一种含硫碳纳米点的制备方法

1.本发明属于纳米技术领域，尤其涉及一种含硫碳纳米点的制备方法。


背景技术：

2.耐药性细菌对抗生素药物具有明显的抵抗作用，不易被灭杀，对人类健康造成极大的威胁。特别是，耐万古霉素肠球菌(vancomycin resistant enterococci,vre)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus,mrsa)等细菌均表现出显著耐药性，使得由其造成的感染(如败血症等)变得更加难以治疗。因此，寻找新的、不产生耐药性的抑菌方法和策略，对治疗耐药菌感染具有重大意义。
3.近年来，光热疗法在灭杀各类耐药菌方面表现出了良好的发展潜力。光热疗法是利用光热转换材料将光能转换为热能杀死细菌的一种治疗方法，治疗时间短、杀菌效果好。最重要的是，由于该疗法是利用产生的热能促使细菌的蛋白质和核酸发生变性而杀死细菌，没有具体的靶向位点，因而不会诱导细菌产生新的耐药性。然而，现有的光热转换材料在生物相容性和光热转换效率方面仍然存在缺陷，因此，需要研发一种具有良好生物相容性和较高光热转换效率的光热材料。
4.碳纳米点(carbon nanodots,cnds)是一种新兴的碳基质的纳米材料，其具有成本低廉、易于获得、生物相容性好等诸多优点，受到广泛的关注。然而，作为光热转换材料，cnds却具有明显的局限性，即其在近红外区的吸收较弱，限制了其在光热治疗中的应用。因此，如何提高cnds在近红外区的光吸收性能成为亟待解决的科学问题。


技术实现要素：

5.本发明为解决上述问题，提供了一种含硫碳纳米点的制备方法，本发明具体的技术方案如下：
6.一种含硫碳纳米点的制备方法，包括如下步骤：
7.步骤1：将二甲基亚砜(dmso)、聚乙烯亚胺、无水柠檬酸和甲酰胺的混合溶液，搅拌均匀，加热反应获得产物；
8.步骤2：将步骤1获得的反应产物进行透析得纯化产物；
9.步骤3：将步骤2获得纯化产物进行烘干得含硫碳纳米点(s@cnds)。
10.本发明采用上述技术特征具有如下技术效果：
11.本发明设计构建了一种含硫碳纳米点(s@cnds)，通过添加二甲基亚砜(dmso)，在碳纳米点合成过程中成功掺入硫元素，形成s@cnds。
12.本技术方案还可以做如下改进：
13.进一步地，步骤1中所述dmso与所述甲酰胺的质量比为(1-25):5；
14.进一步地，步骤1中所述dmso与无水柠檬酸的质量比为(4-20):1；
15.进一步地，步骤1中所述dmso与聚乙烯亚胺的质量比为(6-30):1。
16.进一步地，步骤1中所述加热反应的加热温度为140-180℃，加热时间为4-6h。
17.进一步地，步骤2中所述透析采用截留分子量为1000-5000的透析袋。
18.通过以上技术方案的改进，进一步提高s@cnds的制备的效果，优化s@cnds的颗粒大小，提高s@cnds的产率及纯度。
19.步骤3中所得的s@cnds颗粒大小为3-5nm；所得的s@cnds作为光热转换材料，在808nm光照条件下，s@cnds的光热转换效率达到45％-68％；所得的s@cnds可在黑暗中存储至少30天的稳定性，该稳定性是通过紫外可见光光谱(吸收峰波长的位移不超过10nm)测定。
20.进一步地，步骤3中所述s@cnds应用在耐万古霉素肠球菌等多种耐药菌的光热抑菌治疗领域。
21.本发明的特点和有益效果在于：
22.本发明提供了一种含硫碳纳米点(s@cnds)的制备方法，通过添加二甲基亚砜(dmso)，在碳纳米点合成过程中成功掺入硫元素，形成s@cnds，合成步骤简单，光热转换效率高、稳定性好；合成的含硫碳纳米点(s@cnds)与无硫cnds相比，其在近红外区域的吸收峰显著增强，光热转换效率也显著提高。使含硫碳纳米点(s@cnds)成为一种价格低廉、生物相容性好且光热转化效率高的光热材料，可用于耐万古霉素肠球菌等多种耐药菌的光热治疗中。
附图说明
23.图1为本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的透射电镜图(tem)；
24.图2为本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的x射线能谱仪成分分析图(eds)；
25.图3本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的zeta电位分布图；
26.图4本发明实施例1-3和对比例1-2中不同硫含量的含硫碳纳米点(s@cnds)的紫外可见分光光谱图；
27.图5本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的荧光光谱图；
28.图6为本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的体外光热转换性能测试结果图；
