本发明涉及一种以海带、紫菜、裙带菜为原料制备海藻肥的方法。(二)
背景技术：
：海藻是生长于海洋中的低等隐花植物，共1万多种，有褐藻门、红藻门、蓝藻门等10门。迄今为人类广泛利用的海藻主要是红藻、绿藻和褐藻三大类，约100多种，主要有：海带、裙带菜、紫菜等，可供食用的约50多种。养殖规模较大的包括紫菜、裙带菜、海带、巨藻。海藻肥是以生长在海洋中的大型速生褐藻类为原料，通过化学的或物理的或生物的方法，提取海藻中的有效成分，制成肥料，施予植物用作养分，它能促进植物生长，提高产量，改善农产品品质。海藻肥的生产工艺中最关键的是藻体的消解，藻体消解目的一是使细胞破碎或增溶，使细胞的内含物提取出来；二是使细胞中的大分子物质降解为可溶的易被吸收利用的小分子物质。一般来说，海藻肥生产工艺包括生物降解工艺、化学降解工艺和物理降解工艺。生物降解工艺是利用微生物发酵过程中产生的多种酶类，将海藻大分子物质降解为植物容易吸收利用的小分子物质。接种菌发酵与直接酶解相比，接种菌后通过微生物和酶两者的结合作用，使海藻的大分子物质更充分的降解为小分子的水溶性物质，相比直接使用酶效果更明显，微生物生长繁殖速度快，可实现大规模连续化、自动化生产，在发酵过程中产生并积累的代谢产物如氨基酸、醇醛、维生素及微量元素等不仅可以增加藻肥的适用性，而且对增强植物抗病能力及促进其生长发育都有显著作用。但采用生物法酶解海藻这种方法成本较高，例如cn103145496a，一种生物酶法制备海藻植物营养生长调节剂的方法。酸降解使细胞消解或内源物质增溶，绝大多数海藻肥生产采用酸、碱及有机溶剂处理海藻，使化学试剂对海藻细胞内活性物质成分的破坏性很大，并且残留的试剂容易对环境造成潜在的危害，此法不同于直接添加强酸导致海藻细胞内活性物质成分严重破坏，而是嗜热链球菌产酸降解海藻，其更安全、无残留，且乳酸菌还具有脱除腥味的重要功能，从而解决了遗留的海藻肥腥味较重致使培养的植物果实残留腥味的长久问题，提高经济效益。物理降解法一般采用高温、高压工艺达到海藻细胞壁破碎的目的，高温还使海藻的大分子物质如蛋白质、海藻多糖降解为小分子物质，更易被吸收利用，结合生物和化学降解使海藻肥的制备达到满意的效果。其肥效依赖于海藻肥中所含有的细胞激动素、植物生长素、赤霉素、脱落酸等主要活性物质。海藻中除含有大量的非含氮有机物，微量营养元素，稀有的锌、溴、碘等矿物元素，还含有分子量较大的蛋白质，海藻多糖和高度不饱和酸等。现有技术如授权公告号为cn107141028a的中国发明专利，公开了一种海藻肥的制备方法，该发明是物理法高压萃取海藻。该方法使用天然，无毒，但对仪器设备要求高，成本较高，且降解率不高。现有技术如授权公告号为cn106167422a的中国发明专利，公开了一种复合海藻肥料的制备方法，该发明酶处理结合微生物处理较大限度的保留藻肥的有效活性成分，但预处理粉碎使藻保内营养物质流失，藻肥仍有腥味较重的问题未解决。现有技术如授权公告号为cn107417389a的中国发明专利，公开的混合菌发酵制备液体海藻肥的生产方法，均质后的海带浆加入到复合微生物培养基培养，起到增产的效果，但单一的使用一种降解方法，不能高效的降解海藻大分子多糖和蛋白质，影响海藻肥的应用效果。(三)技术实现要素：本发明涉及一种以海带、紫菜、裙带菜等为原料制备海藻肥的方法，该方法对海带、紫菜、裙带菜等海藻进行有效充分的降解，破除细胞壁，使植物激素等有效物质从细胞内溶出，还使大分子物质如蛋白质、多糖降解为肽、氨基酸、寡糖等小分子物质，并能脱除海藻肥腥味，制备一种更实用、更新型、更营养、更有效益的海藻肥产品。