专利名称：一种鼠抗黄曲霉毒素b的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种采用小鼠骨髓瘤细胞直接接种已免疫产生了抗体的小鼠制备鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的方法。
背景技术：
真菌毒素是产毒真菌分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。在已经发现的真菌毒素中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，简称AFB1)是毒性最强的真菌毒素，其毒性、致癌性和污染频率均居生物毒素的首位。它污染食品及饲料后，直接或间接进入人类食品链，威胁人类的健康和生命安全，危害程度与黄曲霉毒素的摄入量成正比。黄曲霉毒素广泛存在与大米、玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等农产品和鱼肉等食品中，其污染食品及饲料的环节多，为此世界各国都规定了黄曲霉毒素B1食品及饲料中的最大允许含量并作为强制性标准，因此加强对食品及饲料中黄曲霉毒素B1的检测、特别是速测，以便即使了解和掌握食品及饲料的卫生信息，是增强食品安全性的一个重要环节。
现有技术中常用的黄曲霉毒素B1检测技术主要有薄层层析法、精密仪器分析法、免疫学分析法。其中免疫学分析法克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。其中，放射免疫测定法和酶联免疫测定法曾被喻为二十世纪九十年代分析技术的一次变革；近年免疫分析技术研究进展迅速，免疫亲和微球纯化及检测技术又以更短的检测时间和更准确的检测结果显示出更大的应用价值和应用前景。但要研究建立黄曲霉毒素B1的任何一种免疫学检测技术，都必须先制备足够的抗黄曲霉毒素B1抗体作为试验材料。
国内外现有制备抗黄曲霉毒素B1抗体技术主要有以下两种(1)利用大白兔、鸡等成功制备抗AFB1血清多克隆抗体技术。大白兔、鸡血量较充足，可收获较多的多抗血清，但需要消耗较多昂贵的抗黄曲霉毒素B1的合成抗原，一般每次免疫抗原用量在500-2500μg，需要免疫4-7次；(2)采用B-淋巴细胞杂交瘤技术制备小鼠抗AFB1的腹水单克隆抗体技术。这种采用小鼠制备抗AFB1单克隆抗体的方法消耗黄曲霉毒素B1的人工免疫抗原也较少，但由于B-淋巴细胞杂交瘤技术中的细胞融合及筛选等环节技术难度高、要求严格，一般实验室的普通研究人员难以掌握和制备成功。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种免疫抗原用量少，成功率高、制备方法简单，抗体收获量较大的鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备方法。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为(1)取纯种小鼠，按常规方法预养和筛选，筛选方法预养期间，用间接酶联免疫固相吸附试验(间接ELISA)或双向免疫琼脂扩散试验检测小鼠血清与人工免疫抗原的交叉反应情况，将存在交叉反应的小鼠淘汰，所述的人工免疫抗原为黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白的连接物(简写为AFB1-BSA)；(2)取筛选合格的小鼠进行免疫注射，每次免疫注射间隔周期为15-30天，在每次或第二次以后的每次免疫注射后第8-14天，取小鼠血清检测抗黄曲霉毒素B1血清多克隆抗体的效价，直至检测到抗体的间接ELISA效价达到1∶4000以上或抗体的双向免疫琼脂扩散效价达到1∶8以上，在此以后的一次免疫注射即为最后一次免疫注射，免疫注射方法第一次免疫注射，用无菌生理盐水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配制成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA为0.8-2毫克，向人工免疫抗原溶液加入等体积弗氏完全佐剂进行乳化，制备成人工免疫抗原乳化液A，用人工免疫抗原乳化液A进行皮下免疫注射，每只小鼠注射量为0.1-0.3ml；第二次及以后免疫注射时，用无菌生理盐水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配制成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA为0.8-2毫克，向人工免疫抗原溶液加入等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，制备成人工免疫抗原乳化液B，用人工免疫抗原乳化液B进行腹腔免疫注射，每只小鼠注射量为0.1-0.3ml，最后一次腹腔免疫注射(已检测到抗体的间接ELISA效价达到1∶4000以上或抗体的双向免疫琼脂扩散效价达到1∶8以上之后的一次)量为以前注射量(0.1-0.3ml)的1.2-2倍；(3)鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备，在进行最后一次腹腔免疫注射之前的第3-15天内给小鼠腹腔注射液体石蜡0.4-0.6ml，在进行最后一次腹腔免疫注射之前第8天到之后第4天内(注射液体石蜡后)再给小鼠腹腔直接注射(1-10)×106个活的鼠骨髓瘤细胞，5-10天后每天观察小鼠腹水产生情况，及时采集小鼠产生的腹水，可反复采集腹水，腹水中含抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体；
