类M13噬菌体或以噬菌粒形式提供。
此外，本发明的一个特定的实施方案涉及基因库，其中双链DNA序列由编码被显示的肽或蛋白质的DNA区域(fusB)所包括。
此外，本发明的一个特定的实施方案涉及基因库，其特征在于n＝j＝6，a＝14和b＝16。
此外，本发明的一个特定的实施方案涉及基因库，其中限制性酶是IIs型限制性酶。
此外，本发明的一个特定的实施方案涉及基因库，其特征在于
(a)亚序列B1...Bn是限制性酶BpmI(CTGGAG)的识别位点和亚序列Qn+a+b+1...Qn+a+b+j是反向的BsgI识别位点(CTGCAC)；或(b)亚序列B1..Bn是限制性酶BsgI(GTGCAG)的识别位点和亚序列Qn+a+b+1...Qn+a+b+j是反向的BpmI识别位点(CTCCAG)。
此外，本发明的一个特定的实施方案涉及基因库，其特征在于高变序列Xn+1...Xn+a+b含有NNB或NNK，其中N＝腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)；B＝胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)；K＝鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。
本发明的另一个实施方案涉及显示于图6的序列的噬菌粒pROCOS4/7。
仍然是本发明的另一个实施方案涉及显示于图7的序列的噬菌粒pROCOS5/3。本发明的另一个实施方案涉及产生大的—噬菌体展示文库，或—噬菌粒展示文库的方法，所述的文库含任选地包装的重组展示载体或由任选地包装的重组展示载体组成，其中重组发生在限制性酶的裂解位点(切口(B)的酶；图3的箭头)并且其中(a)到(b)选择从含有由前述任一项权利要求所述的M13噬菌体或类M13噬菌体或噬菌粒组成的展示载体群体的大肠杆菌细胞制备的双链DNA；粘粒载体；用于切口(B)的限制性酶；和用于切口(A)的限制性酶，其中(i)切口(B)的酶在编码展示的肽或展示的蛋白质的区域裂解展示载体(图3的箭头)并产生单一的非对称的粘性末端，其中各个粘性末端是由命名为Z的两个碱基形成的2个碱基对的单链末端，和(ii)切口(A)的酶裂解展示载体和粘粒载体并且通过裂解产生不同于切口(B)获得的唯一的非对称的粘性末端(fusA)，(c)用第一种限制性酶裂解展示载体，(d)用第二种限制性酶裂解展示载体和粘粒载体，(e)将经过裂解的展示载体与经过裂解的粘粒载体连接形成连环体，(f)将连接产物进行λ包装并且转导到大肠杆菌宿主，(g)如果需要，选择存在于连接的展示载体中的基因，(h)大肠杆菌宿主中的转导的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，(i)在新鲜的大肠杆菌宿主中将包装的展示载体传代并且形成噬菌体—展示或噬菌粒—展示文库，并且如果需要，(j)经过传代的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，并且形成噬菌体展示文库或噬菌粒展示文库。
本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于在步骤(a)到(b)中选择IIs型限制性酶，优选的是BglI，DraIII，BsgI或BpmI。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于选择相同的限制性和/或限制性酶用于切口(B)和(A)。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于使用不同的酶作为切口(B)和切口(A)的酶(图3)，优选的是BsgI或BpmI作为切口(B)的酶和DraIII作为切口(A)的酶(fd或M13复制源点的裂解)。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于在步骤(h)和选择性地在步骤(j)中将M13K07用作为M13型辅助噬菌体。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于噬菌粒和粘粒是相同的并且进一步存在用切口(A)的酶进行裂解是任选的和/或切口(B)的酶和切口(A)的酶是相同的。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于步骤(i)的感染复数(MOI)低于或等于1。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其中粘粒包括fd或M13噬菌体源点(复制/包装)。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其中在步骤(e)中使用的展示载体与粘粒载体的摩尔比例在3∶1到15∶1的范围内，优选的是3∶1到10∶1的范围内。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其中在步骤(e)中所使用的载体浓度(包括展示载体和粘粒载体)高于100微克DNA/毫升。
本发明的另一个实施方案涉及用于生产大的—噬菌体—展示延伸文库或—噬菌粒—展示延伸文库的方法，其中借助于上述定义的粘性末端ZZ将d碱基长度的寡核苷酸表达盒插入到限制性位点(切口(B))以产生包括由下面的一个链的通式代表的双链DNA序列的序列(上述序列)或基因5＇B1B2B3...BnXn+1..Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3...Xn+a+dZn+a+d+1Zn+a+d+2Xn+a+d+3...Xn+a+d+bQn+a+d+b+1...Qn+a+d+b+j3＇其中d是整数和3的倍数，优选的是在6到36的范围内；n，a，b和j以及B，X，Z和Q具有与前面任一项权利要求中相同的含义；其中(a)到(b)选择从含有由前述任一项权利要求所述的M13噬菌体或类M13噬菌体或噬菌粒组成的展示载体群体的大肠杆菌细胞制备的双链DNA；粘粒载体；用于切口(B)的限制性酶；和用于切口(A)的限制性酶，其中(i)切口(B)的酶在编码展示的肽或展示的蛋白质的区域裂解展示载体并产生单一的非对称的粘性末端，其中各个粘性末端是由命名为Z的两个碱基形成的2个碱基对的单链末端，和(ii)切口(A)的酶裂解展示载体和粘粒载体并且通过裂解产生不同于切口(B)获得的唯一的非对称的粘性末端，(c1)用切口(B)的限制性酶裂解展示载体，(c2)将一个DNA表达盒插入到具有ZZ粘性末端的裂解位点，(d)用切口(A)的限制性酶裂解获得的展示载体和粘粒载体，(e)将经过裂解的展示载体与经过裂解的粘粒载体连接形成连环体，(f)将连接产物进行λ包装并且转导到大肠杆菌宿主，以使DNA表达盒位于两个高变序列(延伸序列)之间，(g)如果需要，选择存在于连接的展示载体中的基因，(h)大肠杆菌宿主中的转导的展示载体
—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，(i)在新鲜的大肠杆菌宿主中将包装的展示载体传代并且形成噬菌体—展示或噬菌粒—展示文库，并且如果需要，(j)经过传代的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，并且形成噬菌体展示文库或噬菌粒展示延伸文库。
本发明的另一个实施方案涉及用于在产生包括如前述定义的序列的大的重组—噬菌体展示延伸文库，或—噬菌粒展示延伸文库中对5’和/或3’突出进行重配的方法，其中在一个或另一个，或连续的在两个裂解位点ZZ发生重组，两个位点由插入的盒隔开，其中(a)到(b)选择从含有如前所述的由M13噬菌体或类M13噬菌体或噬菌粒组成的展示载体群体的大肠杆菌细胞制备的双链DNA；粘粒载体；用于切口(B)的限制性酶；和用于切口(A)的限制性酶，其中(i)切口(B)的酶在编码展示的肽或展示的蛋白质的区域裂解展示载体并选择性地在—延伸序列和表达盒的5’接界(由识别前述定义的结合位点B1...Bn的限制性酶裂解)，或
