由hlaii类分子呈递的mage－a1肽的制作方法

专利名称：由hlaii类分子呈递的mage－a1肽的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及与HLA II类分子结合并呈递给T淋巴细胞的与肿瘤相关的基因产品MAGE-A1的片段。肽，编码这种肽的核酸分子，以及相关的抗体和CD4+T淋巴细胞的应用，尤其在诊断和治疗中。
对外源抗原反应的T细胞包括溶细胞性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞。当被激活时，CD8+细胞毒性或溶细胞性T细胞(CTL)是裂解呈递由HLA I类分子呈递的适当抗原的细胞的T细胞。CD4+辅助性细胞是分泌细胞因子刺激巨噬细胞和抗原呈递B细胞的T细胞，巨噬细胞和抗原呈递B细胞在它们的表面由HLA II类分子呈递适当的抗原。
T细胞识别相异物质的机理也与癌症有牵连。已有描述大量的溶细胞性T细胞(CTL)克隆体抵抗自体同源恶性黑素瘤。在一些情况中，这些克隆体识别的抗原已经定性。免疫遗传学40360-369(1994)中，De Plaen等人对“MAGE”家族进行了描述，这是编码肿瘤特异抗原的基因的家族。(参看PCT申请PCT/US92/04354，1992年11月26日公开。)这些基因的表达产品加工成肽，肽反过来在细胞表面呈递。这样可导致特异CTL裂解肿瘤细胞。编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子的基因，从这些基因衍生的肽称为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。参看Traversari等人的免疫遗传学35145(1992)；Van der Bruggen等人，科学2541643(1991)，查找这个家族基因的更进一步的信息，同样，参看美国专利No，5,342,774。
在美国专利5,405,940中，描述MAGE九肽由HLA-A1分子呈递。假设已知具体肽对具体HLA分子的特异性，人们应能预计具体肽结合一个HLA分子，但不与其他结合。这一点很重要，因为不同的个体拥有不同的HLA显型。因此，虽然辨别具体肽是特异HLA分子的伙伴有诊断和治疗两个结果，但是仅与具有具体HLA显型的个体相关。这就需要在这个领域作进一步的工作，因为细胞异常对一种具体HLA显型不是限制性的，针对性的治疗需要一些有关异常细胞的显型的知识。
在美国专利5,591,430中，描述了由HLA-A2分子呈递的其他分离的MAGE-A3肽。因此，已知的TRAP可以产生多种TRA。
在前述文献中描述了由HLA-I类分子呈递的肿瘤排斥抗原的分离和/或定性。这些TRA可以诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和增殖，CD8细胞毒性T淋巴细胞可识别表达编码TRA的与肿瘤相关的基因(如MAGE基因)的肿瘤细胞。
在抗肿瘤免疫性方面，CD4+T淋巴细胞(辅助性T细胞)的重要性已在动物模型中得到演示，其中这些细胞不仅起到合作性的和效应子功能，而且还在维持免疫记忆方面具有重要性(Topalian评论，免疫学当前观点，6741-745，1994)。并且，几项研究支持较差的肿瘤特异免疫性是由于不充分的辅助性T细胞的激活作用的论点。
目前已经证实，MAGE-A3和和酪氨酸酶编码由HLA II类分子呈递以刺激CD4+T淋巴细胞的肽(PCT/US98/18601；Topalian等人，1994年；Yee等人，免疫学期刊，1574079-4086，1996年；Topalian等人，实验医学期刊，1831965-1971，1996年)。
就象许多癌症相关抗原一样，MAGE-A3和酪氨酸酶仅表达在有限百分比的肿瘤中以及表达在某些种类的肿瘤中。并且，MAGE-A3和酪氨酸酶MHC II类结合肽是HLA-限制性肽，仅通过表达具体HLA分子的细胞来识别。
因此，有许多患者不能从包括通过预先描述过的MAGE-A3和酪氨酸酶肽对辅助性T细胞的刺激作用的任何治疗中受益，或者因为患者的肿瘤不表达MAGE-A3和酪氨酸酶，或者因为患者不表达呈递MAGE-A3或酪氨酸酶肽的适当的HLA分子。因此，需要辨别包含由MHC II类分子呈递的及由CD4+T淋巴细胞识别的表位的其他与肿瘤相关的抗原。
本发明的简述现在已经发现，MAGE-A1基因编码是HLA II类结合肽的其他肿瘤排斥抗原。这些肽，当由呈递具有HLA II类分子的细胞的抗原呈递时，可有效地诱导CD4+T淋巴细胞的激活和增殖。
本发明提供结合HLA II类分子的分离的MAGE-A1肽，和这种肽的功能变体，功能变体包括MAGE-A1肽序列中一个或多个氨基酸添加，替换或缺失。本发明还提供编码这种肽的分离核酸分子，包含这些核酸分子的表达载体，用这些核酸分子转染的宿主细胞，和这些肽和肽和HLA II类抗原呈递分子的复合体的抗体。本发明还提供识别肽和HLA II类抗原呈递分子的复合体的T淋巴细胞。本发明还提供包含前述分子的试剂盒和疫苗组合物。前述物质可使用在诊断和治疗特点在于表达MAGE-A1的病况中。因为众所周知，包括MAGE相关基因的多肽和核酸的MAGE家族的成员具有序列同一性和功能的同源性(如，象治疗抗原和前体)，本发明除了MAGE-A1还包括从MAGE和MAGE-A1家族的成员衍生的结构相关的HLA结合肽。如，本文公开的与MAGE-A1肽相似的氨基酸序列也在MAGE-A4蛋白质中发现。因此，可以理解，包含本文的MAGE-A1 HLA II类结合肽，含有这种肽的组合物，和鉴别及使用这种肽的方法的公开内容也适用于MAGE肿瘤相关抗原家族的其他成员。
依据本发明的一个方面，提供了分离的MAGE-A1 HLA II类结合肽，包括结合HLA II类分子的SEQ ID NO2的氨基酸序列的片段，或包括一个或多个氨基酸的添加，替换或缺失的它们的功能变体。在本发明的这个方面中，MAGE-A1 HLA II类结合肽不包括完整的MAGE-A1蛋白质。在一个实施方案中，分离的肽包括SEQ ID NO7的氨基酸序列，或它的功能变体。在某些实施方案中，分离的HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，和SEQ ID NO7。在优选的实施方案中，分离的肽包括一种前述氨基酸序列。在某些实施方案中，分离的肽包括内体导向信号，优选的是人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。在本发明的其他实施方案中，分离的HLA II类结合肽是不可水解的，优选的不可水解的肽是从下列组中选取的，包括包括D-氨基酸的肽，包括-psi[CH2NH]-还原的酰胺肽键的肽，包括-psi[COCH2]-酮亚甲基肽键的肽，包括-psi[CH(CN)NH]-(氰亚甲基)氨基肽键的肽，包括-psi[CH2CH(OH)]-羟基乙烯基肽键的肽，包括-psi[CH2O]-肽键的肽，包括-psi[CH2S]-硫代亚甲基肽键的肽。
依据本发明的另一个方面，提供了包含分离的MAGE-A1HLA I类结合肽和分离的MAGE-A1 HLA II类结合肽的组合物。在某些实施方案中，MAGE-A1 HLA I类结合肽和MAGE-A1 HLA II类结合肽组合为多面体多肽。在其他实施方案中，在组合物中分离的MAGE-A HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或其功能变体。优选地，组合物中的分离的MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，和SEQ ID NO7。更优选的，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，和SEQ ID NO7。在前述的组合物的某些实施方案中，分离的MAGE-A1 II类结合肽包括内体导向信号。优选地，内体导向信号包括人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
根据本发明的另一个方面，提供了编码任何前述HLA II类结合肽的分离的核酸。关于本发明的这个方面，核酸分子不编码全部MAGE-A1蛋白质。核酸分子可以编码HLA II类结合肽和一个或多个氨基酸；优选地，这些氨基酸是与HLA II类结合肽邻接的MAGE-A1氨基酸。因此，编码1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或更多氨基酸到优选地比从HLA II类结合肽的末端到MAGE-A1蛋白质的氨基末端和/或羧基末端少一个氨基酸的氨基酸的核苷酸序列，可加入到编码MAGE-A1 HLA II类结合肽的核酸分子的一个末端或两个末端。优选地，核酸包括SEQ ID NO12。
依据本发明的另一个方面，提供了表达载体。表达载体包括任何可操作地与启动子结合的前述分离的核酸。在优选的实施方案中，核酸包括SEQ ID NO12。在其他实施方案中，表达载体进一步包括编码HLA DRB1*15分子的核酸。
依据本发明的另一个方面，提供了用任何前述表达载体转染或转化的宿主细胞。表达HLA-DRB1*15分子的，用任何前述载体转染或转化的宿主细胞也提供了。
依据本发明的另一个方面，提供了选择性地增加含有对MAGE-A1 HLA II类结合肽特异的CD4+T淋巴细胞的T淋巴细胞群的方法。方法包括将分离的T淋巴细胞与以能选择性地增加含有CD4+T淋巴细胞的T淋巴细胞群的充足量的呈递MAGE-A1 HLA II类结合肽和HLA II类分子的复合体的试剂相接触。在某些实施方案中，试剂是呈递与MAGE-A1蛋白质或其HLA II类结合肽片段相接触的细胞的抗原。在优选的实施方案中，HLA II类分子是HLA DRB1*15分子，MAGE-A1HLA II类结合肽是具有氨基酸序列SEQ ID NO7，或其功能变体的肽。更优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的氨基酸序列。在前述方法的某些实施方案中，分离的MAGE-A1蛋白质或其HLA II类结合肽包括内体导向信号，优选地，内体导向信号包括人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
依据本发明的一个其他方面，提供了诊断特点在于表达MAGE-A1的病变。方法包括将从受试体分离的生物样品与对MAGE-A1 HLA II类结合肽特异的试剂相接触，确定试剂和MAGE-A1 HLA II类结合肽之间的相互作用来确定病变。在一些实施方案中，生物样品是如用肿瘤细胞裂解物承载的树状细胞。在某些实施方案中，肽包括SEQ ID NO7氨基酸序列，或其功能变体。在优选的实施方案中，MAGE-1 HLA II类结合肽是包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQID NO7的任何氨基酸序列的肽。更优选地，MAGE-A1 HLAII类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7。
依据本发明的另一个方面，提供了诊断特点在于表达了与HLA II类分子形成复合体的MAGE-A1 HLA II类结合肽的病变的方法，方法包括将从受试体分离的生物样品与结合复合体的试剂相接触；确定复合体和试剂之间的结合来确定病变。在一些实施方案中，HLA II类分是HLA DRB1*15分子，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或其功能变体。优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽是包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的任何氨基酸序列的肽。更优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7。
在本发明的另一个方面中，提供了治疗患有特点在于表达MAGE-A1的病变的受试体的方法。方法包括给受试体服用足以改善病变的量的MAGE-A1 HLA II类结合肽。在某些实施方案中，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ IDNO7，或其功能变体。优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽是包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ IDNO7的任何氨基酸序列的肽。更优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQID NO7。在某些实施方案中，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括内体导向信号，优选地，是人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
