专利名称：重组幽门螺杆菌热休克蛋白a基因工程疫苗制备中的纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及幽门螺杆菌热休克蛋白A基因工程疫苗制备中的纯化工艺。
背景技术：
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种定植于胃内的革兰氏染色阴性、螺杆状、微需氧菌，在全世界人群中感染率超过50％，是上消化道疾病如慢性胃炎、消化性溃疡及非溃疡性消化不良的主要致病因素，并且与胃部恶性肿瘤的发生密切相关。
已知的Hp菌株都能产生两种热休克蛋白，即HspA和HspB。HspA由118个氨基酸组成，N端91个氨基酸与大肠杆菌GroES同源性很高，可以作为分子伴侣，在Hp蛋白合成、组装中起重要作用；C端27个氨基酸区域为Hp所特有，富含组氨酸和半胱氨酸，是个镍离子结合区域并与尿素酶活性相关。将hspA与尿素酶基因在大肠杆菌中共表达，尿素酶分解尿素的能力增强4倍以上。总之，HspA参与尿素酶的组装和尿素酶活性的发挥，是Hp重要的致病因子之一。HspA是能够激发机体产生保护性免疫应答最有效的抗原之一，是Hp亚单位疫苗的重要侯选成分。
幽门螺杆菌HspA是HSP家族成员GroES(Hsp 10)的同源蛋白，与其它细菌相比，Hp的HspA具有独特性，在HspA的C末端(即HspA的b区域)包含有一个金属离子结合位点。研究发现HspA与镍离子结合的能力远远大于与钴、铁、锌、铜离子的结合力(Kansau I，Guillain F，et al.Nickel binding andimmunological properties of the c-terminal domain of the Helicobacterpylori GroES homologue(HspA).Mol Microbiol，1996，22(5)1013-1023)。本申请人已构建了高效表达重组幽门螺杆菌热休克蛋白A的大肠杆菌工程菌(冉向阳，邹全明等.重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化.细胞与分子免疫学杂志[J].2002，18(6)539-542)。
申请人在对rHspA的初纯化样品进行进一步纯化的摸索中，发现在非变性条件下，离子交换层析柱、疏水层析柱和凝胶过滤层析柱，均不能将30KD大小的杂蛋白去除，而此蛋白为亲和层析纯化后rHspA样品中主要的杂蛋白。所使用的Superdex 75凝胶过滤层析柱在蛋白分子为3～70KD范围内的分辨率最好(Amersham Pharmacia Biotech AB，Gel Filtration Principles and Methods，code No.18-1022-18)，理论上应能将30KD与16KD的蛋白分离，然而Superdex75凝胶过滤层析中rHspA的亲和样品上样后洗脱只形成了单一峰(见附图1)，SDS-PAGE结果显示峰前、峰尖、峰尾30KD的杂蛋白始终与rHspA相伴随，分析此杂蛋白可能与rHspA形成了聚合体。
打开蛋白聚合体的常用方法是使用变性剂如SDS、尿素、盐酸胍等以及加入还原剂如β-巯基乙醇、DTT(凌明圣，许祥裕，丁树标.以包涵体存在的重组蛋白的纯化和体外折叠.中国生化药物杂志，1995，16(3)135-139)，尝试了将rHspA的初纯化样品浓缩后用盐酸胍裂解，复性，再纯化，观察能否将30KD杂蛋白与rHspA分离。结果表明，仍未将两者分离开。分析可能是变性条件下30KD杂蛋白与rHspA分离开了，但在复性过程中，两者又形成了聚合体。
由此可见采用常规的纯化工艺不能获得高纯度的rHspA。
发明内容
本发明的目的旨在针对现有纯化工艺不能直接适用于本发明人所构建的重组幽门螺杆菌热休克蛋白A基因工程疫苗蛋白，而提供一种工艺简捷、所获得蛋白纯度高回收率较好的重组幽门螺杆菌热休克蛋白A基因工程疫苗制备的纯化工艺。
本发明采用了以下步骤(1)压破菌将高效表达的可溶性表达重组热休克蛋白A(rHspA)的大肠杆菌工程菌菌体200-500g以镍离子亲和层析平衡缓冲液悬浮1∶10(W/V)比例混悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀，用高压均质机破菌4～6次，高速离心，收集上清；(2)过滤将上述上清液通过微孔滤膜过滤直接使用镍离子亲和层析柱进行初级纯化。
