专利名称：一种多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，特别涉及一种β分泌酶的底物及其应用。
背景技术：
切割β淀粉状前体蛋白(APP)产生β淀粉状蛋白多肽(Aβ)必需两个酶，其中之一为β分泌酶(Vassar，R，et.al，Science，286(5440)533-537，1999；Sukanto S，et.al，Nature，402537-540，1999)，Aβ产生后聚集成为Aβ纤维丝最后形成淀粉状沉淀。抑制Aβ的产生以及抑制Aβ纤维丝的形成是治疗Alzheimer疾病的两种途径。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种硫氧还蛋白和Aβ融合形成的多肽。
本发明的另一目的旨在提供这种多肽的应用。
本发明所述的多肽命名为TrxAβ，序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的多肽应用于筛选β分泌酶抑制物。
本发明所述的多肽应用于筛选Aβ纤维丝形成抑制物。
本发明所述的多肽TrxAβ由改构的硫氧还蛋白(HP thioredoxin)和APPSW(651-713)以及一段连接肽组成，如图1所示。HP thioredoxin是invitrogen公司的商业化产品，主要用作重组可溶性表达分子伴侣，可用金属螯和亲和层析纯化。连接肽是在构建TrxAβ的过程中引入的。
当TrxAβ与β分泌酶组成反应体系，在适当条件下经一段时间，TrxAβ被β分泌酶在SW位点切割开，分成两部分一部分由HP thioredoxin和连接肽及APP(651-671)组成，另一部分为Aβ(1-42)，反应液与金属螯和酶标板孵育，含HP thioredoxin的肽段与酶标板结合，然后用抗Aβ抗体作ELISA检测，可反应β分泌酶活性的高低，从而可用于筛选β分泌酶抑制物。
Aβ单体在一定条件下聚集形成Aβ纤维丝，可用刚果红和Thioflavin-T染色显示，还可用其它方法显示Aβ纤维丝的形成(Stephen J.W.，et.al，J.Bio.Chem.271(8)4086-4092，1996；Hilal A.L.，J.Bio.Chem.277(45)42881-42890，2002)。Aβ一般从老年痴呆病人尸体提取得到。本发明的TrxAβ在体外会发生聚集，形成聚集后不能与金属螯和板结合，用ELISA法可检测到与金属螯和板结合的TrxAβ的量(如用抗Aβ抗体)。因此本发明的TrxAβ可用于筛选Aβ纤维丝抑制物。
图1为TrxAβ蛋白组成示意图。
图2表达质粒pThioAβ示意图。
图3β分泌酶酶切反应时间图谱。
具体实施例方式
实施例1TrxAβ用于筛选Aβ纤维丝形成抑制物TrxAβ的制备人工合成如SEQ ID No.2的DNA序列，在其5’端加入含KpnI酶切位点的序列(5’GGTACCC)，在其3’端加入SalI酶切位点(5’GTCGAC)，克隆入表达载体pThioHisA(invitrogen公司)的KpnI/SalI酶切位点间，使其与编码HPthioredoxin蛋白的序列融合，筛选得到重组表达质粒pThioAβ并测序证实，表达质粒pThioAβ示意图如图2所示。
将表达质粒pThioAβ转化入大肠杆菌BL21(DE3)，用LB培养基37℃振荡培养至OD660大约为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达，四小时后离心收菌。菌体悬浮于0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5中，超声破碎离心去上清，沉淀用1M Urea/0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5洗一次，溶于4M Urea/0.02MTris/1mM EDTA/pH7.5中，过QAE-spherose层析纯化，线性梯度洗脱，合并含目的蛋白的各收集管，稀释于4倍体积的0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5中，加入终浓度为1mM的GSH，调pH值为8.0，4℃放置7天后即可使用。
Aβ纤维丝形成抑制物筛选将上述的复性液对0.1M NaAc/pH4.0透析，离心去除沉淀，取37.5ul，加入待筛选样品2.5ul，37℃放置24小时后，加入一定量的0.75M Tris/pH8.8调pH值为7.5-8.0，包被在金属螯和酶标板上(pierce公司，catalog15146)，室温振摇1小时后，然后用专用封闭液(pierce公司，catalog37547)封闭30 minutes，再用封闭液(1％BSA/PBS)封闭30 minutes，加入一抗(生物素标记的抗β-amyloid单抗，pierce公司，catalogMN1150B)室温孵育1小时，用洗液(0.1％BSA/0.05％Tween 20/PBS)洗三次，加入HRP-ABC液孵育30 minutes，洗液洗三次，加入DAB显色剂显色，测OD450-OD630值。
用Aβ纤维丝形成抑制物去甲肾上腺素、多巴胺、MTMA(myristyltrimethylammonim)作阳性对照，结果(表1)表明此方法是有效的。
表1Aβ纤维丝形成抑制物筛选实验结果
实施例2TrxAβ用于筛选β分泌酶抑制物重组β分泌酶的制备以下方法提供了一种β分泌酶的重组融合表达形式(与HP-thiredoxin融合，TrxBACE)。