依据本发明的另一个方面，提供了治疗患有特点在于表达MAGE-A1的病变的受试体的方法。方法包括给受试体服用足以改善病变的量的MAGE-A1 HLA I类结合肽和MAGE-A1HLA II类结合肽。在某些实施方案中，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或其功能变体。优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽是包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的任何氨基酸序列的肽。更优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7。在前述方法的某些实施方案中，MAGE-A1 HLA II类结合肽和MAGE-A1 HLAII类结合肽组合成多面体多肽。在其他实施方案中，MAGE-A1HLA II类结合肽包括内体导向信号，优选地，是人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
依据本发明的另一个方面，提供了治疗患有特点在于表达MAGE-A1的病变的受试体的方法。方法包括给受试体服用足以改善病变的量的能在受试体中选择性地增加HLA II类分子和MAGE-A1 HLA II类结合肽的复合体的存在量的试剂。优选地HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子。在某些实施方案中，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或其功能变体。优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽是包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的任何氨基酸序列的肽。更优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7。在某些实施方案中，试剂包括MAGE-A1 HLA II类结合肽。优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括内体导向信号，优选地，内体导向信号包括人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
在本发明的另一个方面中，提供了治疗患有特点在于表达MAGE-A1的病变的受试体的方法。方法包括给受试体服用足以改善病变的量的自身CD4+T淋巴细胞，其中CD4+T淋巴细胞对HLA II类分子和MAGE-A1 HLA II类结合肽的复合体特异。优选地HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子。在某些实施方案中，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或其功能变体。优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽是包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的任何氨基酸序列的肽。更优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ IDNO7。
依据本发明的另一个方面，提供了分离的多肽。分离的多肽选择性地结合包括MAGE-A1 HLA II类结合肽的表位，优选地结合包括SEQ ID NO7的表位，只要分离的多肽不是HLA II类分子。在某些实施方案中，分离的多肽是抗体，优选地是单克隆抗体。在其他实施方案中，分离的多肽是从下列组中选取的抗体片段，包括Fab片段，F(ab)2片段或包括对MAGE-A1 HLAII类结合肽有选择性的CDR3区域的片段。
依据本发明的另一个方面，提供了分离的CD4+T淋巴细胞。分离的CD4+T淋巴细胞选择性地结合HLA II类分子和MAGE-A1 HLA II类结合肽的复合体。优选地，HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子。在一些实施方案中，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或其功能变体。优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽是包括氨基酸序列SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的任何氨基酸序列的肽。优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7。
依据本发明的另一个方面，提供了分离的抗原呈递细胞。分离的抗原呈递细胞包括HLA II类分子和MAGE-A1 HLA II类结合肽的复合体。优选地，HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子。在某些实施方案中，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或其功能变体。在优选的实施方案中，MAGE-A1 HLA II类结合肽是包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的任何氨基酸序列的肽。更优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7。
依据本发明的另一个方面，提供了鉴别MAGE-A1 HLA II类结合肽的功能变体的方法。根据的这种方法，选取出MAGE-A1 HLA II类结合肽，结合MAGE-A1 HLA II类结合肽的HLA II类结合分子，和接受由HLA II类结合分子呈递的MAGE-A1 HLAII类结合肽刺激的T细胞。将MAGE-A1 HLA II类结合肽的第一氨基酸残基诱变制备变体肽。然后确定变体肽与HLA II类分子的结合以及对T细胞的刺激作用，其中变体肽与HLA II类结合分子结合并且由HLA II类结合分子呈递的变体肽对T细胞的刺激作用说明变体肽是功能变体。在优选的实施方案中，MAGE-A1HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7。更优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽是包括氨基酸序列SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的任何氨基酸序列的肽。更优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7。在某些实施方案中，方法进一步包括比较MAGE-A1 HLA II类结合肽对T细胞的刺激作用和功能变体对T细胞的刺激作用的步骤，来确定功能变体对T细胞刺激作用的有效性。在其他实施方案中，方法包括使用变体肽作为底物重复鉴别功能变体的过程。这些方法包括诱变MAGE-A1 HLA II类结合肽的第二氨基酸残基(而不是诱变变体肽)来制备第二变体肽。然后对于第一变体肽确定第二变体肽与HLA II类结合分子的结合和对T细胞的刺激作用。使用第二变体肽等等可将这个过程重复，只要每次测定到功能。每次重复产生与底物肽有一个氨基酸不同的变体肽。其中在每次重复中多于一个氨基酸残基发生突变的其他方法也包括在本发明中。这样的方法也包括确定肽功能的步骤，如HLA II类结合分子和/或刺激T细胞。
本发明还提供了含有上面或说明书全文中所描述的任何一种或多种药剂的药物制备品。这种制备品可以包括药物可接受的稀释剂载体或赋形剂。
本发明还提供了在制备药剂中使用前述组合物，肽和核酸，特别是在治疗癌症的药剂中。
本发明的这些和其他目的在本发明的详细描述中将进行更详细的描述。
本发明示图的简单描述

图1是用来获得抗-MAGE-A1 CD+4T细胞克隆体的过程总图。重组MAGE-A11蛋白质在E.Coli中制备，重组MAGE-A12蛋白质在Sf9昆虫细胞中制备。
图2演示了克隆体14识别由HLA-DR呈递的MAGE-A1表位。将LB650-EBV-B细胞在10ug/毫升在E.Coli中制备的重组MAGE-A11蛋白质中温育。在圆底微型培养皿中，在没有单克隆抗体[mAb](培养基)存在的情况下，或在mAb W6/32(抗-HLA-A，B，C)或2B6(抗-HLA-DR)存在的情况下，将克隆体14(约3000个细胞)与约10,000EBV-MAGE-A1温育18个小时。在上清液中通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)测定IFN-γ的产生。
图3描述了克隆体14识别筛查MAGE-A1肽。在加入约3000个细胞的克隆体14前用5ug/毫升的肽脉冲自身EBV-B细胞(约每个微型培养皿上10,000个)两个小时。共培养18小时后，在上清液中通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)测定IFN-γ的产生。
图4显示了克隆体14识别肽EYVIKVSARVRF(SEQ IDNO7)和其他MAGE-A1肽。
在图4A中，在加入约3000个细胞的克隆体14前用5ug/毫升的肽脉冲自身EBV-B细胞(约每个微型培养皿上10,000个)两个小时。共培养18小时后，在上清液中通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)测定IFN-γ的产生。使用的肽是VKVLEYVIKVSARVRF(SEQ ID NO3)；EYVIKVSARVRFFFPS(SEQ ID NO4)；ETSYVKVLEYVI(SEQ ID NO5)；VKVLEYVIKVSA(SEQ ID NO6)；EYVIKVSARVRF(SEQ IDNO7)；KVSARVRFFFPS(SEQ ID NO8)；RVRFFFPSLREA(SEQ ID NO9)；FFPSLREAALRE(SEQ ID NO10)；和LREAALREEEEGV(SEQ ID NO11)。
在图4B中，将自身EBV-B细胞(约每个微型培养皿上10,000个)与不同浓度的肽温育2小时。然后将克隆体14(3000个细胞)与肽脉冲的细胞共培养20个小时。在上清液中通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)测定IFN-γ的产生。使用的肽是VKVLEYVIKVSARVRF(SEQ ID NO3)；EYVIKVSARVRFFFPS(SEQ ID NO4)；和EYVIKVSARVRF(SEQ ID NO7)。
本发明的详细描述本发明提供了由HLA II类分子呈递的分离的MAGE-A1肽，该种肽刺激CD4+T淋巴细胞的增殖和激活。这种肽本文称为“MAGE-A1 HLA II类结合肽”，“HLA II类结合肽”和“MHCII类结合肽”。MGAE-A1(SEQ ID NO1和2)也称为MAGE-1。因此，本发明的一个方面是包括氨基酸序列SEQ ID NO7的分离的肽。使用除了由I类呈递的肽外由II类呈递的抗原肽可以改善治疗性抗癌疫苗的有效性。并且，对由HLA II类分子呈递的抗原的了解对评估用蛋白质或携带编码肿瘤抗原全部基因的重组体病毒免疫的癌症患者的免疫反应是有用的。
下面的实施例显示了是MAGE-A1 HLA II类结合肽的肽的分离。这些示例肽是SEQ ID NO1核酸的加工翻译产物。同样地，此领域中的普通技术人员可以理解，MAGE-A1 HLA II类结合肽从中加工而成为最终形式来实施呈递作用的翻译产物可以是4任何长度的或是任何序列的，只要它们包括一种或多种MAGE-A1 HLA II类结合肽。如在下面实施例中所演示的，象12个氨基酸一样小的以及象MAGE-A1蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO2)一样长的的肽或蛋白质都可以适当地被加工，由HLA II类分子呈递并可有效地刺激CD4+T淋巴细胞。MAGE-A1HLA II类结合肽，如SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或SEQ ID NO7的肽可有一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，或更多个氨基酸加在一个末端或两个末端。这种肽的抗原部分在生理条件下裂解，由HLA II类分子呈递。此领域中众所周知的是HLA II类肽的长度在约10个氨基酸到约30个氨基酸之间变化(Engelhard，免疫学评论年刊12181-201，1994)。大多数HLA II类结合肽在12-19个氨基酸长度范围内。嵌套式HLA II类结合肽已经被鉴别，其中肽共享一个核心序列，但在氨基和/或羧基末端具有不同的氨基酸(参看，如实施例和Chicz等人，试验医学期刊，17827-47，1993)。含有比本文所公开的肽少的氨基酸的MAGE-A1HLA II类结合肽也包括在本发明中。因此，其他MAGE-A1 HLAII类结合肽，以及与MAGE-A1 HLA II类结合肽同源的MAGE家族HLA II类结合肽也可被此领域中的普通技术人员通过本文所描述的方法鉴别。
如本文所使用的，对于多肽，“分离”意指从它的天然环境中分离并以足以允许它的鉴别或使用的量存在。分离的，当指蛋白质或多肽时，是指如(i)通过表达克隆选择性地制备或(ii)通过层析法或电泳提纯。分离的蛋白质或多肽可以是，但不必须是，基本上纯的。“基本上纯的”是指蛋白质或多肽基本上不含其他在天然或体内系统中可能发现的物质到可实践并适合它们的意图应用的程度。基本上纯的多肽可通过此领域中的众所周知的技术来制备。因为在药物制备中分离的蛋白质可以与药物可接受的载体混合，所以蛋白质可以组成仅小重量百分比的制备品。虽然如此，蛋白质是分离的，因为它已经从生命系统中与其组合的物质中分离，即，从其他蛋白质中分离。
