专利名称：抗咽喉炎特异性复合IgY及其制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合IgY及其制备方法和制剂，特别是涉及一种抗咽喉炎特异性复合IgY及其制备方法和制剂
背景技术：
当前国内外治疗细菌引起的咽喉炎和扁桃腺炎等疾病的方法主要使用抗生素，此方法效果好，但存在几个问题。一是耐药菌株导致治疗无效，抗生素失效已成为全球性问题，其中中国上海和香港两地有75％以上的抗生素已失效。二是可能诱发抗药菌株的产生，“细菌越来越耐药，抗生素越来越失效”是经济较发达地区的普遍问题。三是将口腔和咽喉的有益细菌也杀灭了，导致菌群失调，破坏微生态平衡，产生不良后果；四是可引致腹泻、敏感反应、真菌感染等副作用。使用中草药制剂治疗细菌引起的咽喉炎和扁桃腺炎等疾病也很多见，如草珊瑚含片、冰硼咽喉片、西瓜霜润喉片、喉宝等。这些药剂舒缓症状作用较其抗菌疗效更为突出。蒸气吸入疗法也是临床常用方法之一，仍以缓和症状作为治疗目的。因此目前对咽喉炎和扁桃腺炎尚没有理想而又无副作用的治疗药物。
IgY(Immunoglobulin of yolk)属IgG类免疫球蛋白，能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变了该抗原(如某些细菌)的状态或活性；能通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细菌的吞噬；能与病毒结合，改变病毒表面的构象，阻止病毒吸附于易感细胞，同时，形成的病毒——IgY免疫复合物会被巨噬细胞吞噬。
技术内容本发明的目的是提供一种直接抑制或杀死咽喉炎(pharyngolaryngitis)致病菌的特异性IgY及其制备方法；本发明的目的还在于提供一种直接抑制或杀死咽喉炎(pharyngolaryngitis)致病菌的特异性IgY制成的天然安全而又具有特效作用的、防治咽喉炎和扁桃腺炎的制剂。
本发明目的是通过如下技术方案实现
(1)优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原(约20亿个以上细菌)。在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后采用本公司已公开的专利技术(专利申请号00101270.3，专利公开号1307061)分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为本发明优选的高免疫应答能力的特种鸡；上述母鸡可以选自明星鸡、莱航鸡、褐兰鸡、罗曼鸡；(2)复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌占40-60％，肺炎双球菌占35-25％，金黄色葡萄球菌占25-15％，的比例混合匀化或者按A簇B型溶血型链球菌占45-30％，肺炎双球菌占15-25％，G簇溶血性链球菌占10-15％，金黄色葡萄球菌占10-20％，白色葡萄球菌占20-10％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，以10000-30000rpm转速进行高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；(3)分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋；(4)抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品；(5)抗咽喉炎IgY的纯化采用本公司已公开的专利技术(专利申请号00101270.3，专利公开号1307061)分别过离子交换柱和凝胶交换柱对按以上工艺所制取的抗咽喉炎IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗咽喉炎IgY粗提物进行检测，测得其中纯IgY含量为50％以上。
采用本发明的特殊免疫激活方法和改进的工艺技术所制得的抗咽喉炎复合IgY粗提物参照上述“ELISA法”进行活性检测，对A簇和G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、白色葡萄球菌等五种致病菌抗体结合效价达到1∶256以上，对其它跟这5种细菌有“共同抗原决定簇”的同属不同种或同种不同簇和不同型的细菌的抗体结合效价也达到1∶128以上。
0.02-80％的复合IgY粗提物或者其纯化物配以99.98-20％的辅料，可制成临床可接受的剂型，如口含片、滴鼻剂、鼻喷剂、口喷剂等剂型的产品。特别是以抗咽喉炎复合IgY粗提物或其纯化物为主要成份配制成新型喷雾剂或口含片，本发明将其设计直接施于致病菌最集中的咽喉部位，作用直接，疗效好、见效快；同时，它克服了常规施药方式要使药物进入人体循环后才产生作用而会给人体带来种种不良影响的弊病。
本发明所制备的抗咽喉炎复合IgY是一种独特的纯天然生物制剂，使用十分安全，无任何毒副作用。由于它仅仅针对咽喉炎和扁桃腺炎的致病病原体直接产生强烈的抑制作用，对有益菌却有很好的保护作用；同时，它完全不会诱发抗药菌株的产生，也不会象“抗生素”或其他常规药物那样，将有益菌群也和病原体一起都抑灭而造成“菌群失调”；反之，抗咽喉炎复合IgY可以在咽喉部位构建一种不产生炎症的正常菌群生态，达到既治疗又预防的双重目的。
