专利名称：采用细胞破碎－双水相萃取工艺提取胞内产物的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程下游技术中的目标产物分离纯化技术，特别是涉及一种细胞破碎-双水相萃取集成化过程提取细胞内产物的方法。
本发明提供的细胞破碎-双水相萃取集成化过程提取胞内产物的方法采取如下技术方案(1)破碎前向细胞悬浮液中加入双水相试剂；(2)将步骤(1)获得的混合液直接通入珠磨机进行破碎；
(3)破碎后从匀浆形成的双水相体系直接分离蛋白质。
其中的双水相试剂包括聚乙二醇+无机盐或聚乙二醇+葡聚糖，本方法优选聚乙二醇+无机盐作为双水相试剂；其中的无机盐优选磷酸盐和硫酸盐。
本方法在细胞破碎的同时加入双水相试剂对目标产物进行萃取，聚乙二醇与无机盐或聚乙二醇与葡聚糖的加入量应根据目标产物的性质及在双水相中的分配行为确定。在细胞破碎前加入双水相萃取液，由于混合过程中的局部盐浓度过高发生在细胞外，因此不会对胞内的目标产物有影响；并且在细胞破碎过程中，利用珠磨机内细胞破碎过程中良好的破碎条件使双水相试剂在细胞悬浮液中均匀分布，同时双水相试剂中的聚乙二醇可对目标产物的活性进行保护。利用珠磨机进行破碎的过程中，操作条件包括搅拌浆转速或浆叶的线性速率，玻璃珠粒径，破碎时间，破碎液的温度及在连续破碎的条件下破碎液的体积流量等。具体破碎条件的确定应根据目标产物的稳定性及目标产物在胞内的具体位置进行选择。在匀浆形成的双水相体系中，目标产物富集在富聚乙二醇相，细胞碎片的分布在另一相。收集含有目标产物的富聚乙二醇相以进行后续目标产物的纯化。
另外，采用过程集成的措施，对初级分离目标产物的各个生化单元操作步骤进行优化，既可降低珠磨机内剪切作用对目标产物的破坏，提高目标产物的稳定性；又缩短了细胞破碎时间，提高了破碎效率。本发明提供的方法是一种生产成本低，操作工艺简单的提取胞内产物的初级分离方法。
本发明与传统的细胞破碎和双水相萃取两步操作过程的分离方法相比较，具有如下的优点a.双水相试剂中的聚乙二醇能够减少在破碎过程中剪切作用对目标产物的破坏，提高生物大分子的稳定性，增加目标产物的活性收率，(如实例2中rhTNF-α的活性收率提高了270％)。b.在破碎前加入无机盐时，不会因为局部盐浓度过高而对胞内产物有影响。c.在细胞破碎过程的同时对目标产物进行萃取，将破碎再萃取的操作过程集成为一步操作，与传统的两步操作过程相比可节省一个混合槽，在进行萃取时无须再进行混合操作，使整个工艺操作简单，易于连续进行，并且节约能耗，缩短操作时间，降低生产成本。
2.将收集的湿细胞重新悬浮在双水相溶液中，其中含14％(w/v) 聚乙二醇(PEG分子量1540)，15％磷酸钾(K2HPO.3H2OKH2PO1＝1.42)(w/v)，15％酵母(w/v，湿重)。
3.细胞破碎在珠磨机内进行珠磨破碎，珠磨机使用型号为KDL 0.015L；装珠量为85％；玻璃珠粒径0.25~0.5mm；破碎时间3分钟；破碎温度2℃。
4.收集破碎后的细胞匀浆，静置直到匀浆形成两相，收集富聚乙二醇相。
测定富聚乙二醇相中乙醇脱氢酶的活性和总蛋白浓度。破碎再萃取法1.将干酵母在磷酸缓冲液(0.05mol/L，含3％氯化钠)中室温下悬浮活化时间1小时，离心收集湿细胞。
2.将收集的湿细胞重新悬浮在溶液中，其中含15％磷酸钾(K2HPO.3H2O∶KH2PO4＝1.42)(w/v)，15％酵母(w/v，湿重)。
3.细胞破碎珠磨机，KDLO.015L；装珠量，85％；玻璃珠粒径，0.25~0.5mm；破碎时间，3分钟；破碎温度，2℃。
4.收集破碎后的细胞匀浆，向匀浆中加入聚乙二醇(分子量1540)，使其浓度为14％(w/v)。
