一种石墨相氮化碳/银杂化纳米复合SERS基底的制备方法及其外泌体的检测应用

本发明涉及一种sers基底的制备方法，尤其是涉及一种石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底的制备方法及其外泌体的检测应用。

背景技术：

1、表面增强拉曼散射(surface enhanced raman scattering，sers)技术是在单分子水平上探测分子光谱信号的有力工具，由于具有非破坏性、非接触、可重复性、高灵敏度、分子特异性等优点，sers技术在医学、生物和食品等多种领域逐渐得到广泛应用。特别是，通过与纳米材料的结合，sers技术可以应用于新型癌症标志物外泌体的检测，但是，sers检测的准确性与sers基底材料的选择至关重要。一般来说，基底的选择主要是金、银等贵金属材料，譬如，贵金属纳米粒子具有更多的电磁“热点”而成为sers技术的最佳候选之一，但是大多数的贵金属纳米材料都具有生物毒性，容易氧化等缺点；而g-c3n4、mos2等二维半导体材料却具有理想的稳定性、较好的抗氧化性和潜在的生物相容性，但是与贵金属纳米材料相比又存在着增强倍数低的缺点。近年来，贵金属和半导体所形成的纳米复合材料由于兼具二者的优势逐渐成为sers领域的研究焦点。然而，sers基底合成时所使用的一锅法等传统方法存在耗时，设备要求高，需要耐高温高压的钢材，耐腐蚀的内衬、技术难度大、温压控制严格、成本高、安全性差、加热时密闭反应釜中流体体积膨胀，能够产生极大的压强，存在极大的安全隐患，并且无法观察晶体生长和材料合成的过程，不直观等缺点，因此迫切需要开发更多的基底合成策略对基底形状、分布和密度进行精确控制，从而提高sers基底的拉曼强度。

2、外泌体(exosome)是由细胞内多泡体(multivesicular body，mvb)与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。它是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mrna和microrna等物质。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液及乳汁等体液中，通过循环系统到达其它细胞与组织，产生远程调控作用。因此，外泌体可作为肿瘤诊断标记物。目前对外泌体的研究在很大程度上依赖于分析候选生物标志物，即特定的蛋白质或核酸。但是这种方法可能会错过一些尚未鉴定的重要生物标志物，因此亟需开发替代方法以实现对外泌体的直接检测。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种显著提高拉曼强度的石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底的制备方法及其外泌体的检测应用。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)采用酸刻蚀法制备g-c3n4纳米片

4、将块状石墨相氮化碳g-c3n4加入到浓盐酸中制成浓度为5/3毫克/毫升悬浊液，将配制好的悬浊液超声处理直至溶液变成乳白色，将乳白色的悬浊液转移到特氟龙容器中，在80℃条件下反应12小时后，进行离心分离，用去离子水洗涤数次后收集上清液，即得到g-c3n4纳米片溶液；

5、(2)采用电化学沉积法制备cu/g-c3n4纳米片基底

6、在步骤(1)得到的g-c3n4纳米片溶液中逐滴滴加浓度为50-250毫克/毫升的聚醚酰亚胺(pei)水溶液，在超声处理下完全混合，在每分钟150转下连续搅拌12小时，离心洗涤后收集沉淀物，将沉淀物溶于无水乙醇使其浓度为0.5-1.0毫克/毫升，再加入1-5毫摩尔的氯化铝加速g-c3n4纳米片的电沉积，电沉积过程采用双电极体系：铂片为阳极，铜片为阴极(铜片分别用丙酮、乙醇、去离子水多次清洗)，在33v电压下阴极电沉积60-300秒，即得到cu/g-c3n4纳米片基底；

7、(3)采用电化学还原法制备cu/g-c3n4/ag杂化纳米复合sers基底

8、将步骤(2)制备得到的cu/g-c3n4纳米片基底作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂片作为对电极，将含0.1-0.7毫摩尔每毫升硝酸银和0.65-2.6毫摩尔每毫升柠檬酸的水溶液作为电解液，将沉积电压控制在-0.2v至-1.4v，沉积时间控制在15-75s，进行电化学反应，即得到石墨相氮化碳/银(cu/g-c3n4/ag)杂化纳米复合sers基底。