实施例中所描述的方法可以用来鉴别MAGE家族HLA II类结合肽。因此，如，人们可以通过将细胞与MAGE多肽接触或通过将指导有兴趣MAGE蛋白质表达的核酸分子引入到细胞中，用重组MAGE蛋白质(或其片段)负载抗原呈递细胞，如正常血液供体的树状细胞。然后，抗原呈递细胞可用来诱导识别MAGE HLA II类结合肽的特异CD4淋巴细胞的体外激活和增殖。然后，如实施例中所描述的，通过用用来刺激CD4淋巴细胞激活和增殖的MAGE蛋白质的肽片段刺激细胞可以确定肽的序列。或者可替换地，人们可以用从MAGE蛋白质衍生的肽负载抗原呈递细胞。如，人们可以根据结合HLA II类负分子的共有氨基酸序列预测从是候选HLA II类结合肽的MAGE家族蛋白质衍生的肽序列。有关这方面，参看如国际申请PCT/US96/03182和PCT/US98/01373。选择HLA II类结合肽的计算机软件也可使用(TEPITOPE；Sturniolo等人，自然生物技术，17555-561，1999年；Manici等人，医学专家期刊，189871-876，1999年)。这样选取的肽可以使用在本文所描述的测试中，来诱导特异CD4淋巴细胞和鉴别肽。选取以及测试肽HLA II类结合的其他方法在此领域中是众所周知的。
如上面所提及的，本发明包括MAGE-A1 HLA II类结合肽的功能变体。如本文所使用的，HLA II类结合肽的“功能变体”或“变体”是含有对HLA II类结合肽的初级氨基酸序列一个或多个修饰的并保持本文所公开的HLA II类和T细胞受体结合属性的肽。产生MAGE-A1 HLA II类结合肽功能变体的修饰可以实施来，如(1)增强MAGE-A1 HLA II类结合肽的属性，如在表达系统中的肽稳定性或蛋白质-蛋白质结合的稳定性如HLA-肽结合的稳定性；(2)给MAGE-A1 HLA II类结合肽提供新型活性或属性，如添加抗原表位或添加可识别组成；(3)提供产生相同或相似的T细胞刺激属性的不同的氨基酸序列。对MAGE-A1(以及MAGE家族)HLA II类结合肽的修饰也可对编码肽的核酸实施，修饰可以包括缺失，点突变，截短，氨基酸替换以及氨基酸添加。另外可替换地，修饰可以直接对多肽实施，如通过裂解，添加接头分子，添加可鉴别组成(如生物素)，添加脂肪酸，用另一个氨基酸替换一个氨基酸等等。变体也可以从肽文库中选取，变体可以是无规则的肽或是基于MAGE肽序列在一个或多个位置上包括替换的肽。如，肽文库可以用在与MAGE肽结合HLA II类分子(如用MAGE-A1 HLAII类结合肽负载的树状细胞)的竞争测试中。竞争MAGE肽与HLA II类负载结合的肽可被测序并可用在其他测试(如CD4淋巴细胞增殖)中以确定作为肽功能变体的适宜性。其他功能变体可以是肽拟态化合物。肽拟态化合物可以制备并检测其与HLAII类结合(参看，如Falcioni等人，自然生物技术，17562-567，1999年)然后检测其对CD4+T细胞的刺激作用。
修饰还包括含有所有或部分MAGE HLA II类结合肽氨基酸序列的融合蛋白质，如不变链-MAGE-A1融合蛋白质。因此本发明还包括含有MAGE-A1 HLA II类结合肽和内体导向信号(如人类不变链Ii或LAMP-1)的融合蛋白质。人类不变链的内体导向信号与MAGE-A1的融合产生MAGE-A1与HLAII类肽呈递途径的有效导向。人类不变链或其他导向多肽的“内体导向部分”是分子当与第二多肽融合或缀合时增加第二多肽的体内定位的分子部分。因此，内体导向部分可以包括导向多肽如人类不变链Ii的全部序列或仅一小部分。此领域中的普通技术人员可以方便地确定导向分子的内体导向部分。仅使用常规试验，其他内体导向信号可由此领域中的普通技术人员鉴别，并与MAGE-A1或其MAGE-A1 HLA II类结合部分融合，也可进行导向HLA II类肽呈递途径的测试。如包括内体导向信号部分和HLA II类结合肽部分的融合多肽的实例，参看公开的PCT申请PCT/US98/18601。
MAGE-A1 HLA II类结合肽的氨基酸序列可以是自然源的或非自然源的，即，它们可以包括自然的MAGE HLA II类结合肽分子或可以包括修饰的序列，只要氨基酸序列当呈递时保持刺激辅助性T细胞的能力，并保持结合HLA II类分子如HLA-DRB1*15分子的属性。如，在这篇文章中MAGE-A1 HLA II类结合肽可以是融合蛋白质，包括MAGE-A1 HLA II类结合肽和不相关氨基酸序列，显示在SEQ ID NO3，4和7的氨基酸序列的合成肽，标记肽，从患有MAGE表达癌症的患者中分离的肽，从表达MAGE-A1的培养细胞中分离的肽，与非肽分子偶合的肽(如在某些药物给药系统中)和其他包括SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的氨基酸序列的分子。
优选地，MAGE-A1 HLA II类结合肽是不-可水解的。为了提供这样的肽，可以从不-可水解的肽的文库中选取MAGEHLA II类结合肽，如含有一个或多个D-氨基酸的肽或含有一个或多个不-可水解的肽键连接氨基酸的肽。可替换地，人们可选取诱导CD4+T淋巴细胞最理想的肽，然后按照需要降低被蛋白酶水解的可能性来修饰这种肽。如为了确定对蛋白水解裂解的易感性，可将肽标记并与细胞提取物温育或与提纯的蛋白酶一起温育，然后分离以确定哪个肽键易受到蛋白水解作用的影响，如通过对肽和蛋白水解片段测序。可替换地，通过将AMGE-A1 HLA II类结合肽的氨基酸序列与一组蛋白酶的已知裂解位点特异性进行比较，可以鉴别可能易受到影响的肽键。根据这种试验结果，个别易受到蛋白水解作用影响的肽可通过肽的体外合成用不-可水解的肽键替换。
许多不-可水解的肽键，以及合成含有这种键的肽的方法在此领域中是众所周知的。不-可水解的键包括-psi[CH2NH]-还原的酰胺肽键，-psi[COCH2]-酮亚甲基肽键，-psi[CH(CN)NH]-(氰亚甲基)氨基肽键，-psi[CH2CH(OH)]-羟基乙烯基肽键，-psi[CH2O]-肽键，和-psi[CH2S]-硫代亚甲基肽键。
肽的非肽类似物，如提供稳定的结构或降低的生物降解行动非肽类似物也考虑在内。肽拟态类似物可以根据选取的MAGE-A1 HLA II类结合肽通过用非肽组成替换一个或多个残基来制备。优选地，非肽组成允许肽保持其天然构象。或稳定优选的确证性，如生物活性的确证性。这种肽可以在分子或细胞基的结合测试中进行测试，以评定替换对构象和/或活性的影响。有关从肽中制备非肽拟态类似物的方法的一个实施例在Nachman等人的Regul.Pept.57359-370(1995)中进行了描述。本文所使用的肽包括前述的所有肽。
如果变体包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO7的氨基酸的变化，那么含有保守性氨基酸替换的MAGE-A1HLA II类结合肽的功能变体通常是优选的，即，保持原氨基酸属性(如电荷，疏水性，构象等)的替换。氨基酸保守性替换包括在下列组内的氨基酸中实施的替换，包括(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D。
鉴别MAGE-A1 HLA II类结合肽的功能变体的其他方法在Strominger和Wucherpfennig的公开PCT申请(PCT/US96/03182)中提供。这些方法依赖于潜在的表位能可与之比较的氨基酸序列基元的发展。每一个基元描述了有限组的氨基酸序列，其中在每个(相对)位置上的残基可以(a)受到单一残基的限制，(b)允许在限制组残基中变化，或(c)允许在所有可能的残基中变化。如，基元可能指定在第一位置上的残基可以是缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸中的任何一个；指定在第二位置上的残基必须是组氨酸；指定在第三位置上的残基可以是任何氨基酸，指定在第四位置上的残基可以是缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸中的任何一个残基；指定在第五位置上的残基必须是赖氨酸。
MAGE-A1 HLA II类结合肽功能变体的序列基元可通过分析主要组织相容性复合体HLA-DR蛋白质的结合域或结合袋和/或如本文所描述的MAGE-A1 HLA II类结合肽的T细胞受体(TCR)接触点来发展。通过提供涉及形成HLA II列结合袋的残基的详细的结构分析，人们能够预测MAGE肽和任何HLA II类蛋白质结合的序列基元。
使用这些序列基元作为检索，评定，或设计标准，人们可以鉴别具有结合具体HLA分子并与T细胞受体相互作用诱导T细胞反应合理可能性的肽(如MAGE HLA II类结合肽，特别是本文所公开的MAGE-A1肽，和其功能变体)的种类。这些肽可如本文所描述的合成并检测活性。使用这些基元，作为与纯序列同源性(其不包括抗原性类似但序列相当不同的多种肽)或与非限制的“保守性”替换同源的序列(其包括在临界高度保守位点不同的多种肽)相反的序列，代表了一种此领域中的普通技术人员能通过其来评估肽在治疗疾病中的潜在应用的方法。
Strominger和Wucherpfennig的PCT申请，和本文所引用的其他参考文献，所有这些文献参考收入本篇，描述了接触HLA II类肽的残基的HLA II类和TCR结合袋。通过保持可能在HLA II类和/或TCR结合袋中结合的残基不变或仅允许特异替换，可制备保持结合HLA II类和T细胞受体的MAGE HLA II类结合肽的功能变体。
因此，提供了鉴别其他MAGE家族HLA II列肽，特别是MAGE-A1 HLA II类结合肽，和其功能变体的方法。通常，MAGE蛋白质可进行上面描述的分析，如本文描述的肽序列选取和测试。对于MAGE-A1，如方法包括选取MAGE-A1 HLAII类结合肽，结合MAGE-A1 HLA II类结合肽的HLA II类结合分子，和受由HLA II类结合分子呈递的MAGE-A1 HLA II类结合肽刺激的T细胞。在优选的实施方案中，MAGE-A1 HLAII类结合肽包括SEQ ID NO7的氨基酸序列，更优选的，肽包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或SEQ ID NO7的氨基酸序列。MAGE-A1 HLA II类结合肽的第一氨基酸残基被诱变制备变体肽。氨基酸残基可依据如上所述的Strominger和Wucherpfennig的PCT申请中描述的HLA和T细胞受体接触点原则来诱变。任何制备变体肽的方法都可使用，如合成变体肽，使用突变的核酸分子重组制备变体肽，等等。
任何依据标准方法确定变体肽与HLA II类结合分子的结合以及对T细胞的刺激作用。例如，在下面所示例的，变体肽可与含有结合MAGE-A1肽的HLA II类分子的抗原呈递细胞接触，形成变体肽和抗原呈递细胞的复合体。然后将这种复合体与识别由HLA II类结合分子呈递的MAGE-A1 HLA II类结合肽的T细胞接触。T细胞可从患有特点在于表达MAGE-A1的病况的患者中获得。T细胞对变体肽的识别作用可通过测定T细胞刺激作用的指示剂来确定，如TNF或IFN-γ的产出。鉴别和定性其他MAGE家族HLA II类结合肽的类似方法也可实施。
变体肽与HLA II类结合分子结合以及由HLA II类结合分子呈递的变体肽对T细胞的刺激作用说明变体肽是一种功能变体。方法还包括比较MAGE-A1 HLA II类结合肽对T细胞的刺激作用和功能变体对T细胞的刺激作用的步骤，来确定功能变体对T细胞的刺激作用的有效性。通过比较功能变体和MAGE-A1 HLA II类结合肽，可制备具有增强的T细胞刺激属性的肽。
如果必要，可对用前述任何方法制备的MAGE-A1 HLA II类结合肽的变体测序，以确定氨基酸序列，并因此推出编码这种变体的核苷酸序列。
本发明还包括编码MAGE HLA II类结合肽或其变体的核酸序列，以及在严格条件下与包括上面描述的核苷酸序列的核酸分子杂交的其他核酸序列。本文所使用的“严格条件”是指此领域中熟悉的参数。核酸杂交参数可在汇编这种方法的参考文献中发现，如分子克隆实验室手册，J.Sambrook，等人，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989，或分子生物学的当前技术，F.M.Ausubel等人，John wiley & Sons有限公司，纽约。更具体地，如本文使用的严格条件是指在65℃杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清清蛋白，25mMNaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mMEDTA(乙二胺四乙酸))中杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，DNA在上面转化的膜在室温用2×SSC冲洗，然后在温度高达68℃用0.1×SSC/0.1×SDS冲洗。
还有其他可以使用的、产生类似严格程度的条件，试剂等等。熟练的技术人员会熟悉这样的条件，因此这些条件没有列出。然而，可以理解熟练的技术人员能够以允许明确地鉴别编码本发明的MAGE HLA II类结合肽的核酸的同系物和等位基因的方式熟练操作这些条件。熟练的技术人员还熟悉筛查表达这种分子的细胞和文库、随后常规地分离表达这种分子的细胞和文库，接着分离相关核酸分子并测序的方法。
