专利名称：：一种单细胞微生物的高效破壁方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体地涉及单细胞微生物的细胞破碎方法。
背景技术：
：微生物发酵在工业中发挥着巨大的作用，很多抗生素、酶类、有机酸、色素等均通过微生物发酵获得。特别是构建基因工程菌株，高效表达目的产物，已经成为人们大量获取有益产物的途径。由于微生物细胞壁组成和厚度差异很大，还没有一个对细菌和真菌通用的方法进行细胞破碎。通常采用酸碱破壁会造成污染，且易破坏拟提取的产物，化学法破壁对环境不友好，现有的压力破壁机(FrenchPress)效率极低，只限实验室使用，且不适于酵母菌的破壁。而一些酵母菌需要釆用蜗牛酶或纤维素酶辅助破壁，对一些壁厚的酵母菌作用不显著，常常需要根据情况混合不同的酶液，调整酶解条件,花费大，效率低，不适于大规模生产使用。
发明内容(一)要解决的技术问题本发明的目的在于针对上述不足提供一种高效快速的细胞破壁方法，既可达到100%破壁，又便于胞内产物的提取。(二)技术方案为实现上述目的，本发明的技术方案是釆用高压勻质机对细胞悬液直接进行破碎。其包括步骤首先将细胞制备成1030%的细胞悬液通入高压均质机中，对于原核单细胞微生物而言，设置压力为6090Mpa，对于真核单细胞微生物，则设置压力为90150Mpa，流速为580升/小时，循环14次。当然，也可以将发酵罐中的发酵液直接加入高压匀质机，按照上述条件进行破壁。具体地说，对于原核单细胞微生物，优选将其制备成20~30%的细胞悬液，通入高压匀质机，选择压力80Mpa,采用流速为7升/小时的高压均质机，循环2次，即可100%破壁。对于真核单细胞微生物，优选将其制备成2030%的细胞悬液，通入高压勻质机，选择压力120Mpa，釆用流速为50-70升/小时，循环2-3次，即可100%破壁。(三)有益效果本发明建立了直接快速的单细胞破壁方法，发酵罐中培养的细胞直接进入破壁程序，无需经过离心-再悬浮混匀的过程，并且可保证目标物完好无损，破碎的细胞粗提液即可直接进入产物纯化的过程，减少了生产环节，节约了工作时间。本发明适用于所有单细胞微生物的破壁环节，其能够在发酵工业中提高工作效率，并且该方法无需任何化学药物辅助，显著降低生产成本，同时对环境无排放污染，可以广泛推广使用，经济效益不可估量。图1:磁螺菌破壁效果检测(60Mpa，20%细胞液，循环2次破壁后光学显微镜照片(xlOOO));图2:法夫酵母破壁图(120Mpa，30%细胞液，循环2次破壁后光学显微镜照片(x400))。具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。实緣备及其参数型号NCJJ-7/200流量(L/H):7最大压力(Mpa):200额定压力(Mpa):180功率(KW):0.75型号NCJJ-75/150流量(L/H):75最大压力(Mpa):150额定压力(Mpa):120功率(KW):7.5最大投入粒径(|im):50最大投入粒径(pm):10实施例l原核单细胞生物的细胞破碎本例釆用单细胞模式微生物趋磁螺菌g，fe而她騰)为代表菌株，将发酵后的趋磁细菌从发酵罐中直接以管道通入高压均质机，设定好压力，流速为7L/h,循环2次后，细胞全部破碎，提取磁小体，经电镜观察，磁小体颗粒均勾，外膜完整，质量完好。表l是磁螺菌在不同条件下的破壁效果。图1是20%细胞液，在60Mpa压力下破碎后，经结晶紫染色后的结果。细胞破碎率达90%。表1磁螺菌在不同条件下的破壁效果<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage5<table>实施例2真核单细胞生物的细胞破碎本例釆用单细胞微生物法夫酵母(Mt^w皿)为代表菌株,分别配制成10%、20%和30%的细胞悬液，通入高压均质机，在不同条件下进行破壁。结果如表2所示。表2法夫酵母在不同条件下的破壁效果<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上表可以看出10%的细胞悬液在90Mpa的压力处理破壁率即可达到87.7%,在120Mpa，150Mpa的处理能彻底的使细胞壁破碎，色素提取率近100%。因此我们选择120Mpa为法夫酵母破壁的最适压力，并大规模的应用于生产。图2是30%细胞悬液，经120Mpa压力破壁后的细胞400倍光学显微镜照片。视野中仅有少量完整细胞，95°/。以上的细胞已经被破碎。法夫酵母破壁后虾青素提取率高于其他破壁方法。实施例3大流量高压均质机对细菌和酵母的破壁效果表3在不同条件下的破壁效果<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3显示大流量高压均质机对磁螺菌和法夫酵母的破壁效果，釆用80-140Mpa的工作压力，在流量为75升/h,循环2-4次，均可达到98%-100%破壁效果。权利要求1、一种单细胞微生物破壁方法，其包括步骤首先将细胞制备成10～30％的细胞悬液通入高压均质机中，对于原核单细胞微生物而言，设置压力为60～90Mpa，对于真核单细胞微生物，则设置压力为90～150Mpa，流速为5～80升/小时，循环1～4次。2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，破壁对象为真核单细胞微生物则设置细胞悬液浓度为2030%，压力120Mpa。3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，破壁对象为原核微生物设置细胞悬液浓度为2030%，压力80Mpa。4、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的原核单细胞微生物为趋磁细菌。5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的真核单细胞微生物为法夫酵母。6、如权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞悬液为发酵培养的发酵液。全文摘要本发明提供了一种高效快速的单细胞微生物的破壁方法，该方法首先将细胞制备成10～30％的细胞悬液通入高压均质机中，对于原核单细胞微生物而言，设置压力为60～90MPa，对于真核单细胞微生物，则设置压力为90～150MPa，流速5～80升/小时，循环1～4次，即可对细菌或酵母实现100％的破壁。本发明方法可有效地应用于发酵工程产物提取工艺，节约时间，提高生产效率，并且无需任何化学药物辅助，尤其适用于发酵工业。文档编号C12N1/20GK101195813SQ20081005566公开日2008年6月11日申请日期2008年1月4日优先权日2008年1月4日发明者涛唐,伟姜,颖李,李季伦,王珍芳,田杰生,苗莉莉申请人:中国农业大学