29.图7为本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的体外光热成像效果图；
30.图8为本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)分别光热处理后的vre细菌的荧光染色结果图；
31.图中标记说明：图8(a)、(b)、(c)分别是pbs、cnds、s@cnds在非光照处理条件下的荧光染色图；
32.图8(d)、(e)、(f)分别是经pbs、cnds、s@cnds在nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理下的荧光染色图；
33.其中，syto-9可以穿过活细菌的细胞壁与dna结合使其显示绿色，而pi只能穿过死
细菌不完整的细胞壁，使死的细菌被染成红色；
34.图9是经本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)分别光热处理后的vre细菌的标准板计数检测图片；
35.图中标记说明：图9(a)、(b)、(c)分别为pbs、无硫碳纳米点(cnds)、s@cnds(5:6)经非光照处理的标准平板菌落照片；
36.图9(d)、(e)、(f)分别为pbs、无硫碳纳米点(cnds)、s@cnds(5:6)经nir光照处理(808nm，0.8w/cm2，10min)的标准平板菌落照片；
37.图10是经本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)分别在非光照和nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理条件下的细菌存活率图；
38.图11是经本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)在非光照和nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理条件下的细菌生长曲线；
39.图12是经本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)分别光热处理后的mrsa细菌的标准板计数检测图片；
40.图中标记说明：图12(a)、(b)、(c)分别为pbs、无硫碳纳米点(cnds)、s@cnds(5:6)经非光照处理的标准平板菌落照片；
41.图12(d)、(e)、(f)分别为pbs、无硫碳纳米点(cnds)、s@cnds(5:6)经nir光照处理(808nm，0.8w/cm2，10min)的标准平板菌落照片；
42.图13是经本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)分别在非光照和nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理条件下的mrsa细菌存活率图；
43.图14是经本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)在非光照和nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理条件下的mrsa细菌生长曲线图。
具体实施方式
44.以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
45.实施例1：
46.一种含硫碳纳米点的制备方法，包括如下步骤：
47.步骤1：称取聚乙烯亚胺0.315g于小瓶中用5.26ml甲酰胺(ρ＝1.14g/ml)溶解；再称取无水柠檬酸0.5g置于小瓶中用4.55ml二甲基亚砜(dmsoρ＝1.1g/ml)溶解，将两者混合搅拌，于160℃温度下反应4h；所用dmso与甲酰胺的质量比为5：6；
48.步骤2：将步骤1反应结束后的溶液用截留分子量为1000的透析袋透析，直至透析液的颜色为无色；
49.步骤3：将步骤2透析后的反应液烘干获得含硫碳纳米点(s@cnds(5:6))。
50.实施例2：
51.一种含硫碳纳米点的制备方法，包括如下步骤：
52.步骤1：称取聚乙烯亚胺0.315g于小瓶中用，1.75ml甲酰胺(ρ＝1.14g/ml)溶解,另
外称取无水柠檬酸0.5g置于小瓶中用8.18ml二甲基亚砜(dmsoρ＝1.1g/ml)溶解，将两者混合搅拌，于160℃温度下反应4h；所用dmso与甲酰胺的质量比为9：2；
53.步骤2：将步骤1反应结束后的溶液用截留分子量为1000的透析袋透析，直至透析液的颜色为无色；
54.步骤3：将步骤2透析后的反应液烘干获得含硫碳纳米点(s@cnds(9:2))。
55.实施例3：
56.一种含硫碳纳米点的制备方法，包括如下步骤：
