用于α－氧代醛合成的官能化固相支持物的制作方法

专利名称：用于α－氧代醛合成的官能化固相支持物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于固相有机合成的官能化固相支持物，涉及制备这些支持物的方法及其应用，特别是涉及α-氧代醛肽或α-氧合醛肽的合成或其他有机分子，如二羟乙酸的非肽性衍生物等的合成。
本发明还涉及α-氧代醛肽，涉及采用所述官能化支持物制备它们的方法和其应用。特别是在制药工业，例如在合成疫苗领域或通过化学连接获得大分子的合成(由于采用化学选择性反应而偶联几个分子片段)，或创建产生微量滴定板或生物芯片(如DNA芯片)的组合库等领域。
有机分子的自动化合成，特别是肽大分子的固相合成，是由Merrifield首先开发的。此合成反应的一般模式如下将第一个N保护的氨基酸结合在一官能化的不溶性固相支持物上，末端氨基脱保护，延伸肽链(逐个偶联不同的氨基酸)，N末端氨基酸可能脱保护。然后，从树脂上切下多肽并同时脱去氨基酸侧链的保护。
已提议采用各种类型的不溶性固相支持物聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、多糖、酚醛树脂、二氧化硅、多孔玻璃和聚丙烯酰胺；最常用的支持物是聚丙烯酰胺和聚苯乙烯，更具体的是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
为了有效和提供足够的产量，固相支持物的合成取决于以下几种因素官能化树脂的选择，氨基酸保护基团的选择，反应条件的选择以及可以被组合以获得最终理想产物的不同肽的选择。
然而，目前使用的树脂不能直接产生该最终产物，例如从固相支持物的锚着官能团上产生带α-氧代醛官能团的产物。就合成含有α-氧代醛官能团的肽而言，惯常用的树脂不能获得α-氧代醛肽，而是得到前体形式，必须经过后续的均相转化来产生所需的官能团。
当前，在水性或部分水性介质中通过部分保护的或全部脱保护的肽片段(使用常规树脂固相合成预先获得)的化学连接，可得到大尺寸的肽结构物。
该方法导致在两种适当官能化的肽片段之间形成酰胺、硫酯、硫醚、噻唑烷、肟或腙类型的共价键。尤其是噻唑烷、肟和腙键对制备具有醛基的肽是必须的。
GeoheganKF等人(BioconjugateChem.，1992.3.138-146)描述了以均相定时氧化N末端部位(存在β-氨基醇时)的丝氨酸或苏氨酸获得带有N末端部位醛基的肽。得到的该N末端α-氧代醛基对其他肽片段的1，2-氨基硫醇基、羟氨基或肼官能团反应性高，因此使它们得以交联。
该方法需要制备β-氨基醇及其纯化，氧化和最后使产品与氧化试剂相分离。
美国专利5362852也描述了β-氨基醇的使用即均相定时氧化肽链中的2-羟氨基在该肽中产生α-氧代醛基，这是在N末端部位带有一丝氨酸或一苏氨酸的肽中或在已插入了一个羟基赖氨酸基团的肽中产生α-氧代醛基的例子。
与此相似，国际专利PCT申请WO94/25071描述均相定时氧化N末端带有一丝氨酸或苏氨酸的肽，在此肽的所述N末端形成α-氧代醛基。所述肽采用Sasrin树脂(由Bachem提供)以自动化方式合成。
关于产生C末端部位的醛基，目前仅有几种方法，其中一些方法要求在C末端部位形成α-氨基醛基。产生的肽缺点是不稳定，其他问题是差向立体异构作用等。
J.P.TAM等人(Proc.Natl.AcadSci，1998年8月，95，9184-9189)提出合成C末端部位带有糖醛基团(-NH-CH2-CHO)的肽。所述的这种合成是不能实施的，因为要求制备一间隔以及均相形成醛基。该固相只用于固相再熟化肽合成，此种合成不可能自动化，因为其最后一步发生在均相中。
在上述国际PCT申请WO94/25071中描述了C末端部位α-氧代醛基的导入，但是所述官能团不是与肽骨架直接连接，如所用的方法表明的那样肽链是固相合成的，采用了聚苯乙烯型树脂，C末端插入一条五个赖氨酸的序列，将丝氨酸接枝到该肽N末端的α或赖氨酸侧链的ε游离氨基上。将经此修饰的肽与固相支持物相分离，以均相定时氧化使形成N末端和C末端赖氨酸侧链的α-氧代醛基。
J.P.JAM等人(Proc.Natl.AcadSci，1998年8月，95，9184-9189)还描述了以类似方法在固相中获得的肽的C末端插入一赖氨酸残基，将一丝氨酸残基接枝到该赖氨酸侧链的氨基上，从支持物上切下肽，并定时均相氧化所述丝氨酸中的β-氨基醇，以获得α-氧代醛基功能。
在所有这些方法中都通过均相产生醛基使肽官能化，然后将肽从固相支持物上切下来。
因此，显然需要一种简单而可自动化的方法合成含有α-氧代醛基的有机产物，例如，C末端带有α-氧代醛基的肽，使用这类有机产物的目的，例如是作为酶的抑制剂，或作为药物学或药理学感兴趣的产品，或在化学连接的构架中带有α-氧代醛基的肽，以制备结构更复杂以及适合于实施这种方法的支持物。
本发明者因此给自己提出了以下任务，即提供一种适合于用α-氧代醛基官能化化学修饰有机分子的固相支持物，以及合成至少含有一个α-氧代醛基的化合物的方法，所述方法应满足以下要求-它必须能在一个步聚中，即在产物与固相支持物相分离的过程中，形成该α-氧代醛基；-将产物从固相支持物上裂解的步骤必须直接产生最终产物，亦即就肽合成而言，α-氧代醛肽是脱保护形式的；-该方法必须使用低成本试剂，并且效率好(产量高)、简单和可以自动化。
因此本发明的目的是一种用于合成至少含有一个α-氧代醛基的化合物的官能化固相支持物。该支持物的特征是它对应于以下分子式I 其中-S为固相支持物，至少其表面在水性或部分水性介质中具有良好的溶剂化性能；-n和m可以相同或不同，为0或1；-当n等于1时，Z为选自醚、硫醚、酯、胺、酰胺、磺酰胺、羟胺、肼、腙、噻唑烷、肟、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲官能团及其衍生物；-当n等于0时，Z为选自酯、酰胺、N-酰基羟胺、肼、腙、肟和噻唑烷官能团及其衍生物；-P1和P2可以相同或不同，或与它们相结合的氧原子一起形成一个环，代表氢原子或保护1、2位上羟基的官能团，此时P1和P2选自-R1、-(CO)R1、-(CO)OR1、-(SO2)OR1、-SiR’R”R、缩醛基和十六烷醛基(cetal)官能团；R，R’，R”和R代表线性、分枝状、环状、饱和或不饱和的1-18个碳原子的烷基、芳基或杂芳基；所述烷基、芳基或杂芳基可被一个或多个卤原子，一个或多个氨基、羟基、烃氧基、芳氧基、烷硫基代芳硫基部分或全部取代，-A和B可以相同或不同，它们代表线性、分支状或环状，饱和或不饱和的碳链，含有1-18个碳原子和可能含有1-7个选自以下基团的官能团羰基官能团、碳环、杂环、芳基和杂芳基，A和/或B还可以含有1-16个杂原子，优选1-16个氮或氧原子，并可被1-16个可受到适当保护的羟基或氨基所取代，-A和/或B的至少一个碳原子可以被以下一官能团所取代 其中，A’与A相同或不同；不同时，A’选自上面定义的其它A官能团；和-X’选自-OR1、-NR’R”基团，R、R’和R”为氢原子或如上所述定义的基团。作为举例和非限制性的例子有-合适的烷基是甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、乙烯基、烯丙基或苄基；-合适的芳基(芳族环)是苯基或羟甲苯基；-合适的杂芳基(芳族杂环化合物)是吡啶基、嘧啶基或吡嗪基；-合适的碳环是环戊基或环己基；-合适的杂环是哌嗪基；可取代所述烷基、芳基或杂芳基的卤族原子，例如氟、氯或溴；合适的烃氧基，例如是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、乙烯氧基和丙烯氧基(alloxy)；合适的芳氧基，例如是苯氧基或甲苯氧基类；合适的烷硫基例如甲硫基、乙硫基、丙硫基、或乙烯硫基；合适的芳硫基例如是苯硫基或甲苯硫基。
作为举例和非限制性例子，保护基P1和P2可以是如下基团-当P1和P2为-R1官能团时，-R1可以是甲基、叔丁基、对甲氧基苄基、甲氧基甲基、苄氧甲基、对甲氧基苄氧甲基、对甲氧基苯氧甲基、叔丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基甲基、三苯甲基、四氢吡喃基、愈创木酚基甲基等；-当P1和P2为-(CO)R1官能团时，-(CO)R1可以是乙酰基、苯甲酰基、对甲基苯甲酰基，新戊酰基等；-当P1和P2为-(CO)OR1官能团时，-(CO)OR1可以是-COOCH3、-COOC2H5、-COOCH2C6H5、9-芴基-甲氧基羰基等。
-当P1和P2为-(SO2)OR1官能团时，-(SO2)OR1可以是-(SO2)OCH3、-(SO2)OC2H5官能团等；-当P1和P2为-SiR’R”R”官能团时，-SiR’R”R可以是三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基等；-当P1和P2为缩醛或十六烷醛(cetal)官能团时，它们可以是亚苄基、异亚丙基等；-当P1和P2与它们所结合的氧原子一起形成一个环时，该环可以是1，3，2-(dioxathiolane)二氧硫杂环烷；然而，应清楚地理解任何羟基保护基团都可用作P1或P2基团，如Theodora.W.Greene和PeterG.M.Wuts在“有机合成中的保护基”，(1991，JohnWileyandSons.Inc出版)一书中所述。
令人惊奇的是，本发明这种官能化的支持物特别适合用来制备含有至少一个α-氧代醛基的化合物，并且这种制备无须事先合成醛。
另外，它们还具有许多优点能在温和条件下特异性地从支持物上裂解合成的化合物；与许多有机分子有相容性；如以下详述可以重复循环使用最初的支持物。
按照所述，支持物S的一个较佳实施方案，其可选自以下物质-多孔硼硅玻璃颗粒；-玻璃或硅制成的表面；按照所述支持物S的优选实施例，它选自以下物质-多孔硼硅玻璃颗粒；-玻璃或硅制的表面；-选自以下树脂聚丙烯酰胺树酯、聚丙烯酰胺一聚乙二醇树酯、聚乙二醇-聚苯乙烯树脂、交联的乙氧基化物-丙烯酸酯树脂和接枝了亲水性分子的聚乙烯、聚苯乙烯或聚丙烯类树脂。
这些树脂可从商品市场上购得，商品名为Spar(聚丙烯酰胺类树脂)、PEGA(聚丙烯酰胺-聚乙二醇类树脂)、TentaGel、ArgoGel、NovaSyn、NovaGel(聚乙二醇-聚苯乙烯类树脂)、Clear(交联的乙氧基化物-丙烯酸酯树脂)、Chiron、SynPhase-MD(接枝了甲基丙烯酸/二甲基丙烯酰胺酸共聚物的聚乙烯环)、SynPhase-HM(接枝了甲基丙烯酸羟基乙酯的聚乙烯环)等。