—延伸序列和表达盒的3’接界(由识别前述定义的结合位点Qn+a+b+1...Qn+a+b+j或前述定义的结合位点Qn+a+d+b+1...Qn+d+b+j的限制性酶裂解)产生单一的非对称的粘性末端，其中各个粘性末端是由命名为Z的两个碱基形成的2个碱基对的单链末端，(ii)切口(A)的酶裂解展示载体和粘粒载体并且通过裂解产生不同于切口(B)获得的唯一的非对称的粘性末端，(c)用第一种限制性酶裂解展示载体，(d)用第二种限制性酶裂解展示载体和粘粒载体，(e)将经过裂解的展示载体与经过裂解的粘粒载体连接形成连环体，(f)将连接产物进行λ包装并且转导到大肠杆菌宿主，(g)如果需要，选择存在于连接的展示载体中的基因，(h)大肠杆菌宿主中的转导的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，(i)在新鲜的大肠杆菌宿主中将包装的展示载体传代并且形成噬菌体—展示或噬菌粒—展示文库，并且如果需要，(j)经过传代的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，并且形成噬菌体展示文库或噬菌粒展示文库。
本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于在步骤(a)到(b)中选择IIs型限制性酶，优选的是BglI，DraIII，BsgI或BpmI。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于选择相同的限制性位点用于裂解(i)和(ii)。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于使用不同的酶作为切口(B)和切口(A)的酶，优选的是BsgI或BpmI作为切口(B)的酶和DraIII作为切口(A)的酶(fd或M13复制源点被裂解)。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于在步骤(h)和选择性地在步骤(j)中将M13K07用作为M13型辅助噬菌体。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于步骤(g)选择抗生素抗性基因的存在。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于步骤(i)的感染复数(MOI)低于或等于1。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其中粘粒包括fd或M13噬菌体源点。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其中在步骤(e)中使用的展示载体与粘粒载体的摩尔比例在3∶1到15∶1的范围内，优选的是3∶1到10∶1的范围内。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其中在步骤(e)中所使用的载体浓度(包括展示载体和粘粒载体)高于100微克DNA/毫升。
本发明的另一个实施方案涉及用于从头开始生产包括如前述定义的DNA序列并可根据如前述定义的程序进行重组的大的—噬菌体—展示文库，或—噬菌粒—展示文库的方法，其中重组发生在如前述定义的DNA序列内，其中a)展示载体，由M13噬菌体或类M13噬菌体组成或由包括噬菌体复制源点，选择性地包括选择性标记基因，优选的是抗生素抗性基因，λ噬菌体cos位点和“填充片段”—序列(图5上部的右边)的噬菌粒—展示载体，其中“填充片段”—序列含有不同于如前权利要求定义的任何酶的IIs型限制性酶的两个结合位点，其中所述两个位点以不同的方向定位并且在两个位点裂解产生的粘性末端是非对称的并且相互不同，和b)包括如权利要求1-31任一项定义的序列的一部分的PCR产生的片段，包括高变序列，优选的是本发明的Xn+1..Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3..Xn+a+b，其由(a)定义的相同类型的IIs限制性酶结合位点隔在中间，但是在这种情况下，两种取向均朝向高变序列(图5左边)且由该限制性酶裂解产生两个非对称的，互相不同的单链末端，其中第一个末端(图5的a’)与在(a)的大载体片段产生的一个末端(图5的a)互补并且第二个末端(图5的b’)与在(a)的大载体片段产生的另一个末端(图5的b)互补，c)仍然含有活性IIs型限制性酶的两个裂解反应系统(a)和(b)以约等摩尔比例混合在一起且在DNA连接酶存在下进行连接；始终去除含有限制性酶结合位点的片段(“填充片段”片段和PCR产物的外侧末端)而—另外两个组分，称之为大载体片段和插入序列(来自于PCR反应的中央片段)被驱动以—A)如果以＞100微克DNA/毫升(图5)进行连接，形成连环体杂合体，或—B)如果以＜或＝40微克DNA/毫升进行连接，形成环状杂合本，d1)在方案A)的情况下，将DNA包装到λ颗粒并且转导到大肠杆菌宿主，d2)在方案B)的情况下，将DNA转化到大肠杆菌宿主，e)如果需要，选择存在于连接的展示载体中的基因，f)大肠杆菌宿主中的转导的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，g)在新鲜的大肠杆菌宿主中将包装的展示载体传代并且形成噬菌体—展示或噬菌粒—展示文库，且如果需要，h)经过传代的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，并且形成噬菌体—展示或噬菌粒展示文库本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于在步骤(a)到(b)中选择IIs型限制性酶，优选的是BgiI，BsgI或BpmI。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于在步骤(f)和选择性地在步骤(h)中将M13K07用作为M13型辅助噬菌体。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于步骤(e)选择抗生素抗性基因的存在。
此外，本发明的特异性实施方案涉及一种方法，其特征在于步骤(g)的感染复数(MOI)低于或等于1。
本发明的另一个实施方案涉及根据如前描述的本发明的任何一种方法可以获得的包装的颗粒形式的噬菌体—展示文库或噬菌粒—展示文库。
本发明的另一个实施方案涉及根据如前描述的本发明的任何一种方法可以获得的由大肠杆菌群体包括的展示载体的形式的噬菌体—展示文库或噬菌粒—展示文库。
本发明的另一个实施方案涉及噬菌体—展示文库或噬菌粒—展示文库，其特征在于如前定义的和根据本发明可获得的一个或几个基因，其中如前使用的术语“大”定义为超过106变异体克隆，优选的是108-1011变异体克隆。
最后，本发明的另一个实施方案涉及包括由如前定义的和通过从如前定义的文库由亲和性选择程序可在定义的靶上获得的DNA序列编码的肽序列的蛋白质或肽。
详细的描述本发明涉及重组DNA技术的新的结合以产生用于选择新的药物，诊断，生物技术，兽药，农用和生物医学重要性的配体的大的高变的基因库，其效力高于至今获得的任何一个文库。
目前认为高变基因库的大小是限制这样的目的的方法的效用的最主要的因子，因为如经济的方法，它依赖于在文库(高变文库)中起始时产生的多样性(不同变异体的数量)。与该传统观点相反，我们认为如本文所述，当研制高效的方法以产生来自于预选择的亚群体的变异体的突变的区段的可能的结合的大比例，将会产生富含所需的结构的元件的群体，所述的群体已经在接近Nx的群体中代表了，其中N是原始群体的大小和x是待重组的群体的数量。
本发明的第一部分涉及利用IIs型限制性核酸内切酶(a)在重组位点内导入切口和(b)产生用于连接反应的定向的底物，而允许编码可变的肽或蛋白质区域的高变的DNA序列内重组的新的序列，所述的高变DNA序列是在组合的噬菌体/噬菌粒展示文库上展示的，其中然后在体外包装到λ包装混合物之后，将连接产物以高效力再克隆。整个方案产生的效力(克隆/输出DNA)超过任何描述的技术(每毫克连接的DNA有＞108个克隆)。
要求保护用于起始文库的生产和任何时候产生文库或选定的亚群体内的增加的多样性的重组程序的(载体)序列和方案的结合。特别是，要求保护用于产生和使用噬菌体/噬菌粒展示组合文库的这样的序列和程序。