一般，同系物和等位基因与MAGE-A1 HLA II类结合肽的氨基酸序列(如SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或SEQ ID NO7)或编码这种肽的核酸(如SEQ ID NO12，其编码SEQ ID NO7的肽)通常分别共享至少90％氨基酸一致性和/或至少70％核苷酸一致性。在一些情况中，同系物和等位基因会共享至少95％的核苷酸一致性和/或至少90％氨基酸一致性，在其他情况中，同系物和等位基因会共享至少99％的核苷酸一致性和/或至少95％的氨基酸一致性。前述核酸的互补体也包括在本发明中。
在筛查编码MAGE HLA II类结合肽的核酸中，可使用前述条件以及32P探针实施核酸杂交，如Southern印迹或Northern印迹。在冲洗编码MAGE HLA II类结合肽的DNA在其上最终转化的膜后，将膜放置在X-光片上以检测放射性信号。
如本文所使用的，对于核酸，“分离的”意指(i)通过如聚合酶链反应(PCR)体体外扩增；(ii)通过克隆重组制备；(iii)提纯，如通过裂解和凝胶分离；或(iv)合成，如通过化学合成。分离的核酸是可方便地通过此领域中众所周知的重组DNA技术操作的核酸。因此，包括在其中5’和3’限制性位点是已知的载体中的核苷酸序列或包括在聚合酶链反应(PCR)引物序列已经公开的载体中的核苷酸序列可考虑是分离的，但在自然宿主中以自然状态存在的核酸序列不是分离的。分离的核酸可以是基本上纯的，但不是必须是纯的。如，在克隆或表达载体中分离的核酸不是纯的，因为它可能仅占它存在的细胞中的很小的百分比。然而，这样的核酸是分离的，如本文所使用的，因为它可方便地通过此领域中的普通技术人员已知的标准技术操作。本文所使用的分离的核酸不是自然存在的染色体。
本发明还包括使用包括编码MAGE HLA II类结合肽的相同氨基酸残基的可替换密码子的核酸序列。如，本文所公开的，肽EYVIKVSARVRF(SEQ ID NO7)是MAGE-A1 HLA II类结合肽。丝氨酸残基(SEQ ID NO7氨基酸No7)可由密码子UCU，UCC，UCA，UCG，AGU和AGC编码。六个密码子的每一个对于编码亮氨酸残基用途是等同的。因此，对此领域中的普通技术人员显然的是任何编码亮氨酸核苷酸三联体可用来指导蛋白质合成装置，体外或体内，掺入亮氨酸残基。类似地，编码包括SEQ ID NO7的MAGE-A1 HLA II类结合肽的其他氨基酸残基的核苷酸序列三联体包括CGA，CGC，CGG，CGT，AGA和AGG(精氨酸密码子)；AAA和AAG(赖氨酸密码子)；GUA，GUC，GUG和GUU(缬氨酸密码子)；GAA和GAG(谷氨酰胺密码子)；UUC和UUU(苯丙氨酸密码子)和UAC和UAU(酪氨酸密码子)。其他氨基酸残基可类似地通过多核苷酸序列编码。因此，本发明包括由于遗传密码的简并在密码子序列上与自然MAGE HLA II类结合肽编码核酸不同的简并核酸。
本发明还提供了包括添加，替换或缺失一个或多个核苷酸的修饰核酸分子。在优选的实施方案中，这些修饰的核酸分子和/或它们编码的多肽保持至少一种未修饰核酸分子和/或多肽的活性或功能，如抗原性，酶活性，受体结合，通过MHC I类或II类分子结合肽形成复合体，等等。在某些实施方案中，修饰的核酸分子编码修饰的多肽，优选的是具有保守性氨基酸替换的多肽，如本文在别处所描述的。修饰的公司分子在结构上与未修饰的核酸分子相关，在优选的实施方案中，修饰的核酸在结构上与未修饰的核酸充分相关，这样修饰的和未修饰的核酸分子在此领域中的技术人员已知的严格条件下杂交。
如，可制备编码具有单一氨基酸变化的多肽的修饰核酸分子。除了如本文所描述的相对于遗传密码简并的核苷酸变化外，这些核酸分子的每一个可具有一个，两个或三个核苷酸替换。同样地，可以制备编码具有两个氨基酸变化的多肽的修饰核酸分子，其具有如2-6个核苷酸变化。此领域中的技术人员可容易地想象到多种象这些核酸分子一样的修饰核酸分子，包括如，在编码氨基酸2和3，2和4，2和5，2和6等的密码子中替换核苷酸。在前述的实例中，两种氨基酸的每种组合包含在修饰核酸分子组中，以及编码氨基酸替换的所有核苷酸替换中。如此领域中的普通技术人员可容易地想象到的，其他编码具有其他替换(即，3个或多个)，添加或缺失(如通过引入终止密码子或剪接位点)的多肽的核酸分子也可制备并包括在本发明的范围内。通过常规的试验可以检测任何前述的核酸或多肽在与本文所公开的核酸和/或多肽的结构相关性或活性方面的保持力。
同样可以理解，本发明包括在表达载体中使用序列，以及去转染宿主细胞和细胞种系，原核细胞(如E.coli)，或真核细胞(如树状细胞，CHO细胞，COS细胞，酵母表达系统和在昆虫细胞中重组杆状病毒表达)。表达载体需要相关的序列，即，上面描述的那些，与启动子可操作地连接的。由于已发现人类HLA-DRB1*15分子呈递MAGE-A HLA II类结合肽，表达载体也可以包括编码HLA-DRB1*15分子的核酸序列。(对于其他MAGE HLA II类结合肽，可以使用不同的HLA分子。)在载体含有两种编码序列的情况中，载体可以用来转染通常不表达任一个的细胞。当宿主细胞已经表达HLA-DRB1*15分子时，MAGE-A1 HLA II类结合肽编码序列也可以单独使用。当然，对可以用作含有如果需要可使用在不表达HLA-DRB1*15分子的宿主细胞中的两个编码序列的载体的具体宿主细胞没有限制，编码MAGE-A1 HLA II类结合肽的核酸也可使用在表达HLA-DRB1*15分子的抗原呈递细胞中。如本文所使用的，“HLA-DRB1*15分子”包括亚型DRB1*15011，DRB1*15012，DRB1*15021，DRB1*15022，DRB1*15023，DRB1*1503，DRB1*1504，DRB1*1505，DRB1*1506，DRB1*1507，DRB1*1508，DRB1*1509，DRB1*1510。HLA-DRB1*15分子也包括可在Bodmer等人的组织抗原49297，0996和http//www.ebi.ac.uk/ingt/hla/网站IMGT/HLA数据库据库中找到的亚型。
如本文所使用的，“载体”可以是多种核酸的任何一种，其中所需的序列可以通过限制和连接作用插入进行在不同遗传环境间转运或在宿主细胞中表达。尽管RNA载体也可使用但载体通常由DNA组成。载体包括，但不限于质粒，噬菌粒和病毒基因组。克隆载体是能自主复制或之后整合到宿主细胞的基因组中的载体，其进一步特点在于载体在一个或多个内切核酸酶限制位点能以可确定的方式切入，并且在一个或多个内切核酸酶限制位点中所需的DNA序列可以获得连接，这样新的重组载体保持着其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况中，所需序列的复制可能发生多次，因为质粒在宿主细菌中增加了拷贝数，或在宿主通过有丝分裂复制前所需的序列的复制每个宿主细胞只发生一次。在噬菌体的情况中，复制可能在裂解期期间主动发生或在溶原期期间被动发生。表达载体是所需的DNA序列可通过限制和连接作用插入到其中的载体，这样它可操作地连接成调节序列并可以表达为RNA转录体。
载体可以进一步包括一种或多种适于用在鉴别已经或还没有被载体转化或转染的细胞中的标记序列。标记包括，如编码增加或降低对抗体或其他化合物抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过此领域中已知的标准测试法检测的酶(如β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酶或荧光素酶)的基因，和明显影响转化的或转染的细胞，宿主，集落或噬菌斑(如，绿色荧光蛋白质)的显型的基因。优选的载体是能自主复制并表达存在于载体可操作地与之连接的DNA区段的结构基因产物的载体。
优选地，表达载体包括将MAGE家族多肽(如MAGE-A1)，或从中衍生的HLA II类结合肽序列导向到蛋白质或肽在其中表达的细胞的核内体。HLA II类分子含有阻止其他分子与HLA II类分子结合的不变链(Ii)。这种不变链在核内体中裂解，从而允许HLA II类分子结合肽。因此，优选的是MAGE-A1 HLA II类结合肽和其前体(如，MAGE-A1蛋白质)被导向核内体，从而增强了MAGE-A1 HLA II类结合肽与HLA II类分子的结合。指导分子到核内体的导向信号在此领域中是众所周知的，并且这些信号可方便地掺入到表达载体中，这样可制备含有内体导向信号的融合蛋白质。Sanderson等人(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA927217-7221，1995)，Wu等人(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA9211671-11675，1995)和Thomson等人(病毒学期刊，752246-2252，1998)描述了内体导向信号(包括不变链Ii和与溶酶体有关的膜蛋白LAMP-1)和它们在指导抗原到内体和/或溶酶体细胞区室中的应用。
内体导向信号如不变链也可以通过非-肽键(即，非融合蛋白质)与MAGE-A1蛋白质或肽缀合以制备能特异导向MAGE-A1的缀合物。共价键的具体实例包括其中使用双功能交联剂分子的共价键。交联剂分子可以是同基上功能试剂或异基双功能试剂，这取决于要缀合的分子的性质。同基双功能交联剂具有两个相同的活性基团。异基双功能交联剂定义为具有两个不同的活性基团，以允许顺序的缀合反应。多种类型的可购得的交联剂与一种或多种序列基团起反应伯胺，仲胺，巯基，羧基，羰基和碳水化合物。根据进行连接的分子的化学性质和键或多个键的优选特点，此领域中的普通技术人员在不需要过分试验的情况下能确定连接内体导向组成和MAGE-A1肽或蛋白质的优选分子。
如本文所使用的，当编码序列和调节序列以将编码序列的表达和转录置于调节序列的影响和控制之下的方式共价连接时，它们被称为“可操作地”连接。如果将编码下列翻译成功能蛋白质是所需的，如果在5’调节序列上启动子的诱导产生编码序列的转录，如果两个DNA序列之间的键的性质不(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录体被翻译成蛋白质的能力，那么两个DNA序列被称为“可操作地”连接。因此，如果启动子区域能够影响DNA序列的转录，以使产生的转录体能被翻译成所需的蛋白质或多肽，那么启动子区域就可操作地与编码序列连接。
基因表达所需的调节序列的确切性质在物种或细胞种类之间是变化的，但一般应包括，如所需的，分别与启动转录和翻译有关的5’非-转录和5’非-翻译序列，如TATA框，加帽序列，CAAT序列，等等。特别地，这种5’非-转录调节序列包括含有对可操作地连接的基因转录控制的的启动子序列的启动子区域。按所需，调节序列也可包括增强子序列或上游激活子序列。本发明的载体任意地包括5’前导序列或信号序列。选择及设计适合的载体在此领域中的普通技术人员的能力和自主判断范围内。
含有所有表达所需的元素的表达载体是可以购得的并且此领域中的技术人员是已知的。参看如Sambrook等人的分子克隆实验室手册，第二版冷泉港实验室出版社，1989。通过在细胞中引入编码MAGE-A1 HLA II类结合肽的异源DNA(RNA)将细胞进行基因工程设计。将异源DNA(RNA)置于转录元素的可操作控制下以允许异源DNA在宿主细胞中表达。如本文所描述的，这种表达构建任意地包括编码内体导向信号(优选的是人类不变链或其导向片段)的核苷酸序列。
在哺乳动物细胞中表达mRNA的优选系统是诸如含有可选择的标记如具有G418抗性(其促使选择稳定的转染细胞种系)的基因和人类巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子序列的pRc/CMV(可从Invitrogen，Carlsbad，CA购得)的那些系统。此外，适合在灵长类或犬科动物细胞种系表达的是Pcep4载体(Invitrogen)，其含有复制Epstein Barr病毒(EBV)，有利于保持质粒为多拷贝染色体外遗传因子。另一个表达载体上含有多肽延伸因子1α的启动子的pEF-BOS质粒，其有效地刺激体外转录。质粒由Mishizuma和Nagata(核酸研究，185322，1990)描述，质粒在转染实验中的应用由如Demoulin(分子细胞生物学，164710-4716，1996)公开。另一种优选的表达载体是腺病毒，由Stratford-Perricaudet描述，其缺损E1和E3蛋白质(临床研究期刊，90626-630，1992)。使用腺病毒作为Adeno.P1A重组体由Warnier等人公开，给鼠皮下注射进行抗P1A免疫接种(国际癌症期刊，67303-310，1996)。
本发明还包括所谓的表达试剂盒，其使得技术人员能制备所需的表达载体或多种表达载体。这种表达试剂盒至少包括至少两种预先讨论的物质的独立部分。其他组成也可以添加，如所需。
本文所描述的本发明具有多种应用，本文描述了其中的一些。下列应用是针对MAGE-A1 HLA II类结合肽的描述，但同样适用于其他结构上或功能上相关的MAGE家族HLA II类结合肽的应用。首先，本发明允许技术人员诊断特点在于表达MAGE-A1 HLA II类结合肽的疾病。这些方法包括在生物样品中确定表达MAGE-A1 HLA II类结合肽，或MAGE-A1 HLA II类结合肽和HLA II类分子的复合体。肽或肽和HLA II类分子的复合体的表达能通过用肽或复合体的结合伙伴(如，抗体)测试来确定。