(4)将所采集的小鼠腹水离心分离，取上清分装，上清液中含有抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体，冷冻干燥后或直接低温保存，即完成抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体的制备。
按上述方案，所述免疫注射的次数为3-7次；所述的皮下免疫注射为颈背部皮下免疫注射；所述的活的鼠骨髓瘤细胞为处于对数生长期的鼠骨髓瘤细胞；所述的反复采集腹水的间隔时间为1-4天，反复采集的次数为3-7次；所述的离心分离转速为5000r/min以上，离心后取上清分装，分别标记抗体效价和采集日期，冷冻干燥后或直接保存于低温冰箱。
按上述方案，所述的弗氏完全佐剂由弗氏不完全佐剂加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌混合而成，最终浓度为2-20mg/ml；121℃灭菌15min后低温保存备用。
所述的弗氏不完全佐剂由油剂石蜡油与乳化剂污水羊毛脂混合而成，混合比例最常用的是2∶1；121℃灭菌15min后低温保存备用。
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂也可从市场上直接购得。
本发明采用人工免疫抗原黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白的连接物免疫小鼠产生了抗黄曲霉毒素B1血清抗体，给小鼠腹腔接种鼠骨髓瘤细胞，使小鼠产生腹水。小鼠抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体随腹水的分泌进入腹腔中，通过采集腹水制备出抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体。
本发明的有益效果在于(1)节约免疫抗原。对难以获得的、昂贵的黄曲霉毒素B1人工免疫抗原尤其合适。每只小鼠每次人工免疫抗原的用量不超过250μg，而免疫其它动物(如兔、鸡等)制备多克隆抗体每次需500-2500μg。
(2)成功率高。用于1只兔免疫3次以内的黄曲霉毒素B1人工免疫抗原极难使1只兔产生质量合格的抗体，但同样量的黄曲霉毒素B1免疫抗原足够10只以上BALB/C小鼠免疫5次，按80％免疫成功率计算，获得质量合格抗体的成功几率大大提高。
(3)制备方法简单，抗体收获量较大。经过3-7次免疫注射，当检测到小鼠抗黄曲霉毒素B1血清抗体达到较高效价时，通过直接给小鼠腹腔注射液体石蜡和接种小鼠骨髓瘤细胞以及最后一次加大剂量的免疫注射，制备小鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体，使得每只小鼠总计可采到效价与血清多克隆抗体效价相当的腹水多克隆抗体2ml-8ml；而按常规制备血清多克隆抗体的方法，实际每只小鼠只能获得0.4-1.2ml的血清抗体。本方法与采用B-淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体相比，省去了复杂繁琐的细胞融合及筛选的过程，制备过程和方法相对简单，更易实现。
(4)抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体经过纯化后，通过化学方法与氨基修饰的硅胶微球共价偶联制备出黄曲霉毒素B1免疫亲和微球；将黄曲霉毒素B1免疫亲和微球作为填料制备成黄曲霉毒素B1免疫亲和微柱，用于粮油及饲料中黄曲霉毒素B1的快速检测方法中。
具体实施例方式
下面结合附图
进一步说明本发明的一个实施例。
实施例1(1)取6-7周龄雌性Balb/c纯种小白鼠12只，预养7-8天，负压采小白鼠尾血，以6000r/min离心30min分离血清，分装，低温保存备用。取少量血清采用间接酶联免疫固相吸附试验检测血清与人工免疫抗原的交叉反应，将存在交叉反应的1只小鼠淘汰。人工免疫抗原为黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白的连接物(简写为AFB1-BSA)。
(2)取通过筛选的Balb/c纯种小白鼠，进行免疫注射，每次免疫间隔周期为26-30天。
第一次免疫注射时，用无菌生理盐水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA，配制成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA为1.0-1.2毫克，将等体积弗氏完全佐剂加入人工免疫抗原溶液中进行乳化，制备成人工免疫抗原乳化液A。给每只小白鼠颈背部皮下免疫注射0.1-0.2毫升人工免疫抗原乳化液A。
第二次及以后免疫注射，用无菌生理盐水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA，配制人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA为1.0-1.3毫克；向人工免疫抗原溶液中加入等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，制备成人工免疫抗原乳化液B。给每只小白鼠腹腔免疫注射0.1-0.2毫升人工免疫抗原乳化液B。自第二次免疫后，每次免疫注射后第9-12天采血，分离血清，采用间接酶联免疫固相吸附试验检测抗黄曲霉毒素B1抗体，全体试验小鼠抗体呈阳性。