本发明的技术方案如下：一种海藻肥的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)原料预处理将原料海藻用水浸泡、清洗，沥干后，用剪刀剪碎，再经胶体磨粉碎，得到海藻泥，于0～5℃保存备用；所述原料海藻例如：海带、紫菜、裙带菜等；具体的，所述用水浸泡、清洗的操作方法为：将原料海藻按料液质量比1：5～20加入清水中，浸泡2h，然后取出用清水冲洗除去泥沙；所述沥干采用r＝32cm的漏勺，沥水后的海藻含水量为40％～70％；(2)海藻生物发酵降解取步骤(1)准备好的海藻泥，加入104～107cfu/ml毛霉菌种液，密封后在温度30～50℃、ph值7.5～10.5的条件下，置于转速120～200r/min的恒温摇床内发酵2～7d，接着加入104～107cfu/ml里氏木霉菌种液，密封后在温度20～28℃、ph值3.5～5.5的条件下，置于转速120～200r/min的恒温摇床内发酵2～6d，之后加入104～107cfu/ml琼氏不动杆菌菌种液，密封后在温度20～40℃、ph值6～9的条件下，置于转速120～200r/min的恒温摇床内发酵1～6d，得到海藻生物发酵液；所述海藻泥与毛霉菌种液、里氏木霉菌种液、琼氏不动杆菌菌种液的质量比为1：3～10：3～10：3～10；所述密封可采用保鲜膜；所述ph值可采用质量分数3～20％的盐酸水溶液或质量分数5～25％的氢氧化钠水溶液进行调节；(3)海藻酸降解、热降解在步骤(2)所得海藻生物发酵液中，加入104～107cfu/ml嗜热链球菌菌种液，(无需密封)在温度25～50℃、ph值3～7的条件下，置于转速120～200r/min的恒温摇床内发酵1～6d，得到酸降解液，取所得酸降解液，(用牛皮纸)密封后，置于121～125℃、1.0～1.5mpa下进行热处理0.5～4h，得到海藻降解物；所述海藻生物发酵液与嗜热链球菌菌种液的质量比为1：0.05～0.2；(4)干燥待步骤(3)所得海藻降解物冷却至室温(20～30℃)，之后干燥至水分含量为10％～40％，粉碎，过100～250目筛，得到成品海藻肥；所述干燥可采用干燥机，在60～95℃下进行。本发明中，所述毛霉菌种液、里氏木霉菌种液、琼氏不动杆菌菌种液、嗜热链球菌菌种液由微生物菌种经扩大培养得到，具体方法如下：(a)毛霉菌种液毛霉(actinomucorelegans)xh-22，采用固体平板基，28℃培养72h，之后用无菌生理盐水将孢子洗脱，洗脱液经高速分散机均质后，用血球计数板在显微镜下计数，最后将菌液按比例稀释至104～107cfu/ml，得到所述毛霉菌种液；所述毛霉(actinomucorelegans)xh-22，保藏于绍兴咸亨腐乳厂；所述固体平板基的组成为：马铃薯浸粉6g/l、葡萄糖20g/l、琼脂20g/l，溶剂蒸馏水；ph值5.6，灭菌20min；(b)里氏木霉菌种液将里氏木霉(trichodermareesei)接种于pda液体培养基中进行有氧培养，在温度50℃下培养24h，之后将菌液按比例稀释至104～107cfu/ml，得到所述里氏木霉菌种液；所述里氏木霉(trichodermareesei)，保藏于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，菌种保藏编号：atcc26921；所述pda液体培养基的组成为：马铃薯浸粉6g/l、葡萄糖20g/l，溶剂蒸馏水；ph值5.6，灭菌20min；(c)琼氏不动杆菌菌种液将琼氏不动杆菌(acinetobacterjunii)x8接种于种子培养基，然后置于恒温摇床中，在摇床转速150r/min，温度25℃，压力0.1mpa的条件下进行培养，每24h转接一次，共转接三次，培养后将菌液按比例稀释至104～107cfu/ml，得到所述琼氏不动杆菌菌种液；所述琼氏不动杆菌(acinetobacterjunii)x8，保藏于武汉大学，保藏编号：cctcc209110；所述种子培养基的组成为：海藻酸钠5g/l、(nh4)2so45g/l、nacl20g/l、k2hpo4·3h2o2g/l、mgso41.0g/l，溶剂蒸馏水；ph值7.5，灭菌20min；(d)嗜热链球菌菌种液将嗜热链球菌接种到m17固体培养基上，37℃培养到对数培养期，再接种到新的m17液体培养基上，于37℃、170r/min摇床中培养12h，之后降温至4℃菌液离心，去上清液，用质量分数0.85％生理盐水洗涤两次，最后将菌液稀释至104～107cfu/ml，得到所述嗜热链球菌菌种液；所述嗜热链球菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号：cgmcc1.1855，添加80％(体积分数)甘油水溶液，置于-80℃冰箱保存；所述m17固体培养基的组成为：大豆胨5g/l、蛋白胨2.5g/l、酪蛋白胨2.5g/l、酵母浸粉2.5g/l、牛肉粉5g/l、乳糖5g/l、抗坏血酸钠0.5g/l、β-甘油磷酸钠19g/l、硫酸镁0.25g/l，溶剂蒸馏水；ph值7.2，灭菌15min。