本发明还允许技术人员治疗患有特点在于表达MAGE-A1HLA II类结合肽的病变的受试体。治疗包括服用增加受试体中MAGE-A1 HLA II类结合肽和HLA II类分子的复合体的试剂，以及服用对这种复合体特异的CD4+T淋巴细胞。应用于前述治疗中的试剂包括MAGE-A1 HLA II类结合肽和其功能变体，包括这种MAGE-A1肽，表达这种蛋白质和肽的核酸(包括含有核酸的病毒)，这种肽和HLA II类结合分子的复合体(如，HLA-DRB1*15)，负载MAGE-A1 HLA II类结合肽和HLA II类结合分子的复合体的抗原呈递细胞，等等的核内体-导向融合蛋白质。本发明还允许技术人员选择性地增加对MAGE-A1 HLA II类结合肽特异的CD4+T淋巴细胞的T淋巴细胞群。
MAGE-A1 HLA II类结合肽的分离使得分离编码MAGE-A1HLA II类结合肽的核酸成为可能。核酸可用来在体外或在原核或真核宿主细胞中制备MAGE-A1 HLA II类结合肽。有多种技术人员熟知的方法可用来获得分离的MAGE-A1 HLA II类结合肽。如表达载体可引入到细胞中以产生肽。在另一种方法中，mRNA转录体可被微注射或用其他方式引入到细胞中以产生编码的肽。在不含细胞的提取物(如网织红细胞裂解物系统)中mRNA的翻译也可用来制备肽。包含本发明的MAGE-A1 HLA II类结合肽的肽也可以在体外合成。为了获得分离的MAGE-A1HLA II类结合肽，此领域中的技术人员也可以方便地依照已知的分离肽的方法。这些方法包括，但不限于，免疫层析法，HPLC，大小排阻层析法，离子交换层析法和免疫亲和层析法。
这些分离的MAGE-AI HLA II类结合肽，包括这种肽的蛋白质，或肽和HLA II类分子的复合体，如HLA-DRB1*15，可以与辅剂组合以制备疫苗，用来治疗特点在于表达MAGE-A1HLA II类结合肽的病变。此外，疫苗可从在其表面呈递MAGE-A1 HLA II类结合肽/HLA复合体细胞制备，如树状细胞，B细胞，非-增殖性转染子等等。在所有细胞用作为疫苗的情况中，这些细胞可以是用编码一种或两种刺激CD4+淋巴细胞所需的组成的序列转染的细胞，或是已经表达两种分子不需要转染的细胞。如自身抗原呈递细胞可从患者分离，并处理以获得呈递与HLA I类和HLA II类分子有关的MAGE-A1表位的细胞。这些细胞将能刺激CD4+和CD8+细胞反应。这种抗原呈递细胞也可通过用编码Ii.MAGE-A1融合蛋白质的重组病毒感染树状细胞获得。树状细胞也可负载HLA I和HLA II类表位。
疫苗也包括裸DNA或RNA，编码MAGE-A1 HLA II结合肽或其前体，疫苗可以在体外制备并通过注射，粒子轰击，鼻吸入或其他方式服用。“裸核酸”类型疫苗已显示能刺激包括产生对裸核酸编码的肽特异的CTL的免疫反应(科学，2591745-1748，1993)。疫苗还包括包装在病毒，脂质体或其他粒子(包括用于药物给药中的聚合物粒子)中的核酸。
通过本文所描述的任何治疗产生的或增强的免疫反应可通过此领域中已知的多种方法监测。如，对给定抗原特异的T细胞的呈递可通过用呈递抗原肽的可溶荧光团MHC分子四聚物直接标记T细胞受体来检测(Altman等人，科学27494-96；Dunbar等人，当前生物学8413-416，1998年)。简单地，在存在β2-微球蛋白和结合I类分子的肽抗原的情况下体外将可溶MHCI类分子折叠。提纯后，将MHC/肽复合体提纯并用生物素标记。通过以摩尔比4∶1将生物素酰化肽-MHC复合体与标记的肌动蛋白(即，藻红蛋白)混合形成四聚物。然后将四聚物与DTL源(如外周血液或淋巴结)接触。四聚物结合识别肽抗原/MHC I类复合体的CTL。被四聚物结合的细胞可通过荧光激活细胞分选仪分选以分离活性CTL。然后可将分离的CTL体外扩展进行本文描述的应用。使用MHC II类分子作为四聚物最近由Crawford等人描述。(免疫性8675-682，1998年)。多聚可溶MHC II类分子可与共价附着肽复合。II类四聚物显示具有适当的特异性和亲和力与特异的T细胞结合。因此，四聚物可用来监测CD4+和CD8+细胞对疫苗接种方案的反应。
使用此领域中众所周知的标准方法，MAGE-A1 HLA II类结合肽，以及MAGE-A1 HLA II类结合肽和HLA分子的复合体，也可用来制备抗体。列出抗体制备的一般原理的标准参考著作包括Catty，D.，抗体，一种实施方法，1卷，IRL出版社，Washington DC(1988年)；Klein，J.，免疫学细胞-Non-细胞辨别的科学，John Wiley和Sons，纽约(1982年)；Kennett，R.，等人单克隆抗体，杂交瘤，生物分析中的新尺度，Plenum出版社，纽约(1980年)；Campbell，A.，单克隆抗体技术，实验室技术和生物化学和分子生物学，13卷(Burdon，R.，等人，EDS)，Elsevier Amsterdam(1983年)；以及Eisen，H.N.，微生物学，第三版，Davis，B.D.等人，EDS(Harper&Rowe，费城(1980年))。因此本发明的抗体可通过多种方法制备，包括给动物服用蛋白质，蛋白质片段，表达蛋白质或其片段的细胞以及适当的HLA II类分子等等以诱导多克隆抗体。单克隆抗体，包括人源化抗体可依据此领域中熟知的技术制备。如本文详细描述的，这种抗体可用来鉴别表达蛋白质的组织或用来提纯蛋白质。抗体也可以与特异标记试剂结合来成像或与抗肿瘤试剂结合，抗肿瘤试剂包括，但不限于，甲氨蝶呤，放射性碘标记的化合物，毒素如蓖麻毒素，其他抑制细胞生长或细胞溶解药物等等。依据本发明制备的抗体也优选地对本文所描述的肽/HLA复合体特异。
当在本文中使用“病变”或“病况”时，它指其中MAGE-A1 HLA II类结合肽表达的任何病理状况。这样的病变包括癌症，如恶性黑素瘤，头，颈，肺或食道的鳞状细胞癌，结肠直肠癌，骨肉瘤，成神经细胞瘤，头或颈的非鳞状细胞癌，卵巢肿瘤，淋巴细胞白血病，膀胱癌，前列腺癌，乳腺癌，和胃癌。
根据公开内容一些治疗方法是以诱导受试体的免疫系统对MAGE HLA II列结合肽呈递细胞反应作为前提。一种这样的方法是给患有在争论中的异常细胞表型的受试体服用对MAGE-A1 HLA II类结合肽和HLA II类分子的复合体特异的自身CD4+T细胞。在体外发展这种CD4+T细胞在技术人员的技术范围内。通常，从受试体中获取细胞样品，如血细胞，将样品细胞与呈递复合体并能刺激CD4+T淋巴细胞的细胞接触以增殖。靶细胞可以是负载HLA II类分子的抗原呈递细胞，如树状细胞或B细胞。如果样品细胞首先被分选以分离CD4+T淋巴细胞群，则靶细胞也可以是转染子，如COS细胞。如上面描述的四聚物技术也可用来分选。这些转染子在它们的表面呈递所需复合体，当与有兴趣的CD4+T淋巴细胞结合时，刺激它的增殖。COS细胞是可以广泛获得的，如其他适合的宿主细胞。CD4+T淋巴细胞的特异产生在下面进行描述。然后将克隆扩展的自身CD4+T淋巴细胞给受试体服用。CD4+T淋巴细胞刺激受试体的免疫反应，从而达到所需的治疗目的。
前述治疗法假设至少一些受试体异常细胞呈递相关的HLA/肽复合体。这一点可非常容易地确定，因为此领域非常熟悉鉴别呈递具体HLA分子的细胞的方法，以及如何鉴别表达相关序列DNA的细胞的方法，相关序列在本文情况中是MAGE-A1序列。
依据本发明，前述治疗法不是可使用的唯一的治疗法。CD4+T淋巴细胞也可以使用多种方法在体内刺激。一种方法是使用表达这种复合体的非-增殖性细胞。使用在这种方法中的细胞可以是通常表达复合体的那些细胞，如树状细胞或用一种或两种呈递复合体所需的基因转染的细胞。Chen等人，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88110-114，1991年)示例演示了这种方法，显示在治疗法中使用表达HPV-E7肽的转染细胞。可使用多种类型的细胞。类似地，携带一种或两种有兴趣的基因的载体也可使用。病毒或细菌载体是特别优选的。如编码MAGE-A1 HAL II类结合肽的核酸可以可操作地结合指导MAGE-A1 HLA II类结合肽在某些组织或细胞类型中表达的启动子和增强子序列。核酸可以掺入到表达载体中。表达载体可以是未修饰的染色体外核酸，质粒或构建或修饰以能插入外源核酸，如编码MAGE-A1 HLA II类结合肽的核酸的病毒基因组。编码MAGE-A1HLA II结合肽的核酸也可以插入到逆转录病毒基因组中，从而促使核酸整合到靶组织或细胞类型的基因组中。在这些系统中，有兴趣的基因被微生物携带，如痘苗病毒，常规痘病毒，腺病毒，单纯疱疹病毒，逆转录病毒或细菌BCG，物质实际上“感染”宿主细胞。呈递有兴趣的复合体的，被自身CD4+T淋巴细胞识别，其然后增殖。
为了便于在体内掺入到HLA II类呈递细胞中，通过将MAGEHLA II类结合肽与辅剂结合也可以获得相似的效果。如果需要产生HLA分子的肽伙伴，如果MAGE-AI HLA II类结合肽大于HLA II类结合部分，MAGE-A1 HLA II类结合肽可以被加工，而TRA被呈递时不需要进一步的加工。通常，受试体可接受真皮内注射有效量的MAGE-A1 HLA II类结合肽。依据此领域中的免疫接种方案标准，初始剂量可接着推进剂量。
一种促使MAGE-A1 HLA II类结合肽掺入到HLA II类呈递细胞中的优选方法是在呈递细胞中表达包括与包含II类结合肽的MAGE-A1多肽融合的内体导向信号的多肽。特别优选的是含有人类不变链Ii的MAGE-A1融合蛋白质。
任何前述的组合物或方案还可包括诱导细胞溶解型T淋巴细胞反应的MAGE HLA I类结合肽。例如，如下面所演示的，MAGE-A1蛋白质可加工到细胞中以产生HLA I类和HLA II类反应。几种这样的肽已在美国专利5,405,940和5,558,995中进行了描述。通过服用结合HLA I类和II类分子的MAGE-A1肽(或编码这种肽的核酸)，通过诱导T辅助性细胞和T杀伤细胞提供改善的免疫反应。
此外，也可服用非-MAGE-A1肿瘤相关-肽通过HLA I类和/或HLA II类增加免疫反应。癌细胞可以表达多于一种的肿瘤相关基因就已充分确定了。对此领域中的普通技术人员来说，确定是否具体受试体表达其他肿瘤相关基因，然后确定在前述MAGE-A1组合物和疫苗中包括从这种基因的表达产品衍生的HLA I类和/或HLA II类结合肽。
特别优选的是编码一系列表位的核酸，称为“多表位”。表位可以顺序的方式或以重叠的方式排列(参看，如Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA925845-5849，1995；Gilbert等人，自然生物技术，151280-1284，1997)，含有或不含天然的侧翼序列，如果需要可通过不相关的接头序列分离。多表位可加工产生免疫系统可识别的并产生免疫反应的个体表位。
因此，MAGE-A1 HLA II类结合肽可与来自其他肿瘤排斥抗原的肽(如通过制备杂交核酸或多肽)结合或与MAGE-A1HLA I结合肽(其中一些在下面列出)结合形成“多表位”。可服用来诱导或增强免疫反应的肿瘤相关肽抗原示例是从肿瘤相关基因衍生的，并编码蛋白质包括MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A7，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，GAGE-9，BAGE-1，RAGE-1，LB33/MUM-1，PRAME，NAG，MAGE-Xp2(MAGE-B2)，MAGE-Xp3(MAGE-B3)，MAGE-Xp4(MAGE-B4)，酪氨酸酶，脑糖原磷酸化酶，Melan-A，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，MAGE-C5，NY-ESO-1，LAGE-1，SSX-1，SSX-2(HOM-MEL-40)，SSX-4，SSX-5，SCP-1和CT-7。如，肿瘤的抗原肽特点包括如下表1中所列出的。
表1抗原示例
1仅在恶性黑素瘤中发现的N-乙酰半乳糖胺基转移酶V的异常转录体(GnTV)HLA I类和HLA II类结合肽的其他实例对此领域中的普通技术人员是众所周知的(参看，如Coulie，干细胞，13393-403，1995)，并且可以如本文所公开的那些以相同的方式使用在本发明中。此领域中的普通技术人员依据分子生物学的标准方法可以制备包括一种或多种MAGE-A1肽和一种或多种前述肿瘤排斥肽，或编码这种多肽的核酸的多肽。
因此，多表位是可以以多种排列方式(如连环的，重叠的)连接在一起的两个或多个潜在免疫原性的或免疫反应刺激肽。多表位(或编码多表位的核酸)可以用标准免疫接种方案给动物服用，以测试多表位刺激，增强和/或促进免疫反应的有效性。
肽也可以直接地或通过使用侧翼序列连接在一起以形成多表位，使用多表位作为疫苗在此领域中是众所周知的(参看，如Thomson等人，Proc.Acad.Natl.Acad.USA 92(13)5845-5894，1995；Gilbert等人，自然生物技术，15(12)1280-1284，1997；Thomson等人，免疫学期刊，157(2)822-826，1996；Tam等人，实验医学期刊，171(1)299-306，1990)。如，Tam显示在鼠模型中包含MHC I类和II类结合表位的多表位成功地产生抗体和保护性免疫性。Tam还显示包含表位“串”的多表位可以被加工产生由MHC分子呈递的由CTL识别的个体表位。因此，含有多种数量和组合的表位的多表位可以被制备，并能通过CTL进行识别测试以及进行增强免疫反应有效性测试。