(3)第四次免疫注射后第8天采小白鼠尾血，分离血清，采用间接酶联免疫固相吸附试验检测抗黄曲霉毒素B1抗体，抗体效价达到了1∶4200，在第四次免疫注射之后第26-28天，进行最后一次免疫注射，给每只小白鼠腹腔免疫注射0.2-0.3毫升人工免疫抗原乳化溶液B。在进行最后一次免疫注射之前第13-15天内，给小鼠腹腔注射液体石蜡0.5-0.6毫升；在进行最后一次免疫注射之前第5-8天内再给小鼠腹腔注射约(1-3)×106个处于对数生长期的P3-X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞。从给小鼠腹腔注射小鼠骨髓瘤细胞当天起的第9-10天，观察到小鼠腹部膨大，产生了腹水。及时采集腹水，每2-4天采集一次，反复采腹水3-6次。
(4)每次采集的腹水在4℃下以8000r/min转速离心分离10min，取腹水上清分装，留少量腹水采用间接ELISA检测腹水中抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体效价，其余置-70℃低温冰箱保存备用。计算出从每只小鼠采集分离到间接ELISA效价达到了1∶4200的腹水多克隆抗体的总体积从3.5-7.5毫升不等，分别标记抗体效价和采集日期。
实施例2(1)取5-6周龄Balb/c-nude裸小鼠15只，预养9-10天，负压采小鼠尾血，以6000r/min离心30min分离血清，分装，低温保存备用。取少量血清采用双向免疫琼脂扩散法检测血清与人工免疫抗原的交叉反应，结果是15只小鼠与人工免疫抗原都不存在交叉反应。
(2)取通过筛选的Balb/c-nude裸小鼠，进行免疫注射，每次免疫注射间隔周期为20-24天。
第一次免疫注射时，用无菌生理盐水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配制成人工免疫抗原溶液，使每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA1.6-1.9毫克，将等体积弗氏完全佐剂加入人工免疫抗原溶液进行乳化，制备成人工免疫抗原乳化液A。然后，以每只小鼠0.10-0.12ml人工免疫抗原乳化液A的剂量，给Balb/c-nude裸小鼠进行颈背部皮下免疫注射。
第二次及以后免疫注射时，用无菌生理盐水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配制成人工免疫抗原溶液，使每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA1.6-1.9毫克；向人工免疫抗原溶液中加入等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，制备成人工免疫抗原乳化液B。以每只0.10-0.12毫升人工免疫抗原乳化液B的剂量，对Balb/c-nude裸小鼠进行腹腔免疫注射。自第二次免疫注射后，每次免疫注射后第8-10天采血，分离血清后，采用双向免疫琼脂扩散法检测抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体，淘汰1只抗体呈阴性的小鼠。
(3)第五次免疫注射后第10天负压采尾血，6000r/min转速离心30min分离血清，采用双向免疫琼脂扩散试验检测小鼠抗黄曲霉毒素B1血清抗体的效价达到1∶16；在第五次免疫注射时间之后第20-24天，进行最后一次腹腔免疫注射，人工免疫抗原乳化液B用量增加到0.20-0.24毫升。在进行最后一次免疫注射之前4-7天，给小鼠腹腔注射液体石蜡0.4-0.5毫升；在进行最后一次免疫注射之后2-4天再给小鼠腹腔注射(5-7)×106个活的SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞。6-8天后每天观察小鼠产生了腹水，及时采集腹水。每1-3天采集一次，重复采集腹水3-5次。
(4)每次采的腹水在4℃下，以7000r/min转速离心分离20min，取腹水上清，分装，取少量检测腹水中抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体双向免疫琼脂扩散试验的效价，其余冷冻干燥后置-40℃低温冰箱保存。计算出从每只小鼠采集分离到双向免疫琼脂扩散效价达到1∶16的腹水多克隆抗体的体积从2.5-6.5毫升不等，分别记录和标记抗体效价和采集日期。
权利要求
1.一种鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备方法，其特征在于(1)取纯种小鼠，按常规方法预养和筛选，筛选方法预养期间，用间接酶联免疫固相吸附试验或双向免疫琼脂扩散试验检测小鼠血清与人工免疫抗原的交叉反应情况，将存在交叉反应的小鼠淘汰，所述的人工免疫抗原为黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白的连接物；(2)取筛选合格的小鼠进行免疫注射，每次免疫注射间隔周期为15-30天，在每次或第二次以后的每次免疫注射后第8-14天，取小鼠血清检测抗黄曲霉毒素B1血清多克隆抗体的效价，直至检测到抗体的间接ELISA效价达到1∶4000以上或抗体的双向免疫琼脂扩散效价达到1∶8以上，在此以后的一次免疫注射即为最后一次免疫注射，免疫注射方法第一次免疫注射，用无菌生理