合适的玻璃表面，例如是显微镜载玻片。
本发明较佳的式I支持物中，例如，S是聚丙烯酰胺-聚乙二醇类树脂；m和n为1，B是-(CH2)2-CO-NH-链，Z是酰胺官能团，A是-CO-NH-(CH2)3-链，P1和P2一起形成异亚丙基保护官能团，和X’代表-NH-(CH2)3-NH2链。
本发明另一个较佳的式I支持物中，例如，S是聚丙烯酰胺-聚乙二醇类或聚乙二醇-聚苯乙烯类树脂，m和n代表O，Z是酰氨基，P1和P2一起形成异亚丙基保护基，和X’代表甲氧基。
本发明对应于分子式I另一个较佳的式1支持物中，S如以上所定义，m为1，n为0，Z是酰胺官能团，P1和P2一起形成异亚丙基保护基，X’为甲氧基，和B为以下基团 本发明对应于式I的另一较佳的式I支持物中，S如以上所定义，m和n为1，Z是酰氨基，P1和P2一起形成异亚丙基保护基，B是-(CH2)2-CO-NH-基团，A为以下基团 以及X’为以下基团 本发明对应于式I的另一较佳的式I支持物中，S如以上所定义，m为0，n为1，Z是氨基甲酸酯基，P1和P2一起形成异亚丙基保护基，X’为甲氧基，以及A为以下基团 本发明对应于以下分子式的另一较佳的式I支持物 其中，S如以上所定义，n＝0，m＝1，Z是酰胺官能团，X’为甲氧基，P1和P2一起形成异亚丙基，以及B是以下基团 本发明对应于以下分子式的另一较佳的式I支持物 其中，S如以上所定义，n＝0，m＝1，Z是酰胺官能团，X’为甲氧基，P1和P2一起形成异亚丙基，以及B为以下基团 本发明式I支持物可有利地用作固相支持物来合成α-氧代醛肽或至少含一个α-氧代醛基而官能化的其他有机分子，如二羟乙酸的衍生物。
本发明式I支持物也可用来合成寡核苷酸，特别是寡脱氧核苷酸，或合成至少含一个α-氧代醛基而官能化的脂质，所采用的熟知技术的描述可参见，例如“寡核苷酸的合成，实用方法”(1984年M.J.GAIT编，IRLPress，WashingtonD.C.)。本发明的式1化合物还可用于肽或蛋白质的自动化方式固相合成，其描述可参见，例如R.C.SheppardComp.Org.Chem，1979，5，352-355和R.B.MerrifieldScience，1986年4月18日，232，341-347。在这种合成中，应如已知的那样恰当地保护氨基酸的侧链。
本发明还涉及制备上述式I支持物的方法，所述方法的特征在于其包括将-具有式S-(B)m-Y的官能化固相支持物，其中B、S和m如上所定义，Y为亲核基团，B可被至少一种其他Y官能团(与式S-(B)m-Y所示官能团相同或不同)所取代。除了式S-(B)m-Y所示官能团外，在此情况下所述固相支持物是多官能化的。
-与选自酒石酸环酐或其衍生物之一的化合物，以及式II化合物 其中，n、A、P1、P2和X’如以上所定义，X为亲电子基团进行反应，按照本发明的含义，“亲核”意味着具有一对自由电子的基团，即供电子基团。“亲电子”意味具有低能量空分子轨道的基团，其能与亲核基团的自由电子对相互反应，即电子接受基团。
另外，当n＝1时，Y可以是亲电子基团，X可以是亲核基团。
根据本发明所述方法的一个优选形式实施方案，合适的亲电子基团(即n＝0时的X基团和n＝1时的X基团或Y基团)宜选自以下官能团-当n＝1时-CR2R3Cl、-CR2R3Br、-CR2R3I、-CR2R3OSO2R4、-CHO、-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、-SO2OR2、-SOOCl、琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、经亲电子激活剂转化的-COO-、-N＝C＝O(异氰酸酯)、-N＝C＝S(异硫氰酸酯)、-O-CO-OR2、-O-CO-Im，-O-COCl、-NR2-COCl和-NR2-CO-Im，其中Im是可能被取代的下式咪唑基团。 其中R2、R3和R4可以相同或不同，为氢原子、或含有1-18个碳原子的线性、分支状或环状、饱和或不饱和烷基，或芳基和杂芳基，所述烷基、芳基和杂芳基可被一个或多个氨基、羟基、烃氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基部分或全部取代。
-当n＝0时-CHO、-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、经亲电子激活剂转化的-COO-，R2为以上n＝1时所述的基团。
亲电子激活剂是一种能与羧酸根-COO-反应而赋予其亲电子性质的物质，这种物质是本领域技术人员熟知的。例如参见B.M.Trost和I.Fleming编著的“综合性有机合成，Comprehensiveorganicsynthesis”，PergamonPress，1991，1-9卷。
按照所述方法的另一优选实施方案，当n＝0或n＝1时，合适的亲核基团(即n＝0时的Y基团和n＝1时的X基或Y基团)宜选自以下官能团-OH、-SH、-COO-、-NHR5、-CONR5NH2、-N[R5(CO)]NH2、-N[R5O(CO)]NH2、-N[R5NH(CO)]NH2、-SO2NH2、-SO2NR5NH2、-ONH2、-(CO)ONH2和-C(NHR5)-CR5R6-SH，R5和R6具有与上述亲电子基团中所定义的R2至R4基团相同的含意。
根据式1支持物制备方法的一个优实施方案，在n＝0和X＝-COOR2，以及R2＝H时，该基团可能起着亲核和亲电子基团双重作用。在n＝0和X＝-COOH时，X可以是亲核基团，Y是亲电子基团。例如，如果X＝-COOH和Y＝-NHR5，X起亲电子基团作用。另一方面，如X＝-COOH和Y＝-CR2R3Cl，-CR2R3Br，-CR2R3I或-CR2R3OSO2R4，那么X起亲核基团作用。
这样固相支持物S-(B)m-Y与环状酒石酸环酐或其衍生物的反应，或与式II化合物的反应使得可能获得本发明式I的支持物。取决于所选择的X和Y官能团，可形成不同的Z基团。作为举例和非限制性实例有
-Z官能团＝＝醚(硫醚或胺)，可通过X＝-OH(-SH或-NHR5)与Y＝-CR2R3Cl、-CR2R3Br、-CR2R3I或-CR2R3OSO2R4(例如对甲苯磺酸盐或甲磺酰盐)反应而形成；-Z官能团＝＝酯(或酰胺)可通过X＝-OH(或-NHR5)与Y＝-COOR2、-COF、-COCl或COBr反应而形成；-Z官能团＝＝磺酰胺，可通过X＝＝-NHR5与Y＝-SO2OR2或-SOOCl反应而形成；-Z官能团＝＝羟胺或羟胺衍生物如N-酰基羟胺或N，O-酰基羟胺键，可通过X＝-ONH2或-(CO)ONH2与Y＝＝-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、-SO2OR2或-SOOCl反应而形成；-Z官能团＝＝肼或肼衍生物，可通过X＝-CONR5NH2、、-N[R5(CO)]NH2、-N[R5O(CO)]NH2、-N[R5NH(CO)]NH2或-SO2NR5NH2与Y＝-COOR2、-COF、-COCl、COBr、SO2OR2或-SOOCl反应而形成；-Z官能团＝＝腙或其衍生物(例如磺酰腙)，可通过X＝-CONR5NH2与Y＝-CHO反应而形成；-Z官能团＝＝噻唑烷，可在X＝-C(NHR5)-CR5R5-SH和Y＝-CHO之间形成；-Z官能团＝＝肟，可通过X＝-ONH2和Y＝-CHO之间的反应而形成；-Z官能团＝＝碳酸酯(-O-CO-O-)可通过X＝-O-CO-OR2，-O-CO-Im或-O-COCl和Y＝-OH之间的反应而形成；-Z官能团＝＝氨基甲酸酯(-NR2-CO-O-)，可通过X＝-NR2-COCl，-NR2-CO-Im或异氰酸酯和Y＝-OH之间的反应而形成；或通过X＝-O-CO-OR2，-O-CO-Im或-O-COCl和Y＝-NHR5之间的反应而形成；-Z官能团＝＝硫代氨基甲酸酯(-NR2-CS-O-)，可通过X＝异硫氰酸酯和Y＝-OH之间的反应而形成；-Z官能团＝＝脲，可通过X＝-NR2-CO-Im，-NR2-CO-Im或异氰酸酯和Y＝-NHR5之间的反应而形成；-Z基团＝＝硫脲，可通过X＝异氰酸酯和Y＝-NHR5之间反应而形成；根据制备本发明分子式I支持物方法的一个优选实施方案，所述酒石酸的环酐或其衍生物是＝二-O-苯甲酰酒石酸酐或二乙酰酒石酸酐；根据制备本发明分子式I支持物方法的另一优选实施方案，当P1和P2为氢原子，而具有分子式S-(B)m-Y的固相支持物与式II化合物反应时，可以在具有式S-(B)m-Y的固相支持物与式II化合物反应后而在本发明式I支持物用于合成含有至少一个α-氧代醛基的化合物之前，在1，2位上引入含保护性羟基的非氢原子的P1和P2基团，即羟基保护基；根据本发明方法另一优选实施方案，式II化合物为酒石酸或其衍生物。在这种情况下，当式II的基团A为使-OP2基团的α位上包含羟基时，固相支持物S-(B)m-Y与式II化合物之间的反应相当于酒石酸或酒石酸衍生物接枝到固相支持物S-(B)m-Y上。
酒石酸的这类衍生物的非限制性例子有-酒石酸盐(钠盐，锂盐)-二苯甲酰基—酒石酸-二对甲苯酰基酒石酸-二异丙基酒石酸-二新戊酰酒石酸-二乙酰基酒石酸-间位酒石酸-菊苣苷酸(cichorinicacid)-tartralinicacid-4-氟-tartrani licacid-4-氯-tartranilicacid-4-甲基-tartranil icacid-4-硝基-tartranilicacid-酒石酸-单-N-辛胺-N-(2，4-二氯苯基)-2，3-二羟基琥珀酰胺酸-2，3-二乙酸基-N-[1-(1-萘基)乙基]琥珀酰胺酸-4-乙酸基-2，5-二氧-四氢呋喃-3-基乙酸酯-3，4-二羟-2，5-二氧四氢呋喃二对-甲苯甲酸酯-酒石酸二甲酯-酒石酸二乙酯-酒石酸二丁酯-酒石酸二叔丁酯-酒石酸二异丙酯-二琥珀酰亚氨酒石酸-二磺基琥珀酰亚氨酸
-二异戊酒石酸-酒石酸二苄酯-3-吡碇甲基酒石酸-2，3-O-异亚丙基酒石酸二甲酯-2，3-O-亚苄基酒石酸二甲酯-2，3-O-(1-苯基亚乙基)酒石酸二甲酯-2，3-O-异亚丙基酒石酸二乙酯-2，3-O-亚苄基酒石酸二甲酯-O，O’-双(三甲基甲硅烷基)酒石酸二异丙酯-二酒石酸苯基丙醇氨-二酒石酸烟碱醇酯-1，3，2-二氧硫烷4，5-二羧酸二甲酯-2苯基-1，3-二氧烷4，5-二羧酸二乙酯-2苯基-1，3-二氧烷4，5-二羧酸盐二甲酯-2，3-二羟基琥珀酸二苄酯-2，3-二羟基琥珀酸二[2-氧-2-(4-三氟甲基)苯基]乙酯当固相支持物S(B)m-Y与酒石酸环酐(或其衍生物之一)或式II化合物之间发生反应时，以及当式II化合物是酒石酸(或其衍生物之一)的酯时，所述环酐或所述酯可在与所述固相支持物反应前经历水解或皂化反应，其目的是产生能与官能化固相支持物反应的游离酸官能团。