本发明的有益效果在于：本发明针对海藻肥生产原料成本较高，海藻中营养物质不能完全释放，导致海藻肥效不高等问题，提供一种新型海藻肥的制备方法。首先采用生物发酵降解法，在海藻中依次接入毛霉、里氏木霉和琼氏不动杆菌，其作用机理为：毛霉释放蛋白酶，把蛋白质大分子降解为易吸收的多肽和氨基酸；里氏木霉释放纤维素酶，破解海藻细胞壁，使内容物流出；琼式不动杆菌释放褐藻胶裂解酶，裂解褐藻胶大分子。上述三种菌种联合发酵在藻肥制备上使用是本领域新创。其次采用酸降解法，利用嗜热链球菌发酵产酸的功能，一方面对海藻处理液的ph进行调节，处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶；另一方面嗜热链球菌还能和腥味大分子物质结合生成无腥味的小分子物质，进而脱除海藻的腥味。最后采用热降解法，一是使细胞的内含物如生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸等从细胞内溶出来出来，溶于发酵液中；二是使细胞中的大分子如蛋白质、多糖等物质进一步充分降解为可溶的易被吸收利用的小分子物质。以上三种方法依次处理才达到了理想的制备海藻肥的方法。降解后的海藻，经过干燥、粉碎，制成海藻肥产品。本发明方法无害、无残留、绿色，使海藻内容物充分溶出，极大的保留了海藻天然的活性成分，集植物激素、营养成分、抗生物质于一体对植物作用效果显著，促进根系和茎叶的生长，提高发芽率，提高抗病、抗旱等不良环境的能力，脱除海藻肥的腥味。不添加过多的化学物质，因此避免了生物活性物质的破坏和某些元素升高而导致的对土壤起到的负面影响。(四)具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例1：1)原料处理：将100g海带置于1000g清水中浸泡两小时，取出后清洗泥沙，用r＝32cm的漏勺沥水，沥水后的海带含水量为50％，用剪刀切碎经胶体磨粉碎，粉碎后的海带置于4℃冰箱冷藏备用；2)微生物菌种扩大培养：a.毛霉(actinomucorelegans)xh-22采用固体平板培养，28℃培养72h，用无菌生理盐水将孢子洗脱，洗脱液经高速分散机均质后，用血球计数板在显微镜下计数，最后将菌液按比例稀释到104cfu/ml。b.里氏木霉(trichodermareesei)，菌种保藏编号：atcc26921，接种于pda液体培养基中有氧培养，50℃培养24h，培养后将菌液按比例稀释到104cfu/ml。c.琼氏不动杆菌(acinetobacterjunii)x8，保藏于武汉大学，保藏编号：cctcc209110。琼氏不动杆菌x8接种至种子培养基。培养基：海藻酸钠，5g；(nh4)2so4，5g；nacl，20g；k2hpo4·3h2o，2g；mgso4，1.0g；蒸馏水，1000ml；ph7.5；0.1mpa，灭菌20min。置于恒温摇床中培养，摇床转速150r/min，温度25℃，每24h转接一次，共转接三次，培养后将菌液按比例稀释到105cfu/ml。d.嗜热链球菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号：cgmcc1.1855，添加80％甘油置于-80℃冰箱保存。嗜热链球菌接种到m17固体培养基上，37℃培养到对数培养期，再接种到m17液体培养基上，37℃，170r/min摇床培养12h，菌液离心(4℃)，去上清液，用0.85％的生理盐水洗涤两次，菌液稀释到104cfu/ml。