一种水溶性高效发光氧化石墨烯量子点的制备方法及其应用

1.本发明属于材料制备领域，具体涉及一种水溶性高效绿色发光石墨烯量子点的制备方法及该量子点在细胞成像上进行应用。


背景技术：

2.通常说的石墨烯，其粒径大致都分布在几十纳米到几百纳米偶尔到达微米级，当材料的尺寸小于其激子波尔半径时，电子和空穴的运动受到限制，呈现出量子化的特点，这样的纳米结构称为量子点。石墨烯量子点由sp2 、sp3杂化的碳结构，通常具有单层或多层石墨结构，当二维石墨烯微片被破碎至纳米尺度时，石墨烯表现出了半导体的特性。这些粒径在10nm左右甚至小于10nm的碳基量子点，由于量子表面效应、限域效应、量子尺寸效应、宏观量子效应和小尺寸效应，使得其呈现出很多独特的性质；发光效率增强、发光峰位受尺寸调控、具备多激子效应等。石墨烯量子点具有许多优点：1、生物相容性好；2、低细胞毒性；3、原材料易得；4、具有发光特性；5、良好的电学性质；6、化学惰性等。
3.近年来，人们在石墨烯量子点的合成研究方面取得了一定的进展，先后发展了多种合成方法。大部分的合成方法是以石墨、石墨烯、氧化石墨烯、活性炭、碳纳米管、碳纤维等作为前驱体，用物理、化学、电化学的方法将其破碎，获得石墨烯发光量子点。虽然目前已有多种方法可以制备氧化石墨烯发光量子点，但是还存在一定问题，如：合成效率低、荧光效率低，荧光发射波长多在蓝光区域，发光谱与激发波长有依赖关系等缺点。例如有研究人员利用高锰酸钾、浓硫酸、硝酸钠在高温下氧化石墨制备石墨烯量子点的方法，但是这种方法得到的石墨烯量子点荧光量子效率非常低，不到1％。又例如，有研究人员将氧化石墨烯在dmf溶液中高温破碎，得到了荧光量子效率超过10％的石墨烯量子点，但是该合成方法的反应转化率仅有1.6％。总体而言，大部分方法得到的石墨烯量子点的发光效率普遍较低，特别缺乏获得水溶性的高效发光石墨烯量子点，影响了在生物医学成像及led显示等领域的应用，急需开发一种简单有效的制备方法。
4.开发一种简单、快捷、方便又环保的获得高量子产率石墨烯量子点的方法仍然是一个巨大的挑战。


