专利名称：联三唑化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及联三唑化合物及其制备方法和用途，属于有机化学和生物化学领域。
背景技术：
植物病毒病有“植物癌症”之称，在植物病害中所占的比例仅次于真菌病害，给农业生产造成严重威胁，有关的研究方兴未艾(Whitham，2004)。据估计全世界每年仅由烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)造成的损失就达一亿美元以上。由于病毒在植物细胞中专性寄生，其复制所需的物质、能量和场所完全依赖寄主，且植物没有完整的免疫代谢系统，使得植物病毒病的防治尤为困难。为了有效地防治植物病毒病，人们对许多方案进行了有益的尝试，如利用农业措施(轮作、倒茬、选用抗性品种及种子脱毒处理等)预防病毒病害的发生；利用病毒间的交叉保护选用弱毒株系和卫星RNA等生物制剂来干扰病毒的浸染和增殖；尤其是抗病毒基因的转基因植物为人类征服病毒病害提供了新的途径(李在国等，1999)；另外，通过杀虫剂控制病毒的传播媒介也用于防治病毒病的流行。然而，这些措施无论是单独应用还是综合应用都不能有效地克服病毒病造成的危害。
为了开发理想的抗植物病毒药剂，化学科学工作者进行了许多的定向合成和筛选尝试。近几十年来，国内外在对植物病毒的防治研究中，开发出两大类抗病毒剂一是天然物质如微生物、菌类和植物提取物，二是合成的化学物质。前者的代表物有日本首先开发的Lentemin、我国开发的NS83以及宁南霉素和安托芬等(向固西等，1995；胡厚芝等，1998；An等，2001；姚宇澄等2001)。这类药剂主要是保护植物不受病毒侵染，有些也能钝化病毒，它们抗病毒谱较窄。合成药剂的代表有病毒唑(Ribavirin)、氢化均三嗪二酮(DHT)和E30，以及我国开发的菌毒清、盐酸吗啉呱和三十烷醇等。这些药剂对病毒病兼具防治作用。它们能钝化病毒，也能抑制和干扰病毒的增殖，它们的抗病毒谱虽然较宽但毕竟有限，而且它们包括天然物在内的大田防效一般在30％～60％之间，显然这是不够的。至今为止，我们还没有开发出像杀虫剂和除草剂以及杀菌剂等类似的高效或超高效而环境友好的药剂。
近年来在农药先导物的发现和优化的过程中，组合化学起到了很大的作用。组合化学的优势在于能快速高效地合成大量可用于测试或筛选的化合物。然而，因为大量化合物的投入，组合化学也比传统的合成化学更依赖于每个独立的反应，并由这些反应来构建新的化学键网络。而点击化学(Click Chemistry)是一种更能推动这种合成进程的方法，这种方法应用了一些近乎完美的化学反应来合成和组装新的结构单元。通过使用这些最方便和最有选择性的化学转化过程，点击化学简化了化合物的合成，提供了快速找到药物先导及其优化产物的方法。点击化学的出现并不是要取代药物发现中已存在的经典方法，而是要对这些方法进行补充和延伸。同时，“点击化学”概念的出现对使用很少的反应就可以实现化合物的多样性是有指导意义的。一个点击化学反应必须遵循的原则是反应容易进行，对氧气和水不敏感，反应原料易得，反应的处理和产物分离必须简单易行。由叠氮与炔烃生成1，2，3-三唑的Huisgen 1，3-偶极环加成反应正是一个最典型的点击化学反应。这个反应的特点在于其高度的可靠性，完全的特异性和反应物的生物相容性。而所得的三唑化合物常常可以通过偶极相互作用或氢键而与很多生物靶标相作用，因而成为一个有潜力的活性结构单元。
目前，人们对三唑衍生物作为抗病毒、抗肿瘤、抗真菌试剂的研究比较多。三唑化合物作为抗病毒药剂最典型的代表就是病毒唑(Ribavirin)，它也是目前公认的较好的抗植物病毒(包括动物)的药剂之一。人们通过对病毒唑进行修饰，得到了一系列的衍生物。CN1420723，CN85108679和CN1063183报道的三唑衍生物就是病毒唑的类似物，这类化合物通常具有较好的抗病毒和抗肿瘤效果。国外最近的一些专利中也有相关报道，如WO 2004037809、WO02088108、AU 2003256003就报道了一些用于治疗细胞疾病和具有抗癌效果的三唑化合物。
以上报道的化合物通常只含有一个三唑单元。而在化合物中引入两个三唑单元的报道则相对较少。CN1259867报道了一种能抑制哺乳动物中肿瘤和癌症的生长的药物组合物，它包括杀真菌剂。所用的具体的杀真菌剂是1，3-双-三唑基-2-丙醇衍生物。这些组合物对动物病毒感染也有效。国外的专利中FI 893051也报道了类似结构的化合物，其具体结构如下 其中R1是任意取代的烷基、环烷基(如，环戊基或环己基)、芳基或卤代芳基(如苯基或2，4-二氯苯基)或芳烷基(如苄基)。