9、上述方法制备的石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底检测癌症标志物外泌体的方法，具体步骤如下：将50μl待测外泌体样液滴到石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底上并风干，直到液体溶液消失外泌体被捕获在sers基底上，采用532nm激光波长的拉曼激光器作为激发源，对待测样液进行检测。若细胞发生病变则外泌体表面的蛋白会磷酸化导致磷蛋白内的p-o键发生震动，便会在1087cm-1处出现sers峰，若细胞没有发生病变则外泌体表面的蛋白不会磷酸化，磷蛋白内的p-o键也不会发生震动，在1087cm-1处便观测不到相应的sers峰。因此，根据这一特征我们可以很容易对癌症患者和健康人进行区分。

10、进一步，所述的拉曼激光器的激光光斑直径为12.5微米，数值孔径为0.55，激光功率设置为1mw，积分时间为10s。

11、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底的制备方法及其外泌体的检测应用，该新型复合纳米sers基底。首先，通过酸化处理和电化学沉积的方式制备了cu/g-c3n4纳米片基底，其次通过电化学还原的方式制造了cu/g-c3n4/ag复合纳米sers基底。其中，g-c3n4纳米片结构具有极大的比表面积，可以更好的吸附和浓缩目标分子并且其所具有的π共轭层状结构可以提供较高的电荷转移效率，而银纳米晶体的存在也会因为局部表面等离子体共振(lspr)而极大的增强拉曼信号，可以进一步提高对待测物质的检测。通过监测外泌体内蛋白磷酸化过程，尤其是在1087cm-1处由磷蛋白内的p-o键产生的外泌体的sers强度作为一个判断依据，初步实现了对癌症的大范围筛查。

12、综上所述，本发明一种石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底的制备方法及其外泌体的检测应用，通过电化学方法实现对基底形状、分布和密度进行精确控制，而使得g-c3n4纳米片和银颗粒结合紧密，有利于富集拉曼分子，并且g-c3n4具有化学增强拉曼信号的作用，在双重作用下获得更灵敏的检测结果，降低拉曼检测极限，进一步推动sers在外泌体实际检测中的应用和发展。

技术特征：

1.一种石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.一种利用权利要求1所述方法制备的石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底检测癌症标志物外泌体的方法，其特征在于具体步骤如下：将50μl待测外泌体样液滴到石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底上并风干，直到液体溶液消失外泌体被捕获在sers基底上，采用532nm激光波长的拉曼激光器作为激发源，对待测样液进行检测。

3.根据权利要求2所述的利用石墨相氮化碳/银杂化纳米复合sers基底检测癌症标志物外泌体的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于：所述的拉曼激光器的激光光斑直径为12.5微米，数值孔径为0.55，激光功率设置为1mw，积分时间为10s。

技术总结
本发明公开了一种石墨相氮化碳/银杂化纳米复合SERS基底的制备方法及其外泌体的检测应用，特点是包括采用酸刻蚀法制备g‑C<subgt;3</subgt;N<subgt;4</subgt;纳米片的步骤；采用电化学沉积法制备Cu/g‑C<subgt;3</subgt;N<subgt;4</subgt;纳米片基底的步骤；最后将Cu/g‑C<subgt;3</subgt;N<subgt;4</subgt;纳米片基底作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片作为对电极，将含0.1‑0.7毫摩尔每毫升硝酸银和0.65‑2.6毫摩尔每毫升柠檬酸的水溶液作为电解液，将沉积电压控制在‑0.2V至‑1.4V，沉积时间控制在15‑75s，进行电化学反应，即得到石墨相氮化碳/银杂化纳米复合SERS基底的步骤；优点是极大的增强拉曼信号，进一步提高对待测物质的检测。

技术研发人员：姜涛,赵佳龙
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11