技术实现要素：

5.本发明为了克服现有的方法所制备的石墨烯量子点量子效率不足的问题，提供了一种改良的hummer法制作氧化石墨烯、利用尖端超声技术大幅提高石墨烯量子点量子效率以及氧化石墨烯的转化率的制备方法，得到了高效绿色发光石墨烯量子点，并对其进行了生物成像上的应用。
6.本发明具体采用以下技术方案：一种水溶性高效绿色发光石墨烯量子点的制备方法，包括以下步骤：步骤1：氧化石墨烯的制备：（1）通过改良的hummer法制备氧化石墨烯。将浓硫酸先在烧瓶里冰浴一段时间，然
后将石墨烯微片加入到浓硫酸中，使石墨烯充分胀开。
7.具体的，所述浓硫酸为质量浓度为98%的浓硫酸，冰浴时间为15min，石墨烯和浓硫酸的比例为20:1（mg/ml）。
8.（2）冰浴下搅拌，再缓慢加入高锰酸钾，溶液由透明变成墨绿色。保持35℃继续搅拌反应12h直到溶液变成土黄色粘稠浆液。
9.具体的，冰浴下搅拌时间为30min，高锰酸钾与石墨烯的质量比为4:1。
10.（3）撤除水浴，分次加超纯水，之后继续35℃搅拌反应2h。
11.具体的，超纯水是因为浓硫酸稀释会放热，防止温度过高，每次加入超纯水量恰好使土黄色粘稠浆液能够很好的分散在水中。
12.（4）加入质量百分数30%的双氧水，搅拌直至溶液变成金黄色。
13.双氧水有强氧化性，加入后溶液会变成金黄色，双氧水加入量正好使得溶液变为金黄色为宜，因为加入更多溶液也不会颜色更深。
14.（5）洗涤。在10000rpm/min转速下将盐酸加入步骤（4）制备的金黄色溶液中进行洗涤；再在10000rpm/min转速下向上述溶液中加入蒸馏水进行洗涤。弃掉上层悬浊液，取下层沉淀，得到氧化石墨烯。
15.具体的，所述盐酸为将36%～38%质量分数浓盐酸与水按照1:6体积比进行混合，即得。
16.步骤2：利用细胞破碎仪对氧化石墨烯进行超声：（1）将上述步骤1中制备得到的氧化石墨烯沉淀进行冷冻干燥12h，得到干燥的氧化石墨烯固体，向氧化石墨烯固体中加入n,n-二甲基甲酰胺，形成质量浓度为10mg/ml的氧化石墨烯悬浊液。
17.（2）将氧化石墨烯悬浊液进行利用细胞破碎仪超声10min后，将氧化石墨烯悬浊液搅拌后转入100ml的聚四氟乙烯在反应釜中，控制在反应釜填充率为80%，放入烘箱内200℃、12h进行加热，待反应结束后自然冷却至室温，用微孔滤头过滤，得到在dmf中的氧化石墨烯量子点溶液。
18.其中，细胞破碎仪的超声模式为超声开3s关5s，功率比为6%，功率为900w。
19.另外，在利用细胞破碎仪超声前，先使用超声波清洗器超声30min，超声机超声功率600w。
20.（3）将dmf中的氧化石墨烯量子点溶液放入旋转蒸发仪处理得到干燥的氧化石墨烯量子点固体。
21.上述制备的氧化石墨烯量子点固体在不同激发波长下如380～480nm下可以发出绿色荧光且细胞毒性低，因此可将其应用于细胞成像中。
22.本发明的有益效果为：利用本发明制备方法得到的氧化石墨烯量子点固体具有较好的水溶性，溶于水的氧化石墨烯量子点的量子效率可达14.9%。另外，所得氧化石墨烯量子点细胞相容性好、细胞毒性低，因此可将其应用于细胞成像中。
附图说明
23.图1为本发明实施例中制得的氧化石墨烯分散液吸收图。
24.图2为本发明实施例中制得的氧化石墨烯afm图。
25.图3为本发明实施例中制得的不同浓度（mg/ml）氧化石墨烯dmf悬浊液、氧化石墨烯悬浊液在反应釜中不同填充程度（%）所制得的高效绿色发光石墨烯量子点荧光图。
26.图4为本发明实施例中制得的不同时间下的尖端超声对高效绿色发光石墨烯量子点在水中的荧光图。
27.图5为本发明实施例中制得的高效绿色发光石墨烯量子点的吸收谱、激发谱和荧光谱。
28.图6为本发明实施例中制得的高效绿色发光石墨烯量子点的粒径分布。
29.图7为本发明实施例中制得的高效绿色发光石墨烯量子点的afm图。
30.图8为本发明实施例中制得的不同激发波长下的高效绿色发光石墨烯量子点荧光图。
31.图9为本发明实施例中制得的高效绿色发光石墨烯量子点的细胞毒性检测图。
32.图10为本发明实施例中制得的高效绿色发光石墨烯量子点在488nm激发光下海拉细胞中的成像merge图。
具体实施方式
33.下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
34.实施例1一、氧化石墨烯的制备：（1）通过改良的hummer法制备氧化石墨烯。具体的，将25ml质量浓度为98%浓硫酸先在烧瓶里冰浴15min，冰浴过程中不断加入冰块。将500mg石墨烯微片加入到浓硫酸中，使石墨烯充分胀开。
35.（2）冰浴下搅拌30min，再缓慢加入2g高锰酸钾，此时溶液由透明变成墨绿色。保持35℃继续搅拌反应12h直到溶液变成土黄色粘稠浆液。
36.（3）撤除水浴，分六次加超纯水，每次12ml，之后继续35℃搅拌反应2h。