根据本发明方法的另一优选实施方案，式II化合物可选自以下物质粘酸(半乳糖二酸)，糖酸，葡糖二酸(其中X’＝-OH，n＝1，A＝-CH(OH)-CH(OH)-，X＝-COOH，P1＝P2＝H，这三种酸在它们各自的立体化学结构上不同)，它们的盐(钾盐，钠盐)和它们的衍生物。
根据本发明方法的另一优选实施方案，所述方法包括使-具有式H2N-(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-S的官能化固相支持物，其中S定义如前，-与2，3-O-异亚丙基酒石酸二甲酯反应；根据本发明方法的另一优选实施方案，所述方法包括使-具有式H2N-(CH2)3-NH-CH2-CO-NH-S的官能化固相支持物，其中S定义如前，-与2，3-O-异亚丙基酒石酸二甲酯反应；本发明还涉及具有如下分子式III的支持物 其中S、B、A、n、m、Z、P1和P2定义如上，Y’为一有机成分。
较佳的，Y’为一种化合物，或由选自脂、核苷酸(可被取代或不被取代)和氨基酸的几种化合物形成的链(可含有脂)。一般讲，Y’为脂、寡核苷酸、肽、拟肽等。Y’可含有一种或多种类型的上述化合物，Y’也可是均聚物或杂聚物。
借助于能提供氨基酸、脂、核苷酸等接枝到支持物上的官能团的适当试剂，经对-COX’官能团的化学修饰或衍生后，可从式I支持物获得式III支持物。例如，可设想将二胺、二醇或氨基醇接枝到COX’官能团上，支持物上具有导入的氨基或游离醇基就能合成修饰的肽。
可从本发明式I支持物获得上述式III支持物，例如可参见以下描述“固相有机反应”四面体报告编号394，Tetrahedron，1996，52，4527-4554和“固相有机反应II”四面体报告编号418，Tetrahedron，1997，53，5643-5678。
上述式III支持物可用于保存合成的产品，使所述产品在使用时与支持物分离，同时形成α-氧代醛基。
本发明还涉及合成至少含有一个α-氧代醛基的有机化合物的方法，其特征在于，此方法在固相中进行，包括以下步骤-制备上述式I支持物，所述制备按上述方法进行；-可能的话，衍生改变式I支持物的X’基团以导入一官能团，使能在上述有机化合物Y’的支持物上进行制备；-固相制备化合物Y’；-如果P1和P2不是氢原子，对根据上述式III支持物受P1和P2保护的1，2位上的两个羟基脱保护；-定期固相氧化，和-分离产生的、至少由一个α-氧代醛基而官能化的产物。
式I支持物的X’基团的衍生化步骤宜包括接枝一个联氨，二元醇或氨基醇。
关于受P1和P2保护的1，2位上的两个羟基的脱保护可能步骤，可在本领域技术人员熟知的条件下进行。例如，见“有机合成中的保护基”，ThedoraW.Greene和PeterG.M.Wuts，1991，JohnWiley和Sons股份有限公司，或“综合有机合成”，B.M.Trost和I.Fleming编，PergamonPress，1991，第1-9卷。
根据一优选实施方案，二元醇-1，2的脱保护在酸性介质中(较佳在三氟乙酸中)进行。
如果P1和P2为缩醛基、十六烷醛基，-SiR’R”R、叔丁基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基时，非限制性例子在酸性介质中脱保护是适宜的。
当用本发明式I支持物合成的产物是肽或蛋白质时，该脱保护步骤可能同时脱去所述肽或所述蛋白质氨基酸侧链的保护。
根据本发明方法的另一优选形式的实施方案，二元醇-1，2(1，2位上的羟基)的脱保护发生在碱性介质中进行，当P1和P2为-(CO)R1酯基团时，在碱性介质中脱保护是适宜的。
脱保护步骤产生具有以下分子式IV所示产物 宜用过碘酸钠在水/乙酸溶剂中进行定时氧化，例如参见L.Zhang等人在Pro.Natl.Acad.Sci.1998，95，9184-9189中的描述。当借助本发明式I支持物合成的产物是肽或蛋白质时，这类溶剂可使所述肽增溶。采用水/乙酸溶剂也解释了为什么选自本发明式I支持物的固相支持物S应具有良好的溶解性能是重要的。
然而，可采用其他混合溶剂来进行定时氧化步骤。如果采用本发明式I支持物来合成含有甲硫氨酸的肽，可在柠檬酸/甲醇/二甲硫缓冲液中进行定时氧化，当用本发明式I支持物来合成衍生加入了脂肪酸链的肽时，可在叔丁醇/乙酸/水混合液中进行定时氧化。
定时氧化式IV产物的结果是形成了含有α-氧代醛基而官能化的产物Y’，以及形成了具有以下分子式V的固相支持物OHC-(A)n-Z-(B)m-S(V)其中，S，B，A，Z，n和m如上所定义。
凭借上述固相氧化步骤，本发明方法以特别优良方式，从支持物上释放产物同时该产物在支持物上的锚着点形成α-氧代醛官能团。当支持物上合成的产物为肽时，在脱保护的肽上进行的固相定时氧化步骤同时使肽从支持物上释放下来，无需进行其他均相脱保护步骤，并在该肽锚着于支持物的点上形成α-氧代醛基，这可能涉及所述肽或其侧链的终止。
然后，通过例如过滤步骤，接着用高效液相色谱法，以原先已知技术分离如此形成的含α-氧代醛基的官能化产物。
关于上述式V固相支持物，以再使用的观点上看，其优点是可以再循环或再生，即可与适当的试剂反应产生上述本发明式I支持物，如以下所详述。
本发明还涉及具有如下特征的肽，在所述肽N末端以外某位置含有至少一个α-氧代醛基，及不以酰胺键与赖氨酸或鸟氨酸侧链的氨基结合，它们可按上述方法获得。
这样的肽可有利地用于化学连接反应中。
本发明还涉及合成有机化合物库的方法，其特征在于，此方法包括-提供具有分子式S-(B)m-Y的多种固相支持物表面，其中B、S、Y和m如以上所定义；-使它们与选自酒石酸环酐或其衍生物的化合物和式II化合物反应 其中n、A、P1、P2、X’和X定义如上，以获得可用于合成含α-氧代醛基的化合物的支持物；-使得到的支持物与有机分子混合物反应，如上所述关于从式I支持物得到式III支持物；和-获得有机化合物库。
所述有机分子与上述支持物反应，例子见“Thecombinatorialindex”，1998，AcademicPress，London中所述。
所述有机分子可能是氨基酸、核苷酸或脂类，获得的有机化合物是肽、寡核苷酸或脂质。
本发明还涉及有机化合物库，其特征在于是根据上述方法获得的。
该化合物库的有机化合物可从不溶性支持物上分离得到以便以后使用于如上述关于合成含α-氧代醛基的有机合物的方法中。
本发明还涉及选自酒石酸环酐或其衍生物之一的化合物和式II化合物的用途 其中，n、A、P1、P2和X’及X与上面关于固相支持物衍生化所定义的相同，所述固相支持物至少其表面在水性或部分水性介质中具有良好的溶剂化性能，得到的支持物可用于固相合成含有至少一个α-氧代醛基的化合物。
至少其表面在水性或部分水性介质中具有良好溶剂化性能的所述固相支持物，优选对应于分子式S-(B)m-Y的支持物，S、B、m和Y定义如上。
酒石酸环酐或其衍生物之一，优选二-O-苯甲酰酒石酸酐或二乙酰酒石酸酐。
式II化合物优选其A基团在OP2基团的α位包含一羰基以及A基团为酒石酸或酒石酸衍生物。
另外，式II化合物选自包括粘酸、糖酸、葡糖二酸、它们的盐和衍生物的家族。
本方法的另一内容是制备在固相支持物上的诊断试剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤-将用上述方法获得的含有至少一个α-氧代醛基的有机化合物连接到适当官能化的微量滴定板上-获得其上共价固定了所述有机化合物的微量滴定板。
获得的试剂可用于开发免疫试剂或药理试验。
所述有机化合物宜为肽、寡核苷酸或脂质。
所述微量滴定板，优点是官能化，这样使所述有机化合物能与肟、噁唑烷或腙键相连。
本发明另一内容是获得生物芯片的方法，其特征在于，该方法包括接枝用上述方法获得的含有至少一个α-氧代醛基的寡核苷酸到固相支持物的步骤。
在这样获得的生物芯片中，寡核苷酸共价固定于固相支持物。
这些生物芯片使得追踪基因表达(按Science，1995，270，467-470提出的概念)成为可能。
根据本发明方法的另一个优秀实施方案，所述固相支持物是玻璃或硅制成的表面。
根据本发明方法的一个优秀实施方案，所述生物芯片是AND芯片。
除了上述内容，本发明还包括其它内容，这将从以下描述、并参考本发明支持物的实施例和本发明α-氧代醛基合成方法的实施例、以及附图呈现出来。附图如下

图1和图2，合成本发明式I支持物的步骤。
图3，用本发明支持物合成的肽3-6和肽9，以及用常规固相技术合成的肽10，12和14。
图4，肽18，为经脂肪酸修饰的肽，含有α-氧代醛基，所述肽用本发明支持物合成。
图5，肽19，聚赖氨酸类型的由8个氯乙酰基和一个α-氧合酰醛基而官能化的肽，所述肽用本发明支持物合成。
图6，肽20，聚赖氨酸类型的由16个氯乙酰基和一个α-氧合酰醛基而官能化的肽，所述肽用本发明支持物合成。
图7和图8，用本发明肽进行腙类的化学联接反应。
图9，用本发明肽进行噻唑烷类的化学联接反应。
图10，用本发明肽进行肟类的化学联接反应。
图11，用本发明支持物合成的带有末端α-氧代醛基的肽21。
然而，应清楚地理解，给出的这些实施例只是为了阐述本发明的目的，不以任何方式构成对本发明的限制。
实施例1从氨基-PEGA树脂和(+)-2，3-O-异亚丙基-D-酒石酸二甲酯合成本发明分子式I支持物图1总结了此合成中的不同步骤。
45分钟内将2ml(9.16mmol)的(+)-2，3-O-异亚丙基-D-酒石酸二甲酯(由ACROS提供)1，以下称为IPT，加入到10ml(120mmol)的1，3-二氨基丙烷中。室温搅拌5小时30分钟后，减压蒸发除去过量的1，3-二氨基丙烷，分离得到化合物IPT-1，其核磁共振和红外分析如下RMN1H300MHz(DMSO-d6，TMS)8.19(t，2H，j＝5.5Hz，CONH)，4.46(s，2H，COCH)，3.15(m，4HCH2NHCO)，2.50(m，4H，CH2NH2)，1.48(q，4H，j＝6.6Hz，NHCH2CH2)，1.39(s，6H，(CH3)2C).RMN13C75MHz(DMSO-d6，TMS)171.5，111.5，77.6，39.0，36.4，32.6，26.2.IR(cm-1)3356.8，2940.3，1660.7，1537.6，1084.6。