CN1195288报道了一种治疗哺乳动物癌症或肿瘤的药物组合物，其中包含2-(2，4-二氟苯基)-1，3-双(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-2-醇及其衍生物。可以将某种化疗剂和增效剂一样与2-(2，4-二氟苯基)-1，3-双(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-2-醇及其衍生物合用。2-(2，4-二氟苯基)-1，3-双(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙-2-醇及其衍生物还可以用于治疗动物病毒感染，或者单独使用，或者与其它抗病毒药物和增效剂合用。其具体结构如下 EP 113509-A，US 4466974报道的双三唑化合物则是用于治疗由真菌引起的局部或系统感染，是一类很有效的抗真菌化合物。其具体结构式如下 R1可以是单取代、双取代或多取代的苯基，取代基团包括F，Cl，Br，I，CF3，1-4C烷基，1-4C烷氧基或5-氯-2-吡啶基等；X为NH2，单或双取代的(1-4C烷基)氨基，或NHCOOR’；R’为1-4C烷基。
另外，结构如下的唑类化合物也是一种引入了双三唑结构单元的化合物，SU 1643538-A1，SU 1622368-A和SU 1622368中曾有报道。但这类化合物通常用于在分光光度法中测定某些元素或用作选择性增亮剂，还未见报道作为抗病毒或抗真菌药物。其结构式如下 R为NO2或NH2。
以上专利报道的三唑化合物均未涉及由两个三唑环直接相连的结构单元，也没有将其应用于抗植物病毒的研究。因此，我们利用点击化学中应用最广泛的Huisgen环加成反应来合成的一系列联三唑化合物是一类新型的结构单元。由于烟草花叶病毒是农业植物病毒研究的一种重要模式，所以本专利利用烟草花叶病毒对合成的化合物进行了初步的筛选，试验结果表明该类化合物对烟草花叶病毒有较好的防治作用。而且我们合成的联三唑化合物在同样条件下抑制烟草花叶病毒的活性要优于商品化的抗植物病毒试剂-病毒唑。同时，除了已商品化的抗病毒试剂外，文献报道的抗烟草花叶病毒的抑制剂大多是对已知的具有抗植物病毒活性的结构单元进行衍生化的产物，如苯并噻唑类，苯并咪唑类，DHT类，哒嗪酮类，吡喃酮类，喹唑啉类化合物等。而本专利合成的联三唑化合物还未见报道。其中，化合物1d在初步筛选中表现出优秀的对烟草花叶病毒的防治作用，为我们开发新一类的抗植物病毒药剂提供了先导。而且与上述多类化合物繁琐的合成路线相比，本专利提供的合成方法简单、价廉、环境友好，具有广阔的应用前景发明内容本发明所要解决的问题是提供一类联三唑化合物及其制备方法和用途，所得联三唑化合物不仅制备较简单、价廉，而且可抑制植物花叶病毒的活性，可用于受花叶病毒侵袭植物的治疗剂。
本发明提供的技术方案是联三唑化合物，其通式为
其中R为乙酯甲基(1a)、对戊基苯基(1b)、环己醇基(1c)，环己烯基(1d)和对甲氧基苯基(1e)。
上述化合物的制备方法，通过Huisgen反应，用5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯的与乙酸丙炔醇酯、对戊基苯乙炔、环己醇炔、环己烯炔或甲氧基苯乙炔在四氢呋喃或四氢呋喃和水的混合溶剂中，在Cu(I)催化下40-100℃反应得到所需的联三唑化合物。
上述5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯与炔的用量摩尔比为1∶1-1.5。
上述5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯以四氢呋喃或四氢呋喃和水为溶剂的浓度为0.01-1摩尔/升。
上述四氢呋喃和水的混合溶剂的用量体积比为1∶1-4。
上述联三唑化合物作为植物病毒病抑制剂的应用。
上述联三唑化合物作为烟草花叶病毒抑制剂的应用。
本发明制得的联三唑化合物不仅制备简单、价廉，而且可直接抑制植物病毒尤其是烟草花叶病毒的活性，从而可以作为植物病毒尤其是烟草花叶病毒的抑制剂，作为抗病毒药物的先导物。
附图为本发明化合物1d抗烟草花叶病毒的效果图。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步描述。
实施例一将5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯(50mg，0.297mmol)置于两口瓶中，在油泵上抽真空处理20分钟后加入10mL混合溶剂(THF/H2O＝1/4)，得到无色透明的溶液。再在Ar气保护下加入乙酸丙炔醇酯(35mg，0.36mmol)。另将五水硫酸铜(11.8mg，0.047mmol)和抗坏血酸钠盐(29.5mg，0.148mmol)分别溶于200μL水中后，再注入上述反应体系。反应在80℃反应1小时后，停止反应，此时反应体系是黄色浑浊液，减压蒸除溶剂后，得到黄色固体。通过柱色谱层析分离产品(CH2Cl2/MeOH＝30/1)，得到的产物(1a)经真空干燥后为白色固体73.1mg，产率92.4％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.79(s，1H)，5.22(s，2H)，3.96(s，3H)，2.07(s，3H)；13CNMR(150MHz，DMSO-d6)δ171.2，158.1，144.0，125.1，57.7，54.1，21.5；ESI-MSm/z 264.9[M-H]-。