(3)镍离子亲和层析柱纯化选择镍离子亲和层析柱进行初步纯化，使用20mmol/L Tris在pH 7.0～9.0条件下对目标蛋白进行纯化，收集目的蛋白峰。
(4)浓缩、裂解将步骤(3)将初纯化样品浓缩后加盐酸胍和DTT变性裂解；(5)Superdex凝胶过滤层析纯化将步骤(4)所获得的变性蛋白样本，用凝胶过滤柱Superdex纯化，用凝胶过滤平衡缓冲液平衡；(6)复性将步骤(5)纯化样品采用稀释等容透析法或层析柱复性法复性，复性后的样品，采用Superdex凝胶过滤层析分离单体和聚体。
步骤(1)所述采用生产或中试纯化中使用的高压破菌技术，破菌至细菌破解率大于98％，差速离心获得包涵体沉淀物。
步骤(2)所述离心上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后直接上层析柱纯化。
步骤(3)所述镍离子纯化填料为Chelating Sepharose HP、ChelatingSepharose FF之一。
步骤(4)的初纯化样品超滤浓缩至蛋白浓度为20～30g/L，变性裂解是加入盐酸胍至6～7mol/L、加入DTT至50mmol/L，4℃，搅拌30分钟以上；步骤(5)使用的凝胶过滤层析柱为Superdex 75、Superdex 200、SuperdexHR 10/30之一。
步骤(6)所用的层析柱复性法，可采用Sephadex G-25脱盐除尿素复性和镍离子亲和层析柱上重折叠复，镍离子亲和层析柱填料为Chelating SepharoseHP、Chelating Sepharose FF之一。
发明效果本发明人所构建的rHspA，在使用镍离子亲和层析后天然条件下直接样品进行纯化效果不理想的情况下，在变性条件下，直接对rHspA的亲和层析纯化样品进行进一步纯化，采用镍离子亲和层析柱，从表达HspA的大肠工程菌破菌液中提取rHspA，获得了理想的纯化效果，对最终纯化获得的变性rHspA，采用稀释复性或层析柱上复性，从而可以获得纯度大于98％的rHspA。(初步纯化得的rHspA纯度＞75％，经鉴定本发明人构建获得的rHspA分子量约为15KD)。
参见图2，通过SDS-PAGE显示，在8mol/L尿素条件下，使用Superdex 75凝胶过滤层析柱发现，与非变性条件相比，层析图谱中在130ml～170ml处出现了双峰，SDS-PAGE表明已经将30KD杂蛋白与目的蛋白rHspA分离，并且纯化后的rHspA纯度＞98％，目的蛋白得率在67％左右，参见图3，图中1为低分子蛋白标准；2为未纯化前的蛋白样品；3为镍离子亲和层析纯化后的样品；4为变性条件下Superdex 75二次纯化时的杂蛋白峰样品，以30KD杂蛋白为主；5~10为变性条件下Superdex 75二次纯化时的收集的目的蛋白峰样品。
通过上述工艺处理不同批次的rHspA作15％SDS-PAGE，呈现单一条带，分子质量约为15KD。HPLC C4柱分析呈现单一的峰，纯度在98％以上。等电点在pH6.2左右。不同rHspA图谱各峰峰数均保持一致，各峰的保留时间均在±10s内波动，肽图谱重视性好。纯化后的rHspA与粘膜免疫佐剂CT(霍乱毒素)或LTB(大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位)共口服免疫BalB/c小鼠，发现rHspA加粘膜免疫佐剂组血清、胃肠液中的IgA和IgG水平显著高于对照组(PBS组)(P＜0.01)，证明HspA可有效刺激机体产生较高的免疫应答；rHspA与粘膜免疫佐剂CT(霍乱毒素)或LTB(大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位)共口服免疫蒙古沙鼠后，采用Hp SS1株(澳大利亚Lee A.教授惠赠)感染，发现rHspA加粘膜佐剂组蒙古沙鼠感染率为21％，对照组(PBS组)感染率为87％，计算得出rHspA抗Hp感染的保护率为70％。
