一种碳点稳定的过氧化铜的制备方法及应用

本发明属于纳米材料的制备及应用领域，具体涉及一种碳点稳定的过氧化铜(cuo2@cd)的制备方法及其在抗肿瘤治疗方面的应用。

背景技术：

1、癌症严重威胁人类的生命健康。传统的癌症治疗手段包括手术、化疗和放疗。由于特异性较差，这些治疗方法往往会对正常组织造成损伤，从而导致严重的副作用。光热疗法(ptt)得益于近红外激光的强大穿透能力，可实现对深层肿瘤的精准治疗，在不损伤正常细胞的同时实现深层肿瘤的消融，具有副作用小的优势。化学动力学治疗(cdt)通过将肿瘤细胞内源性过氧化氢转化为强细胞毒性的 •oh来杀死肿瘤细胞，可特异性杀伤深部肿瘤。然而肿瘤区域处于乏氧状态，且内源性过氧化氢含量有限，使化学动力学治疗受限。此外，肿瘤区域高水平的谷胱甘肽再次削弱了•oh的作用。因此现在迫切需要一种能够改善肿瘤乏氧，过氧化氢有限，高谷胱甘肽水平的纳米材料来增强光热治疗 (ptt) 和化学动力学治疗(cdt) 在抗肿瘤领域的应用。

2、有学者利用铜离子和过氧化氢在氢氧根离子辅助下的络合作用制备得到过氧化铜纳米粒子。该过氧化铜纳米粒子具有酸响应的特点，可在弱酸性条件下分解释放过氧化氢和具有类芬顿催化活性的铜离子，所伴随发生的类芬顿反应可有效生成羟基自由基，从而高效杀伤细胞，显示出很好的肿瘤化学动力学疗效（j. am. chem. soc. 2019, 141,25, 9937–9945）。

3、碳点(carbon dots,cds)是一种新型的碳纳米材料，具有光热性、生物相容性、渗透性、低毒性等优点，近年来，研究者们利用碳点的光热特性，将碳点用于抗菌治疗（cn113549448a、cn117208893a），或与光动力和光热治疗相结合（cn110339357a、cn110151995a）成为新型光热治疗的有效的、副作用小的光治疗光敏剂。

4、然而，现有的过氧化铜水相分散性较差，为提高过氧化铜分散性差，光热性能有限的问题，本发明将过氧化铜负载碳点是一种可行的策略。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术的不足，提供了一种碳点稳定的过氧化铜的制备方法及应用。由柠檬酸，尿素水热合成的碳点，再经丙酮处理后在碱性条件下原位合成过氧化铜得到碳点稳定的过氧化铜(cuo2@cd)。cuo2@cd的粒径大小均一，具有优秀的光热性能，酸环境产氧性能，类过氧化物酶 (pod-like) 活性，类谷胱甘肽氧化酶 (gshox-like) 活性。在癌症的光热治疗及化学动力学治疗中具有可观的应用潜能。

2、为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种碳点稳定的过氧化铜的制备方法，具体包括如下步骤：

4、（1）将柠檬酸和尿素超声分散在去离子水中，加入水热合成釜中，水热反应得到溶液ⅰ；往溶液ⅰ中加入数倍体积丙酮，离心分离沉淀，得到cd。

5、其中，柠檬酸和尿素的物质的量之比为1~2：0.5~1。水热合成反应的温度为100~200 ºc，时间为3~12 h。向溶液ⅰ中加入丙酮的体积为溶液ⅰ的2~5倍。