本发明人认识到从而决定进一步变异的高效生产的主要因子是借助于较小的元件(高变区域内的特异性肽序列，和/或结构区域的重配)的重配从起始文库高效生产组合的文库，这归功于选定的特性。本发明提供了这样的方法，该方法具有独特的特性，即重组位点可以在高度可变区域内，从而对所涉及的高变区域内的序列没有影响。替代地，利用该方法可以将蛋白质区域或异源聚体的蛋白质(蛋白质由两个或多个不同的变异多肽链组成)的亚单位重配，各个蛋白质可以含有高变区域，没有重配以再克隆分离的DNA片段或产生含有新的合成的寡核苷酸的新的文库。值得注意的是，当基于预选定的克隆群体(亚群体)和根据可能的变异呈几何增加时使该结构的预定特性最佳化，可以定量代表新特征，其中通过所描述的新的方案仅仅可以获得稀少的结构，该方法因此节省了时间和材料。
我们命名为cosmix-plexing的方法是基于克隆载体的设计，所使用的插入物和特异性的重组DNA方案的组合，这些方案特别是利用i)用IIs型限制性酶裂解噬菌体/噬菌粒DNA，ii)随后连接到连环体，iii)将连环体体外包装到λ包装系统，iv)随后有效地转导到大肠杆菌菌株，v)然后将他们重新体内包装到丝状噬菌体外膜。如此定义的cosmix-plexing用于异源噬菌体/噬菌粒群体导致在如何时候在进一步的实验期间新的变异体大量增加，例如在用于具有预定的一个特性或几个特性的结构的富集步骤之后。
特别是从原始文库富集特定的特性的亚群体将会富集共有基序(变化的区域内的相关序列的简并组，这些变化的区域都以某种程度显示需要的特性)，就所需要的特性而言，这些基序可以(可能将会)包括最适序列。由cosmix-plexing将这些区域或单个高变序列的部分重配将会增加获得最适序列的可能性。通过在定义的靶上的基于差异亲和性的选择，或基于其它需要的可选择的特性的富集程序可以分离亚群体(实施例1底物特性例如由结合到识别修饰的(在这种情况下磷酸化)底物的抗体而富集的特定的蛋白质激酶进行磷酸化；或实施例2利用借助于末端蛋白质结构(锚)和固定玛个表面的配体或捕获到表面上的后者之间的相互作用以前结合的噬菌体或噬菌粒的选择性释放，由内蛋白酶裂解变异的序列)。
本发明进一步覆盖了延伸文库的产生，其中例如在基因库内的重组位点插入“方案—特异性表达盒”。通过从选定的克隆产生进一步的组合文库然后出现了最佳化的配体，其中可以在一定的时候将单个或两个邻接的区域有效地“改组”，直到我们知道没有其它系统提供该“表达盒”插入/交换特性。
附图解释
图1图示描述涉及cosmix-plexing7文库的高度可变区域内制备重组的步骤。
用IIs限制性酶(由小的条状指示的裂解位点)裂解高变区域内的来自于许多克隆(其本身可以是粘粒)的双链噬菌粒和粘粒DNA(如果噬菌粒不是粘粒)并且以高DNA浓度连接到一起，以致于形成DNA分子的长连环体，所有的连环体的以相同的方向例如就M13包装源点定向，即没有形成回文区域。该载体含有IIs型限制性酶的一个或几个限制性位点，以便没有形成在连接时形成回文(即头到头或尾到尾)结构的粘性末端。当通过限制性酶裂解产生的粘性末端本身是非回文并且对于各个质粒/噬菌粒内的限制性位点是独特的，仅仅可以形成闭合环和连环体的形成。以较高DNA浓度(即超过200微克/毫升)形成连环体是优选的。在图2和3中给出了所形成的分子结构的更详细的描述。将连接产物加入到体外λ包装提取物，就是说将该DNA包装到在λ的cos-位点处裂解的37到50千碱基对的线性DNA形式的λ噬菌体外膜。在称之为转导的下面的步骤，将携带粘粒—噬菌粒杂合体的DNA的这些颗粒加入到大肠杆菌细胞(如该图中省略号显示的)，DNA本身注射到该细胞。在该细胞中利用内源性DNA连接酶由闭合的裂解的cos-位点将该DNA环化。然后将它以大的粘粒—噬菌粒杂合体形式从质粒DNA复制源点进行复制而繁殖。在称之为超感染的步骤中将M13型辅助噬菌体(例如M13K07)加入到这些细胞。在进入辅助噬菌体时，启动从存在于包含在连环体的单个拷贝的噬菌粒的M13复制源点的单链的复制。在该过程期间，也将噬菌体包装到M13外膜，并且分泌到培养基中，从培养物的上清液收集噬菌粒。在这些噬菌粒用于选择操作以便确保仅仅在携带编码特定的变异蛋白质的基因的颗粒上提供特定的变异蛋白质之前，进行第二次传代，即转导到大肠杆菌宿主和通过用辅助噬菌体超感染再包装是必要的。值得注意的是，这是高效力的过程，其中每微克连接的输入DNA可以产生多于108的不同的噬菌粒的产量。
图2图示说明当如图1所示，实施cosmix-plexing7方案时形成DNA结构。对于整个质粒由不同的模式命名不同的变异体。起始时用IIs型限制性酶A裂解双链DNA。连接产物描述为连环体，其中各个噬菌粒以相同的方向定位。显示了在体外λ包装和导入到大肠杆菌细胞(有阴影的省略号)之后导入的37到50千碱基对的产物，从而例如每个细胞存在8到10个拷贝的4.5千碱基对的噬菌粒。在再包装之后，获得了如裂解和连接之前提供的相同的噬菌粒。当用双链DNA起始时，本文显示的方案是简单和有效的扩增方法，其中所述方案中M13包装/再复制位点和酶A的限制性位点是相同的。
图3图示说明图1和2描述的方案的改变形式，其中在不同的噬菌粒变异体之间获得了重组。重组的交叉点是Iis型限制性酶B的裂解位点(如中空的箭头显示)，所述的酶优选地在高变区域内或两个不同的可变区域之间裂解(也参见图4，其它可变区域内的其它的裂解位点同时重组)。又，如图1的说明提到的，各个噬菌粒本身可以是粘粒，在这种情况下，加入另一个粘粒不是必要的，在该实施例中，用限制性酶A裂解是任选的。虽然图2和3几乎是相同的，但是应该注意到所有图3的方案的产物是重组的，即不同变异体两侧的杂合体。如前面的两个图讨论的相同的理由，在用于重组的文库之前再传代是进行选择试验所必要的。
图4cosmix-plexing7方案图的左边部分显示编码噬菌体/噬菌粒呈现的肽或蛋白质的可变部分的高变DNA序列。命名为“N变异体”的四个棒显示在Iis型限制性裂解位点的每一侧有不同的序列。用IIs型限制性酶可以裂解来自于变异体克隆的噬菌粒DNA并且再连接以在克隆的效力限制的范围内产生指定数量的重组克隆。如果以从初始文库的预富集的变异体的亚群体开始(说4×104个克隆)，然后可以获得1/16的所有可能的重组体(108)。
在打点的线下面显示了“伸展的文库”的构建。在这种情况下，将方案特异性表达盒插入到高变序列的IIs型限制性裂解位点，所述的表达盒含有编码前面定义的相同序列元件的习惯性密码子分布以便优先与靶结合。由此获得的大文库编码含有三个区段(区域B，A和C)的蛋白质，从而由方案特异性表达盒编码中央区域A，并且以高变区域B和C作为边界。
对于构建了四个独立的文库的方案制作了计算获得的变异体数量的公式。
图的右侧描述了变异体蛋白质怎样结合到靶蛋白质。预期从延伸文库选择的变异体具有较大的互相作用的表面并且由此显示更强和/或更特异性地结合到定义的靶。该靶可以是细胞，(部分)纯化的蛋白质或肽例如酶，抗体，激素或淋巴因子，细胞受体或事实上任何定义的表面或颗粒悬浮液，可能的用上面提到的靶之一包被，它适用于物理分离，即容器(管，管道，烧瓶，微滴板，平面的表面)的壁，或颗粒(例如，珠，磁珠或两个相的液体系统中的液滴)。
图5驱动的指导的克隆(DDC)该图描述了克隆方案的例子，该方案具有优越的特性用于高效地构建高变的文库和伸展的文库，该方案可以与cosmix-plexing方法一起使用。该图的左侧显示待插入到粘粒—噬菌粒双链载体中的高变区域的表达盒。含有“填充片段”的粘粒—噬菌粒载体显示于右侧。如星型线显示的含有高变序列的PCR产物和含有“填充片段”的载体用相同类型的IIs限制性酶裂解。值得注意的是该酶的识别位点以相反的方向定位，即对于载体的情况它背向填充片段，对于PCR产物的情况它向着填充片段。在裂解之后，既不是待插入的高变表达盒也不是载体含有任何的原始IIs类型的限制性酶识别位点。但是载体和插入物被设计为在由限制性酶裂解产生的末端具有非回文粘性末端，以致于插入物和载体连接之后导致高变区域的定向插入。另外，该载体在没有插入表达盒的情况下不能环状闭合也不能将插入片段相互连接。由于连接是在高DNA浓度并且在连续存在限制性酶时进行的，在初始未裂解的或部分裂解的载体或PCR产物中包装的连接产物将会立即再被裂解。定向的非回文粘性末端和再裂解的不希望的连接产物的这种结合尤其是以高DNA浓度结合驱动了定向的双链连环体结构的形成，这种结构是高效的粘粒包装所需要的，其中载体—插入物杂合体形成环状闭合是优选的。通过将包装过的粘粒—噬菌粒杂合体转导到大肠杆菌宿主最后形成起始的cosmix-plexing文库，其中大肠杆菌宿主含有或被M13类似辅助噬菌体超感染。在用于选择之前将噬菌粒再在第二个M13噬菌体包装步骤中传代，以便从单次感染的细胞衍生单个的噬菌体克隆。为了使各个噬菌粒颗粒携带在其基因组中编码的变异体这是必要的。在第一个包装步骤中不是这种情形，其中大肠杆菌宿主含有8个不同的变异体噬菌粒的连环体。