图1是非变性条件下rHspA亲和纯化样品的Superdex 75 26/60凝胶过滤层析图谱；图2是变性条件下rHspA亲和纯化样品Superdex 75 26/60凝胶过滤层析纯化图谱；图3是变性条件下Superdex 75 26/60层析柱纯化rHspA亲和纯化样品结果。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作详细描述实施例一将本申请人构建的重组幽门螺杆菌热休克蛋白A工程菌，通过高密度发酵，目标蛋白表达率为23％，离心收集菌体，按以下步骤进行纯化(1)高压破菌将高效表达的菌体500g以TE镍离子亲和层析缓冲液悬浮1∶10(W/V)比例混悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀。采用高压均质机在压力为75Mpa的条件下进行破菌(共破菌5次，至细菌破解率大于98％)，破菌完毕后，取少量菌液涂片染色，显微镜观察细胞的完整性，确保细胞破碎完全，以15,000g离心40min，收集上清弃沉淀。
(2)过滤将上述上清液通过0.45μm微孔滤膜过滤直接使用镍离子亲和层析柱进行初级纯化。
(3)镍离子亲和层析柱纯化选择镍离子亲和层析柱Chelating SepharoseHP进行初步纯化，使用20mmol/L Tris在pH 8.5条件下对目标蛋白进行纯化，镍离子亲和层析平衡缓冲液10mmol/L咪唑，20mmol/L Tir，0.5mol/L NaCl)，采用咪唑(0.5mol/L咪唑，20mmol/L Tris，0.5mol/L NaCl)梯度洗脱，收集目的蛋白峰。
(4)浓缩、裂解步骤(3)初纯化样品经超滤(膜包孔径小于5KD)浓缩至蛋白浓度为30g/L后，加入盐酸胍至6mol/L、加入DTT至50mmol/L，4℃，搅拌30分钟以上。
(5)Superdex凝胶过滤层析纯化在变性条件下，对步骤(4)所获得的变性蛋白样本，采用凝胶过滤柱Superdex 75纯化(平衡缓冲液8mol/L尿素，0.15mol/L NaCl，20mmol Tris，pH8.5)，收集目标峰，至紫外吸收峰为零时停止。
(6)复性将变性条件下纯化的HspA使用镍离子亲和层析柱ChelatingSepharose FF进行柱上复性法复性，方法为层析柱经平衡液(8mol/L尿素，20mmolTris，pH 8.5)平衡后，上样变性目的蛋白样品，使用复性液(20mmol/L PBS，2mmolGSH，0.2mmol/L GSSG，0.15mol/L NaCl)缓慢梯度洗脱柱至尿素完全去除，使用咪唑缓冲液(20mmol/LPBS，0.5mol/L咪唑，pH8.5)洗脱目的蛋白，收集蛋白峰。
实施实例二样品处理同实例一，使用镍离子亲和纯化柱Chelating Sepharose FF初步纯化，纯化条件同实例一；采用8mol/L尿素和50mmol/L DTT变性裂解蛋白；变性条件下，采用凝胶过滤柱Superdex 75纯化(平衡缓冲液6mol/L盐酸胍，20mmolTris，pH8.5)，收集目标蛋白峰。变性蛋白采用凝胶过滤柱G-25进行柱脱盐除变性剂复性，蛋白上样后使用复性液(20mmol NaHCO3/Na2CO3，20mmol EDTA，pH10)，收集目的蛋白峰。
实施实例三样品处理、纯化条件同实例一；变性裂解蛋白采用8mol/L尿素和50mmol/LDTT；变性条件下，采用凝胶过滤柱Superdex 200纯化(平衡缓冲液6mol/L盐酸胍，20mmol Tris，pH8.5)，收集目标蛋白峰；HspA变性蛋白，使用镍离子亲和层析柱Chelating Sepharose HP进行柱上复性，方法为层析柱经平衡液(8mol/L尿素，20mmol Tris，pH 8.5)平衡后，上样变性目的蛋白样品，使用复性液(20mmol/L PBS，2mmol GSH，0.2mmol/L GSSG，0.15mol/L NaCl)缓慢梯度洗脱柱至尿素完全去除，使用咪唑缓冲液(20mmol/L PBS，0.5mol/L咪唑，pH8.5)洗脱目的蛋白，收集蛋白峰。