5.搅拌均匀，静置，直到匀浆形成两相。测定富聚乙二醇相乙醇脱氢酶的活性和总蛋白浓度。结果如下总蛋白浓度 乙醇脱氢酶活性相比(mg/ml) (U/ml)破碎萃取过程集成法 20.8100 1.0破碎再萃取法19.0601.07其中的相比为富聚乙二醇相与富无机盐相之间的体积比。上表结果表明在破碎前加入聚乙二醇可明显提高总蛋白收率和乙醇脱氢酶的活性收率；因为相比接近，因此破碎前后加入聚乙二醇对双水相的形成没有的影响，而聚乙二醇的加入可以明显提高目标产物的稳定性。实施例2珠磨法破碎大肠杆菌提取重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)过程中加入双水相试剂提高细胞破碎过程中目标产物的稳定性。破碎萃取过程集成法1破碎液组成菌体浓度15％(湿重)，双水相试剂PEG1540 16％(w/v)，NH4SO414％(w/v)，pH＝7.02破碎条件珠磨机，KDL0.15L；装珠量，85％；玻璃珠粒径，0.25~0.5mm；转速，3200r/m；破碎时间，3分钟；破碎温度，2℃。3收集破碎后的细胞匀浆，静置直到匀浆形成两相，测定上清夜中rhTNF-α的活性为9.3×106U/ml。破碎再萃取法1破碎液组成菌体浓度15％(湿重)，NH4SO414％(w/v)，pH＝7.02破碎条件珠磨机，KDL0.15L；装珠量，85％；玻璃珠粒径，0.25~0.5mm；转速，3200r/m；破碎时间，3分钟；破碎温度，2℃。3收集破碎后的细胞匀浆，静置直到匀浆形成两相，测定上清夜中rhTNF-α的活性为2.5×106U/ml。结果如下总蛋白浓度rhTNF-α活性 相比
(mg/ml) (U/ml)破碎萃取过程集成法 12.79.3×1068.5破碎再萃取法10.52.5×1069该结果表明，在破碎前加入聚乙二醇能够明显提高目标产物rhTNF-α的稳定性。
2将收集的湿细胞重新悬浮在双水相溶液中，其中含24％(w/v)聚乙二醇(PEG分子量600)，18％磷酸钠(Na2HPO.12H2O∶NaH2PO4.2H2O＝1.83)(w/v)，15％酵母(w/v，湿重)。
3细胞破碎在珠磨机内进行珠磨破碎，珠磨机使用型号为KDL 0.015L；装珠量为85％；玻璃珠粒径0.25~0.5mm；破碎时间3分钟；破碎温度2℃。
4收集破碎后的细胞匀浆，静置直到匀浆形成两相，收集富聚乙二醇相。
测定富聚乙二醇相中乳酸脱氢酶的活性和总蛋白浓度。破碎再萃取法1.将干酵母在磷酸缓冲液(0.05mol/L，含3％氯化钠)中室温下悬浮活化时间1小时，离心收集湿细胞。
2.将收集的湿细胞重新悬浮在溶液中，其中含18％磷酸钠(Na2HPO.12H2O∶NaH2PO4.2H2O＝1.83)(w/v)，15％酵母(w/v，湿重)。
3.细胞破碎珠磨机，KDLO.015L；装珠量，85％；玻璃珠粒径，0.25~0.5mm；破碎时间，3分钟；破碎温度，2℃。
4.收集破碎后的细胞匀浆，向匀浆中加入聚乙二醇(分子量600)，使其浓度为24％(w/v)。
5.搅拌均匀，静置，直到匀浆形成两相。测定富聚乙二醇相乙醇脱氢酶的活性和总蛋白浓度。结果如下总蛋白浓度 乳酸脱氢酶活性 相比(mg/ml) (U/ml)破碎萃取过程集成法 22.3 100 1.45破碎再萃取法 18.5 58 1.38该结果表明，在破碎前加入聚乙二醇能够明显提高目标产物乳酸脱氢酶的稳定性。
权利要求
1.一种采用细胞破碎-双水相萃取提取胞内产物的方法，包括如下步骤(1)破碎前向细胞悬浮液中加入双水相试剂；(2)将步骤(1)获得的混合液直接通入珠磨机进行破碎；(3)破碎后从匀浆形成的双水相体系直接分离蛋白质。
2.按权利要求1所述的细胞破壁-双水相萃取提取胞内产物的方法，其特征在于所用的双水相试剂是聚乙二醇+无机盐。
3.按权利要求2所述的细胞破壁-双水相萃取提取胞内产物的方法，其特征在于所用的无机盐是磷酸盐和硫酸盐。
全文摘要
本发明是一种将细胞破碎技术和双水相萃取技术集成化以提取细胞内产物的新工艺。该方法是将待破碎的细胞和双水相萃取剂直接置于珠磨机内进行破碎操作，在破碎过程中双水相试剂对目标产物具有保护作用，破碎液直接进行双水相萃取。破碎过程中利用珠磨机内良好的混合条件，将双水相试剂在细胞悬浮液中充分混合，避免了破碎在萃取中局部盐浓度过高造成的目标产物的活性损失。其特征在于不但能节省操作时间和设备，而且还可以降低珠磨机的剪切作用对目标产物的破坏，提高目标产物的稳定性并提高破碎效率。
文档编号C07K1/14GK1463781SQ0212130
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月13日 优先权日2002年6月13日
发明者苏志国, 张贵峰 申请人:中国科学院过程工程研究所