实验例1以单一A簇溶血性链球菌、单一金黄色葡萄球菌、A簇溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌混合，分别制成三种不同抗原免疫母鸡，并分别按上述方法制取三种不同IgY。然后各自参照“ELISA法”检测其抗体结合效价。
比较分析以上试验后，我们发现采用几种致病菌制成复合抗原，再用这种复合抗原免疫母鸡所制得的复合IgY，对复合抗原的结合效价比对单一抗原的结合效价高。由于咽喉部位的致病菌很少是单一发生作用的，都是由几种致病菌综合作用才产生炎症等症状，例如，金黄色葡萄球菌在咽喉部位存在，只是有条件致病菌，它单独存在并不一定会导致咽喉炎症，只有当溶血性链球菌作祟时，它才会跟着起作用。因此，以复合抗原免疫母鸡，所制得的复合IgY，对于由多种致病菌引致的疾病，效果比采用单一抗原免疫母鸡所制备的IgY要好得多。
实验例2筛选高免疫应答的鸡种以A簇溶血性链球菌制作抗原，用同一剂量、同一注射方式分别免疫法国“明星鸡”、意大利“莱航鸡”、美国“罗曼鸡”；然后分别从这些不同种的母鸡所产蛋中提取出IgY，再参照前述“ELISA法”逐个检测这些IgY的效价。
从对比试验中，可以明显看出，在各方面条件一样的情况下，免疫美国“罗曼鸡”所制取的IgY的效价比其他鸡种高得多。
实验例3采用菌体成份制作抗原的抗体结合效价试验试验及检测结果见下表
试验和检测结果证实，采用菌体成份制作抗原，可以使所制取的IgY对未免疫的其他同种不同型和亚型的细菌的抗体结合效价大幅度提高。这一点对于提高所制备的IgY的活性和广谱性十分重要。
实验例4采用特殊的多部位、大剂量注射方式代替普遍采用的肌肉注射方式的强化免疫激活方法对抗体结合效价的影响。
试验结果如下
采用特殊的多部位、大剂量注射方式代替普遍采用的肌肉注射方式的强化免疫激活方法所制得的特异性复合IgY，对具有“共同抗原决定簇”的一系列细菌的抗体结合效价都大幅度提高。
实验例5强化免疫激活方法对母鸡免疫应答时间的影响用强化免疫激活方法对所改良的特种母鸡在1个月内先后进行3次免疫后，该种母鸡的免疫应答时间由6个月延长到13个月。即在13个月的时间里，在这种母鸡所产蛋中，都一直保持有高活性的抗体，大幅度降低了IgY产品的成本。
将所筛选的200只鸡，任选10只采用以上四项强化免疫激活方法免疫；同时，另外任意选择其他10只一般“罗曼鸡”，采用常规的方法，以五种同样的细菌制作全菌抗原，用常规肌肉注射方式免疫这些鸡。然后，在第一次免疫注射后的不同时期，分别以这两批不同的鸡所产的蛋提取出IgY，再逐个检测其效价，结果如下
这样长的免疫应答时间，比全世界其他许多研究IgY的机构在免疫的母鸡时所能实现的免疫应答时间(一般为4-5个月，最长为6个月)，提高了一倍以上。反映了本发明的一系列免疫激活方法是先进的。
实验例6不同鸡种的免疫效果观察我们任选“明星鸡”10只、“莱航鸡”10只、“褐兰鸡”10只、普通“罗曼鸡”10只、本试验优选的“罗曼鸡”10只，采用本发明复合抗原，应用上述强化免疫激活方法，分别免疫上列五种母鸡。分别制取IgY，再各自检测其效价。
试验结果显示，本发明免疫激活方法可以明显激活和提高一些原本较迟钝的母鸡的免疫应答机能。
实验例7减少抗原中细菌组成成份，观察免疫激活方法对复合IgY广谱性的影响。
将抗原中五种主要致病菌种中减少G簇溶血性链球菌和白色葡萄球菌从抗原中剔除，再把精简后剩下的三种抗原细菌高速粉碎匀化后制成全菌和菌体成份的特殊复合抗原，同样采用以上强化免疫激活方法免疫优选的良种“罗曼鸡”，然后提取IgY。最后，分别检测所得的广谱性的复合IgY对G簇溶血性链球菌和白色葡萄球菌的抗体结合效价，结果如下
从以上试验看出，用高速粉碎所得的菌体成份来制取特殊抗原，又采用了其他一系列免疫激活方法，所制得的抗咽喉炎复合IgY具有理想的广谱性，不仅对所免疫的几种致病菌有很强的抑制效果，对同种不同型和不同簇(如A簇溶血性链球菌与不同簇的G簇溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌和不同种属的白色葡萄球菌)也同样都有理想的抑制作用。
因此，本发明的免疫激活方法不但效果显著，而且具有很强的适应性和灵活性。
实验例8抗咽喉炎IgY喷雾剂治疗100例急性咽喉炎及扁桃腺炎的临床疗效观察治疗天数 疼痛症状减轻例数 疼痛症状消失例数 咽喉和扁桃腺体征第一天 785 5例局部红肿消失第二天 1758 58例局部红肿减轻或消失第三天 5 32 27例红肿消失，5例减轻第四天 0 5 5例红肿消失喷雾剂制剂对引起咽喉炎和扁桃腺炎等疾病的主要病原体，如A族和G族链球菌(streptococcus)、金黄色和白色葡萄球菌(staphylococci)和肺炎双球菌(S.pneumoniae)，以及不同种和属、不同型和亚型所有具有“共同抗原”的链球菌、葡萄球菌和肺炎双球菌，都具有特殊的效果，故而能从根本上治愈由这类细菌引起的咽喉炎和扁桃腺炎等疾病。实施例1制备100g抗咽喉炎IgY粗提物及纯IgY生产工艺流程。