根据图1描述的方案，编码在噬菌粒上提供的蛋白质或肽的基因的高变区域内可以获得重组。利用伸展的文库，通过用识别作为左末端，右末端(相反定向)，或分别两个末端的边界的位点的IIs类型的限制性酶裂解将左(5’)或右(3’)延伸，或两者重配，如对于序列B1-Bn和权利要求3中Qn+a+1...Qn+a+i的描述。
利用高变序列描述本发明总的来说意指我们试图利用寡核苷酸组，其中“随机化的序列”以接近通常在天然蛋白质中发现的比例编码氨基酸，从而减少了终止密码子的频率。我们知道对于某些应用，习惯于的亚组在构建所显示的亚文库时是优选的。
实施例1利用四个试管方法的cosmix-plexing(根据权利要求1-10)1a)文库的生产寡核苷酸序列NONA-CA
NONA-CT
NONA-GA
NONA-GT
其中X是指A，C和G；NA，C，G和T；KG和T；RG和A；YC和T；MC和A。NONA PCR-L
NONA PCR-R
用粗线型标记KnpI(GGTACC)和SacI(GAGCTC)限制性酶识别位点。
重要的载体DNA-序列pROCOS4/7
pROCOS4/7-填充片段
质粒Pbr322的952bp Ecc47III片段用粗线型标记KpnI(GGTACC)，SacI(GAGCTC)，BsgI(GTGCAG)，Eco47III(AGCGCT)和BpmI(CTGGAG)限制性酶识别位点。指出了成熟pIII蛋白质的第一个密码子(GAA)。
为了制备双链DNA插入物，利用单链DNA寡聚NONA PCR-L和NONA PCR-R作为PCR引物，根据下列方案扩增单链高变DNA寡聚NONA-CA，NONA-CT，NONA-GA和NONA-GT注意必须将四个高变DNA-寡聚体严格保持分开！DNA寡聚体的PCR-扩增PCR-缓冲液(10×)氯化钾 500mMTris-HCl(pH9.0) 100mMTriton X-1001％TaqDNA聚合酶(Promega)在储存缓冲液A甘油50％Tris-HCl(pH8.0) 50mM
氯化钠 100mMEDTA0.1mMDTT 1mMTriton X-1001％TE缓冲液(1×)Tris-HCl(pH 8.0)10mMEDTA0.1mM1.将高变寡聚体NONA-CA，-CT，-GA和-GT的2微升的10皮摩尔/微升溶液转移到0.2毫升的PCR反应试管(4个试管)。
2.将下面的物质在Eppendorf反应试管中混合蒸馏水 276.75微升PCR-缓冲液(10×) 45.0微升NONA PCR-L(100皮摩尔/微升)9.0微升NONA PCR-R(100皮摩尔/微升) 9.0微升dNTPs(各10mM) 9.0幑升Taq DNA聚合酶(5U/微升) 2.25微升3.将该混合物78微升转移到各个含有高变寡聚体的PCR试管(步骤1)。
4.将45微升氯化镁(25mM)和45微升蒸馏水在Eppendorf反应试管中混合。
5.将PCR热循环仪预加热到94℃(如果可能利用经过加热的盖)。
6.将20微升的氯化镁溶液(步骤4)转移到各个PCR试管(步骤3)。
7.将试管直接置于热循环仪(简单化为热开始)和执行下面的程序1.94℃30秒2.94℃10秒3.52℃10秒4.将步骤2和3重复9次5.在4℃保持8.取5微升试样在4.5％琼脂糖凝胶上电泳。
9.向各个试管中加入200微升的蒸馏水，用苯酚提取，用乙醇沉淀并且将DNA重新悬浮于120微升的TE-缓冲液。
为了进行克隆，将扩增的寡聚DNA用KpnI和SacI裂解。载体DNA也必须用两种酶进行裂解。因为使用载体DNA pROCOS4/7或其称之为pROCOS4/7-填充片段1的衍生物，没有获得最后的克隆结果，其中衍生物含有易于控制双重消化反应的DNA填充片段。根据下面的方案进行消化缓冲液B+TX-100(1×)Tris-HCl(pH7.5) 10mM氯化镁 10mMBSA 0.1毫克/毫升Triton X-1000.02％缓冲液A(1×)Tris-乙酸(pH7.9)33mM乙酸镁 10mM乙酸钾 66mM
二硫苏糖醇 0.5mM载体DNA的消化1.为了用KpnI限制性消化载体DNA，配制下面混合物pROCOS4/7-填充片段1 X微升(200微克)缓冲液B+TX-100(10×)150微升BSA(10毫克/毫升＝100×) 15微升KpnIX微升(400U)蒸馏水 加到1500微升在37℃保温3小时，并且通过在65℃保温20分钟终止反应。
2.取3微升试样并且在1％琼脂糖凝胶上电泳，以未裂解的DNA作为对照。
3.用苯酚提取，用乙醇沉淀并且将DNA重新悬浮于820微升的TE-缓冲液。
4.将消化的DNA的20微升的试样储存于-20℃并且混合下面物质以用SacI消化pROCOS4/7-填充片段/KpnI 800微升缓冲液A(10×) 100微升SacI X微升(400U)蒸馏水1000微升在37℃保温3小时。
5.取3微升试样并且在1％琼脂糖凝胶上电泳，以未裂解的DNA和单次裂解的DNA作为对照。
6.用苯酚提取，用乙醇沉淀并且将DNA重新悬浮于550微升的TE-缓冲液。
寡聚DNA消化1.为了用KprI消化双链(ds)寡聚DNA，配制下面4种混合物NONA-CA，-CT，-GA或-GT ds DNA 100微升缓冲液B+TX-100(10×) 50微升BSA(10毫克/毫升＝100×) 5微升KpnI X微升(400U)蒸馏水加到500微升在37℃保温5小时。注意不要加热该寡聚DNA。
2.取5微升试样并且在4.5％琼脂糖凝胶上电泳，以未裂解的DNA作为对照。
3.用苯酚提取，用乙醇沉淀并且将DNA重新悬浮于110微升的TE-缓冲液。
4.将消化的DNA的10微升的试样储存于-20℃并且配制下面四种混合物以用SacI消化NONA-CA，-CT，-GA或-GT/KpnI 100微升缓冲液A(10×) 50微升SacI X微升(400U)蒸馏水加到500微升在37℃保温5小时。
5.取5微升试样并且在4.5％琼脂糖凝胶上电泳，以未裂解的DNA和单次裂解的DNA作为对照。
6.用苯酚提取，用乙醇沉淀并且将DNA重新悬浮于55微升的TE-缓冲液。
利用下面的方案可以纯化载体-DNA片段
采用凝胶提取纯化载体DNA片段1.为了将pROCOS4/7载体DNA片段与填充片段分离开，利用一个齿状梳子制备水平1％琼脂糖凝胶。
2.将DNA与1/10体积的凝胶载样缓冲液混合，上样到凝胶并且以100伏电泳直到两个片段清楚地分离开。
3.将凝胶置于UV穿透照明器并且切割下5.5kb pROCOS4/7载体DNA片段。
4.利用JETsorb凝胶提取试剂盒(Genomed GmbH，德国)提取琼脂糖切片。
将载体和插入DNA片段连接并且根据下面方案转化DNA片段的连接通过琼脂糖凝胶电泳(分别是1％和4.5％)检查载体和插入DNA片段的整合。通过将其用溴化乙啶染色后与已知量的类似于包装的寡核苷酸的标准物进行比较可以估测插入的DNA的浓度。为了测定载体DNA的浓度，测定260/280nm处的吸收值。
T4 DNA连接酶缓冲液(1×)Tris-盐酸(pH7.5) 50mM氯化镁 10mM二硫苏糖醇 10mMATP1mMBSA25微克/毫升测试连接1.为了测定插入物与载体DNA的合适的比例，可以进行将一系列测试连接反应。对于该包装连接反应，反应物包括
载体DNA片段 X微升(0.5微克)T4 DNA连接酶缓冲液(10×) 1微升蒸馏水加到9微升2.用蒸馏水制备三个两倍稀释的插入的DNA并且将1微升的未稀释的DNA以及各1微升的每个稀释液加入到连接反应之一。
注意该步骤的目的是制备载体与插入DNA(V/I)比例为1∶5到2∶1。
3.将1个单位的T4 DNA连接酶加入到各个反应并且在15℃保温过夜。
注意作为对照，应该包括没有插入DNA的反应和没有连接酶的反应。
4.将1倍体积的蒸馏水加入到各个反应并且在65℃保温10分钟。
5.用乙醇将DNA沉淀并且重新悬浮于10微升的TE缓冲液。