用QIAGEN公司的Oligotex Direct mRNA Micro Kit提取胎胰腺组织mRNA，用大连宝生物公司的BcaBestTMRNA Kit Ver1.1，以oligodT作引物扩增第一链，以引物(BACE_F5’GGTACCCACCCAGCACGGCATCCGGC，BACE_R5’GTCGACTTAGGGTTGACTCATCTGTCTGT)扩增得BACE cDNA，克隆入宝生物公司的pMT18载体，转化大肠杆菌DH5alpha，用蓝白斑筛选结合PCR法筛选得阳性克隆，提取质粒并测序证实，测序结果表明克隆得到的序列有一无意突变，编码Tyr129的TAT→TAG。设计引物组1(TrxF5’TTCCTCGACGCTAACCTG和MutantR5’GGTGTAGGGCACGTACACACCCTTCCG)和引物组2(TrxR5’TGTAAAACGACGGCCAGTGC和MutantR5’CGTGCCCTACACCCAGG)，再用TrxF和TrxR作引物，突变得到编码序列正确的BACE cDNA，其5’端加有含KpnI酶切位点的序列(5’GGTACCC)，3’端加有SalI酶切位点(5’GTCGAC)，克隆入表达载体pThioHisA(invitrogen公司)的KpnI/SalI酶切位点间，筛选得到重组表达质粒pThioBACE。
将表达质粒pThioBACE转化入大肠杆菌BL21(DE3)，用LB培养基37℃振荡培养至OD660大约为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达，四时间后离心收菌。菌体悬浮于0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5中，超声破碎离心去上清，沉淀用1M Urea/0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5洗一次，溶于4M Urea/0.02MTris/1mM EDTA/pH7.5中，稀释于4倍体积的0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5中，加入终浓度为1mM的GSH，调pH值为8.0，4℃放置7天后即可使用。
β分泌酶抑制物筛选将TrxAβ和TrxBACE复性液对0.1M NaAc/pH4.0透析，离心去除沉淀。取TrxAβ75ul和TrxBACE 100ul及筛选样品5ul，20ul乙醇组成酶反应体系，37℃保温18至24小时后，调pH至7.5-8.0，与金属螯和酶标板结合，其它ELISA步骤同实施例1。用βsecretase inbitor II(calbiochem，catalog565749)，测得的IC50与报道的近似，说明本方法的有效性。
本酶切反应耐受20％含量以下的甲醇和乙醇，耐受10％含量以下的DMSO。在反应中加入多巴胺或去甲肾上腺素等Aβ纤维丝形成抑制物，可使检测信噪比增高。另外，酶切反应结果还可用SDS-PAGE显示。将酶切液跑SDS-PAGE电泳，随酶切时间的延长，可见一酶切条带增强，而底物条带逐渐减弱(图3)。
表2 β分泌酶抑制物筛选实验
SEQ ID No.1序列特征1.长度184氨基酸2.类型蛋白质序列1 MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA HWCGPCKMIA PILDEIADEY51 QGKLTVAKLN IDHNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL101 KEFLDANLAG SGSGDDDDKV PTTRPGSGLT NIKTEEISEV NLDAEFRHDS151 GYEVHHQKLV FFAEDVGSNK GAIIGLMVGG VVIASEQ ID No.2序列特征1.长度192碱基对2.类型核酸3.链型双链4.拓扑学线性序列1 ACC ACC CGT CCG GGT TCC GGT CTG ACC AAC ATC AAA ACC GAA GAATGG TGG GCA GGC CCA AGG CCA GAC TGG TTG TAG TTT TGG CTT CTT46 ATC TCC GAA GTT AAC CTG GAC GCT GAA TTC CGT CAC GAC TCC GGTTAG AGG CTT CAA TTG GAC CTG CGA CTT AAG GCA GTG CTG AGG CCA91 TAC GAA GTT CAC CAC CAG AAA CTG GTT TTC TTC GCT GAA GAC GTTATG CTT CAA GTG GTG GTC TTT GAC CAA AAG AAG CGA CTT CTG CAA136 GGT TCC AAC AAA GGT GCT ATC ATC GGT CTG ATG GTT GGT GGT GTTCCA AGG TTG TTT CCA CGA TAG TAG CCA GAC TAC CAA CCA CCA CAA181 GTT ATC GCT TAACAA TAG CGA ATT
权利要求
1.一种多肽，其特征在于命名为TrxAβ，序列如下所示1 MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA HWCGPCKMIA PILDEIADEY51 QGKLTVAKLN IDHNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL101 KEFLDANLAG SGSGDDDDKV PTTRPGSGLT NIKTEEISEV NLDAEFRHDS151 GYEVHHQKLV FFAEDVGSNK GAIIGLMVGG VVIA
2.权利要求1的多肽用于筛选β分泌酶抑制物。
3.权利要求1的多肽用于筛选Aβ纤维丝形成抑制物。
全文摘要
本发明涉及一种生物制剂，特别涉及一种β分泌酶的底物及其应用。本发明所述的多肽命名为TrxA β，序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述的多肽TrxAβ由改构的硫氧还蛋白(HP thioredoxin)和APP
文档编号C07K14/00GK1583786SQ20041002264
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者赵彬, 杨宏军, 赵晶, 徐林 申请人:成都军区昆明总医院