化合物IPT-1的元素分析如下C49.67％，H9.14％，N18.08％，O22.84％。
用电雾化质谱仪分析化合物IPT-1，得到值302.2，符合该化合物的质量。
继续进行如下将0.4mmol的氨基-PEGA树脂2(0.4mmol/g，Novabiochem)浸泡在最小体积(9.6ml)的二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在697微升(4.0mmol)的二异丙基乙胺(DIEA)和2mlDMF)存在下加入400.3mg(4.0mmol)的琥珀酸酐。得到的支持物3用DMF洗涤(2分钟，2次)，三氯甲烷洗涤(2分钟，2次)和用NMP洗涤(2分钟，2次)。
将1209mg(40mmol)的化合物IPT-1溶于1mlNMP中，加到上面获得的用最小体积NMP浸泡的支持物3中。然后一步加入265.4mg(0.6mmol)六氟磷酸苯丙三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)-磷鎓盐(BOP)，搅拌该混合物1小时。产生的支持物4用DMF洗涤(4次2，分钟)，二氯甲烷洗涤(2次，2分钟)和用乙醚洗涤(2次，2分钟)，然后真空干燥。
如此获得本发明式1支持物，其中S为氨基-PEGA树脂，m和n为1，B为-(CH2)2-CO-NH-链，Z是酰胺官能团，A是-CO-NH-(CH2)3-链，P1和P2一起形成异亚丙基保护基，X’为-NH-(CH2)3-NH2链。
通过S-(B)m-Y支持物与式II化合物的反应获得该支持物，定义如上。式II化合物中Y＝-COOH和X＝-NH2。
实施例2从氨基-PEGA树脂和(+)-2，3-O-异亚丙基-D-酒石酸二甲酯合成本发明另一分子式I支持物图2总结了此合成中的不同步骤。
室温下将7.2微升(0.4mmol)水加入到873微升的(+)-2，3-O-异亚丙基-D-酒石酸二甲酯(由ACROS提供)中。然后在此溶液中加入59.8微升(0.4mmol)的1，8-二氮杂二环[5.4.0]十～7-烯(DBU)，搅拌所得的混合物1小时，获得混合物5。
用二氯甲烷配的5％DIEA和DMF洗涤0.1mmol氨基-PEGA树脂(0.4mmol/g，Novabiochem)。用最小体积的DMF浸泡该树脂，然后加入支持物5，以及溶于1mlDMF中的177mg(0.4mmol)BOP试剂(在化合物5中产生羧基的亲电子活化剂)。搅拌40分钟后，用DMF(4次，2分钟)和二氯甲烷(2次，2分钟)洗涤所得的支持物6。
如此获得本发明式1支持物，其中S为氨基-PEGA树脂，m和n为0，Z是酰胺官能团，P1和P2一起形成异亚丙基保护基，X’为甲氧基，通过S-(B)m-Y支持物与式II化合物反应获得。其中式II化合物定义如上，Y＝-NH2和X＝-COO-由亲电子活化剂(BOP)转化而生成。
肼(联氨)的优点是可接枝到-COX’官能团上，在支持物上诱生一自由氨基而使得能合成修饰的肽。
为此目的，加入以最小体积DMF浸泡的支持物6和溶于1ml中的1.0g(7.7mmol)1，7-二氨基庚烷。搅拌1小时后，用DMF(5次，2分钟)、二氯甲烷(2次，2分钟)和乙醚(2次，2分钟)洗涤所产生的支持物7，然后真空干燥。
实施例3从氨甲基-Novagel和Argogel-NH2树脂和(+)-2，3-O-异亚丙基-D-酒石酸二甲酯合成本发明另外二个分子式I支持物。
所用方法类似实施例2中所述。
用5％DIEA(以CH2Cl2配)溶液中和氨甲基-Novagel树脂(0.76nmol/g，由Novabiochem出售的第一种树脂)和Argogel-NH2树脂(0.4mmol/g，由ArgonautTechnologies出售的第二种树脂)，然后在最小体积的DMF中膨胀。
将4.8mmolDBU(717.8微升)一步加入含48mmol(+)-2，3-O-异亚丙基-D-酒石酸二甲酯(10.47ml)和4.8mmol水(86.4微升)的溶液中。搅拌1小时后将一半溶液倒入0.6mmol的氨甲基-Novagel树脂(0.76mmol/g)中，另一半倒入0.6mmol的Argogel-NH2树脂(0.41mmol/g)中。
对于每一种树脂，一步加入溶于6mlDMF的1.06g(2.4mmol)BOP作第一次交联(45分钟)和12ml作第二次交联(45分钟)。树脂然后用DMF(4次，2分钟)和二氯甲烷(2次，2分钟)洗涤，再用Ac2O/DIEA/CH2Cl2(10％/5％/85％)处理10分钟。
如此获得本发明式I支持物，其中S是Novagel树脂或Argogel树脂，m和n为0，Z是酰胺官能团，P1和P2一起形成异亚丙基保护基，X’为甲氧基。
如实施例2所述，联氨的优点是可接枝到支持物的-COX’官能团上。为此目的，将7.70M的1，3-二氨基丙烷DMF溶液(3ml)加入支持物中，搅拌1小时后，支持物用DMF(5次2分钟)、二氯甲烷(2次，2分钟)和乙醚(2次，2分钟)洗涤，然后减压干燥。通过紫外分光光度分析测定支持物的电荷。用20％哌啶DMF液交联Fmoc-Gly-OH和脱保护后释放出富烯-哌啶加成。以本发明的氨甲基-Novagel树脂基支持物时，电荷为0.34mmol/g；以本发明Argogel-NHz树脂基支持物时的电荷为0.23mmol/g。
实施例4用本发明支持物合成C末端含有-氧代醛基的肽图3显示用本发明支持物合成的肽3-6和肽。
a)固相肽合成分别用实施例1所述支持物4和实施例2所述支持物6(0.2mmol/g)合成了肽3-5和肽9。
肽合成用AplliedBiosystem431A合成仪以自动化方式进行，按照Fields，G.B.等人Int.J.Pept.Protein，1990，35，161所述方法。
用Fmoc(9-芴基甲氧羰基)保护的氨基酸由Propeptide公司(Vert-Le-Petit，France)提供，侧链保护官能团如下Arg(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢呋喃-6-磺酰基)，Asn(三苯甲基)，Asp(叔丁基)，Gln(三苯甲基)，Lys(叔丁氧基羰基，也称为Boc)，Ser(叔丁基)，Thr(叔丁基)，Tyr(叔丁基)。
以0.1mmol支持物进行合成，每一交联步骤使用10当量活化氨基酸。肽3和肽9采用一次交联，其他肽交联氨基酸二次。
一次或二次联后重新开始合成前，进行残余氨基加帽，以防止产生缺失肽。为此，通过与含7.5mMN-羟基苯并三唑(HOBt)的Ac2O/DIEA/N-甲基吡咯烷酮(NMP)混合物以4.75/2.25/91.5(体积比)反应，用乙酰基封闭氨基。
当肽合成完成时，如需要(肽3，5和肽9在它们的末端含乙酰化氨基)通过与上述混合物反应而乙酰化肽的末端。
以实施例1所述支持物4的0.1mmol(0.2mmol/g)人工合成了肽6。每一次交联步骤使用10当量的活化氨基酸，以溶于DMF的混合物HBTU/HOBt/DIEA(10当量/10当量/30当量)(HBTUH-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)-亚甲基]-N-甲基甲烷鎓N-氧化物六氟磷酸盐；HOBtN-羟基苯并三唑；DIEA二异丙基乙胺)活化氨基酸。然后用乙酰基封闭交联步骤中未起反应的氨基(与10/5/85体积比的Ac2O/DIEA/CH2Cl2混合液反应)。对F-moc--Ala-OH和Fmoc-L-Lys(Boc)-OH行一次交联(1小时)。F-moc-L-Lys(Fmoc)-OH连接二次。用二异丙基碳二亚胺(2当量，以DMF配)活化30分钟将氯乙酸(2当量)连接二次。
b)脱保护并从支持物上切下固相合成肽的脱保护如下所述在固相上进行-对于肽3、4、6和9，采用10ml三氟乙酸/水/苯甲醚混合液(95/2.5/2.5，体积比)、室温2小时。
-对于肽5，采用10ml三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合液(95/2.5/2.5，体积比)、室温3小时。
然后用二氯甲烷(4次，2分钟)和乙醚(2次，2分钟)洗涤支持物，减压干燥。
脱保护步骤包括肽的氨基酸侧链脱保护和本发明式III支持物邻接羟基(1和2位)的脱保护，从而形成本发明的式IV化合物(去除了P1和P2的保护基团)。
c)固相的定时氧化将干燥形式(以上步骤b)的其上结合着脱保护肽的支持物0.1mmol浸泡于5ml水/乙酸混合液(2/1体积比)中15分钟。然后再一步加入溶于2ml水/乙酸混合液(5/1体积比)的128.3mg(6当量)的过碘酸钠。此步骤同时形成C末端-氧代醛基和从支持物上切下肽。
搅拌2分钟后，过滤支持物，用6ml水洗涤二次，各1分钟。然后将该溶液倒入200微升乙二醇中并注入HyperprepC18型反向高效液相色谱(RP-HPLC)柱(购自Interchim.Monlucon，France)中。用含0.05％三氯乙酸的水/乙腈线性梯度洗脱液纯化肽。
肽3，4，6和9直接冻干，经RP-HPLC纯化后得率分别为38.0％，26.0％、30.1％和32.9％。
关于肽5，冻干前加入500mg(+)-D-甘露糖醇(Sigma)，目的是避免肽凝聚现象。
通过氨基酸定量分析测定了肽5的含量(3.3％)，方法是110℃用6N/HCl苯酚10/1混合液完全水解24小时后用茚三酮检测。肽5得率为6.1％。
实施例5合成末端含有-氧代醛基官能化的肽，所述肽含有甲硫氨酸用实施例1所述支持物4按实施例4所述方法固相制备了以下肽AcKYML-NH-(CH2)3-NH-CO-CHO氨基酸侧链保护基团分别是赖氨酸为Boc基团，酪氨酸为-O-叔丁基。
用10ml三氟乙酸/水/乙二硫醇(EDT)/三异丙基硅烷混合液(94/2.5/2.5/1，体积比)室温下进行2小时固相脱保护。
然后如实施例4所述用二氯甲烷和乙醚洗涤支持物，真空干燥，再进行定时氧化步骤。由于存在甲硫氨酸，肽的定时氧化需要防止此氨基酸被氧化(形成甲硫氨酸亚砜的危险)的特殊条件采用接近中性的pH和二甲硫，后者先于甲硫氨酸被氧化从而起保护作用。
为了定时氧化和从支持物上切下肽，取270mg干燥支持物置于反应器内，加入5.4ml柠檬酸钠缓冲液(pH6)、5.4ml甲醇和0.9mlMe2S(二甲硫)。