盐水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配制成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA为0.8-2毫克，向人工免疫抗原溶液加入等体积弗氏完全佐剂进行乳化，制备成人工免疫抗原乳化液A，用人工免疫抗原乳化液A进行皮下免疫注射，每只小鼠注射量为0.1-0.3ml；第二次及以后免疫注射时，用无菌生理盐水溶解人工免疫抗原AFB1-BSA配制成人工免疫抗原溶液，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA为0.8-2毫克，向人工免疫抗原溶液加入等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，制备成人工免疫抗原乳化液B，用人工免疫抗原乳化液B进行腹腔免疫注射，每只小鼠注射量为0.1-0.3ml，最后一次腹腔免疫注射量为以前注射量的1.2-2倍；(3)鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备，在进行最后一次腹腔免疫注射之前的第3-1 5天内给小鼠腹腔注射液体石蜡0.4-0.6ml，在进行最后一次腹腔免疫注射之前第8天到之后第4天内(注射液体石蜡后)再给小鼠腹腔直接注射(1-10)×106个活的鼠骨髓瘤细胞，5-10天后每天观察小鼠腹水产生情况，及时采集小鼠产生的腹水，可反复采集腹水，腹水中含抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体；(4)将所采集的小鼠腹水离心分离，取上清分装，上清液中含有抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体，冷冻干燥后或直接低温保存，即完成抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体的制备。
2.按权利要求1所述的鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述免疫注射的次数为3-7次。
3.按权利要求1或2所述的鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的皮下免疫注射为颈背部皮下免疫注射。
4.按权利要求1或2所述的鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的活的鼠骨髓瘤细胞为处于对数生长期的鼠骨髓瘤细胞。
5.按权利要求1或2所述的鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的反复采集腹水的间隔时间为2-4天，反复采集的次数为3-7次。
6.按权利要求1或2所述的鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的离心分离转速为5000r/min以上。
7.按权利要求1或2所述的鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备方法，其特征在于第一次免疫注射时，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA为1.0-1.2毫克，给每只小白鼠颈背部皮下免疫注射0.1-0.2毫升人工免疫抗原乳化液A，第二次及以后免疫注射，每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA为1.0-1.3毫克，给每只小白鼠腹腔免疫注射0.1-0.2毫升人工免疫抗原乳化液B，最后一次免疫注射，给每只小白鼠腹腔免疫注射0.2-0.3毫升人工免疫抗原乳化溶液B，在进行最后一次免疫注射之前第13-15天内，给小鼠腹腔注射液体石蜡0.5-0.6毫升；在进行最后一次免疫注射之前第5-8天内再给小鼠腹腔注射约(1-3)×106个处于对数生长期的P3-X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞。
8.按权利要求1或2所述的鼠抗黄曲霉毒素B1腹水多克隆抗体的制备方法，其特征在于第一次免疫注射时，使每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA 1.6-1.9毫克，以每只小鼠0.10-0.12ml人工免疫抗原乳化液A的剂量，给小鼠进行颈背部皮下免疫注射，第二次及以后免疫注射时，使每毫升人工免疫抗原溶液中按重量计含AFB1-BSA 1.6-1.9毫克，以每只0.10-0.12毫升人工免疫抗原乳化液B的剂量，对小鼠进行腹腔免疫注射，最后一次腹腔免疫注射，人工免疫抗原乳化液B用量增加到0.20-0.24毫升，在进行最后一次免疫注射之前4-7天，给小鼠腹腔注射液体石蜡0.4-0.5毫升；在进行最后一次免疫注射之后2-4天再给小鼠腹腔注射(5-7)×106个活的SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞。
全文摘要
本发明涉及一种制备鼠抗黄曲霉毒素B
文档编号C07K16/14GK1696157SQ20051001861
公开日2005年11月16日 申请日期2005年4月26日 优先权日2005年4月26日
发明者李培武, 杨金娥, 张文, 丁小霞, 谢立华, 杨湄, 李光明 申请人:中国农业科学院油料作物研究所