已知肿瘤表达一组肿瘤抗原，其中仅某些亚组可以在任何给定的患者的肿瘤中表达。多表位可制备成对应表现在具体患者中表达的亚组肿瘤排斥抗原的的表位的不同组合的多表位。多表位也可以制备来反映宽范围的已知由肿瘤类型来表达的肿瘤排斥抗原。多表位也可以以多肽结构，或使用此领域中已知的核酸输送系统(参看，如Allsopp等人，欧洲免疫学期刊，26(8)1951-1959，1996年)引入到需要这种治疗的患者中。腺病毒，痘病毒，Ty-病毒状颗粒，腺相关病毒，质粒，细菌等也可以使用在这种输送系统中。在鼠模型中可以测试多表位输送系统以确定这种输送系统的有效性。系统也可以在人类临床实验中测试。
作为部分免疫接种方案，促进免疫反应的物质也可以与癌症疫苗的核酸或肽组成一起服用。这样的免疫反应促进化合物可以分类为辅剂或细胞因子。辅剂可以通过提供抗原贮槽(细胞外或巨噬细胞内)，激活巨噬细胞并刺激特异组的淋巴细胞来增强免疫反应。在此领域中有多种众所周知的辅剂；具体实例包括MPL(SmithKline Beecham)，在Salmonella minnesota Re 595脂多糖的提纯和酸水解作用后获得的同类物，QS21(SmithKlineBeecham)，从Quillja saponaria提取物中提纯的纯QA-21皂角苷，DQS21，(在PCT申请WO96/33739中所描述的，(SmithKline Beecham))；QS-7，QS-17，QS-18和QS-L1(So等人，分子细胞7178-186，1997年)；不完全Freund辅剂；完全Freund辅剂；维生素E；montanide；矾；CpG寡聚核苷酸(参看Kreig等人，自然374546-9，1995年)；以及由生物可降解油如鲨烯和/或生育酚制备的多种油包水乳液。优选地，肽与DQS21/MPL的组合混合一起服用。DQS21与MPL的比率通常是约1∶10到10∶1，优选的约1∶5到5∶1，更优选的上约1∶1。一般对于人类服用，DQS21和MPL存在于疫苗配方中，范围在约1微克到约100微克。其他辅剂在此领域中是已知的，也可以使用在本发明中(参看如，Goding的单克隆抗体原理和实践，第二版，1986年)。制备肽和辅剂的混合物或乳液的方法对疫苗接种领域的技术人员是众所周知的。
刺激受试体的免疫反应的其他试剂也可以给受试体服用。例如，其他由于淋巴细胞刺激属性而使用在疫苗接种方案中的细胞因子。用于这种目的的多种细胞因子对此领域中的普通技术人员是熟知的，包括白细胞介素-12(IL-12)，其已经显示出能增强疫苗的保护性作用(科学，2681432-1434，1995)，GM-CSF和LI-18。
有许多其他免疫反应促进化合物可以使用在疫苗接种方案中。这些包括以蛋白质或核酸形式提供的共同刺激分子。这种共同刺激分子包括B7-1和B7-2(分别为CD80和CD86)分子，这些分子在树状细胞(DC)上表达并与在T细胞上表达的CD28分子相互作用。这种相互作用给抗原/MHC/TCR刺激(信号1)T细胞提供了共同刺激作用(信号2)，增加T细胞增殖以及效应子功能。B7还与CTLA4(CD152)在T细胞上相互作用，关于CTLA4和B7配体的研究表明B7-CTLA4的相互作用能增强抗肿瘤免疫性以及CTL增殖作用(zheng等人，Proc，Natl，Acad.Sci.USA956284-6289，1998年)。
B7通常不在肿瘤细胞上表达，这样它们就不是T细胞的有效的抗原呈递细胞(APC)。诱导B7表达能使肿瘤细胞更有效地刺激CTL增殖以及效应子功能。B7/IL-6/IL-12的共同刺激作用的组合以显示能诱导IFN-γ和Th1细胞因子在T细胞群中分布，产生进一步增强的T细胞活性(Gajewski等人，免疫学期刊，1545637-5648，1995年)。B7转染的肿瘤细胞由Wang等人结合用于过继转移免疫治疗的体外CTL扩展已经讨论过(免疫学期刊191-18，1996年)。B7分子的其他输送机理可包括核酸(裸DNA)免疫接种(Kim等人，自然生物技术，157641-646，1997)和重组体病毒如腺病毒和痘病毒(Wendtner等人，基因治疗，4726-735，1997年)。这些系统也适用于B7与选择的其他分子(如本文所讨论的抗原或抗原的片段(包括多表位)或细胞因子)的共同表达的表达盒的构建和应用。这些输送系统可用来体外诱导适当的分子及使用在体内疫苗接种的情况中。在体内和体外使用抗-CD28抗体直接刺激T细胞也可考虑。类似地，诱导T细胞对外源抗原反应的可诱导共同-刺激分子ICOS也可通过使用抗-ICOS抗体来调节(Hutloff等人，自然，397263-266，1999年)。
淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3)在APC和一些肿瘤细胞上表达并与在T细胞上表达的CD2相互作用。这种相互作用诱导T细胞IL-2和IFN-γ产生，并因此能互补但不是替换，B7/CD28共同刺激相互作用(Parra等人，免疫学期刊，158637-642，1997年；Fenton等人，免疫治疗期刊，2195-108，1998年)。
淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)在白细胞上表达并与在APC和一些肿瘤细胞上表达的ICAM-1相互作用。这种相互作用诱导T细胞IL-2和IFN-γ产生，并因此能互补但不是替换，B7/CD28共同刺激相互作用(Fenton等人，1998年)。因此，LFA-1是能以上面讨论的B7的多种方式在疫苗接种方案中提供的共同刺激分子的另一个实例。
完全CTL激活作用和效应子功能需要通过Th细胞CD40L(CD40配体)分子与DC表达的CD40分子之间的相互作用的Th细胞辅助作用(Ridge等人，自然393474，1998年；Bennett等人，自然393478，1998年；Schoenberger等人，自然393480，1998年)。这种共同刺激信号的机理可能涉及DC(APC)对B7的正调节作用和相关联的IL-6/IL-12产出。因此，CD40-CD4L相互作用互补信号1(抗原/MHC-TCR)和信号2(B7-CD28)相互作用。
使用抗-CD40抗体直接刺激DC细胞预计会增强肿瘤相关抗原的反应，肿瘤相关抗原通常在炎症状况外部才能遇到或由非-专门APC(肿瘤细胞)呈递。诱导树状细胞突变的其他方法在此领域中是众所周知的，如通过增加CD40-CD40L的相互作用，或通过将DC与含Cp-G的寡聚脱氧核苷酸或来自细胞外基质的刺激糖组分接触。在这些情况中，Th辅助作用和B7共同刺激作用没有提供。这种机理可能可使用在基于抗原脉冲DC的治疗中，或使用在Th表位还没有在已知的肿瘤相关抗原前体中被限定的情况中。
当服用时，本发明的治疗组合物可以药物可接受的制备品服用。这种制备品可以按常规含有药物可接受的浓度的盐，缓冲试剂，防腐剂，相容载体，补充免疫促进试剂，如辅剂和细胞因子，以及任意的其他治疗试剂。
本发明制备品以有效量服用。有效量是指单独的或与进一步的剂量一起的，刺激所需反应的药物制备品的量。在治疗癌症的情况中，所需的反应是抑制癌症的发展。这可能仅包括临时减缓疾病的发展，尽管更优选的是，包括永久阻止疾病的发展。在诱导免疫反应的情况中，所需的反应是增加了对使用的MAGE-A1免疫原特异的抗体或T淋巴细胞。这些所需的反应可以通过常规方法监测，或者可以依据本文所讨论的本发明的诊断方法来监测。
在需要使用本发明的治疗组合物来刺激免疫反应的情况中，这可能涉及刺激体液抗体反应，产生抗体在血清中滴定度的增加细胞毒性淋巴细胞的克隆扩展，或一些其他需要的免疫性反应。可以相信认为，根据服用方式，免疫原的剂量范围从1毫微克/公斤到100毫克/公斤都是有效的。优选的剂量范围相信在500毫微克/公斤到500微克/公斤之间。绝对量取决于多种因素，包括选取用来服用的物质，服用是单剂量还是多剂量，个体患者的参数，如年龄，身体状况，身高，体重，以及疾病的阶段。这些因素对此领域中的普通技术人员是熟知的，并且仅需要常规试验就可以实施。实施例实例1鉴别CD4+T淋巴细胞由HLA II类分子呈递的MAGE-A1表位将单细胞衍生树状细胞负载MAGE-A1重组蛋白质，并用来刺激自身CD4+T细胞。将CD4+T细胞克隆体分离，识别由HLA-DRB1*15分子呈递的肽MAGE-A1281-292(SEQ ID NO7)，HLA-DRB1*15分子在17％的高加索人中表达。I.细胞种系，细胞因子将EBV-转化的B(EBV-B)细胞种系在Iscove改进的Dulbecco培养基(IMDM)中培养(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)，其中在Iscove改进的Dulbecco培养基中补充有10％胎牛血清(FCS)(Gibco，BRL)，0.24mML-天冬酰胺，0.55mML-精氨酸，1.5mML-谷氨酰胺(AAG)，100U/毫升青霉素和100微克/毫升的链霉素。人类重组IL-2是从Eurpcetus(阿姆斯特丹，荷兰)购买的，IL-7是从Genzyme(Cambridge，MA，USA)购得，GM-CSF是从Schering Plough(Brinny，爱尔兰)购得，TNF-α从R&D系统(Abingdon，英国)购得。人类重组IL-4，IL-6，和IL-12是使用标准重组技术在实验室中制备。II.制备两种重组MAGE-A1蛋白质A在E.Coli中制备脂D-MAGE-A1-组氨酸蛋白质由SmithKline Beecham联合药物公司(Rixensart，比利时)制备重组脂D-MAGE-A1-组氨酸蛋白质。它在其N-末端含有三分之一序列的流感嗜血菌(haemophilus influenzae)脂D蛋白质，在其C末端含由7个残基的多组氨酸标记，以及在脂D和组氨酸末端之间含有MAGE-A1蛋白质(SEQ ID NO2)。这种重组体蛋白质在E.Coli中制备，本文后面称为蛋白质MAGE-A1①。
B在Sf9昆虫细胞中制备组氨酸-MAGE-A1蛋白质在实验室中使用杆状病毒表达系统(PharMingen，圣地亚哥，CA，USA)将另一种重组MAGE-A1蛋白质制备在Spodoptera furgiperda(Sf9)昆虫细胞中。MAGE-A1的编码序列(SEQ ID NO1的核苷酸139-1068)克隆在杆状病毒转移载体(pAcGP67-A，PharMingen)中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)(杆状病毒的一个菌株)的gp67表面蛋白质的信号序列的下游。为了简化提纯，将编码组氨酸尾部的序列加在MAGE-A1序列的C末端。这种构建便于昆虫细胞分泌MAGE-A1蛋白质，本文后面称为MAGE-A1①。重组质粒的DNA与致死突变AcNPV的DNA一起共同转染到昆虫细胞中。共同转染使得质粒和病毒的同源区域之间重组，将外源基因从载体转移到AcNPV DNA中。对包含在Sf9昆虫细胞培养物上清液中的蛋白质的提纯对于不同的分批培养物包括不同的步骤，如下面所描述的。
No.1批培养物通过如下连续步骤提纯过滤，阴离子交换树脂(DEAE-sephadex(交联葡聚糖))，用氯化镍饱和的高捕获螯合柱，用免疫接种抗-MAGE-A1单克隆抗体(MabllB2)的亲和层析，浓缩，和透析。
No.2批培养物通过如下连续步骤提纯过滤，阴离子交换树脂DEAE-sephadex(交联葡聚糖)，用氯化镍饱和的高捕获螯合柱，反相高效液相层析(RP-HPLC)，和浓缩。III.人类血液的加工从血色素沉着病患者获取外周血液作为标准白细胞层制备品。外周血液单核细胞(PBMC)通过在Lymphoprep(NycomedPharma，奥斯陆，挪威)中离心分离。为了最小化血小板对PBMC的污染，制备品首先在室温下在1,000rpm下离心20分钟。除去顶部20-25毫升后，其含有大多数的血小板，将试管在室温下在1,500rpm下离心20分钟。收获含有PBMC的中间相，然后为了除去残留的血小板用含有2mMEDTA的磷酸缓冲液中冲洗3次(或更多次)。为了制备自身树状细胞，通过与用2-氨基乙基异硫脲鎓盐(2-aminoethylisothiouronium)(Sigma)治疗过的绵羊红血球(BioMerieux，Marcyl’Etoile，法国)进行花结试验从T淋巴细胞中除尽PBMC。除尽淋巴细胞的PBMC残留下来以密度2×106个细胞/毫升在培养烧瓶(Falcon)中在补充有AAG和1％自身血浆的RPMI1640培养基(本文后面称为完全RPMI培养基)中37℃贴壁培养2小时。将未贴壁细胞除去，贴壁细胞在存在IL-4(100U/毫升)和GM-CSF(100毫微克/毫升)的完全RPMI培养基中培养。在第二天和第四天通过用加入IL-4(100U/毫升)和GM-CSF(100毫微克/毫升)的新鲜培养基替换培养基来饲养培养物。在第五天，将未粘壁细胞群用作为富含树状细胞的物源。
结花结的T细胞用氯化铵(160mM)处理以裂解绵羊红血球，并冲洗。通过使偶合到磁性微珠(Miltenyi Biotech，德国)上的抗-CD8单克隆抗体的负选择和通过MACS(依据制造商的建议)的分选，将CD4+T淋巴细胞从结花结的T细胞中分离出。将淋巴细胞冷冻，在与树状细胞共培养前当天解冻。IV.混合淋巴细胞/树状细胞培养在37℃，5％二氧化碳中，在存在约20微克No.2批的MAGE-A1①蛋白质的情况下，将树状细胞(5×105个/毫升)在补充有IL-4(100U/毫升)，GM-CSF(100毫微克/毫升)和TNF-α(1毫微克/毫升)的完全培养基中温育18-20个小时。将细胞冲洗，并在存在IL-6(1000U/毫升)和IL-12(10毫微克/毫升)的情况下，以每个园底培养皿104个加入到200微升IMDM培养基(补充有AAG和10％人类血清)(本文后面称为完全IMDM培养基)中的105个自身CD4+T淋巴细胞中(图1)。在第七天和第十四天用新鲜负载No.2批MAGE-A①蛋白质的自身树状细胞重新刺激CD4+T淋巴细胞，并将CD4+T淋巴细胞在补充有IL-2(10U/毫升)和IL-7(5毫微克/毫升)的完全iscove培养基中培养。第四周，用等量的No.1批的透过的蛋白质实施刺激作用。