15分钟后一步加入溶于2ml柠檬酸缓冲液的63.18mg(6当量)过碘酸钠。搅拌15分钟，再加入同样量的过碘酸钠。搅拌15分钟后，将上清液迅速加到0.36g乙二醇中。
立即以pH6.0的5.4ml柠檬酸缓冲液、5.4ml甲醇和0.9mlMe2S重处理回收支持物以同样方法用过碘酸钠处理。重复此程序10次。
以RP-HPL纯化后，分离得到肽，得率15.3％。
实施例6合成C末端含α-氧代醛基而官能化的肽18(图4)，所述肽经脂肪酸修饰。
用实施例1所述获得的本发明式4支持物进行肽合成。采用以DMF膨胀的410mg支持物4(0.2mmol/g，或0.082mmol)，连续洗涤三次，每次2分钟。除非另作说明，所有反应在室温进行。
·导入第一个赖氨酸。
将76.8mgFmoc-Lys(Boc)-OH(0.164mmol，或2当量)，25.1mgHOBt(0.164mmol，或2当量)和62.2mgHBTU(0.164mmol或2当量)加入一试管并溶于1mlDMF中再加入115微升DIEA(0.656mol或8当量)。搅拌1分钟后，将所得的活化的溶液置于支持4上，搅拌1小时后，用DMF淋洗支持物3次，2分钟，再用二氯甲烷洗3次，2分钟。用Kaiser定量试验(Anal.Biochem，1970，34，595)(阴性)和TNBS试验(Anal.Biochem，1976，71，260-264)(阴性)评价反应性氨基的消失情况。
一旦反应性氨基消失，用NMP淋洗支持物3次，2分钟，加入大大过量的20％哌啶NMP液将Fmoc官能团脱保护。支持物用NMP洗3次，2分钟，用CH2Cl2洗3次，2分钟。用Kaiser定量试验评价脱保护的质量(阳性)。
·导入酪氨酸支持物用DMF洗3次，2分钟。将75.4mg的Fmoc-Tyr(叔丁基)-OH(0.164mmol或2当量)，25.1mg的HOBt(0.164mmol或2当量)和62.2mg的HBTU(0.164mmol，或2当量)加入一试管中，溶于1mlDMF中，以上述引入赖氨酸同样的方法进行。
·导入另一个赖氨酸支持物用DMF洗3次2分钟，将96.9mg的Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(0.164mmol，2当量)，25.1mg的HOBt(0.164mmol，2当量)和62.2mg的HBTU(0.164mmol，2当量)加入一试管，溶于1mlDMF中。以上述引入第一个赖氨酸的同样方法进行。
·肽的脂肪酸修饰用DMF/CH2Cl2混合液(50/50体积比)洗涤其上合成有Lys-Tyr-Lys的支持物3次2分钟，将84.1mg棕榈酸(0.328mmol，4当量)加入一试管溶于500微升的50/50DMF/CH2Cl2混合液中。将50.2mgHOBt(0.328mmol，4当量)和124.4mgHBTU(0.328mmol，4当量)加入另一试管，溶于1ml50/50DMF/CH2Cl2中。混合此二试管内容物，搅拌1分钟，然后加入230微升DIEA(1.312mmol，16当量)，搅拌1分钟后将得到的活化液体置于支持物上，搅拌1小时，用50/50DMF/CH2Cl2混合液洗涤支持物3次2分钟。在同一试管中再次加入溶于1ml50/50DMF/CH2Cl2的84.1mg棕榈酸(0.328mmol，4当量)和146mgPyBrop(六氟磷酸溴-三吡咯烷鏻盐)(0.328mmol，4当量)。另将173.5微升DIEA(0.984mmol，12当量)溶于1ml50/50DMF/CH2Cl2中。混合二液1分钟，将所得溶液置于支持物上，搅拌1小时后，支持物用50/50DFM/CH2Cl2混合液洗3次2分钟，然后用CH2Cl2洗三次2分钟。用TMBS试验评价反应性氨基的消失情况。
·获得肽18将以上操作得到的支持物真空干燥过夜，在其上加20ml的三氟乙酸、水和三异丙基硅烷混合液(95/2.5/2.5体积比)。搅拌2分钟，除去三氟乙酸/水/三异丙基硅烷混合液，重新加20ml该混合液到支持物上。搅拌20分钟后，支持物用CH2Cl2洗3次2分钟，真空干燥过夜。
用叔丁醇洗涤112mg干燥支持物(0.224mmol)2次2分钟。将28.9mg过碘酸钠(0.135mmol，6当量)溶于200微升水中，加入200微升33％乙酸水溶液和200微升叔丁醇。将得到的液体加到支持物上。
搅拌15分钟后，将已沉积在支持物上的溶液引入一含80微升乙二醇的试管中，用600微升的33％水/乙酸合液在水/叔丁醇中(1/1/1体积比)，洗涤支持物。再将得到的液体引入含乙二醇的试管中，沉淀得到肽18(图4)将该试管放置-20℃有利于沉淀，用33％水/乙酸/叔丁醇(1/1/1体积比)200微升洗涤沉淀。将所得溶液再放置于-20℃以引起产物沉淀，然后离心。回收的沉淀占支持物上形成的产物总量的50％。用4ml叔丁醇/甲醇混合液(50℃)洗涤支持物6次后，以该抽提混合液冷沉淀，抽提其余产物，抽提总得率为79％。用112mg(0.224mmol)支持物分离得到20.1mg纯产物18，[M+Na]+计算值1048；实测值1048。
实施例7即8价的肽19(图5)，称为聚赖氨酸型、8个氯乙酰基和1个-氧代醛基官能化的肽，所述肽用本发明的支持物合成肽19由实施例1获得的0.1mmol(0.2mmol)支持物4手工合成。所有氨基酸(每一支持物自由氨基10当量)用以DMF配置的HBTU/HOBt/DIEA(10当量/10当量/30当量)活化。每一交联步骤后肽用Ac2O/DIEA/C2H2Cl2混合液10/5/85(体积)乙酰化。对于Fmoc--Ala-OH和Fmoc-L-Lys(Boc)-OH交联一次(1小时)，而Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH均连接二次(1小时)，一次用二异丙基碳二亚胺(32当量)活化连接氯乙酸(64当量)二次。
室温下用10mlTFA/水/苯甲醚(95/2.5/2.5体积比)给官能化的肽固相脱保护2小时，然后用二氯甲烷(4次，2分钟)和乙醚(2次，2分钟)洗涤支持物，减压干燥。
支持物(0.1mmol)用5ml水/乙酸(2/1体积)膨胀15分钟后用128.33mg溶于2ml水/乙酸(5/1体积)的过碘酸钠进行定时氧化，并一步加到支持物上。搅拌悬液2分钟，过滤支持物并用6ml水洗(2次，1分钟)。合并滤液加入200微升乙二醇以终止氧化反应。
在C18Hyperprep柱(15×300mm)上用RP-HPLC纯化产物。用0-50％线性梯度的洗脱液B纯化支持物100分钟，流速3ml/分，测定215nm吸光值。
洗脱液A含0.05％体积TFA的水洗脱液B含0.05％体积TFA的乙腈/水(4/1体积)直接收集纯化组分并冻干，获得45mg纯化的肽19，得率23.5％。
实施例8合成16价的肽20(图6)，即聚赖氨酸型、以16个氯乙酰基和1个-氧代醛基官能化的肽，所述肽用本发明的支持物合成肽20由实施例2获得的0.1mmol支持物6(0.2mmol/g)合成并按实施例2所述方案用联氨官能化，所用联氨为1，3-二氨基丙烷。
交联氨基酸所用活化试剂是.HBTU、HOBt和DIEA，每次交联时每个氨基所用当量数将在下面给出。
在加入支持物前活化1分钟。Fmoc基团的脱保护用20％哌啶NMP液进行(5分钟1次和20分钟1次)，每一交联步骤后进行Kaiser试验和TNBS试验以核查反应性-NH2基团的消失。
第一次交联用10当量Fmoc-Ala-OH/HBTU/HOBt(312mg/136mg/379.5mg)和12当量DIEA(210微升，以NMP配)。反应50分钟后洗涤支持物去除过量的试剂，进行Kaiser试验以核查自由-NH2基团的消失。
第二次交联Fmoc-Lys-Boc-OH(4当量，或187.4mg)HOBt/HBTU/DIEA当量数4/4/12(54.4mg/151.4mg/210微升)反应时间50分钟第三次交联Fmoc-Lys-Fmoc-OH(4当量，或236.3mg)HOBt/HBTU/DIEA当量数4/4/12(54.4mg/151. 4mg/210微升)反应时间50分钟第四次交联Fmoc-Lys-Fmoc-OH(4当量，或473mg)HOBt/HBTU/DIEA当量数4/4/12(109mg/303.6mg/420微升)反应时间50分钟第五次交联Fmoc-Lys-Fmoc-OH(2.5当量，或590mg)HOBt/HBTU/DIEA当量数2.5/2.5/7.5(136mg/379.5mg/579微升)反应时间50分钟第六次交联Fmoc-Lys-Fmoc-OH(2.5当量，或1.18g)HOBt/HBTU/DIEA当量数2.5/2.5/7.5(272mg/759mg/1 158微升)反应时间50分钟氯乙酸(每-NH2基8当量)的交联用二异丙基碳二亚胺作为活化剂进行二次。
室温下用10mlTFA/水/苯甲醚(95/2.5/2.5体积比)进行支持物和氨基酸的脱保护2小时，然后用二氯甲烷和乙醚洗涤支持物，减压干燥。
支持物用5ml水/乙酸(2/1体积)膨胀15分钟后，用128mg溶于2ml水/乙酸(5/1体积)的过碘酸钠进行定时氧化。反应2分钟后，过滤支持物并用6ml水洗2次。收集滤液加入200微升乙二醇以终止氧化反应。
在C18Hyperprep柱(15×200mm)上以RP-HPLC纯化产物。用0-50％线性梯度的洗脱液B洗脱100分钟，流速3ml/分，测定215nm吸光值。
洗脱液A含0.05％体积TFA的水洗脱液B含0.05％体积TFA的乙腈/水(4/1体积)收集纯化组分并冻干，获得71mg纯化的肽20，得率20％。
实施例9化学连接产生本发明C末端含有-氧代醛基而官能化的肽1) 肽10，12，和14的合成这些肽见图3。
●肽10和14的合成在4-甲基-二苯甲基胺聚苯乙烯树酯(0.57mmol反应性氨基/每克树脂，AppliedBiosystem，FosterCity，US)上制备肽10和14，按照R.B.Merrified在J.Am.Chem.Soc；1963，85，2149和Science，1986，232，341上描述的方法(Boc/苄基方法)。自动肽合成仪是431AAppliedBiosystem(FosterCity，USA)，该仪器执行Int.J.Pept.ProteinRes；1992，40，180描述的方法。