6.用各个试管的内容物转化电感受态的大肠杆菌JM110λ细胞并且将稀释液涂布于含有青霉素的LB琼脂平板上培养。大规模的连接1.为了制备文库，配制下面四种混合物载体DNA片段X微升(1/4的总制备量)插入DNAX微升(产生最适的V/I比例)T4 DNA连接酶缓冲液(10×) X微升(1/10的最终体积)T4 DNA连接酶 X微升(2U/微克DNA)蒸馏水 以使DNA浓度为0.05微克/微升在15℃保温过夜。
2.用苯酚提取，用乙醇沉淀并且将各个连接混合物重新悬浮于足够的TE-缓冲液以将DNA浓度调节到0.1-0.2微克/微升。感受态细胞的制备1.将大肠杆菌JM110λ的单个菌落接种20毫升的LB培养基并且在37℃和180rpm保温过夜。
2.第二天将过夜生长的培养物以1％接种到2×1升的LB培养基(2×2升Erlenmeyer培养瓶)并且在相同条件下再保温直到光密度已经达到OD600＝0.6。
3.将250毫升培养物试样转移到离心管(GS3)，将细胞置于冰上冷却并且以8000rpm和4℃离心15分钟(Sorvall RC5C离心机；GS3转头)。滗去上清液。
4.将各个沉淀重新悬浮于250毫升的冰冷的蒸馏水，再离心(步骤3)并且滗去上清液。
5.将各个沉淀重新悬浮于125毫升的冰冷的蒸馏水，将两个试样各收集到一个试管，再离心(步骤3)和滗去上清液。
6.将各个沉淀重新悬浮于10毫升的冰冷无菌甘油(10％)，将所有的试样收集到一个GSA离心管，以8000rpm离心15分钟并且吸出上清液。
7.将细菌沉淀重新悬浮于10毫升的冰冷无菌甘油(10％)。
8.将100微升的试样填充到预冷却的，无菌的Eppendorf反应试管，立即在液氮中冰冻并且储存在-70℃。通过电击穿转化大肠杆菌细胞1.将感受态的大肠杆菌细胞的冰冻的试样置于冰上并且使其冻融。
2.向各个试样中加入直到2微克和小于10微升的DNA并且在冰上保温1分钟。
3.将悬浮液填充到预冷却的电击穿小试管(0.2厘米通道长度)，将小试管置于电击穿小橇并且在2.5KV，25μF的能量和200欧姆的电阻(基因脉冲仪和Puls控制器，Bio-Rad)获得脉冲。
4.立即加入1毫升的LB培养基(用20mM葡萄糖补充)，混合和转移悬浮液到Eppendorf反应试管。
5.在37℃保温1小时，并且涂布到含有青霉素(100微克/毫升)的LB琼脂平板上培养。在37℃保温过夜。注意；为了测定文库的大小也将转化细胞的稀释液进行平板培养。
6.为了制备文库原液，将细胞重新悬浮于LB/青霉素培养基，与1倍体积的无菌87％的甘油混合并且储存在-70℃。1b)重组为了根据本发明的四个试管的cosmix-plexing方法进行高变序列内的重组，可以预选择文库。为了该目的，将含有噬菌粒文库的大肠杆菌细胞用M13K07辅助噬菌体进行超感染，收集提供融合蛋白质的子代噬菌体并且用于根据标准方法的第一轮筛选，例如制备M13K07噬菌体原液PEG/氯化钠—溶液(16.7％/3.3M)100克PEG 8000116.9克氯化钠475毫升水PBS-缓冲液(1×)8.0克的氯化钠
0.2克的氯化钾1.43克的Na2HPO4+2H2O0.2克磷酸二氢钾加水到1升pH6.8-71.使用可任意使用的巴斯德移液管从在LB/卡那霉素(Km)平板生长过夜的大肠杆菌WK16菌坪吸取单个的，分离较好的M13K07噬菌斑，将该琼脂片接种到20毫升的LB(2×)/Km培养基(100毫升Erlenmeyer烧瓶)并且在37℃，摇床，以180rpm培养过夜。
2.将10毫升的预培养物接种到2×500毫升的LB(2×)/Km培养基(在2升的Erlenmeyer烧瓶)并且培养过夜(37℃，180rpm)。
3.第二天在4℃以8,000rpm将四个250毫升的试样离心15分钟(sorvall RC5C离心机；GS3转头)。将上清液转移到离心瓶，离心并且又将上清液转移到新鲜的离心瓶。
4.加入0.15体积的PEG/氯化钠溶液，混合和置于冰上至少保温2小时。
5.以8,000rpm(GS3转头)至少离心60分钟，滗去上清液，以在几秒内高达4000rpm进行离心并且利用移液管去除最后痕量的上清液。
6.将各个PEG沉淀再悬浮于2.5毫升的PBS溶液并且收集再悬浮的噬菌体于一个SS34离心瓶。为了澄清悬浮液再以12000rpm离心10分钟(SS34转头)。重新获得上清液(移液管)，将叠氮化钠加入到最终浓度为0.02％并且将噬菌体储存在4℃。噬菌粒的包装(保持各个文库分离)1.用1毫升的含有噬菌粒的大肠杆菌JM110λ细胞(来自于培养过夜的培养物或重新悬浮的细胞)接种到100毫升的LB/Amp培养基(1升Erlenmeyer烧瓶)并且在37℃，和180rpm培养直到OD600＝0.5(2.5小时)。
2.加入500微升的M13K07原液溶液(1011-1012cfu/毫升)，在37℃培养15分钟并且继续在37℃和180rpm振荡培养过夜。
3.第二天以8,000rpm离心15分钟(GSA转头)，将上清液滗出到新鲜离心瓶，重复离心步骤。
4.加入0.15体积的PEG/氯化钠溶液，置于冰上至少保温2小时。
5.以10,000rpm(GS3转头)离心60分钟，滗去上清液，重复离心并且完全去除上清液。
6.将沉淀溶解于1毫升的PBS缓冲液并且将该溶液转移到Eppendorf反应试管。以13000rpm离心10分钟(分批离心)。重新获得澄清的溶液，将叠氮化钠加入(最终浓度为0.02％)并且储存在4℃。筛选程序(保持各个文库分离)T-PBS溶液含有2％ Tween 20的PBS-缓冲液封闭溶液含有0.5％脱脂奶粉的PBS-缓冲液洗脱缓冲液甘氨酸(0.1M；pH2.2)1.微滴板的包被将100微升的配体溶液(100微克/毫升PBS)填充到96孔的微滴板(Nunc maxisorb)的各个孔并且在4℃培养过夜或至少在室温下培养2小时。摇晃孔，将平板猛地置于纸巾上并且用T-PBS溶液洗涤孔一次(ELISA平板洗涤器或手动)。
2.封闭将400微升的封闭溶液填充到孔并且在室温下保温1小时。摇晃孔，将平板猛地置于纸巾上并且用T-PBS溶液洗涤孔一次。
3.结合将用脱脂奶粉以1∶1稀释的噬菌体制剂(通常约1010-1011噬菌体/孔)100微升填充到包被的和一个未包被的孔(作为对照)并且在室温下保温1-3小时。
4.洗涤利用移液管去除溶液并且将平板猛地置于纸巾上。
在第一轮的筛选，用T-PBS洗涤一次，用400微升的封闭溶液保温10分钟，又用T-PBS洗涤并且最后用水洗涤2次。在所有的其它轮期间，重复T-PBS洗涤步骤3次。利用移液管手动或ELISA平板洗涤器进行所有的洗涤步骤。
5.洗脱将平板猛地置于纸巾上并且用100微升的洗脱缓冲液填充到孔，在室温下保温15分钟并且转移该溶液到含有6微升的Tris(2M)的Eppendorf反应管。
6.测定洗脱的噬菌体的效价，如3.1.3的描述进行。再感染大肠杆菌细胞(保持各个文库分离)1.将洗脱的噬菌体和10毫升的大肠杆菌JM110λ对数期细胞混合并且在37℃保温30分钟。
2.通过离心收集细胞(5分钟，8000rpm，SS34转头)并且将沉淀重新悬浮于400微升的LB/Amp培养基。
3.将各个悬浮液涂布于LB/Amp琼脂平板(φ14.5厘米)并且在37℃保温过夜。
在第一轮筛选之后，预期互相结合的富集约105的单个克隆的群体。为了重组，噬菌粒DNA必须根据标准方案分离，例如从再感染的细胞制备噬菌粒DNA1.将再感染的大肠杆菌细胞重新悬浮于20毫升的LB/Amp培养基并且利用200微升接种3毫升的LB/Amp培养基。
2.以180rpm和37℃培养1小时。
3.利用Jetquick质粒Miniprep Spin试剂盒(Genomed GmbH，德国)，根据供应商的说明制备DNA。
利用该方法分离高达30微克的DNA。对于基于pROCOS4/7的文库，噬菌粒大小是4.3kb，这对应于2.9×106克/毫升的分子量或约2×1011噬菌粒分子/微克DNA。由此10微克的重组DNA含有多于不同变异体的理论数目，所述的变异体可以从105克隆((105)2＝1010)制备。
为了进行重组，例如用BpmI或替代地用BsgI独立地裂解各个预选择的文库的噬菌粒DNA。
噬菌粒DNA的消化NEB3-缓冲液(1×)氯化钠100mMTris-盐酸(pH7.9) 50mM氯化镁10mM二硫苏糖醇1mM1.建立下面的反应噬菌粒DNA 10微克BpmI(2U/微升) 5微升NEB3(10×)4微升BSA(1毫克/毫升) 4微升水 加水到40微升在37℃保温5小时。
2.取4微升试样并且在1％琼脂糖凝胶电泳以检查消化情况。