在第35天当用负载蛋白质MAGE-A①的自身EBV-B细胞刺激时，对含有增殖的CD4+T细胞的微培养物评定它们产生IFN-γ的能力。使用另一种蛋白质的原因是为了避免考虑CD4+T细胞对抗包含在用来负载树状刺激子细胞的蛋白质中的污染物。在存在20微克/毫升的蛋白质MAGE-A①或卵清蛋白(OVA)(Sigma)的情况下将自身EBV-B细胞温育18-20个小时作为负对照物。将蛋白质脉冲的EBV-B细胞冲洗，并与约3000个CD4+T淋巴细胞一起以约20,000个细胞每个园底微型培养皿分布补充有IL-2(25U/毫升)的150微升的完全IMDM培养基中。20个小时后，收集上清液，使用MedgenixDiagnostics-Biosource(Fleurus，比利时)的试剂通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)测定上清液中IFN-γ的含量。V.定向MAGE-A1抗原的CD4+T细胞克隆体微量培养物G3，在用蛋白质MAGE-A①刺激后产生大量的IFN-γ，其是通过使用负载蛋白质MAGE-A①的作为刺激子细胞(5×103到10×104个细胞每个微型培养皿)的自身EBC-B细胞的有限稀释来克隆的。由于自身树状细胞的有限提供，所以将这些刺激子细胞使用在克隆步骤中。同种异型LG2-EBV-B细胞(5×103到10×104个细胞每个微型培养皿)作为饲养细胞添加。CD4+T细胞克隆体一周重新刺激一次，并在补充有IL-2(50U/毫升)和0.5毫微克/毫升的纯PHA(HA16，MurexDiagnostics，Dartford，英国)的完全IMDM培养基中培养。建立的CD4+T细胞克隆体每周用新鲜的培养介质补充一次，并以1-2周的间隔用饲养细胞(在24个培养皿板中的每个培养皿中1.5×106同种异型PBL加5×105LG2 EBV-B细胞)培养。获得CD4+T克隆体LB650-CTL488/G3.14(本文后面称为克隆体14)。它识别负载蛋白质MAGE-A①的自身EBV-B细胞(图2)。
克隆体14对负载蛋白质MAGE-A1的细胞的识别作用被抗-HLA-DR抗体废除。在37℃8％二氧化碳下，在连续存在不含防腐剂的单克隆抗体(以1/20稀释度使用)的情况下，将MAGE-A①脉冲的EBV-B细胞与克隆体14共培养24小时。抗克隆抗体2B6(抗HLA-DR)废除了识别作用，而在存在单克隆抗体W6/32(抗HLA-A，B，C)的情况下识别作用没有改变。
VI. CD4克隆体14识别HLA-DRB1*15上的MAGE-A1肽EYVIKVSARVRF(SEQ ID NO7)
为了确定CD克隆体14对MAGE-A1肽的识别作用，将对应MAGE-A1蛋白质序列(SEQ ID NO2)的重叠部分的16个氨基酸肽负载在自身EBV-1细胞上，进行识别作用测试。使用进行瞬间NH2-末端保护作用的F-moc在固相上合成肽，并使用质谱仪定性。所有肽大于80％是纯的，如分析HPLC所显示的。首先将冻干的肽溶解在DMSO中，2毫克/毫升，然后在稀释在iscove培养基中，以浓度5微克/毫升使用。在37℃在不同肽中温育EBV-B细胞2小时，标示的浓度表示在温育步骤期间它们的浓度。将它们以约10,000个细胞每个园底微型培养皿与约2,500个CD4+T淋巴细胞一起在补充有IL-2(25U/毫升)的100微升的完全IMDM培养基中分布。18-20个小时后，收获上清液并测定IFN-γ分泌。使用Medgenix Diagnostics-Biosource(Fleurus，比利时)的试剂在实验室中发展的ELISA(酶联免疫吸附测定法)(20-4000pg/毫升)测定IFN-γ的产出。两种肽评分为正，即VKVLEYVIKVSAPVRF(氨基酸277-292；SEQ ID NO3)和EYVIKVSARVRFFFPS(氨基酸281-296；SEQ ID NO4)(图3)。它们有12个氨基酸重叠。不象有I类分子呈递的肽，有II类分子呈递的肽长度是变化的并且容许氨基和羧基末端的扩展，因为在II类分子沟中它们的末端不是固定的。因此，精确确定这种肽的长度是很困难的。对其序列包括在两个正16氨基酸肽的序列中的另一组12氨基酸肽进行测试(图4)。肽EYVIKVSARVRF(氨基酸281-292；SEQ ID NO7)可由克隆体14很好地识别(图4)。通过将刺激子细胞与10nM的这种肽一起温育获得刺激作用的半量最大值。将这个结果与用在HLA II类分子上由CD4+T细胞识别的其他MAGE表位获得的结果进行比较。例如，需要10nM的MAGE-A3诱导抗-MAGE-A3 CD4+T克隆体的半量最大IFN-γ产出。
测定患者LB650的血清学类型为DRB1*0701，DRB1*15和DRB4*01和DRB5*0101。为了鉴别呈递HLA-DR分子，测定表达DRB1*0701，DRB1*15和DRB4*01或DRB5*0101的其他EBV-B细胞种系。所有以及仅表达DRB1*15的细胞种系能呈递MAGE-A1281-292肽到克隆体14上(表2)。
表2克隆体14在HLA-DRB1*15上识别MAGE-A1肽EYVIKVSARVRF(SEQ ID NO7)
自身LB650EBV-B细胞或同种异型EBV-B细胞用1uM肽EYVIKVSARVRF(SEQ ID NO7)脉冲2小时并冲洗。在园底微型培养皿中将10,000肽脉冲EBV与3,000个CD4克隆体细胞一起温育18个小时。通过ELISA(酶联免疫吸附测试法)测定上清液中的IFN-γ产出。
实例2克隆体14对其他MAGE蛋白质的识别作用与本文所描述的MAGE-A1 HLA结合肽同源的肽序列在其他癌症抗原中发现，包括MAGE-A4。如，合成MAGE-A4肽YVKVLEHVVRVNARVR(SEQ ID NO13)和LEHVVRVNARVRIAYP(SEQ ID NO14)。为了确定CD4+T细胞克隆体是否识别这些MAGE-A4肽，依据上面描述的测试法，这些肽可用来负载抗原呈递细胞(如EBV-B细胞)来测定克隆体14的识别作用。为了确定CD4+T细胞克隆体是否能识别其他癌症相关抗原，重组蛋白质(如MAGE蛋白质)或对应这些肽的同源区域的其他合成肽也可如上述使用。克隆体14识别的同源肽可被认为是本文所描述的MAGE-A1肽的功能变体。
本发明的其他方面对熟练的技术人员是显然的，不需要在这里重复。本文所引用的每个参考文献全文参考收入本篇。
所使用的术语和表达是用作为描述的，不是用作为限制，没有意图在使用这些术语和表达中排除所显示和描述的性质或其部分的任何等同物，可以理解的是多种修正包括在本发明的范围内。
序列表<110>Van Snick，JacquesLethe，BernardChaux，PascalBoon-Falleur，ThierryVan der Bruggen，Pierre<120>由HLA II类分子呈递的MAGE-A1肽<130>L0461/7063WO<140>PCT/US00/16287<141>2000-06-14<150>US 09/336,091<151>1999-06-18<160>72<170>FastSEQ的Windows 3.0版<210>1<211>1624<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1gttttcaggg gacaggccaa cccagaggac aggattccct ggaggccaca gaggagcacc60aaggagaaga tctgcctgtg ggtcttcatt gcccagctcc tgcccacact cctgcctgct 120gccctgacga gagtcatcat gtctcttgag cagaggagtc tgcactgcaa gcctgaggaa 180gcccttgagg cccaacaaga ggccctgggc ctggtgtgtg tgcaggctgc cacctcctcc 240tcctctcctc tggtcctggg caccctggag gaggtgccca ctgctgggtc aacagatcct 300ccccagagtc ctcagggagc ctccgccttt cccactacca tcaacttcac tcgacagagg 360caacccagtg agggttccag cagccgtgaa gaggaggggc caagcacctc ttgtatcctg 420gagtccttgt tccgagcagt aatcactaag aaggtggctg atttggttgg ttttctgctc 480ctcaaatatc gagccaggga gccagtcaca aaggcagaaa tgctggagag tgtcatcaaa 540aattacaagc actgttttcc tgagatcttc ggcaaagcct ctgagtcctt gcagctggtc 600tttggcattg acgtgaagga agcagacccc accggccact cctatgtcct tgtcacctgc 660ctaggtctct cctatgatgg cctgctgggt gataatcaga tcatgcccaa gacaggcttc 720ctgataattg tcctggtcat gattgcaatg gagggcggcc atgctcctga ggaggaaatc 780tgggaggagc tgagtgtgat ggaggtgtat gatgggaggg agcacagtgc ctatggggag 840cccaggaagc tgctcaccca agatttggtg caggaaaagt acctggagta ccggcaggtg 900ccggacagtg atcccgcacg ctatgagttc ctgtggggtc caagggccct cgctgaaacc 960agctatgtga aagtccttga gtatgtgatc aaggtcagtg caagagttcg ctttttcttc 1020ccatccctgc gtgaagcagc tttgagagag gaggaagagg gagtctgagc atgagttgca 1080gccaaggcca gtgggagggg gactgggcca gtgcaccttc cagggccgcg tccagcagct 1140tcccctgcct cgtgtgacat gaggcccatt cttcactctg aagagagcgg tcagtgttct 1200cagtagtagg tttctgttct attgggtgac ttggagattt atctttgttc tcttttggaa 1260ttgttcaaat gttttttttt aagggatggt tgaatgaact tcagcatcca agtttatgaa 1320tgacagcagt cacacagttc tgtgtatata gtttaagggt aagagtcttg tgttttattc 1380agattgggaa atccattcta ttttgtgaat tgggataata acagcagtgg aataagtact 1440tagaaatgtg aaaaatgagc agtaaaatag atgagataaa gaactaaaga aattaagaga 1500tagtcaattc ttgccttata cctcagtcta ttctgtaaaa tttttaaaga tatatgcata 1560cctggatttc cttggcttct ttgagaatgt aagagaaatt aaatctgaat aaagaattct 1620tcct 1624<210>2<211>309<212>PRT<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens<400>72Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu1 权利要求
1.一种分离的MAGE-A1 HLA II类结合肽，包括结合HLA II类分子的SEQ ID NO2氨基酸序列的片段，或包括一种或多种氨基酸添加，替换或缺失的其功能变体。
2.根据权利要求1的分离的HLA II类结合肽，其中分离肽包括SEQ ID NO7列出的氨基酸序列或其功能变体。
3.根据权利要求2的分离的HLA II类结合肽，其中分离肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQID NO4，和SEQ ID NO7。
4.根据权利要求2的分离的HLA II类结合肽，其中分离肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，和SEQ ID NO7。
5.根据权利要求1的分离的HLA II类结合肽，其中分离肽包括内体导向信号。
6.根据权利要求5的分离的HLA II类结合肽，其中内体导向信号包括人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