57.步骤1：称取聚乙烯亚胺0.315g于小瓶中用1.82ml二甲基亚砜(dmsoρ＝1.1g/ml)溶解；称取无水柠檬酸0.5g置于小瓶中用7.89ml甲酰胺(ρ＝1.14g/ml)溶解，将两者混合搅拌，于160℃温度下反应4h；所用dmso与甲酰胺的质量比为2：9；
58.步骤2：将步骤1反应结束后的溶液用截留分子量为1000的透析袋透析，直至透析液的颜色为无色；
59.步骤3：将步骤2透析后的反应液烘干获得含硫碳纳米点(s@cnds(2:9))。
60.对比例1：
61.一种含硫碳纳米点的制备方法，包括如下步骤：
62.步骤1：分别称取聚乙烯亚胺0.315g及无水柠檬酸0.5g于小瓶中用10ml二甲基亚砜(dmsoρ＝1.1g/ml)溶解，搅拌后于160℃温度下反应4h；所用dmso与甲酰胺的质量比为11：0；
63.步骤2：将步骤1反应结束后的溶液用截留分子量为1000的透析袋透析，直至透析液的颜色为无色；
64.步骤3：将步骤2透析后的反应液烘干获得含硫碳纳米点(s@cnds(11:0))。
65.对比例2：
66.一种无硫碳纳米点的制备方法，包括如下步骤：
67.步骤1：分别称取聚乙烯亚胺0.315g及无水柠檬酸0.5g于小瓶中用9.65ml甲酰胺(ρ＝1.14g/ml)溶解，搅拌后于160℃温度下反应4h；所用dmso与甲酰胺的质量比为0：11；
68.步骤2：将步骤1反应结束后的溶液用截留分子量为1000的透析袋透析，直至透析液的颜色为无色；
69.步骤3：将步骤2透析后的反应液烘干获得无硫碳纳米点(cnds)。
70.由图1本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的透射电镜图(tem)，可以看出，cnds的颗粒大小为3.0-5.0nm，s@cnds的颗粒大小也为3.0-5.0nm。由此说明，硫元素的掺入没有改变颗粒大小和形貌。
71.由图2本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的x射线能谱仪成分分析图(eds)，可以看出，与cnds相比，s@cnds具有明显的s元素峰，说明s@cnds成功掺入硫元素。
72.由图3本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的zeta电位分布图，可以看出，与cnds相比，s@cnds的电位由-15.1mv变为-19.6mv。上述电位变化说明，掺杂硫元素后，碳纳米点表面的负电荷明显增多。可能的原因是，硫元素的掺杂导致碳纳米点表面修饰了硫酸根，导致负电荷增加。
73.由图4本发明实施例1-3和对比例1-2中不同硫含量的含硫碳纳米点(s@cnds)的紫
外可见分光光谱图，可以看出，在波长近红外区的紫外可见吸收值中，s@cnds(5:6)的吸收值较其他碳纳米点明显增高，说明一定比例硫元素的掺入可以有效提高碳纳米点在近红外区的光吸收性能。
74.由图5本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的荧光光谱图，可以看出，s@cnds的荧光信号最弱，而cnds的荧光信号最强，这一结果说明，硫元素的掺入导致合成的碳纳米点发生了部分的荧光猝灭。
75.本发明进行如下测试：
76.1、含硫碳纳米点(s@cnds)的体外光热转换性能测试
77.取实施例1制得的500μl160μg/ml s@cnds于比色皿中，使用808nm、0.8w/cm2的激光照射10min，记录随照射时间增加，溶液温度的变化，且经过反复多次的光热转换性能测试。
78.图6为本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的体外光热转换性能测试结果图。由图6(a)在808nm、0.8w/cm2条件下cnds和s@cnds进行光照记录溶液温度随时间变化的曲线图，可以看出，与pbs组相比，cnds和s@cnds溶液的温度均随光照时间的延长而显著升高，且s@cnds较cnds温度变化更显著，s@cnds与cnds的温差可达10℃。这一结果充分说明硫元素的掺入，使碳纳米点的近红外光热性能显著升高。
79.由图6(b)s@cnds在不同光照强度下溶液温度随时间的变化曲线，可以看出，随着光照强度的增加，s@cnds溶液的温度明显升高。当光照强度达到1.5w/cm2时，溶液温度在照射10分钟后，可升高45℃。
80.由图6(c)不同浓度的s@cnds溶液在808nm、0.8w/cm2下随时间变化的曲线图，可以看出，在s@cnds浓度为400μg/ml时变化最显著，温差可达37.5℃，这一结果更进一步证实了s@cnds具有良好的近红外光热转换性能。
81.由图6(d)s@cnds的光照开-关温度曲线，可以看出，s@cnds的开-关温度曲线随着光照次数的增加没有发生明显的变化，这进一步证实了s@cnds具有良好且稳定的光热转换性能，可循环、重复使用，保证了光热治疗应用期间的治疗效果。