3.用苯酚提取，用乙醇沉淀并且将DNA重新悬浮于TE-缓冲液。
将消化的噬菌粒DNA以高浓度(≥0.2微克/微升)重新连接以有助于连环体的形成，包装到λ噬菌体颗粒并且用于转染大肠杆菌细胞(根据“体外包装噬菌体λDNA；方案I“第2.100-2.104，分子克隆—实验室手册，Sambrook等人，第二版，1989，Cold Spring Harbour实验室出版社)。通过利用M13K07辅助噬菌体包装再感染(见上文)分离转染的噬菌粒。实施例2利用一个试管方法进行的cosmix-plexing(根据权利要求11-17和44)2a)文库的制备寡核苷酸的序列
其中N是指A，C，G或T；BC，G或T；MA或CSC，G或T。
用粗线型标记BpiI(GAAGAC)，BsgI(GTGCAG)和BpmI(CTGGAG)限制性酶识别位点。BpiI裂解位点用箭头表示。pROCOS5/3的重要的载体DNA-序列
用粗线型标记BpiI(GAAGAC)，BsgI(GTGCAG)，Eco47III(AGCGCT)和BpmI(CTCCAG)限制性酶识别位点。BpiI裂解位点用箭头表示。也指出了成熟pIII-蛋白质(GAA)的第一个密码子。
为了根据本发明的一个试管方法制备文库，利用如实施例1描述的PCR引物NONA COS-L和NONA COS-R扩增高变寡聚NONACOS-NGG，-NCT，-NAM和-NTS，不同的是寡聚DNA不必要保持分离。
在用BpiI将pROCOS5/3-载体-DNA和双链(ds)寡聚-DNA消化之后，同时根据下面方案连接消化/连接1.建立下面的混合物pROCOS5/3 DNA 200微克NONACOS-NGG，-NCT，-NAM和-NTS ds DNA 100微升BpiI 200U缓冲液G(10×) 40微升BSA(10毫克/毫升) 4微升水 加水到400微升在37℃保温2小时，加入200单位的T4 DNA连接酶并且继续在15-30℃保温过夜。
2.取3微升的试样并且作为对照在1％琼脂糖凝胶上电泳。该方案有助于生产需要的产物的连环体，通过实施例1的λ-包装方法该连环体可以包装到例如大肠杆菌JM110λ细胞。
2b)重组为了筛选和重组，可以使用如实施例11描述的相同的方法，不同的是利用一个文库替代四个单独的文库。图中标号说明图11体外噬菌粒文库2 1.IIs型的限制性消化和连接2.在λ包装混合物中的体外包装3.转导到大肠杆菌效力≥107/微克连接的DNA3 含有噬菌粒的连环体的粘粒4 由M13K07的超感染5 从每个大肠杆菌克隆释放约7-8个不同的噬菌粒总的效力≥108/微克连接的DNA6 各提供不同的变异体蛋白质的噬菌粒颗粒图21 酶A(IIs型)裂解和连接到连环体2 体外λ包装和转导到大肠杆菌3 M13辅助噬菌体超感染(连环体的单个噬菌粒的再包装)4 接入者为获得者图31 M13复制/包装源点＝IIs型酶A裂解位点2 酶A+B(IIs型)裂解并且连接到连环体3 体外λ包装和转导到大肠杆菌4 M13辅助噬菌体超感染(连环体的单个噬菌粒的再包装)5 IIs型裂解位点B的左侧和右侧被重组图4cosmix-plexing1 在裂解和再包装之后的重配2 方案特异性表达盒3 在裂解和再包装之后的重配4 靶5 用标准的cosmix-plexing文库进行选择6 初始选择的配体(区域A)7 用cosmix-plexing文库进行选择，将来自于起始文库的共有表达盒插入到延伸文库8 从延伸文库选择的二级优化配体(区域B，A+C；来自于延伸的B+C)9 连续最佳化？1.重配，左侧和/或右侧延伸2.在新的延伸文库插入另一个表达盒→再插入中央表达盒3.重复步骤......
图5用于构建初始文库的驱动指导的克隆(DDC)1 高变区域2 Iis型限制性酶裂解3 在限制性酶存在下裂解4 “填充片段”5 粘粒的包装和噬菌粒的包装+M13型辅助噬菌体6 杂合噬菌粒
权利要求
1.基因库，其中所述的基因包括由下面的一个链的通式代表的双链DNA序列5＇B1B2B3...BnXn+1...Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3...Xn+a+bQn+a+b+1…Qn+a+b+j3＇其中n，a，b和j是整数，n＞3，a＞1，b＞3和j＞1，其中Xn+1...Xn+a+b是高变序列，B，X，Z和Q代表腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)，(i)Z代表G或T， G∶T的比例约1∶1，和/或(ii)Z代表C或T，C∶T的比例约为1∶1，和/或(iii)Z代表A或G，A∶G的比例约为1∶1，和/或(iv)Z代表A或C，A∶C的比例约为1∶1，以及其中亚序列B1...Bn和/或Qn+a+b+1…Qn+a+b+j代表限制性酶的识别位点，其中识别位点的定位使其裂解位点在裂解时产生包括命名为Z的两个碱基的粘性末端。
2.根据权利要求1所述的基因库，其中亚序列B1...Bn或Qn+a+b+l…Qn+a+b+j代表限制性酶的识别位点，其中识别位点的定位使其裂解位点在裂解时产生包括命名为Z的两个碱基的粘性末端。
3.根据权利要求1或2所述的基因库，其中粘性末端是由命名为Z的两个碱基形成的2个碱基对单链末端。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基因库，其中各个基因由展示载体尤其是如M13噬菌体或类M13噬菌体或噬菌粒提供。
5.由四个根据前面权利要求任一项所述的基因库构成的一组基因库，其中基因库的特征如下—第一个基因库Z代表G或T，优选的是G∶T的比例约为1∶1；—第二个基因库Z代表C或T，优选的是C∶T的比例约为1∶1；—第三个基因库Z代表A或G，优选的是A∶G的比例约为1∶1；—第四个基因库Z代表A或C，优选的是A∶C的比例约为1∶1。
6.根据权利要求5所述的四个基因库的一组，其中各个基因由展示载体尤其是如M13噬菌体或类M13噬菌体或噬菌粒提供。
7.基因库，其中所述的基因包括由下面的一个链的通式代表的双链DNA序列5＇B1B2B3...BnXn+1...Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3…Xn+a+bQn+b+1...Qn+a+b+j3＇其中n，a，b和j是整数，n＞3，a＞1，b＞3和j＞1，其中Xn+1...Xn+a+b是高变序列且B，X，Z和Q代表腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)，其中包括Zn+a+1和Zn+a+2的四组寡核苷酸序列优选的是以(i)∶(ii)∶(iii)∶(iv)为约1∶1∶2∶2的比例存在，其中四组的特性如下第一组Zn+a+1代表G，Zn+a+2也代表G；第二组Zn+a+1代表C，Zn+a+2代表T；第三组Zn+a+1代表A，Zn+a+2代表A或C，优选的是A∶C的比例约为1∶1；和第四组Zn+a+1代表T，Zn+a+2代表C或G，优选的是C∶G的比例约为1∶1；和其中序列B1...Bn和/或Qn+a+b+1...Qn+a+b+j代表限制性酶的识别位点，其中识别位点的定位使其裂解位点在裂解时产生包括命名为Z的两个碱基的粘性末端。
8.根据权利要求7所述的基因库，其中四组寡核苷酸序列以(i)∶(ii)∶(iii)∶(iv)的比例为(0到1)∶(0到1)∶(0到1)∶(0到1)存在，条件是至少存在一个所述组。
9.根据权利要求7或8所述的基因库，其中亚序列B1...Bn和/或Qn+a+b+1...Qn+a+b+j代表限制性酶的识别位点，其中识别位点的定位使其裂解位点在裂解时产生包括命名为Z的两个碱基的粘性末端。
10.根据权利要求7，8或9所述的基因库，其中粘性末端是由命名为Z的两个碱基形成的2个碱基对单链末端。