实施例二将5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯(50mg，0.297mmol)置于两口瓶中，在油泵上抽真空处理20分钟后加入混合溶剂5mL(THF/H2O＝1/2)，原料溶解得到无色透明的溶液。再在Ar气保护下加入对戊烷苯乙炔(50mg，0.297mmol)。另将五水硫酸铜(11.8mg，0.047mmol)和抗坏血酸钠盐(29.5mg，0.148mmol)分别溶于200μL水中后，再注入上述反应体系。反应在60℃反应2小时后，停止反应，此时反应体系是棕黄色浑浊液，直接减压蒸除溶剂后，得到棕黄色固体。通过柱色谱层析分离产品(CH2Cl2/MeOH＝30/1)，得到的产物(1b)经真空干燥后为白色固体82.2mg，产率81.2％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.24(s，1H)，7.88(d，2H，J＝7.8Hz)，7.27(d，2H，J＝7.8Hz)，3.93(s，3H)，2.57(t，2H，J＝7.8Hz)，1.56(m，2H)，1.25(m，4H)，0.83(t，3H，J＝6.4Hz)；13CNMR(150MHz，DMSO-d6)δ159.3，155.4，150.2，147.5，143.3，129.5，128.0，126.2，120.6，53.0，35.6，31.5，31.2，22.6，14.6；ESI-MSm/z 339.0[M-H]-。
实施例三将5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯(50mg，0.297mmol)置于两口瓶中，在油泵上抽真空处理20分钟后加入四氢呋喃12mL，原料溶解得到无色透明的溶液。再在Ar气保护下加入环己醇炔(54.7mg，0.44mmol)。另将五水硫酸铜(11.8mg，0.047mmol)和抗坏血酸钠盐(29.5mg，0.148mmol)分别溶于200μL水中后，再注入上述反应体系。反应在90℃反应2小时后，停止反应，此时反应体系是淡黄色浑浊液，直接减压蒸除溶剂后，得到黄色固体。通过柱色谱层析分离产品(CH2Cl2/MeOH＝30/1)，得到的产物(1c)经真空干燥后为白色固体67.5mg，产率77.7％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.41(s，1H)，5.07(br s，1H)，3.93(s，3H)，1.89-1.96(m，2H)，1.66-1.77(m，3H)，1.42-1.50(m，3H)，1.21-1.30(m，2H)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ157.9，157.2，121.0，68.6，53.7，38.2，25.8，22.3；ESI-MSm/z 291.1[M-H]-。
实施例四将5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯(50mg，0.297mmol)置于两口瓶中，在油泵上抽真空处理20分钟后加入混合溶剂9mL(THF/H2O＝1/2)，原料溶解得到无色透明的溶液。再在Ar气保护下加入环己烯炔(38.6mg，0.36mmol)。另将五水硫酸铜(11.8mg，0.047mmol)和抗坏血酸钠盐(29.5mg，0.148mmol)分别溶于200μL水中后，再注入上述反应体系。反应在80℃反应4小时后，停止反应，此时反应体系是黄色浑浊液，直接减压蒸除溶剂后，得到黄色固体。通过柱色谱层析分离产品(CH2Cl2/MeOH＝30/1)，得到的产物(1d)经真空干燥后为白色固体72.3mg，产率88.7％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.69(s，1H)，6.58(s，1H)，3.91(s，3H)，2.35(m，2H)，2.14(m，2H)，1.67(m，2H)，1.59(m，2H)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ160.1，155.7，151.2，148.8，127.6，125.3，119.3，52.6，26.4，25.4，22.7，22.5；ESI-MSm/z 273.1[M-H]-。