7.根据权利要求1的分离的HLA II类结合肽，其中分离肽是不可水解的。
8.根据权利要求7的分离的HLA II类结合肽，其中分离肽是从包括含有D-氨基酸的肽的下列肽组中选取的，包括包括-psi[CH2NH]-还原的酰胺肽键的肽，包括-psi[COCH2]-酮亚甲基肽键的肽，包括-psi[CH(CN)NH]-(氰亚甲基)氨基肽键的肽，包括-psi[CH2CH(OH)]-羟基乙烯基肽键的肽，包括-psi[CH2O]-肽键的肽，包括-psi[CH2S]-硫代亚甲基肽键的肽。
9.一种组合物，包括分离的MAGE-A1 HLA I类结合肽和分离的MAGE-A1 II类结合肽。
10.根据权利要求10的组合物，其中MAGE-A1 HLA I类结合肽和MAGE-A1 HLA II类结合肽组合为多表位多肽。
11.根据权利要求9的组合物，其中分离的MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ ID NO7的氨基酸序列或其功能变体。
12.根据权利要求11的组合物，其中分离的MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ IDNO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
13.根据权利要求11的组合物，其中分离的MAGE-A1 HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ IDNO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
14.根据权利要求9的组合物，其中分离的MAGE-A1 HLA II类结合肽包括内体导向信号。
15.根据权利要求14的组合物，其中内体导向信号包括人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
16.一种分离的核酸，编码从下列组中选取的肽，包括权利要求1的肽，权利要求2的肽，权利要求3的肽，权利要求4的肽，权利要求5的肽。
17.根据权利要求16的分离的核酸，其中核酸包括SEQ ID NO12列出的核苷酸序列。
18.一种表达载体，包括可操作地结合启动子的权利要求17的分离的核酸。
19.根据权利要求18的表达载体，其中核酸由SEQ ID NO12列出的核苷酸序列构成。
20.根据权利要求18的表达载体，进一步包括编码HLA-DRB1*15分子的核酸。
21.一种宿主细胞，其用从下列组中选取的表达载体转染或转化，包括权利要求18的表达载体，权利要求19的表达载体，和权利要求20的表达载体。
22.一种宿主细胞，其用从下列组中选取的表达载体转染或转化，包括权利要求18的表达载体，权利要求19的表达载体，其中宿主细胞表达HLA-DRB1*15分子。
23.一种选择性地增加含有对MAGE-A1 HLA II类结合肽特异的CD4+T淋巴细胞的T淋巴细胞群的方法，包括将分离的T淋巴细胞群与呈递MAGE-A1 HLA II类结合肽和HLA II类分子的复合体的足以选择性地增加含有CD4+T淋巴细胞的T淋巴细胞群的量的试剂相接触。
24.根据权利要求23的方法，其中试剂是与MAGE-A1蛋白质或其HLA II类结合片段接触的抗原呈递细胞。
25.根据权利要求23或24的方法，其中HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ ID NO7列出的氨基酸序列或其功能变体。
26.根据权利要求23或24的方法，其中HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，和SEQ ID NO7。
27.根据权利要求23或24的方法，其中HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，和SEQ ID NO7。
28.根据权利要求24的方法，其中MAGE-A1蛋白质或其HLAII类结合肽包括人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
29.一种诊断特点在于表达MAGE-A1的病变的方法，包括将从受试体分离的生物样品与对MAGE-A1 HLA II类结合肽特异的试剂接触，确定试剂和MAGE-A1 HLA II类结合肽之间的相互作用来确定病变。
30.根据权利要求29的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ ID NO7的氨基酸序列或其功能变体。
31.根据权利要求30的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
32.根据权利要求30的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
33.一种诊断特点在于表达与HLA II类分子形成复合体的MAGE-A1 HLA II类结合肽的病变的方法，包括将从受试体分离的生物样品与结合复合体的试剂接触，确定复合体与试剂之间的相互作用来确定病变。
34.根据权利要求33的方法，其中HLA II类分子是HLA-DRB1/13分子，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ IDNO7的氨基酸序列或其功能变体。
35.根据权利要求34的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
36.根据权利要求34的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
37.一种治疗患有特点在于表达MAGE-A1的病变的受试体的方法，包括给受试体服用足以减轻病变的量的MAGE-A1 HLAII类结合肽。
38.根据权利要求37的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括内体导向信号。
39.根据权利要求38的方法，其中内体导向信号包括人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
40.根据权利要求38的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ ID NO7的氨基酸序列或其功能变体。
41.根据权利要求40的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
42.根据权利要求40的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
43.一种治疗患有特点在于表达MAGE-A1的病变的受试体的方法，包括给受试体服用一定量的MAGE-A1 HLA I类结合肽和足以减轻病变的量的MAGE-A1 HLA II类结合肽。
44.根据权利要求43的方法，其中MAGE-A1 HLA I类结合肽和MAGE-A1 HLA II类结合肽结合成多表位多肽。
45.根据权利要求43的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括内体导向信号。
46.根据权利要求45的方法，其中内体导向信号包括人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
47.根据权利要求43的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ ID NO7的氨基酸序列或其功能变体。
48.根据权利要求47的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
49.根据权利要求47的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
50.一种治疗患有特点在于表达MAGE-A1的病变的受试体的方法，包括给受试体服用足以减轻病变的量的选择性地增加受试体内HLA II类分子和MAGE-A1 HLA II类结合肽的复合体的存在的试剂。
51.根据权利要求50的方法，其中HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ IDNO7的氨基酸序列或其功能变体。
52.根据权利要求51的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
53.根据权利要求51的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
54.根据权利要求50的方法，其中试剂包括MAGE-A1 HLA II类结合肽。
55.根据权利要求54的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括内体导向信号。
56.根据权利要求55的方法，其中内体导向信号包括人类不变链Ii或LAMP-1的内体导向部分。
57.一种治疗患有特点在于表达MAGE-A1的病变的受试体的方法，包括给受试体服用足以减轻病变的量的自身CD4+T淋巴细胞，其中CD4+T淋巴细胞对HLA II类分子和MAGE-A1 HLA II类结合肽的复合体特异。
58.根据权利要求57的方法，其中HLA II类分子是HLA-DRB1/13分子，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ IDNO7的氨基酸序列或其功能变体。
59.根据权利要求58的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
60.根据权利要求58的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
61.一种鉴别MAGE-A1 HLA II类结合肽的功能变体的方法，包括选取MAGE-A1 HLA II类结合肽，结合MAGE-A1HLA II结合肽的HLA II类分子，由HLA II类结合分子呈递的MAGE-A1 HLA II类结合肽刺激的T细胞；诱变MAGE-A1 HLA II类结合肽的第一氨基酸残基以制备变体肽；确定变体肽与HLA II类结合分子的结合以及对T细胞的刺激作用，其中变体肽结合HLA II类结合分子并且由HLAII类结合分子呈递的变体肽刺激T细胞说明变体肽是功能变体。
62.根据权利要求61的方法，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ ID NO7的氨基酸序列或其功能变体。
63.根据权利要求61的方法，进一步包括步骤比较MAGE-A1 HLA II类结合肽对T细胞的刺激作用和功能变体对T细胞的刺激作用，来确定功能变体刺激T细胞的有效性。
64.一种选择性地结合具有包括SEQ ID NO7的表位的多肽的分离多肽，条件是分离多肽不是HLA II类分子。
65.根据权利要求64的分离多肽，其中分离多肽是抗体。
66.根据权利要求65的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
67.根据权利要求64的分离多肽，其中分离多肽是从下列组中选取的抗体片段，包括Fab片段，F(ab)2片段或包括对MAGE-A1 HLA II类结合肽有选择性的CDR3区域的片段。
68.一种分离的CD4+T淋巴细胞，其选择性地结合HLA II类分子和MAGE-A1 HLA II类结合肽的复合体。
69.根据权利要求68的分离的CD4+T淋巴细胞，其中HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ ID NO7的氨基酸序列或其功能变体。
70.根据权利要求69的分离的CD4+T淋巴细胞，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
71.根据权利要求69的分离的CD4+T淋巴细胞，其中MAGE-A1 HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
72.一种分离的抗原呈递细胞，其包括HLA II类分子和MAGE-A1 HLA II类结合肽的复合体。
73.根据权利要求72的分离的抗原呈递细胞，其中HLA II类分子是HLA-DRB1*15分子，MAGE-A1 HLA II类结合肽包括SEQ ID NO7的氨基酸序列或其功能变体。
74.根据权利要求73的分离的抗原呈递细胞，其中MAGE-A1HLA II类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
75.根据权利要求73的分离的抗原呈递细胞，其中MAGE-A1HLA II类结合肽由从下列组中选取的氨基酸序列构成，包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO7。
全文摘要
本发明描述了由MAGE－A1肿瘤相关基因编码的HLAII类结合肽,以及编码这种肽的核酸,和其相关的抗体。肽刺激CD文档编号C07K7/08GK1357006SQ00809119
公开日2002年7月3日 申请日期2000年6月14日 优先权日1999年6月18日
发明者贾克斯·范斯尼克, 伯纳德·利德, 帕斯考·乔克斯, 斯瑞·布恩－福尔尤, 皮埃尔·范德布鲁甘 申请人:路德维哥癌症研究院