6、这里的柠檬酸也可以是叶酸、氨基酸等水溶性有机弱酸，尿素也可以是硫脲、乙二胺等二元胺。

7、（2）将步骤（1）得到的cd分散在去离子水中，得到cd分散液，加入适量铜盐溶液搅拌，并用氢氧化钠调节ph为碱性，得到溶液ⅱ。

8、其中，铜盐与cd的质量比为0.01-0.1：1，用氢氧化钠调节溶液ⅱ的ph到8~10。这里的铜盐可以是氯化铜、硝酸铜、硫酸铜等。

9、优选的，cd分散液与铜盐溶液的体积比为1:1。

10、（3）在冰浴中向溶液ⅱ中加入过氧化氢溶液并搅拌一定时间得到溶液ⅲ。

11、其中，过氧化氢必须要在冰浴下滴加，过氧化氢的终浓度为200~500 mm。搅拌时间为0.5~3 h。

12、（5）将溶液ⅲ透析纯化，离心分离沉淀得到碳点稳定的过氧化铜。

13、其中，透析时间为12~24 h。

14、本发明还提供了上述cuo2@cd在抗肿瘤治疗中的应用。经过丙酮处理后，cd的光热性能显著增强，使cuo2@cd具有优秀的光热效应。此外，在cd原位合成的过氧化铜可在肿瘤弱酸环境下分解为过氧化氢和铜离子，过氧化氢不仅可在酸性条件下继续分解产生的氧气并帮助改善肿瘤乏氧环境，还可被铜离子的类过氧化物酶活性催化形成•oh，实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。最后铜离子可氧化谷胱甘肽并降低其含量，实现化学动力学治疗效果增强。综合以上性能，cuo2@cd在ptt和cdt抗肿瘤治疗中具有可观的应用潜力。

15、本发明提供的cuo2@cd的光热性能是通过用热成像仪检测其在808 nm激光照射下的升温情况来评价的。在5 min内，500 μg/ml cuo2@cd在808 nm激光照射下从15°c升高至60.0°c。而对于没有经过丙酮处理得到的cuo2@cd*以及单独的纳米cuo2在相同的条件下分别升温至48.3°c和38.3°c，说明经过负载碳点和丙酮的处理，cuo2@cd的光热性能得到大幅度增强，具有良好的ptt潜力。

16、本发明提供的cuo2@cd的酸环境下产氧能力是通过用便携式溶氧仪检测ph6.5下cuo2@cd水溶液的氧气含量来评价的。500 μg/ml cuo2@cd在20 min内可使体系中的氧气含量从2 mg/l上升至11 mg/l。说明cuo2@cd在弱酸性条件下产生大量氧气，这有利于cuo2@cd改善肿瘤乏氧环境。

17、本发明提供的cuo2@cd的类过氧化物酶活性是通过羟基自由基检测试剂亚甲基蓝(mb) 检测结果来评价的。向含有mb的醋酸缓冲液中加入谷胱甘肽，控制谷胱甘肽终浓度为100 μm，之后向混合溶液中加入cuo2@cd并控制浓度为100 μg/ml，待反应10 min后，检测溶液在波长650 nm的吸收。cuo2@cd可在短时间内将mb在650 nm的吸收消除，说明大量 •oh产生，体现了cuo2@cd在化学动力学治疗中的应用潜力。

18、本发明提供的cuo2@cd的类谷胱甘肽氧化物酶活性是通过检测不同反应时间下，200 μm谷胱甘肽体系中谷胱甘肽检测试剂dtnb的紫外特征吸收变化来衡量的。100 μg/ml的cuo2@cd可在120 min内将体系中的gsh清除殆尽，体现了优秀的类谷胱甘肽氧化酶活性，这有助于缓解肿瘤微环境过度表达的谷胱甘肽的并提高化学动力学治疗效果。

19、本发明的有益效果：

20、本发明通过水热合成法合成柠檬酸尿素碳点 (cd)，又通过丙酮处理，使cd的光热性能得到大幅度提升。与纳米过氧化铜相比，负载碳点后的过氧化铜在水溶液中不易聚沉，具有较好的分散性。cuo2@cd光热性能显著提高，可在更低的浓度下获得良好的光热性能，从而降低高浓度过氧化铜对机体的毒性。在冰浴中原位合成的过氧化铜使cuo2@cd具有均一的粒径，氯化铜和cd的质量比为1：10，搅拌时间为2 h时cuo2@cd具有最佳的类酶活性。cuo2@cd可在肿瘤弱酸环境下分解为铜离子和过氧化氢，过氧化氢既可以继续分解为氧气以改善肿瘤乏氧环境，又可以被铜离子催化产生毒性极强的 •oh来杀死肿瘤细胞。最后，铜离子可以氧化gsh成gssg，减弱肿瘤细胞的抗氧化应激能力，实现化学动力学的治疗效果的增强。