3)海带生物发酵降解：取步骤1)备用海带10g，装入锥形瓶中，加入50g步骤2)所得毛霉菌种液，用保鲜膜封口后在温度30℃、ph值7.5的条件下，置于转速180r/min的恒温摇床内发酵2d，接着加入30g步骤2)所得里氏木霉菌种液，用保鲜膜封口后在温度27℃、ph值4.5的条件下，置于转速180r/min的恒温摇床内发酵4d，之后加入50g步骤2)所得琼氏不动杆菌菌种液，用保鲜膜封口后在温度30℃、ph值7的条件下，置于转速180r/min的恒温摇床内发酵3d，得到海带生物发酵液。4)海带酸降解：把13g步骤2)所得嗜热链球菌菌种液接入到海带生物发酵液中，继续震荡降解。接入嗜热链球菌处理最适温度为37℃，摇床转速180r/min，发酵时间1d。5)海带热降解：取出摇床里的锥形瓶，用牛皮纸封口，置于121℃、1.2mpa高压灭菌锅中，进行热降解2h。6)海带降解物干燥：热降解后的海带，放置冷却，在温度65℃下干燥至水分为20％，粉碎过150目，得到海带肥。实施例2：1)原料处理：将100g紫菜置于1000g清水中浸泡两小时，取出后清洗泥沙，用r＝32cm的漏勺沥水，沥水后的紫菜含水量为50％，用剪刀切碎经胶体磨粉碎，粉碎后的紫菜置于4℃冰箱冷藏备用；2)微生物菌种扩大培养：a.毛霉(actinomucorelegans)xh-22采用固体平板培养，28℃培养72h，用无菌生理盐水将孢子洗脱，洗脱液经高速分散机均质后，用血球计数板在显微镜下计数，最后将菌液按比例稀释到104cfu/ml。b.里氏木霉(trichodermareesei)，菌种保藏编号：atcc26921，接种于pda液体培养基中有氧培养，50℃培养24h，培养后将菌液按比例稀释到104cfu/ml。c.琼氏不动杆菌(acinetobacterjunii)x8，保藏于武汉大学，保藏编号：cctcc209110。琼氏不动杆菌x8接种至种子培养基。培养基：海藻酸钠，5g；(nh4)2so4，5g；nacl，20g；k2hpo4·3h2o，2g；mgso4，1.0g；蒸馏水，1000ml；ph7.5；0.1mpa，灭菌20min。置于恒温摇床中培养，摇床转速150r/min，温度25℃，每24h转接一次，共转接三次，培养后将菌液按比例稀释到105cfu/ml。d.嗜热链球菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号：cgmcc1.1855，添加80％甘油置于-80℃冰箱保存。嗜热链球菌接种到m17固体培养基上，37℃培养到对数培养期，再接种到m17液体培养基上，37℃，170r/min摇床培养12h，菌液离心(4℃)，去上清液，用0.85％的生理盐水洗涤两次，菌液稀释到104cfu/ml。3)紫菜生物发酵降解：取步骤1)备用紫菜10g，装入锥形瓶中，加入50g步骤2)所得毛霉菌种液，用保鲜膜封口后在温度35℃、ph值7.5的条件下，置于转速180r/min的恒温摇床内发酵2d，接着加入50g步骤2)所得里氏木霉菌种液，用保鲜膜封口后在温度28℃、ph值5的条件下，置于转速180r/min的恒温摇床内发酵4d，之后加入50g步骤2)所得琼氏不动杆菌菌种液，用保鲜膜封口后在温度25℃、ph值6的条件下，置于转速180r/min的恒温摇床内发酵1d，得到紫菜生物发酵液。4)紫菜酸降解：把15g步骤2)所得嗜热链球菌菌种液接入到紫菜生物发酵液中，继续震荡降解。接入嗜热链球菌处理最适温度为35℃，摇床转速180r/min，发酵时间1d。5)紫菜热降解：取出摇床里的锥形瓶，用牛皮纸封口，置于121℃、1.5mpa高压灭菌锅中，进行热降解1h。6)紫菜降解物干燥：热降解后的紫菜，放置冷却，在温度70℃下干燥至水分为20％，粉碎过120目，得到紫菜肥。实施例3：1)原料处理：将100g裙带菜置于1000g清水中浸泡两小时，取出后清洗泥沙，用r＝32cm的漏勺沥水，沥水后的裙带菜含水量为60％，用剪刀切碎经胶体磨粉碎，粉碎后的裙带菜置于4℃冰箱冷藏备用；2)微生物菌种扩大培养：a.