(1)优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫1000只罗蔓母鸡，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记按后常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只200只。再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种鸡并选40只；(2)复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌占40％，肺炎双球菌占15％，G簇溶血性链球菌占15％，金黄色葡萄球菌占20％，白色葡萄球菌占10％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，以10000-30000rpm转速进行高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；(3)分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋1000只；(4)抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时；将稀释液加入高速离心分离机中，以8000-12000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品；过离子交换柱和凝胶交换柱对抗咽喉炎IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。实施例2制备100g抗咽喉炎IgY粗提物及纯IgY生产工艺流程。
(1)优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫1000只罗蔓母鸡，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记按后常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只200只。再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种鸡并选40只；(2)复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上三种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按按A簇B型溶血型链球菌占40-60％，肺炎双球菌占35-25％，金黄色葡萄球菌占25-15％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，以10000-30000rpm转速进行高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；(3)分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋1000只；(4)抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时；将稀释液加入高速离心分离机中，以8000-12000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品；过离子交换柱和凝胶交换柱对抗咽喉炎IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。实施例3抗咽喉炎复合IgY粗提物或纯化物制备口喷液复合抗咽喉炎病原菌IgY粗提物或纯化物0.15％阿斯巴甜 0.12％薄荷香精 0.35％
香橙香精 0.30％水蜜桃香精0.10％蒸馏水加至100ml先取蒸馏水约80.0ml，然后按配方成份的次序先后加入搅拌均匀；最后加水至100ml，搅拌均匀；再通过0.22μ膜过滤除菌器过滤除菌，得到无菌液体，即防治咽喉炎IgY喷雾剂，采用无菌喷雾瓶灌装。实施例4复合抗咽喉炎病原菌IgY粗提物或纯化物0.30％阿斯巴甜 0.24％薄荷香精 0.70％香橙香精 0.60％水蜜桃香精 0.20％蒸馏水 加至100ml先取蒸馏水约80.0ml，然后按配方成份的次序先后加入搅拌均匀；最后加水至100ml，搅拌均匀；再通过0.22μ膜过滤除菌器过滤除菌，得到无菌液体，即防治咽喉炎IgY喷雾剂，采用无菌喷雾瓶灌装。实施例5复合抗咽喉炎病原菌IgY粗提物或纯化物90g加入10g的常规敷料，制成口含片500粒。
权利要求
1.一种抗咽喉炎复合IgY粗提物，其特征在于该IgY粗提物是由如下方法制备的优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的IgY，以ELISA法检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为本发明优选的高免疫应答能力的特种鸡；复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌占45-30％，肺炎双球菌占15-25％，G簇溶血性链球菌占10-15％，金黄色葡萄球菌占10-20％，白色葡萄球菌占20-10％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋；抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品。