Propeptide(Vert-Le-petitFrance)提供Boc官能团保护的氨基酸，侧链保护基团如下①Arg(对-甲苯磺酰基)，②Asp(O-环己基)，③Asn(三苯甲基)，④Lys(2-氯苄氧基羰基)，⑤Gln(三苯甲基)，⑩Ser(O-苯甲基)，⑥Tyr(2-溴苄氧基-羰基)，⑨His(二硝基苯基)，⑦Glu(O-环己基)，Cys(对甲基苯甲基)，Trp(甲酰基)，⑧Asn(三苯甲基)。
对于肽10，将拟用N-氨基化试剂N-Boc-3-(4-氰基苯基)oxaziridine(BCPO)修饰的赖氨酸引入FranceBiochem(Meudon，France)提供的Boc-L-Lys(Fmoc)-OH。在装配氨基酸后用以DMF配置的20％哌啶混合液去除Fmoc基团。N-氨基化方法采用AppliedBiosystem431A自动化合成仪，见(TetrahedronLetters，1996，37，7259-7262和J.PeptideRes，1998，52，180-184)所述。
用液体氟化氢(HF)以下述比例干燥支持物/HF/对甲酚/对甲苯硫酚(1g/10ml/0.75g/0.25g)0℃作用1小时30分使肽10脱保护和从支持物上分离。然后0℃减压除去氢氟酸，并以200ml冷乙醚沉淀粗肽，离心得到沉淀，溶于水/乙酸混合液中然后冻干。
在Hyperprep柱上以RP-HPLC纯化粗肽，用含0.05％三氟乙酸的水/乙腈液线性梯度洗脱。肽10得率为16％。用电雾化质谱获得其质量为2330.6。
对于肽14，用哌啶/DMF混合液(1/10体积比)洗涤支持物3小时除去位于固相上的色氨酸上的甲酰基。将肽14接枝到支持物上，然后用DMF及乙醚洗涤，真空干燥。
用干燥支持物/HF/对甲酚/对甲苯硫酚混合物(1.5g/10ml/0.75g/0.25g)0℃作用1小时30分进行最后的脱保护并从支持物上切下肽，乙醚沉淀粗肽，离心，然后溶于水/乙酸混合液(3/1体积比)中，最后冻干。用MachereyNagel(Paris，France)提供的15×300mmNucleosiC18柱，以提纯肽10同样方法进行RP-HPLC纯化。肽14得率为44.6％，用等离子体解吸质谱(plasmadesorptionmass)测得其质量为1823.3。
●BocNHNHCH2COOH官能团的合成将31.36g(0.144mmol)的Boc2O加到溶于130ml水/乙醇混合液(1/1体积)的15.80ml(0.131mmol)N-甲基吗啉和20g(0.131mmol)盐酸肼基乙酸乙脂(ethylhydrazinoacetatehydrochloride)中。室温搅拌反应混合物24小时，然后于15分钟内加入氢氧化钠11.5g(0.288mmol)。搅拌3小时45分后将混合物以100ml水稀释并用氯化钠饱和，用柠檬酸钠调节pH至3.0。
用乙醚抽提得到的水性溶液(8次50ml)，收集连次的抽提物，用水洗(2次50ml)，用磷酸三钠干燥并减压浓缩。
以叔丁基甲基醚/甲醇混合液(10/1体识)重结晶获得的粗产物，得到12.2g白色固体(得率为43％)，元素分析为C44.52％，H7.69％，N15.02％和O33.57％。该产物的RMN1H分析如下(300MHz，MeOH-d4)1.44(叔丁基)，4.06(CH2CO)。
●肽12的合成用0.25mmolRinkAmide树脂(0.47mmol/g，FranceBiochem，Meudon，Drance)，即4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-甲基)-苯氧基树脂，以制备肽3-5和9(实施例4)相同方式制备了肽12。
用溶于DMF的BOP/DIEA混合物(4当量/12当量)将4当量预合成的BocNHNHCH2COOH接枝到肽的N-末端。
从支持物上分离肽12，用10ml三氟乙酸/苯硫基甲烷/水混合液(95/5/5体积)脱保护2小时30分。将含脱保护肽的混合液逐滴加入200ml冷乙醚中，离心沉淀，重悬于水/乙酸混合液(9/1体积比)中，然后冻干。
用15×300mmC18Hyperprep柱以RP-HPLC纯化粗肽。用含0.05％TFA的10-40％线性梯度的洗脱液B进行100分钟洗脱(洗脱液B水/CH3CN(1/4体积比)；洗脱液A含0.05％TFA的水)，流速3ml/分。测定215nm吸光值。
冻干前用0.1MTris缓冲液将含肽12组分的pH调节到达6.8。
如肽5那样测定，获得的固相(537.9mg)含20.9％的肽12，因此得率为28.5％。
2)肽10和肽3之间的腙型连接(图7)将实施例4获得的11.2mg(3.7mol)肽10和3.2mg(4.2mol)肽3室温溶于2.25ml柠檬酸/磷酸缓冲液(pH6.0)和560l二甲基亚砜中。48小时后，用15×300mmC18Hypreperp柱以RP-HPLC纯化混合物。冻干后得到6.6mg肽11，即得率48.8％。
3)肽12和肽14之间的腙型连接(图8)将实施例4获得的15.65mg(2.08mol)肽12和5.87mg(4.15mol)肽4溶于1.5ml柠檬酸磷酸缓冲液(pH6.0)中，48小时后如2)所述用RP-HPLC纯化混合物。冻干后得到6.2mg肽13，得率47.0％。
图7和图8显示可以实现两肽片段之间的腙型化学连接，得率良好，一个片段(图7肽10和图8肽12)其N-末端含一肼基，而另一片段(图7肽3和图8肽4)其C-末端含一-氧代醛基，该官能团通过在本发明支持物上肽的合成而引入。
4)肽14和肽4之间的噻唑烷型连接(图9)在氮气下进行反应。将6mg(2.29mol)的肽14溶于680l1/1(体积)的NMP和柠檬酸/磷酸缓冲液(pH5.1)中，加入溶于48.3l前述缓冲液的328g(1.15mol)盐酸三(2-羧乙基)-膦，然后加入6.49mg(5.58mol)溶于680l缓冲液/NMP(1/1体积比)的肽4，室温拌混合物1小时，37℃2放置20小时。
如2)所述用RP-HPLC纯化混合物，冻干后获得4.8mg肽15，得率53.7％。
图9显示在本发明支持物上进行肽合成获得的C末端含有-氧代醛基的肽可化学键合于N-末端含半胱氨酸残基(-氨基硫羟基)的肽，在两个片段之间形成噻唑烷键，得率良好。
5)肽16和肽4之间的肟型连接(图10)●肽16的合成用Boc/苯甲基法从0.5mmol的tBoc-Leu-OCH2-PAM树脂(667mg，电荷0.75mmol/g)合成该三肽，用TFA/CH2Cl2混合液(1/1体积比，30分钟)脱去亮氨酸的保护后，用HBTU/DIEA(756mg，4当量/1044l，12当量)将氨基酸Boc-L-Tyr(2-溴苯甲氧羰基)-0H(988.4mg，4当量，单交联)和Boc-Lys(2-氯苯甲氧羰基)-OH(428.3mg，4当量，双交联)活化1分钟，加入用最小体积NMP溶剂化的该树脂中，将Boc-HN-O-CH2-CO2H(191.2mg，2当量)和BOP(440mg，2当量)加入用最小体积NMP溶剂化的该树脂中。一步加入DIEA(500l，6当量)并室温搅拌悬液45分钟。
用HF/对甲酚(10ml/0.2g/0.2g)0℃度处理30分钟，进行此肽的脱保护并从支持物(0.8g)上切下，蒸发氢氟酸后，残余物悬浮于TFA中，过滤，将滤液逐滴加入到冷乙醚中。离心沉淀，在20×300mmC18Hyperprep柱上进行RP-HPLC纯化。洗脱液A含0.05％TFA的水；洗脱液B含0.05％TFA的异丙醇/水(3/2)。0-10％梯度洗脱液B洗脱150分钟，流速1ml/分，测215nm吸光值。
●化学连接将实施例4获得的肽43.53mg溶于200l水中，加入溶于pH4.6，1.2ml乙酸钠/乙酸缓冲液(混合510l 0.2M乙酸与492l 0.2M乙酸钠并用水加到2ml)的3.25mg肽16。
反应24小时后，如2)所述用RP-HPLC纯化肽17，冻干后，获得4.0mg肽17，得率78.13％。
图10显示通过在本发明支持物上进行的肽合成获得的C-末端含-氧代醛基的肽可化学键合于N-末端含羟胺官能团的肽，导致两肽片段之间形成肟键。
实施例10在本发明支持物用于合成含有-氧代醛基的有机化合物后再循环使用该支持物在本发明合成至少含一个-氧代醛基的有机化合物的过程中进行的定时氧化还在固相支持物上产生醛基，即式V产物OHC-(A)n-Z-(B)m-S (V)在该实施例中描述了末端含氨基的支持物的再生，在基团-(A)n-Z-(B)m是酰氨基(-CO-NH-)时，即如果固相支持物在定时氧化后对应于式VI化合物时OHC-CO-NH-S (VI)-氧代醛基通过还原性氨基化可产生一个或多个氨基，例如，式VI产物可与溶于甲醇的NH4Br/NaCNBH3反应，产生以下式VII产物
H2N-CH2-CO-NH-S (VII)也可能式V产物与溶于甲醇的NaCNBH3/1，3二氨基丙烷混合液(或另一具有式H2N-(CH2)a-NH2的二胺)反应，产生以下式VIII产物H2N-(CH2)a-NH-CH2-CO-NH-S (VIII)后一种情况，采用伯二胺有可能在再生的支持物上产生一个伯氨基和一个仲氨基，二者使该支持物的电荷增至二倍。采用仲二胺可能在支持物上产生一个叔氨基和一个仲氨基，使该支持物起初的电荷受到保存。
上述还原性氨基化反应是本领域技术人员熟知的，可参见下文”Reductionbythealumino-andborohydridesinorganicsynthesis”，J.Seyden-Oenne，1991，VCHPublishersInc./Lavoisier，NewYork。
一旦完成还原性氨基化，可如上所述使获得的产物(产物VII或产物VIII)与式II化合物反应再生本发明的式I支持物。
例如，如果用NH4Br/NaCNBH3或用仲二胺进行还原性氨基化，还原产物如式VII化合物与式II化合物反应产生以下支持物 如果用伯二胺，例如用具有式H2N-(CH2)3-NH2的二胺进行还原性氨基化，还原产物如式VIII化合物(其中a＝3)与式II化合物反应产生以下支持物 这些实施例表明了用本发明支持物获得的C-末端含有-氧代醛基的本发明肽在化学连接中的用途。
实施例11用本发明支持物合成含有-氧代醛基而官能化的寡核苷酸所用支持物相应于上述式I，其中n＝m＝0，P1和P2为CH3CO-乙酰基，X’为-OH基团，Z为酰胺键，S是硼硅玻璃。通过使酒石酸衍生物(其1，2位置的羟基受乙酰基保护)与含氨基官能化的硼硅玻璃反应获得这样的支持物，硼硅玻璃的官能化用本领域技术人员已知的方法进行，例如见以下描述“Oligonucleotidessynthesisapracticalapproach”，1984，M.J.GAIT编，IRLPress，WashingtonD.C.。所用的酒石酸衍生物例如是二乙酰基酒石酸酐(环酐)或其位置1，2的羟基受乙酰基保护而由BOP活化的酒石酸。