毛霉(actinomucorelegans)xh-22采用固体平板培养，28℃培养72h，用无菌生理盐水将孢子洗脱，洗脱液经高速分散机均质后，用血球计数板在显微镜下计数，最后将菌液按比例稀释到104cfu/ml。b.里氏木霉(trichodermareesei)，菌种保藏编号：atcc26921，接种于pda液体培养基中有氧培养，50℃培养24h，培养后将菌液按比例稀释到104cfu/ml。c.琼氏不动杆菌(acinetobacterjunii)x8，保藏于武汉大学，保藏编号：cctcc209110。琼氏不动杆菌x8接种至种子培养基。培养基：海藻酸钠，5g；(nh4)2so4，5g；nacl，20g；k2hpo4·3h2o，2g；mgso4，1.0g；蒸馏水，1000ml；ph7.5；0.1mpa，灭菌20min。置于恒温摇床中培养，摇床转速150r/min，温度25℃，每24h转接一次，共转接三次，培养后将菌液按比例稀释到107cfu/ml。d.嗜热链球菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号：cgmcc1.1855，添加80％甘油置于-80℃冰箱保存。嗜热链球菌接种到m17固体培养基上，37℃培养到对数培养期，再接种到m17液体培养基上，37℃，170r/min摇床培养12h，菌液离心(4℃)，去上清液，用0.85％的生理盐水洗涤两次，菌液稀释到106cfu/ml。3)裙带菜生物发酵降解：取步骤1)备用裙带菜10g，装入锥形瓶中，加入30g步骤2)所得毛霉菌种液，用保鲜膜封口后在温度35℃、ph值8.5的条件下，置于转速180r/min的恒温摇床内发酵1.5d，接着加入50g步骤2)所得里氏木霉菌种液，用保鲜膜封口后在温度28℃、ph值4的条件下，置于转速180r/min的恒温摇床内发酵3d，之后加入100g步骤2)所得琼氏不动杆菌菌种液，用保鲜膜封口后在温度25℃、ph值6的条件下，置于转速180r/min的恒温摇床内发酵1d，得到裙带菜生物发酵液。4)裙带菜酸降解：把18g步骤2)所得嗜热链球菌菌种液接入到裙带菜生物发酵液中，继续震荡降解。接入嗜热链球菌处理最适温度为35℃，摇床转速180r/min，发酵时间1d。5)裙带菜热降解：取出摇床里的锥形瓶，用牛皮纸封口，置于125℃、1.5mpa高压灭菌锅中，进行热降解1h。6)裙带菜降解物干燥：热降解后的裙带菜，放置冷却，在温度80℃下干燥至水分为20％，粉碎过120目，得到裙带菜肥。对比例：现有技术如授权公告号为cn107417389a的中国发明专利，公开的混合菌发酵制备液体海藻肥的生产方法，均质后的海带浆加入到复合微生物培养基培养，起到增产的效果。均质后的海带浆液，海带的各类组织细胞被破碎较多，而且海带浆液需现磨现用，长时间放置会变色、变质，这种技术使用单一的微生物发酵降解方法，不能高效的降解海藻大分子多糖和蛋白质，影响海藻肥的应用效果。相比之下，本发明尽可能的保留海带细胞不受损失，而且使内容物尽可能释放，提高藻肥的肥效；对海藻原料要求不高，只需粉碎即可，不需要复杂的海带浆液的制备过程；本发明用发酵降解、酸降解、热降解三种方法依次处理才达到了理想的制备海藻肥的方法。本发明方法无害、无残留、绿色，使海藻内容物充分溶出，极大的保留了海藻天然的活性成分，集植物激素、营养成分、抗生物质于一体对植物作用效果显著，促进根系和茎叶的生长，提高发芽率，提高抗病、抗旱等不良环境的能力，脱除海藻肥的腥味。不添加过多的化学物质，因此避免了生物活性物质的破坏和某些元素升高而导致的对土壤起到的负面影响。而且其中酸降解法，利用嗜热链球菌发酵产酸的功能，一方面对海藻处理液的ph进行调节，处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶；还能和腥味大分子物质结合生成无腥味的小分子物质，进而脱除海藻的腥味。海藻肥应用样品蛋白质(％)纤维素(％)褐藻胶(％)腥味物质(种)原料海带15.7515.8312.1343实施例18.9612.156.9123当前第1页12