2.如权利要求1所述的一种抗咽喉炎复合IgY粗提物，其特征在于该IgY粗提物是由如下方法制备的优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的IgY，以ELISA法检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只200只。再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种鸡；复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌占40％，肺炎双球菌占15％，G簇溶血性链球菌占15％，金黄色葡萄球菌占20％，白色葡萄球菌占10％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，以10000-30000rpm转速进行高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋；抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时；将稀释液加入高速离心分离机中，以8000-12000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品。
3.如权利要求1或2所述的抗咽喉炎复合IgY粗提物，其特征在于该IgY粗提物制备方法中的复合抗原制备还可以选取按A簇B型溶血型链球菌占40-60％，肺炎双球菌占35-25％，金黄色葡萄球菌占25-15％的比例混合匀化。
4.如权利要求1或2所述的一种抗咽喉炎复合IgY，其特征在于该IgY制备方法中的良种母鸡可以选自明星鸡、莱航鸡、褐兰鸡、或罗曼鸡。
5.如权利要求3所述的一种抗咽喉炎复合IgY，其特征在于该IgY制备方法中的良种母鸡可以选自明星鸡、莱航鸡、褐兰鸡、或罗曼鸡。
6.一种抗咽喉炎纯IgY，其特征在于该IgY是由如下方法制备的优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的IgY，以ELISA法检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为本发明优选的高免疫应答能力的特种鸡；复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌占45-30％，肺炎双球菌占15-25％，G簇溶血性链球菌占10-15％，金黄色葡萄球菌占10-20％，白色葡萄球菌占20-10％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋；抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品；过离子交换柱和凝胶交换柱对抗咽喉炎IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
7.如权利要求6所述的一种抗咽喉炎IgY，其特征在于该IgY是由如下方法制备的优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的IgY，以ELISA法检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只200只。再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种鸡；复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌占40％，肺炎双球菌占15％，G簇溶血性链球菌占15％，金黄色葡萄球菌占20％，白色葡萄球菌占10％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，以10000-30000rpm转速进行高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋；抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时；将稀释液加入高速离心分离机中，以8000-12000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品；过离子交换柱和凝胶交换柱对抗咽喉炎IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
8.如权利要求6或7所述的抗咽喉炎IgY，其特征在于该IgY制备方法中的复合抗原制备还可以选取按A簇B型溶血型链球菌占40-60％，肺炎双球菌占35-25％，金黄色葡萄球菌占25-15％的比例混合匀化。
