专利名称：羟基磷灰石复性及同时纯化基因重组蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种羟基磷灰石复性及同时纯化基因重组蛋白质的方法，属于基因工程下游技术领域。
背景技术：
以大肠杆菌为宿主来表达的基因重组蛋白质，往往绝大部分以不可溶且无生物活性的包涵体形式存在。常用变性剂来溶解包涵体，然后通过透析或稀释的方法除去变性剂或降低其浓度，在无变性剂或低浓度变性剂的条件下，蛋白质才能获得天然构象，获得生物活性，这一过程称为复性。但采用这两种方法，大部分蛋白质要形成沉淀，只有小部分蛋白质，约5～20％，获得复性。
根据刘国诠主编《生物工程下游技术》，化学工业出版社2003年第二版，采用液相色谱技术复性蛋白质有良好的效果，活性回收率有很大的改善，且同时有纯化的作用。能够用于蛋白质复性及同时纯化的有凝胶过滤色谱、离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱。凝胶过滤色谱是利用蛋白质分子与变性剂分子的大小不同，而逐渐将两者分离，实现复性，其关键是在柱床中形成良好的变性剂浓度梯度，使蛋白逐渐脱离变性剂；后三者属于吸附性色谱，都是利用柱床的固定相与蛋白质的吸附作用力强于固定相与变性剂的作用力，而将蛋白质与变性剂分离，这种吸附作用也可帮助蛋白复性和防止蛋白沉淀。但是，均有其不足之处。凝胶过滤色谱中，变性剂的浓度梯度不易控制，蛋白质容易在色谱柱中沉淀而堵塞柱子，加载蛋白浓度不能太高；纯化能力较差。在离子交换色谱，最常用的变性剂盐酸胍也会在固定相中保留，不仅影响柱容量，而且往往与蛋白质一起在洗脱过程中流出色谱柱，从而使最有效提取蛋白质的变性剂盐酸胍的使用受到限制。中国专利ZL92102727，在疏水色谱复性中，要在变性液中加高浓度的盐，限制了蛋白浓度，且容易在柱头处产生沉淀。亲和色谱只对一种或少数几种蛋白质有亲和作用，适用范围窄。因此，采用良好的色谱填料、探索适宜的操作条件，在复性纯化蛋白质的同时，防止沉淀的产生，是液相色谱复性基因重组蛋白质的关键问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种羟基磷灰石复性及同时纯化基因重组蛋白质的方法，其特点是采用羟基磷灰石作为液相色谱填料，在变性蛋白加载前后加入变性剂，对高浓度变性蛋白进行复性，避免了蛋白质复性过程中产生沉淀，提高了活性回收率，目的蛋白的纯度达到90％。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所用原料份数除特殊说明外，均为摩尔数。
羟基磷灰石复性及同时纯化基因重组蛋白质的方法1.选用对变性蛋白有强的吸附能力而对变性剂和还原剂的吸附能力较弱的羟基磷灰石作为填料，用高浓度变性剂4～8mol/L脲，防止蛋白在管道和柱头处的沉淀。用洗脱方法将蛋白与变性剂和还原剂分离，实现蛋白的折叠复性；同时将目的蛋白和杂蛋白分离，实现目的蛋白的纯化。
2.洗脱变性剂、还原剂常用变性剂为盐酸胍和脲、还原剂为二硫苏糖醇，与羟基磷灰石结合力较弱，可用去离子水或低浓度盐溶液如0～0.05mol/L的含有Na+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+等阳离子的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐溶液将其洗脱。
3.洗脱蛋白质羟基磷灰石对蛋白的吸附作用类似于离子交换剂，可用pH＞5的浓度较高的盐如0.1～3mol/L，含有Na+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+等阳离子的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐溶液，线性梯度或阶梯梯度分别洗脱杂蛋白和目的蛋白。
4.柱子再生目的蛋白洗脱后，用上述高浓度盐或0.5～1mol/L的氢氧化钠将所有杂蛋白完全洗脱，然后再用去离子水或低离子浓度盐溶液平衡柱子，至少5个柱床体积。
本发明具有如下优点(1)在变性蛋白上样前后加用变性剂，避免了蛋白质产生聚集而沉淀；(2)适用范围广，羟基磷灰石既能结合带正负电荷的蛋白，也能结合不带电荷的中性蛋白，可用于多种基因重组蛋白质的复性及纯化；而且，盐酸胍和脲变性的蛋白都可以直接上柱；(3)羟基磷灰石十分稳定，实验结果重复性好；填料经济，有助于工业放大。适用于基因工程下游重组蛋白质的复性和纯化。
四
图1为色谱操作装置示意图1.去离子水或低浓度盐溶液槽2.高浓度脲溶液槽3.变性蛋白槽4.高浓度盐溶液槽5.泵6.羟基磷灰石色谱柱7.检测器8.收集器。
图2为上样示意图9.高浓度脲10.变性蛋白溶液。
图3为重组人骨形态发生蛋白-2的复性及同时纯化操作中的色谱图和电泳图A、B、C为杂蛋白组分，D为目的蛋白组分，a、b、c、d为杂蛋白组分的电泳图谱，e、f为目的蛋白组分的电泳图谱，g为蛋白质分子量标准。