11.基因库，其中所述的基因包括由下面的一个链的通式代表的双链DNA序列5＇B1B2B3...BnXn+1..．Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3...Xn+a+bQn+a+b+1...Qn+a+b+j3＇其中n，a，b和j是整数，n＞3，a＞1，b＞3和j＞1，其中Xn+1...Xn+a+b是高变序列，B，X，Z和Q代表腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)，其中包括Xn+a，Zn+a+1和Zn+a+2的下面的六组寡核苷酸序列优选的是以(i)∶(ii)∶(iii)∶(iv)∶(v)∶(vi)为约3∶4∶3∶4∶4∶1的比例存在，其中这六组的特性如下第一组Xn+a代表A，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1或Xn+a代表C，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1，Zn+a+1代表G，Zn+a+2代表G；第二组Xn+a代表A，C，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1∶1，Zn+a+1代表C，Zn+a+2代表T；第三组Xn+a代表A，C和/或G，优选的比例是1∶1∶1，Zn+a+1代表A，Zn+a+2代表A；第四组Xn+a代表A，C，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1∶1，Zn+a+1代表A，Zn+a+2代表C；第五组Xn+a代表A，C，G和/或T，优选的比例是1∶1∶1∶1，Zn+a+1代表T，Zn+a+2代表C；第六组Xn+a代表A，Zn+a+1代表T，Zn+a+2代表G。
12.根据权利要求11所述的基因库，其中六组寡核苷酸序列以(i)∶(ii)∶(iii)∶(iv)∶(v)∶(vi)的比例为(0到1)∶(0到1)∶(0到1)∶(0到1)∶(0到1)∶(0到1)存在，条件是存在至少一个所述组。
13.根据权利要求7-12任一项所述的基因库，其中以展示载体的形式特别是以M13噬菌体或类M13噬菌体或以噬菌粒形式提供各个基因。
14.根据前面任一项权利要求所述的基因库，其中权利要求1或7的双链DNA序列由编码被展示的肽或蛋白质的DNA区域组成。
15.根据前面任一项权利要求所述的基因库，其特征在于n＝j＝6，a＝14和b＝16。
16.根据前面任一项权利要求所述的基因库，其中限制性酶是IIs型限制性酶。
17.根据前面任一项权利要求所述的基因库，其特征在于(a)亚序列B1...Bn是限制性酶BpmI的识别位点(CTGGAG)和亚序列Qn+a+b+1...Qn+a+b+j是反向的BsgI识别位点(CTGCAC)；或(b)亚序列B1...Bn是限制性酶BsgI的识别位点(GTGCAG)和亚序列Qn+a+b+1...Qn+a+b+j是反向的BpmI识别位点(CTCCAG)。
18.根据前面任一项权利要求所述的基因库，其特征在于高变序列Xn+1...Xn+a+b含有NNB或NNK，其中N＝腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)；B＝胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)；K＝鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)。
19.图6所示的噬菌粒pROCOS4/7的序列。
20.图7所示的噬菌粒pROCOS5/3的序列。
21.产生大的—噬菌体展示文库，或—噬菌粒展示文库的方法，所述的文库含有任选地包装的重组展示载体或由任选地包装的重组展示载体组成，其中重组发生在限制性酶的裂解位点(切口(B)的酶；图3的箭头)并且其中(a)到(b)选择从含有由前述任一项权利要求所述的M13噬菌体或类M13噬菌体或噬菌粒组成的展示载体群体的大肠杆菌细胞制备的双链DNA；粘粒载体；用于切口(B)的限制性酶；和用于切口(A)的限制性酶，其中(i)切口(B)的酶在编码展示的肽或展示的蛋白质的区域裂解展示载体(图3的箭头)并产生单一的非对称的粘性末端，其中各个粘性末端是由命名为Z的两个碱基形成的2个碱基对的单链末端，和(ii)切口(A)的酶裂解展示载体和粘粒载体并且通过裂解产生不同于切口(B)获得的唯一的非对称的粘性末端，(c)用第一种限制性酶裂解展示载体，(d)用第二种限制性酶裂解展示载体和粘粒载体，(e)将经过裂解的展示载体与经过裂解的粘粒载体连接形成连环体，(f)将连接产物进行λ包装并且转导到大肠杆菌宿主，(g)如果需要，选择存在于连接的展示载体中的基因，(h)大肠杆菌宿主中的转导的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，(i)在新鲜的大肠杆菌宿主中将包装的展示载体传代并且形成噬菌体—展示或噬菌粒—展示文库，并且如果需要，(j)经过传代的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，并且形成噬菌体展示文库或噬菌粒展示文库。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于在步骤(a)到(b)中选择IIs型限制性酶，优选的是BglI，DraIII，BsgI或BpmI。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于选择相同的限制性和/或限制性酶用于切口(B)和(A)。
24.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于使用不同的酶作为切口(B)的酶和切口(A)的酶(图3)，优选的是BpmI或BsgI作为切口(B)的酶，DraIII作为切口(A)的酶(fd或M13复制源点被裂解)。
25.根据权利要求21-24任一项所述的方法，其特征在于在步骤(h)和选择性地在步骤(j)中将M13K07用作为M13型辅助噬菌体。
26.根据权利要求21-25任一项所述的方法，其特征在于噬菌粒和粘粒是相同的并且切口(A)的酶的存在和用切口(A)的酶进行的裂解是任选的和/或切口(B)的酶和切口(A)的酶是相同的。
27.根据权利要求21-26任一项所述的方法，其特征在于步骤(i)的感染复数(MOI)低于或等于1。
28.根据权利要求21-27任一项所述的方法，其中粘粒包括fd或M13噬菌体源点(复制/包装)。
29.根据权利要求21-28任一项所述的方法，其中在权利要求21的步骤(e)中使用的展示载体与粘粒载体的摩尔比在3∶1到15∶1的范围内，优选的是3∶1到10∶1的范围内。
30.根据权利要求21-29任一项所述的方法，其中在权利要求21的步骤(e)中所使用的载体浓度(包括展示载体和粘粒载体)高于100微克DNA/毫升。
31.用于生产大的—噬菌体—展示延伸文库或—噬菌粒—展示延伸文库的方法，其中借助于如权利要求1-18任一项定义的粘性末端ZZ将d碱基长度的寡核苷酸表达盒插入到限制性位点(切口(B))以产生包括由下面的一个链的通式代表的双链DNA序列的序列或基因5＇B1B2B3...BnXn+1...Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3...Xn+a+dZn+a+d+1Zn+a+d+2Xn+a+d+3...Xx+a+d+bQn+a+d+b+1...Qn+a+d+b+j3＇其中d是整数和3的倍数，优选的是在6到36的范围内；n，a，b和j以及B，X，Z和Q具有与前面任一项权利要求中相同的含义；其中(a)到(b)选择从含有由前述任一项权利要求所述的M13噬菌体或类M13噬菌体或噬菌粒组成的展示载体群体的大肠杆菌细胞制备的双链DNA；粘粒载体；用于切口(B)的限制性酶；和用于切口(A)的限制性酶，其中(i)切口(B)的酶在编码展示的肽或展示的蛋白质的区域裂解展示载体并产生单一的非对称的粘性末端，其中各个粘性末端是由命名为Z的两个碱基形成的2个碱基对的单链末端，和(ii)切口(A)的酶裂解展示载体和粘粒载体并且通过裂解产生不同于切口(B)获得的唯一的非对称的粘性末端，(c1)用切口(B)的限制性酶裂解展示载体，(c2)将一个DNA表达盒插入到具有ZZ粘性末端的裂解位点，(d)用切口(A)的限制性酶裂解获得的展示载体和粘粒载体，(e)将经过裂解的展示载体与经过裂解的粘粒载体连接形成连环体，(f)将连接产物进行λ包装并且转导到大肠杆菌宿主，以使DNA表达盒位于两个高变序列(延伸序列)之间，(g)如果需要，选择存在于连接的展示载体中的基因，(h)大肠杆菌宿主中的转导的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，(i)在新鲜的大肠杆菌宿主中将包装的展示载体传代并且形成噬菌体—展示或噬菌粒—展示文库，并且如果需要，(j)经过传代的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，并且形成噬菌体展示文库或噬菌粒展示延伸文库。