37.（4）加入7.5ml、质量百分数为30%的双氧水，搅拌15min后，溶液变成金黄色。
38.（5）洗涤。将质量分数为36%～38%的浓盐酸与水按照1:6体积比进行混合，得到稀释后的盐酸。在10000rpm/min转速下将稀释后的盐酸加入步骤（4）制备的金黄色溶液中进行洗涤，每次洗涤五分钟，洗涤三次；再在10000rpm/min转速下向上述溶液中加入蒸馏水进行洗涤，每次洗涤20分钟，洗涤三次。弃掉上层悬浊液，上层悬浊液的吸收图如图1所示，图1表明制备出了氧化石墨烯（悬浊液中有少量石墨烯），229nm处的吸收峰来自c=c双键的π-π跃迁，300nm处吸收峰来自c=o双键的n-π跃迁。取下层沉淀，得到氧化石墨烯，所得氧化石墨烯的afm图如图2所示，图2说明制得的氧化石墨烯呈单层结构，纯度比较好。
39.二、利用细胞破碎仪对氧化石墨烯进行尖端超声：将上述一中制备得到的氧化石墨烯沉淀先用冰箱-22℃冷冻，然后放入冷冻干燥箱-56℃下12h，得到干燥的氧化石墨烯固体(go)，向氧化石墨烯固体中加入n,n-二甲基甲酰胺（dmf），分别形成质量浓度为0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml的氧化石墨烯悬浊液。将氧化石墨烯悬浊液倒入烧杯放入超声波清洗器（北京天佑恒达科技有限公司，
型号：tyhd-600，功率：600w），中超声半小时后，待悬浊液冷却放入超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：lc-jy92-iin，超声功率：900w)进一步尖端超声，控制超声波细胞破碎仪的超声模式为超声开3s关5s，功率比为6%。在超声波细胞破碎仪中分别处理0min、5min、10min、15min、20min、25min后，将氧化石墨烯悬浊液搅拌后转入100ml的聚四氟乙烯中，控制填充率分别为100%、80%、60%、40%，放入烘箱内200℃、12h进行加热，待反应结束后自然冷却至室温，用220nm的微孔滤头过滤，得到在dmf中的氧化石墨烯量子点溶液。使用滤头过滤前先将溶液多余的氧化石墨烯固体离心掉，因为在反应釜反应时有部分氧化石墨烯无法裂解成石墨烯量子点，而石墨烯量子点都溶解在dmf溶液中，所以先离心把氧化石墨烯固体分离出来，再用220nm滤头把大颗粒都滤除，就可以得到纯净的石墨烯量子点。
40.氧化石墨烯dmf悬浊液的质量浓度（mg/ml）、氧化石墨烯悬浊液在反应釜中填充程度（100%、80%、60%、40%）对氧化石墨烯量子点荧光的影响如图3所示。图3a表明：通过把不同质量（mg）的氧化石墨烯溶解到不同体积（ml）的dmf中，得到石墨烯量子点的荧光图高低不一，通过筛选得到一个合适的比例，即go/dmf为10mg/ml的比例时量子点荧光最强。图3b表明：填充率百分比是反应釜里的聚四氟乙烯容器装溶液的程度，100%表示装满了，通过筛选发现填充率为80%时量子点荧光最强。
41.将dmf中的氧化石墨烯量子点溶液放入旋转蒸发仪0.5小时，控制温度为55℃，得到干燥的氧化石墨烯量子点固体，而后向干燥的氧化石墨烯量子点固体中加入超纯水，即得到了在水中的氧化石墨烯量子点溶液。
42.不同超声波细胞破碎仪处理时间下的得到的在水中的氧化石墨烯量子点的荧光图如图4所示。图4表明不同超声时间对石墨烯量子点在水中荧光有影响，10分钟超声时间最好，此时水中量子点荧光最高。
43.氧化石墨烯量子点的吸收谱、激发谱、荧光谱、粒径以及形貌分别如图5、6、7所示。图5说明量子点的最好激发波长380nm，在380nm激发下荧光发光峰位500nm附近，图5右上角是在紫外灯照射下的实物图。图6、图7说明量子点平均粒径6.3nm左右，高度均一。图8是在不同的激发波长下，可以发现量子点的发光位置只有轻微移动，具有轻微的波长依赖。
44.三、高效绿色发光氧化石墨烯量子点的应用使用不同浓度（0μg、25μg、50μg、100μg、200μg）高效绿色发光石墨烯量子点对海拉细胞进行毒性测量。
45.500ml海拉细胞培养液：445mldmem中加入50ml牛血清蛋白，然后加入5ml抗生素。
46.首先将海拉细胞接种96孔板，设置一个空白对照，五个复孔，五个浓度梯度（0μg、25μg、50μg、100μg、200μg），5个复孔，每个不同浓度的样品gqds加入到设置的五个复孔中，孵育12小时，每隔三小时测量细胞存活率求平均值，结果如图9所示，图9说明石墨烯量子点毒性比较低，可以应用于细胞成像。
47.制作细胞爬片，将氧化石墨烯量子点导入海拉细胞中，在488nm激光下使用共聚焦显微镜进行细胞成像，在海拉细胞中的merge图如图10，该结果表明石墨烯量子点可以很好的进入海拉细胞，在488nm激光下发出绿色荧光，可以应用在细胞成像上。
48.以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。