82.由图7本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)的体外光热成像效果图，可以看出，与cnds相比，s@cnds的温度变化更加显著，这一结果进一步证实了掺入硫元素的s@cnds具有更好的近红外光热转换性能。
83.2、含硫碳纳米点(s@cnds)对耐万古霉素肠球菌(vre)的体外光热抑菌治疗后的荧光染色分析
84.从lb平板上挑取单克隆vre菌株(enterococcus faecalis，atcc51299)到5ml lb培养液中，37℃过夜培养。6000rpm离心收集细菌，并用0.85％的生理盐水洗涤3次后，用生理盐水重悬细菌沉淀后调节od600为0.5。然后分别取250μl的菌液和250μl320μg/ml的含硫碳纳米点(s@cnds)混合后，于37℃培养箱中孵育10min后，进行光照或者非光照处理，所有光照实验均采用激光(808nm，0.8w/cm2)照射10min；处理后用生理盐水清洗两次，6000rpm离心，向处理后的菌液中加入1μl的syto-9/pi混合染料，孵育15min后离心浓缩，浓缩后于荧光显微镜观察并拍照。
85.图8为本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米
点(cnds)分别光热处理后的vre细菌的荧光染色结果图。图8(a)、(b)、(c)分别是pbs、cnds、s@cnds在非光照处理条件下的荧光染色图；图8(d)、(e)、(f)分别是经pbs、cnds、s@cnds在nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理下的荧光染色图。其中，syto-9可以穿过活细菌的细胞壁与dna结合使其显示绿色，而pi只能穿过死细菌不完整的细胞壁，使死的细菌被染成红色。
86.因图片仅能为黑白色，特作如下解释：图(a)和(d)中的细菌(白点部分)均显示明显的绿色，说明经过pbs非光照和光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理后的细菌都是活的；图8(b)中的细菌(白点部分)显示为明显的绿色，这说明cnds本身对vre细菌没有杀伤作用；而图8(e)中的vre细菌(白点部分)显示为小部分红色，这说明cnds在光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理后，小部分vre细菌死亡；图8(c)中的细菌(白点部分)显示明显的绿色，这说明s@cnds本身的杀菌性能低；而图8(f)中的细菌(白点部分)显示全部变成红色，说明s@cnds在光照(808nm，0.8w/cm2，10min)条件下，可杀死大部分的细菌，表明s@cnds对vre细菌具有良好的光热杀灭作用。
87.3、含硫碳纳米点(s@cnds)用于耐万古霉素粪肠球菌(vre)的体外光热抑菌治疗
88.从lb平板上挑取单克隆vre菌株到5mllb培养液中，37℃过夜培养。取菌液，用pbs洗涤3次后，6000rpm、10min离心，调节od600为0.5。然后取250μl菌液与250μlpbs混合，进行光照或者非光照处理。待处理完成后，将菌液与pbs的混合溶液稀释100倍。所有光照实验均采用808nm激光，0.8w/cm2照射10min，所有组均室温孵育10min。取50μl加到lb固体培养基上，涂匀后放于37℃过夜培养。或者，吸取500μl处理后的菌液加入于10mllb培养液中，37℃过夜培养，每小时记录od600的数值。
89.由图9本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)分别光热处理后的vre细菌的标准板计数检测图片，可以看出，cnds和s@cnds在非光照条件下时，与pbs的非光照组和光照组类似，均有大量细菌存活，没有明显的杀灭作用。但是，经过光照处理后，cnds处理后的活细菌略微减少，杀菌效果不明显；而s@cnds处理后的活细菌明显减少，表现出良好的杀菌效果，这与上述s@cnds的光热转化性能测试以及活/死细菌荧光染色的结果高度一致。
90.由图10本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)分别在非光照和nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理条件下的细菌存活率图，可以看出，pbs和cnds在非光照和光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理后的细菌存活率仍然很高，并没有表现出明显的杀菌效果。并且，vre细菌经s@cnds和非光照处理后，也具有很高的存活率。但是，经s@cnds光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理后，vre细菌的死亡率能够达到99％以上。上述结果说明，s@cnds具有良好的近红外光热杀菌效果。