32.在产生包括如权利要求31定义的序列的大的重组—噬菌体展示延伸文库，或—噬菌粒展示延伸文库中对5’和/或3’突出进行重配的方法，其中在一个或另一个，或连续的在两个裂解位点ZZ发生重组，两个位点由插入的盒隔开，其中(a)到(b)选择从含有权利要求31所述的由M13噬菌体或类M13噬菌体或噬菌粒组成的展示载体群体的大肠杆菌细胞制备的双链DNA；粘粒载体；用于切口(B)的限制性酶；和用于切口(A)的限制性酶，其中(i)切口(B)的酶在编码展示的肽或展示的蛋白质的区域裂解展示载体并选择性地在—延伸序列和表达盒的5’接界(由识别如权利要求1和31定义的结合位点B1...Bn的限制性酶裂解)，或—延伸序列和表达盒的3’接界(由识别如权利要求1定义的结合位点Qn+a+b+1...Qn+a+b+j或如权利要求31定义的结合位点Qn+a+d+b+1...Qn+a+b+j的限制性酶裂解)产生单一的非对称的粘性末端，其中各个粘性末端是由命名为Z的两个碱基形成的2个碱基对的单链末端，(ii)切口(A)的酶裂解展示载体和粘粒载体并且通过裂解产生不同于切口(B)获得的唯一的非对称的粘性末端，(c)用第一种限制性酶裂解展示载体，(d)用第二种限制性酶裂解展示载体和粘粒载体，(e)将经过裂解的展示载体与经过裂解的粘粒载体连接形成连环体，(f)将连接产物进行λ包装并且转导到大肠杆菌宿主，(g)如果需要，选择存在于连接的展示载体中的基因，(h)大肠杆菌宿主中的转导的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，(i)在新鲜的大肠杆菌宿主中将包装的展示载体传代并且形成噬菌体—展示或噬菌粒—展示文库，并且如果需要，(j)经过传代的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，并且形成噬菌体展示文库或噬菌粒展示文库。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于在步骤(a)到(b)中选择IIs型限制性酶，优选的是BglI，DraIII，BsgI或BpmI。
34.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于对于切口(B)和(A)选择相同的限制性识别位点。
35.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于使用不同的酶作为切口(B)和(A)的酶，优选的是BsgI或BpmI作为切口(B)的酶和DraIII作为切口(A)的酶(fd或M13复制源点被裂解)。
36.根据权利要求21-35任一项所述的方法，其特征在于在步骤(h)和选择性地在步骤(j)中将M13K07用作为M13型辅助噬菌体。
37.根据权利要求31-36任一项所述的方法，其特征在于步骤(g)选择抗生素抗性基因的存在。
38.根据权利要求31-37任一项所述的方法，其特征在于步骤(i)的感染复数(MOI)低于或等于1。
39.根据权利要求31-38任一项所述的方法，其中粘粒包括fd或M13噬菌体源点。
40.根据权利要求31-39任一项所述的方法，其中权利要求31或32的步骤(e)中使用的展示载体与粘粒载体的摩尔比在3∶1到15∶1的范围内，优选的是3∶1到10∶1的范围内。
41.根据权利要求31-40所述的方法，其中在权利要求31或32的步骤(e)中所使用的载体浓度(包括展示载体和粘粒载体)高于100微克DNA/毫升。
42.用于从头开始生产包括如权利要求1-18任一项定义的DNA序列并可根据如权利要求21-41任一项定义的程序进行重组的大的—噬菌体—展示文库，或—噬菌粒—展示文库的方法，其中重组发生在如前任一项权利要求，尤其是权利要求21或31定义的DNA序列内，其中a)展示载体，由M13噬菌体或类M13噬菌体组成或由包括噬菌体复制源点，选择性地包括选择性标记基因，优选的是抗生素抗性基因，λ噬菌体cos位点和“填充片段”—序列(图5上部的右边)的噬菌粒—展示载体，其中“填充片段”—序列含有不同于如前权利要求定义的任何酶的IIs型限制性酶的两个结合位点，其中所述两个位点以不同的方向定位并且在两个位点裂解产生的粘性末端是非对称的并且相互不同，和b)包括如权利要求1-31任一项定义的序列的一部分的PCR产生的片段，包括高变序列，优选的是权利要求1的Xn+1..Xn+aZn+a+1Zn+a+2Xn+a+3..Xn+a+b，其由(a)定义的相同类型的IIs限制性酶结合位点隔在中间，但是在这种情况下，两种取向均朝向高变序列(图5左边)且由该限制性酶裂解产生两个非对称的，互相不同的单链末端，其中第一个末端(图5的a’)与在(a)的大载体片段产生的一个末端(图5的a)互补并且第二个末端(图5的b’)与在(a)的大载体片段产生的另一个末端(图5的b)互补，c)仍然含有活性IIs型限制性酶的两个裂解反应系统(a)和(b)以约等摩尔比例混合在一起且在DNA连接酶存在下进行连接；始终去除含有限制性酶结合位点的片段(“填充片段”片段和PCR产物的外侧末端)而—另外两个组分，称之为大载体片段和插入序列(来自于PCR反应的中央片段)被驱动以—A)如果以＞100微克DNA/毫升(图5)进行连接，形成连环体杂合体，或—B)如果以＜或＝40微克DNA/毫升进行连接，形成环状杂合体，d1)在方案A)的情况下，将DNA包装到λ颗粒并且转导到大肠杆菌宿主，d2)在方案B)的情况下，将DNA转化到大肠杆菌宿主，e)如果需要，选择存在于连接的展示载体中的基因，f)大肠杆菌宿主中的转导的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，g)在新鲜的大肠杆菌宿主中将包装的展示载体传代并且形成噬菌体—展示或噬菌粒—展示文库，且如果需要，h)经过传代的展示载体—在噬菌体—展示载体的情况下，自发地包装在M13或类M13噬菌体外膜中，或—在噬菌粒—展示载体的情况下，通过用M13型辅助噬菌体感染大肠杆菌宿主(超感染)而包装，并且形成噬菌体—展示或噬菌粒展示文库。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于在步骤(a)到(b)中IIs型限制性酶优选的是BgiI，BsgI或BpmI。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其特征在于在步骤(f)和选择性地在步骤(h)中将M13K07用作为M13型辅助噬菌体。
45.根据权利要求42-44任一项所述的方法，其特征在于步骤(e)选择抗生素抗性基因的存在。
46.根据权利要求42-45任一项所述的方法，其特征在于步骤(g)的感染复数(MOI)低于或等于1。
47.根据如权利要求21-46任一项所述获得的包装的颗粒形式的噬菌体—展示文库或噬菌粒—展示文库。
48.根据如权利要求21-46任一项所述获得的由大肠杆菌群体包括的展示载体形式的噬菌体—展示文库或噬菌粒—展示文库。
49.噬菌体—展示文库或噬菌粒—展示文库，其特征在于如权利要求1-20任一项定义的且根据权利要求21-46任一项所述获得的基因，其中如权利要求21，31，32和42使用的术语“大”定义为超过106个变异体克隆，优选的是108-1011个变异体克隆。
50.蛋白质或肽，其包括由权利要求1-18任一项定义的且通过权利要求48或49的文库由亲和性选择程序在给定的靶中获得的DNA序列编码的肽序列。
全文摘要
本发明涉及利用噬菌粒或噬菌体展示结合Ⅱs型限制性酶和粘粒包装制备的基因库和其组合衍生物;涉及它们在配体的分离中的应用,所述葡萄包括酶抑制剂,受体的激动剂和拮抗剂,给定的靶的竞争性结合肽,疾病和自身免疫综合症诊断配体包括免疫状态的监视工具,转译后修饰的肽,也涉及由该技术产生的这样的配体。
文档编号C40B40/02GK1246150SQ98802184
公开日2000年3月1日 申请日期1998年2月2日 优先权日1997年1月31日
发明者约翰·柯林斯, 彼得·勒特根 申请人:科斯米克斯分子生物有限公司