实施实例四样品处理同实例一，使用镍离子亲和纯化柱Chelating Sepharose FF初步纯化，纯化条件同实例一；变性裂解蛋白采用6mol/L盐酸胍和50mmol/L DTT；变性条件下，采用凝胶过滤柱Superdex HR 10/30纯化(平衡缓冲液6mol/L盐酸胍，20mmol Tris，pH8.5)，收集目标蛋白峰。变性蛋白采用凝胶过滤柱G-25进行柱脱盐除变性剂复性，蛋白上样后使用复性液(20mmol NaHCO3/Na2CO3，20mmolEDTA，pH10)，收集目的蛋白峰。
结果15％SDS-PAGE，目标蛋白呈现单一条带，分质量约为15KD。HPLC C4柱分析呈现单一的峰，纯度为98.2％。等电点在pH6.2左右。口服免疫BALB/c小鼠，能刺激小鼠产生特异性sIgA分泌，蒙古沙鼠攻毒保护试验证实其能有效诱导沙鼠预防和清除Hp感染，保护率为70％。
权利要求
1.一种重组幽门螺杆菌热休克蛋白A基因工程疫苗制备中的纯化工艺，其特征在于用发酵方式高密度表达rHspA后，采用高压破菌、过滤，镍离子亲和层析、凝胶过滤层析等纯化技术的顺序组合，大量获得高纯度rHspA。
2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于纯化按以下顺序进行(1)高压破菌将高效表达的可溶性重组幽门螺杆菌热休克蛋白A的大肠杆菌工程菌菌体以镍离子亲和层析平衡缓冲液混悬浮，预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀，用高压均质机破菌，高速离心，收集上清(2)过滤将上述上清液通过微孔滤膜过滤待用；(3)镍离子亲和层析柱纯化选择镍离子亲和层析柱进行初步纯化，使用Tris在pH7.0～9.0条件下对目标蛋白进行纯化，采用咪唑梯度洗脱；(4)浓缩、裂解将步骤(3)初纯化样品浓缩后加盐酸胍和DTT变性裂解；(5)Superdex凝胶过滤层析纯化将步骤(4)所获得的变性蛋白样本，用凝胶过滤柱Superdex纯化，用凝胶过滤平衡缓冲液平衡；(6)复性将步骤(5)纯化样品采用稀释等容透析法或层析柱复性法复性，复性后的样品，采用Superdex凝胶过滤层析分离单体和聚体。
3.如权利要求2中所述制备方法，其特征在于步骤(1)所述采用生产或中试纯化中使用的60～80Mpa高压破菌技术，破菌至细菌破解率大于98％，差速离心获得包涵体沉淀物。
4.如权利要求2中所述的纯化工艺，其特征在于步骤(2)所述离心上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后直接上层析柱纯化。
5.如权利要求2中所述制备方法，其特征在于步骤(3)所述镍离子纯化填料为Chelating Sepharose HP、Chelating Sepharose FF之一。
6.如权利要求2中所述制备方法，其特征在于步骤(4)的初纯化样品超滤浓缩至蛋白浓度为20～30g/L，变性裂解是加入盐酸胍至6～7mol/L(或尿素6～8mol/L)、加入DTT(或β-巯基乙醇)至10～50mmol/L，4℃，搅拌30分钟以上。
7.如权利要求2中所述制备方法，其特征在于步骤(5)使用的凝胶过滤层析柱为Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR 10/30之一。
8.如权利要求2中所述制备方法，其特征在于步骤(6)所用的层析柱复性法，可采用Sephadex G-25脱盐除尿素复性和镍离子亲和层析柱上重折叠复，镍离子亲和层析柱填料为Chelating Sepharose HP、Chelating Sepharose FF之一。
全文摘要
本发明公开了重组幽门螺杆菌热休克蛋白A基因工程菌疫苗制备中的纯化工艺。采用对基因工程菌进行高压破菌、过滤，镍离子亲和层析纯化、浓缩裂解、凝胶过滤层析及复性等技术，获得高纯度的重组幽门螺杆菌热休克蛋白A。该发明纯化工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明本发明纯化获得的重组幽门螺杆菌热休克蛋白A具有较好的免疫活性和免疫保护性。
文档编号C07K14/195GK1563406SQ200410022360
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月20日 优先权日2004年4月20日
发明者邹全明, 郭鹰, 冉向阳, 朱永红, 吴超, 张卫军, 童文德 申请人:中国人民解放军第三军医大学