五具体实施例方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1、重组人骨形态发生蛋白-2用盐酸胍及二硫苏糖醇将重组菌包涵体还原变性溶解，使总蛋白浓度25～30mg/ml，盐酸胍浓度6mol/L，二硫苏塘醇0.2mol/L。上样条件先用1ml 8mol/L脲平衡柱头，柱子规格为φ1.6cm×3cm，上变性液1.5ml，而后，又灌注1ml 8mol/L脲。淋洗条件先用去离子水洗脱变性剂和还原剂，再用梯度磷酸钠分别洗脱杂蛋白和目的蛋白。色谱和电泳测试结果详见图3所示，A、B、C为杂蛋白峰，a条带为A峰的组分，b、c为C峰组分，d为B峰组分，g条带为蛋白质分子量标准，D峰为目的蛋白峰，e、f为D峰组分，目的蛋白纯度为90％。将D峰组分脱盐后直接氧化。氧化条件是pH＝8.5，还原型谷胱甘肽2mmol/L，氧化型谷胱甘肽1mmol/L。诱导大鼠胚胎肌母细胞碱性磷酸酶表达实验证实生物活性，目的蛋白活性回收率约30～50％。
2、鸡蛋白溶菌酶用8mol/L脲和0.2mol/L二硫苏糖醇还原变性溶菌酶，溶菌酶浓度约35mg/ml，充分变性4小时后，加磷酸二氢钠至终浓度0.02mol/L，而后上样0.2ml于用0.02mol/L磷酸二氢钠平衡好的羟基磷灰石柱子φ1.6cm×2cm，加样前后加用0.5ml含8mol/L脲和0.02mol/L磷酸二氢钠的溶液。依次用0.02M磷酸二氢钠和0.2M磷酸氢二钠淋洗，得到两个峰。将第一峰脱盐、氧化，氧化条件是0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH＝8.5、2mmol/L还原型谷胱甘肽和0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽氧化；第二峰直接加还原型谷胱甘肽至2mmol/L、氧化型谷胱甘肽至0.2mmol/L氧化。活性回收率大于85％。
3、猪胃蛋白酶变性方法及柱子规格同溶菌酶，蛋白浓度约33.33mg/ml，上样0.3ml，前后用0.5ml8mol/L脲溶液。依次用去离子水、0.15mol/L磷酸氢二钠淋洗，得到两个峰。将第一峰脱盐后，加三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH＝8.5至终浓度0.05mol/L、2mmol/L还原型谷胱甘肽和0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽氧化；第二峰直接加2mmol/L还原型谷胱甘肽、0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽氧化。活性回收率约75％。
权利要求
1.羟基磷灰石复性及同时纯化基因重组蛋白质的方法，其特征在于(1)选用对变性蛋白有强的吸附能力而对变性剂和还原剂的吸附能力较弱的羟基磷灰石作为填料，用高浓度变性剂4～8mol/L脲，防止蛋白在管道和柱头处的沉淀，用洗脱方法将蛋白与变性剂和还原剂分离，实现蛋白的折叠复性；同时将目的蛋白和杂蛋白分离，实现目的蛋白的纯化，(2)洗脱变性剂、还原剂常用变性剂为盐酸胍和脲、还原剂为二硫苏糖醇，与羟基磷灰石结合力较弱，可用去离子水或低浓度盐溶液如0～0.05mol/L的含有Na+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+阳离子的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐溶液将其洗脱，(3)洗脱蛋白质羟基磷灰石对蛋白的吸附作用类似于离子交换剂，可用pH＞5的浓度较高的盐如0.1～3mol/L，含有Na+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+阳离子的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐溶液，线性梯度或阶梯梯度分别洗脱杂蛋白和目的蛋白，(4)柱子再生目的蛋白洗脱后，用上述高浓度盐或0.5～1mol/L的氢氧化钠将所有杂蛋白完全洗脱，然后再用去离子水或低离子浓度盐溶液平衡柱子，至少5个柱床体积。
全文摘要
一种羟基磷灰石复性及同时纯化基因重组蛋白质的方法。其特点是选用对变性蛋白有强的吸附能力而对变性剂和还原剂的吸附能力较弱的羟基磷灰石作为填料，用高浓度变性剂防止蛋白在管道和柱头处的沉淀。用适当的洗脱方法将蛋白、变性剂和还原剂分离，实现蛋白的折叠复性，同时将目的蛋白和杂蛋白分离，提高了活性回收率，目的蛋白纯度达到90％。
文档编号C07K1/16GK1569888SQ20041002247
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月10日 优先权日2004年5月10日
发明者姚少华, 张伶俐, 张兴栋, 范红松 申请人:四川大学