9.如利要求6或7所述的一种抗咽喉炎复合IgY，其特征在于该IgY制备方法中的良种母鸡可以选自明星鸡、莱航鸡、褐兰鸡、或罗曼鸡。
10.一种抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备方法，其特征在于该方法为优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的IgY，以ELISA法检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为本发明优选的高免疫应答能力的特种鸡；复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌占45-30％，肺炎双球菌占15-25％，G簇溶血性链球菌占10-15％，金黄色葡萄球菌占10-20％，白色葡萄球菌占20-10％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋；抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品。
11.一种抗咽喉炎纯IgY的制备方法，其特征在于该方法为优选具高免疫应答能力的良种鸡用A簇溶血性链菌制作抗原，分别免疫母鸡，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸡所产的蛋标记后分别提取其中的IgY，以ELISA法检测所制得的IgY的效价；再比较其效价，选出其中能制得IgY效价≥1∶128的免疫应答能力特别强的鸡只，再用这批鸡所产的蛋孵出优良鸡种，待其长大至2-3个月，作为本发明优选的高免疫应答能力的特种鸡；复合抗原的制备选取A簇B型溶血性链球菌、肺炎双球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌为咽喉炎和扁桃腺炎主要致病菌；购买市售以上五种主要致病菌菌株，用细菌培养基分别在三气培养箱中常规培养；将培养好的细菌按A簇B型溶血型链球菌占45-30％，肺炎双球菌占15-25％，G簇溶血性链球菌占10-15％，金黄色葡萄球菌占10-20％，白色葡萄球菌占20-10％的比例混合匀化；按1∶1的比例将福氏佐剂加入混合好的菌株混和体中搅拌均匀，制得乳状全菌复合抗原；将全菌复合抗原放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，制得全菌和菌体成份的复合抗原；分别对优选的特种鸡进行强化免疫用所制取的复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种鸡进行免疫，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于30-60亿个细菌；每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫注射20天后，检取鸡所产免疫蛋；抗咽喉炎复合IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品；过离子交换柱和凝胶交换柱对抗咽喉炎IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
12.如权利要求10或11所述的一种抗咽喉炎复合IgY的制备方法，其特征在于该方法中的良种母鸡可以选自明星鸡、莱航鸡、褐兰鸡、或罗曼鸡。
13.如权利要求10或11所述的抗咽喉炎IgY的制备方法，其特征在于该方法中的复合抗原制备还可以选取按A簇B型溶血型链球菌占40-60％，肺炎双球菌占35-25％，金黄色葡萄球菌占25-15％的比例混合匀化。
14.各种抗咽喉炎制剂，该制剂可以是口含片、滴鼻剂、鼻喷剂、糖果制品等。其特征在于该制剂中含有0.02-80％的抗咽喉炎病原菌IgY粗提物或纯化物。
15.一种抗咽喉炎口喷剂，其特征在于该其特征在于该口喷剂是由下列组份制成复合抗咽喉炎病原菌IgY粗提物或纯化物 0.15-0.3％阿斯巴甜 0.12-0.24％薄荷香精 0.35-0.70％香橙香精 0.30-0.60％水蜜桃香精 0.10-0.20％蒸馏水 加至100％
全文摘要
本发明公开一种抗咽喉炎特异性复合IgY及其制备方法和制剂。本发明抗咽喉炎特异性复合IgY通过优选具高免疫应答能力的良种鸡，用全菌和菌体成份的复合抗原，分别对优选的特种鸡进行强化免疫，检取强化免疫鸡所产免疫蛋，制得抗咽喉炎复合IgY粗提物干粉成品，IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。用本发明IgY制备的抗咽喉炎口喷制剂无化学有害物质、天然安全并可直接喷服。
文档编号C07K16/02GK1463749SQ0212124
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月11日 优先权日2002年6月11日
发明者胡义结, 杨荣, 包海威, 包晟 申请人:雅臣药业集团(远东)有限公司