将获得的支持物再用BOP作为活化基团用二氨基丙烷官能化。按以下参考文献使寡核苷酸键合于所得的支持物“Oligonucleotidessynthesisapracticalapproach”，1984，M.J.GAIT编，IRLPressWashingtonD.C，“Curretprotocolinmolecularbiology”，1994，JohnWiley&Sons.，sections2.11.1-2.11.25。
例如，通过氨基甲酸酯键连接第一个脱氧核苷酸碱基使以上获得的支持物与光气反应(在支持物上产生异氰酸基)，然后与脱氧核苷酸反应，该脱氧核苷酸的糖5’位的羟基用二甲氧三苯甲基保护，该脱氧核苷酸通过其3’位的羟基被结合在支持物上。该脱氧核苷酸的碱基受到酰基，如苯甲酰基或甲基-2-丙酰基的保护。
逐步依次进行多个脱氧核苷酸碱基的结合，实现DNA的固相合成。类似地，可按相同方法进行RNA合成，然后以适当方法，如用叔丁二甲基甲硅烷基保护糖2’位的羟基。
合成完成时，以碱性介质(如氢氧化铵)处理除去本发明支持物的P1和P2基团。这种处理同时使寡核苷酸碱基脱保护。如实施例4所述的固相定时氧化步骤能使寡核苷酸(DNA或RNA)获得-氧代醛基而官能化。对于合成RNA，上述以碱性介质处理先于例如用Bu4N+，F-使糖2’位羟基脱保护的步骤。
实施例12用本发明支持物合成以-氧代醛基官能化的肽以及这些肽作为诊断试剂的用途1)制备本发明支持物用干电荷等于0.3mmol/g和湿电荷(在甲醇中)为0.06mmol/g的PEGA氨基树脂制备。树脂用量为25.1g或1.5mmol。用二氯甲烷洗三次，用溶于二氯甲烷的0.5％DIEA洗三次，然后用DMF洗三次。将树脂浸泡在最小体积的DMF中。
在108微升水(6mmol)中加入13.11ml(69.54mol)的(+)-2，3-O-异亚丙基酒石酸二甲酯，再加入897微升的DBU。室温搅拌混合物1小时，然后加到上述制备的树脂中。搅拌30秒后，加入3122mg(6mmol)PyBOP(苯丙三唑基-1-基-氧-三-吡咯烷-膦六氟磷酸盐)。将反应液于搅拌下室温效果40分钟。树脂用DMF洗4次，用二氯甲烷洗4次。获得与实施例2制备的支持物6相同的本发明式I支持物。
将4，7，10-三氧杂-1，13-十三碳二胺(TTD)接枝到该支持物的末端以在其表面导入游离氨基，使便于以后的肽合成。为此，将支持物浸泡在最小体积的DMF中，然后加入6.61mlTTD(30mmol，是PEGA氨基树脂初始量的20倍)。搅拌1小时后，支持物用DMF洗5次，用二氯甲烷洗2次，用乙醚洗2次，然后真空干燥。在Fmoc-Gly-OH与已知量的支持物交联后用UV分光法测定的分析哌啶/二苯并富烯加成物，获得的支持物具有电荷0.18mmol/g。
2)合成-氧代醛基官能化的肽在Pioneertrade-mark(PerceptiveBiosystem)的肽合成仪上，在用以上Fmoc/叔丁基方法制备的固相支持物上合成了具有以下序列的肽AVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ侧链的保护基团如下(tBu叔丁基，Trt；三苯甲基；Boc叔丁氧基羰基；Pbf2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)，Arg(Pbf)，Asn(Trt)，Asp(OtBu)，Cys(Trt)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，His(Trt)，Ser(tBu)，Thr(tBu)，Trp(Boc)，Lys(Boc)，Tyr(tBu)。
用0.555g支持物进行肽合成。采用10倍过量氨基酸并用溶于DMF的HOBt/HBTU(0.5M)活化。每个氨基酸进行二次交联，然后加帽。
肽合成一旦完成，用TFA/水/苯甲醚混合物(95/2.5/2.5)在支持物上将末端含伯氨基的肽脱保护。用二氯甲烷(3次，2分钟)和乙醚(2次，2分钟)洗涤支持物，真空干燥。
按以下步骤进行定时切割产生末端-氧代醛基将支持物悬浮于5ml乙酸中，加入6当量NaIO4，搅拌5分钟，加100微升乙醇胺，搅拌1分钟。
回收含末端-氧代醛基的肽21(图11)，在G10Sephadex柱(60cm×2.5cm)上纯化，层析条件如下-溶剂5％乙酸-溶剂流速0.7ml/分
-泵速30rpm-肽的测定波长为240nm。
冻干对应于该肽的层析组分，在C18柱上进行制备性RP-HPLC纯化此肽，层析条件如下-静止相C18Nucleosil-流动相含0.05％TFA的水，0-80％的线性梯度乙腈，-温度60℃-流动相流速3ml/分-肽de测定波长为215nm。
冻干对应于该肽的层析组分，并鉴定。在C18-VYDAC柱上进行分析性HPLC，用上述相同溶剂洗脱，验证该肽的均一性。通过用HCl6N/苯酚(10/1)混合液全部酸水解和在BIOIon20等离子体(plasma)分光光度计(由BioIonAB，Upsala，Sweden提供)上记录质谱，测定氨基酸组成以证实此肽身份(质量计算值2605g/mol，实测值2605g/mol)。
3)用此肽制备ELISA型诊断试剂在潮湿环境下用以上合成的肽(0.1ml，浓度0.5l/ml，以0.1M，pH5.5乙酸钠缓冲液配制)包被微量滴定板孔(Carbo-bindNewYork.USA)1小时。
在自动洗涤机中用含1.8％NaCl的、pH7.4的0.01M磷酸缓冲液(PBS)洗涤各孔三次，用全奶粉(每孔加0.2ml用PBS配的2.5％奶粉)封闭多余的结合位点，37℃温育60分钟。
用含0.05％吐温20的PBS(PBS-T缓冲液，购自Sigma)洗三次后，用含2.5％全奶和0.5％吐温20的PBS以1∶50稀释待测人血清。取稀释血清在含有上述合成肽21的孔中37℃温育120分钟。
用PBS-T洗4次后，加入用含0.5％吐温20和2.5％全奶的PBS缓冲液作1∶1000稀释的过氧化物酶-羊抗人IgG-A-M(PasteurDiagnosis)交联物37温育60分钟。
用PBS-T洗4次后用底物0.1ml二盐酸邻苯二胺和H2O2(pH5.5，0.05M，以柠檬酸缓冲液配)室温暗处30分钟检测结合于固定在支持物上Ig的偶联抗体的过氧化物酶活性。
加入H2SO22N(25l)停止反应，用多通道自动读数仪(Mr5000，Dynatech)参考空白孔记录492nm吸光值。
用阴性EBV(Epstein-BarrVirus)样品的平均值A492+3个标准差作为ELISA试验的域值。第二种表达结果的方法是计算比值R[A492阳性血清]/[均值A492+3个标准差)阴性血清]，R比值大于1的血清作为阳性。
在Carbo-Bind微量滴定板上进行ELISA试验得到的结果列于表1。用非共价常规微量滴定板(Nunc，Maxisorp，Rocksilde，Denmark)进行同样的这些试验。两种试验的R值比较显示其上共价交联了肽的Carbo-Bind微量滴定板(可以固定肽)提高了阳性血清的信号并降低了阴性血清的信号以及降低了本底燥音。
表权利要求
1.用于合成含有至少一个α氧代醛基的化合物的官能化固相支持物，该支持物的特征在于，它相应于以下分子式I 其中-S为固相支持物，至少其表面在水性或部分水性介质中具有良好的溶剂化性能；-n和m可以相同或不同，为0或1；-当n等于1时，Z为选自醚、硫醚、酯、胺、酰胺、磺酰胺、羟胺、肼、腙、噻唑烷、肟、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲官能团及其衍生物；-当n等于0时，Z为选自酯、酰胺、N-酰基羟胺、肼、腙、肟和噻唑烷官能团及其衍生物；-P1和P2可以相同或不同，或与它们相结合的氧原子一起形成一个环，代表氢原子或保护1、2位上羟基的官能团，此时P1和P2选自-R1、-(CO)R1、-(CO)OR1、-(SO2)OR1、-SiR’R”R、缩醛基和十六烷醛基(cetal)官能团；R，R’，R”和R代表线性、分枝状、环状、饱和或不饱和的1-18个碳原子的烷基、芳基或杂芳基；所述烷基、芳基或杂芳基可被一个或多个卤原子，一个或多个氨基、羟基、烃氧基、芳氧基、烷硫基代芳硫基部分或全部取代，-A和B可以相同或不同，它们代表线性、分支状或环状，饱和或不饱和的碳链，含有1-18个碳原子和可能含有1-7个选自以下基团的官能团羰基官能团、碳环、杂环、芳基和杂芳基，A和/或B还可以含有1-16个杂原子，优选1-16个氮或氧原子，并可被1-16个可受到适当保护的羟基或氨基所取代，-A和/或B的至少一个碳原子可以被以下一官能团所取代 其中，A’与A相同或不同；不同时，A’选自上面定义的其它A官能团；和-X’选自-OR1、-NR’R”基团，R、R’和R”为氢原子或如上所述定义的基团。
2.如权利要求1所述的支持物，其特征在于，所述固相支持物S选自-多孔硼硅玻璃颗粒，-玻璃或硅制成的表面，-选自以下的树酯聚丙烯酰胺树酯、聚丙烯酰胺-聚乙二醇树酯、聚乙二醇-聚苯乙烯树酯、交联的乙氧基化物-丙烯酸酯树酯和接枝了亲水性分子的聚乙烯、聚苯乙烯或聚丙烯类树酯。
3.如权利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于-S是聚丙烯酰胺-聚乙二醇类树酯，-m和n为1，-B是-(CH2)2-CO-NH-链，-Z是酰胺基团，-A是-CO-NH-(CH2)3-链，-P1和P2一起形成异亚丙基保护基团，和-X’为-NH-(CH2)3-NH2链。
4.如权利要求1或2所述的式1支持物，其特征在于-S为聚丙烯酰胺-聚乙二醇或聚乙二醇-聚苯乙烯树脂，-m和n为0，-Z为酰胺基团，-P1和P2一起形成异亚丙基保护基团，-X’为甲氧基。
5.如权利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于-S如权利要求1或2所定义，-m为1，-n为0，-Z为酰胺基团，-P1和P2一起形成异亚丙基保护基团，-X’为甲氧基，B为以下基团