91.由图11本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)在非光照和nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理条件下的细菌生长曲线图，可以看出，pbs、无硫碳纳米点(cnds)分别在非光照和光照(808nm，0.8w/cm2，10min)条件下均没有明显的抑菌效果。s@cnds(5:6)在非光照条件下也没有明显的抑菌效果，但经过808nm、0.8w/cm2照射10min后出现明显抑菌效果。上述结果表明，s@cnds(5:6)对vre细菌具有良好的光热杀菌性能。
92.4、含硫碳纳米点(s@cnds)用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的体外光热抑
菌治疗
93.从lb平板上挑取单克隆mrsa菌株(staphylococcus aureus，atcc700698)到5mllb培养液中，37℃过夜培养。取菌液，用pbs洗涤3次后，6000rpm、10min离心，调节od600为0.5。然后取250μl菌液与250μlpbs混合，进行光照或者非光照处理。待处理完成后，将菌液与pbs的混合溶液稀释100倍。所有光照实验均采用808nm激光，0.8w/cm2照射10min，所有组均室温孵育10min。取50μl加到lb固体培养基上，涂匀后放于37℃过夜培养。或者，吸取500μl处理后的菌液加入于10ml lb培养液中，37℃过夜培养，每小时记录od600的数值。
94.由图12本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)分别光热处理后的mrsa细菌的标准板计数检测图片，可以看出，cnds和s@cnds在非光照条件下时，与pbs的非光照组和光照组类似，均有大量细菌存活，没有明显的杀灭作用。但是，经过光照处理后，cnds处理后的活细菌略微减少，杀菌效果不明显；而s@cnds处理后的活细菌明显减少，表现出良好的杀菌效果，这与上述s@cnds的光热转化性能测试以及活/死细菌荧光染色的结果高度一致。
95.由图13本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)分别在非光照和nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理条件下的细菌存活率图，可以看出，pbs和cnds在非光照和光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理后的细菌存活率仍然很高，并没有表现出明显的杀菌效果。并且，mrsa细菌经s@cnds和非光照处理后，也具有很高的存活率。但是，经s@cnds光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理后，mrsa细菌的死亡率能够达到99％以上。上述结果说明，s@cnds具有良好的近红外光热杀菌效果。
96.由图14本发明实施例1合成的含硫碳纳米点(s@cnds)和对比例2合成的无硫碳纳米点(cnds)在非光照和nir光照(808nm，0.8w/cm2，10min)处理条件下的细菌生长曲线，可以看出，pbs、无硫碳纳米点(cnds)分别在非光照和光照(808nm，0.8w/cm2，10min)条件下均没有明显的抑菌效果。s@cnds(5:6)在非光照条件下也没有明显的抑菌效果，但经过808nm、0.8w/cm2照射10min后出现明显抑菌效果。上述结果表明，s@cnds(5:6)对mrsa细菌具有良好的光热杀菌性能。
97.由此可见，本发明提供的一种含硫碳纳米点(s@cnds)的制备方法，通过添加二甲基亚砜(dmso)，在碳纳米点合成过程中成功掺入硫元素，形成s@cnds，合成步骤简单，光热转换效率高、稳定性好；合成的含硫碳纳米点(s@cnds)与无硫cnds相比，其在近红外区域的吸收峰显著增强，光热转换效率也显著提高。使含硫碳纳米点(s@cnds)成为一种价格低廉、生物相容性好且光热转化效率高的光热材料，可用于耐万古霉素肠球菌等多种耐药菌的光热治疗中，效果显著。
98.可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的实施例1的限制，所有落入本技术的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。