6.如权利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于-S如权利要求1或2所定义，-m和n为1，-Z为酰胺基团，-P1和P2一起形成异亚丙基保护基团，-B为-(CH2)2-CO-NH基团，-A为以下基团 -X’为以下基团。
7.如权利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于-S如权利要求1或2所定义，-m为0，-n为1，-Z为氨基甲酸酯基团，-P1和P2一起形成异亚丙基保护基团，-X’为甲氧基，和-A为以下基团
8.如权利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于其对应于以下分子式
9.如权利要求1或2所述的式I支持物，其特征在于其对应于以下分子式
10.如上面权利要求中任一项所述的式I支持物的制备方法，其特征在于，该方法包括使-具有分子式S-(B)m-Y的官能化固相支持物，其中B、S和m如上面权利要求任一项所述，Y为亲核基团，B可被至少一个除了式S-(B)m-Y中所代表的外与式S-(B)m-Y代表的相同或不同的其他Y官能团所取代，此时所述固相支持物是多官能化的；-与选自酒石酸环酐或其衍生物的化合物和式II化合物反应； 其中，n、A、P1、P2和X’如前面权利要求任一项所定义，X为亲电子基团。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于当n＝1时，所述的基团Y代表亲电子基团，所述的基团X代表亲核基团。
12.如权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于，合适的亲电子基团选自以下基团-当n＝1时，-CR2R3Cl、-CR2R3Br、-CR2R3I、-CR2R3OSO2R4、-CHO、-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、-SO2OR、，-SOOCl、琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、亲电子活化剂转化的-COO-、-N＝C＝O(异氰酸酯)、-N＝C＝S(异硫氰酸酯)、-O-CO-OR2、-O-CO-Im、-O-COCl、-NR2-COCl和-NR2-CO-Im；其中Im代表可被取代的下式咪唑基 其中R2、R3和R4可相同或不同，为氢原子；线性、分枝状或环状，饱和或不饱和的1-18个碳原子的烷基、或芳基或杂芳基，所述烷基、芳基和杂芳基可以被一个或多个卤原子，一个或多个氨基、羟基、烃氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基部分或完全取代；-当n＝0时，-CHO、-COOR2、-COF、-COCl、-COBr、亲电子活化剂转化的-COO-；R2是如上所述当n＝1时的基团。
13.如权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于合适的亲核基团选自以下官能团当n＝0或n＝1时-OH、-SH、-COO-、-NHR5、-CONR5NH2、-N[R5(CO)]NH2、-N[R5O(CO)]NH2、-N[R5NH(CO)]NH2、-SO2NH2、-SO2NR5NH2、-ONH2、-(CO)ONH2和-C(NHR5)-CR5R6-SH，R5和R6与权利要求12所定义的R2-R4基团相同。
14.如权利要求10至12任一项所述的制备方法，其特征在于，当n＝0，X＝-COOR2，而R2＝H时，所述官能团X＝-COOR2可起亲电子基团和亲核基团两部分作用。
15.如权利要求10至14任一项所述的制备方法，其特征在于，当式11化合物中，P1和P2为氢原子时，在具有式S-(B)m-Y的固相支持物与式II化合物反应后和采用如权利要求1-9任一项的式I支持物合成含有至少一个α氧代醛基的化合物之前，可以在1，2位上引入氢原子以外的P1和P2基团，作为羟基的保护基。
16.如权利要求10-15任一项所述的制备方法，其特征在于，式II化合物为酒石酸或酒石酸衍生物。
17.如权利要求10-15任一项所述的制备方法，其特征在于，式II化合物选自粘酸、糖二酸、葡糖二酸，它们的盐和它们的衍生物。
18.如权利要求10-16任一项所述的制备方法，其特征在于，该方法包括使-具有分子式H2N-(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-S的官能化固相支持物，其中S如权利要求10所定义，-与2，3-O-异亚丙基酒石酸二甲酯反应。
19.如权利要求10-16任一项所述的制备方法，其特征在于，该方法包括使-具有分子式H2N-(CH2)3-NH-CH2-CO-NH-S的官能化固相支持物，其中S如权利要求10所定义，-与2，3-O-异亚丙基酒石酸二甲脂反应。
20.具有以下分子式III的支持物 其中，S、B、A、n、m、Z、P1和P2如权利要求1-9任一项所定义，Y’是有机化合物。
21.如权利要求20所述的式III支持物，其特征在于，Y’为一化合物或由选自脂、核苷酸和氨基酸的几种化合物形成的链所述核苷酸，可被取代或不取代，氨基酸可含有脂。
22.如权利要求20或21所述的式III支持物，其特征在于，它获自用适当试剂化学修饰如权利要求1-9任一项所述的式I支持物的-COX’官能团，该适当试剂提供了一官能团使在该支持物上可制备化合Y’。
23.如权利要求22所述的支持物，其特征在于，所述适当试剂是联氨、二元醇或氨基醇。
24.合成含有至少一个α-氧代醛基的有机化合物的方法，其特征在于，所述方法在固相中进行并包括以下步骤-制备如权利要求1-9之一所定义的式I支持物，所述制备按权利要求10-19任一项方法进行；-可能的话，衍生处理所述式I支持物的基团X’以引入一个可在该支持物上制备权利要求20或21所定义的化合物Y’的基团；-固相制备化合物Y’；-如果P1和P2不是氢原子，脱去如权利要求20所述式III化合物1，2位上受P1和P2保护的两个羟基的保护基；-定时固相氧化；和-分离所形成的至少含一个α氧代醛基的官能化的产物。
25.如权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述式I支持物基团X’的衍生处理包括接枝联氨，二元醇或氨基醇。
26.如权利要求24或25所述的制备方法，其特征在于，1，2位两个羟基的脱保护在酸性介质中，优选在三氟乙酸存在下进行。
27.如权利要求24或25所述的制备方法，其特征在于，1，2位两个羟基的脱保护在碱性介质中进行。
28.如权利要求24-27任一项所述的制备方法，其特征在于，定时化氧化在过碘酸钠存在下进行。
29.一类肽，其特征在于，它们含有在位于其N末端以外位置且不包含在酰胺键中的至少一个α-氧代醛基，及在赖氨酸或鸟氨酸侧链上含有胺官能团；而且，它们按权利要求24-28任一项所定义的制备方法获得。
30.如权利要求29所述的肽在化学连接反应中的应用。
31.合成一种有机化合物库的方法，其特征在于，该方法包括-提供具有式S-(B)m-Y的多个固相支持物表面，其中B、S、Y和m如权利要求10-19任一项所述，-使它们与选自酒石酸环酐或其衍生物的化合物和分子式II化合物反应； 其中，n、A、P1、P2、X’和X如权利要求10-19任一项所定义，以获得可用于合成含α-氧代醛基化合物的支持物；-使获得的该支持物与混合的有机分子反应；和-获得有机化合物库。
32.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述有机分子是氨基酸、核苷酸和脂类。
33.一种有机化合物库，其特征在于，它通过采用权利要求31或32所述方法获得。
34.选自酒石酸环酐或其衍生物之一的化合物和式II化合物的用途 其中，n、A、P1、P2、X’和X如权利要求10-19任一项所定义，对固相支持物的衍生化处理使至少其表面在水性或部分水性介质中具有良好的溶剂化性能，这样得到的支持物能用于固相合成含有至少一个α-氧代醛基的化合物。
35.如权利要求34所述的用途，其特征在于，至少其表面在水性或部分水性介质中具有良好溶剂化性能的所述固相支持物，相应于分子式S-(B)m-Y，其中S、B、m和Y如权利要求10-19任一项所定义。
36.如权利要求34或35所述的用途，其特征在于所述酒石酸环酐或其衍生物之一是二-O-苯甲酰基-酒石酸酐或二乙酰基-酒石酸酐。
37.如权利要求34或35所述的用途，其特征在于式II化合物为酒石酸或酒石酸衍生物。
38.如权利要求34或35所述的用途，其特征在于式II化合物选自粘酸、糖二酸、葡糖二酸，它们的盐或它们的衍生物。
39.制备在固相载体上的诊断试剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤-制备如权利要求1-9任一项所定义的式I支持物并按权利要求10-19任一项进行所述制备；-可能的话，衍生处理式I支持物的基团X’，以引入一个允许在该支持物上制备权利要求20或21所定义的化合物Y’的官能团；-将权利要求24-28任一项所述方法获得的含有至少一个α-氧代醛基的有机化合物连接到已适当官能化的微量滴定板上；-获得其上共价固定有所述有机化合物的微量滴定板。
40.如权利要求39所述制备方法，其特征在于，所述产物是肽、寡核苷酸或脂类。
41.如权利要求39或40所述制备方法，其特征在于，通过肟、噻唑烷或腙键进行所述有机化合物的所述连接。
42.获得一种生物芯片的制备方法，其特征在于，该方法包括接枝含有至少一个α-氧代醛基的寡核苷酸的步骤，该寡核苷酸用权利要求24-28任一项的制备方法在固相支持物上获得。
43.如权利要求42所述的制备方法，其特征在于所述固相支持物是玻璃或硅制成的表面。
44.如权利要求42或43所述制备方法，其特征在于，所述芯片是DNA芯片。
全文摘要
本发明涉及用于合成含有至少一个α－氧代醛基的化合物的官能化固相支持物、其制备方法和用途,特别是制备有机化合物库、诊断试剂、微量滴定板和生物芯片,如DNA芯片。本发明还涉及合成含有至少一个α－氧代醛基的有机化合物的方法和用所述方法获得的α－氧代醛肽。
文档编号C07K1/04GK1356968SQ0080906
公开日2002年7月3日 申请日期2000年4月20日 优先权日1999年4月21日
发明者O·梅尔尼克, J－S·弗鲁查特, L·布雷尔, H·格拉斯－马西 申请人:里尔巴斯德研究所, 中央科学研究中心