实施例五将5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯(50mg，0.297mmol)置于两口瓶中，在油泵上抽真空处理20分钟后加入混合溶剂9mL(THF/H2O＝1/2)，原料溶解得到无色透明的溶液。再在Ar气保护下加入对甲氧基苯乙炔(47.2mg，0.36mmol)。另将五水硫酸铜(11.8mg，0.047mmol)和抗坏血酸钠盐(29.5mg，0.148mmol)分别溶于200μL水中后，再注入上述反应体系。反应在80℃反应2.5小时后，停止反应，此时反应体系是淡黄色浑浊液，直接减压蒸除溶剂后，得到黄色固体。通过柱色谱层析分离产品(CH2Cl2/MeOH＝30/1)，得到的产物(1e)经真空干燥后为白色固体73.6mg，产率82.5％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.22(s，1H)，7.93(d，2H，J＝8.7Hz)，7.03(d，2H，J＝8.7Hz)，3.95(s，3H)，3.79(s，3H)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ160.2，157.8，147.7，127.8，122.8，120.1，115.1，55.9，53.7；FAB-MSm/z 301.0[M+H]+。
实施例六化合物抗TMV活性的测定(半叶枯斑法)在5～6叶龄的珊西烟草植株上，选取适用于测试的叶片(叶形正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金钢砂，用毛笔将备用的毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金钢砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即用盛有带有本发明化合物的药液的培养皿中处理20分钟，取出，沥去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保温的搪瓷盘内加盖玻璃，控制温度23±2℃，放在温室自然光照即可，2～3天即可显现枯斑。每个处理都有其相应的半叶作为对照，另外还设置一组商品病毒A的处理作为对比。
x%=CK-TCK×100]]>X相对效果(％)；CK浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)；T浸于药液中半片叶的枯斑数(个)实施例七化合物抗TMV活性的测定(活体诱导法)新化合物诱导烟草活体抗烟草花叶病毒活性的筛选方法参照范志金等(2005)的方法进行，将苗龄一致的普通烟苗，3盆为一组，药剂处理方式包括喷施本发明化合物的溶液2到3次，每次10mL，或灌根处理烟苗2到3次，每次20mL，一定时间后在烟叶上摩擦接种TMV，培养3d后，检查发病情况，综合病斑数目按下式计算出本发明化合物对TMV的诱导抗病毒效果，每一处理设3次重复，对照分空白对照和标准药剂处理对照2种；测试化合物的诱导效果分为5级A、B、C、D和E，具体数据为A级诱导效果＞90％，为优；B级诱导效果90～70％，为良；C级诱导效果70～50％，为较好；D级诱导效果50～30％，为差；E级诱导效果＜30％视为无诱导效果。
R=CK-ICK×100]]>其中，R为药剂或本发明化合物对烟草抗TMV的诱导(或活体)效果，单位％CK为清水对照叶片的平均枯斑数，单位个I为经药剂或本发明化合物处理(或诱导处理)后叶片的平均枯斑数，单位个将上述本发明所得的联三唑化合物根据筛选的常规实验进行了500μg/mL的筛选，实验结果(见下表)表明，本发明所得的联三唑化合物对烟草花叶病毒有一定的抑制效果，特别是化合物1d，其抑制率在70％以上(见附图)，是一个很有潜力的烟草花叶病毒抑制剂。标准的植物诱导抗病激活剂苯并噻二唑本身不具有抗TMV的活性，但它能够诱导烟草产生对TMV持久而滞后的抗性，与之相比，化合物1d却不具有诱导的活性。
权利要求
1.联三唑化合物，其通式为 其中R为乙酯甲基、对戊基苯基、环己醇基、环己烯基或对甲氧基苯基。
2.权利要求1所述联三唑化合物的制备方法，通过Huisgen反应，用5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯的与乙酸丙炔醇酯、对戊基苯乙炔、环己醇炔、环己烯炔或甲氧基苯乙炔在四氢呋喃或四氢呋喃和水的混合溶剂中，在Cu(I)催化下40-100℃反应得到所需的联三唑化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯与炔的用量摩尔比为1∶1-1.5。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是5-叠氮基-1，2，4三唑-3-酰甲酯以四氢呋喃或四氢呋喃和水为溶剂的浓度为0.01-1摩尔/升。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是四氢呋喃和水的混合溶剂的用量体积比为1∶1-4。
6.权利要求1所述的联三唑化合物作为植物病毒病抑制剂的应用。
7.权利要求1所述的联三唑化合物作为烟草花叶病毒抑制剂的应用。
全文摘要
本发明涉及联三唑化合物，其通式如图。其中R为乙酯甲基、对戊基苯基、环己醇基、环己烯基或对甲氧基苯基。上述化合物的制备方法用5－叠氮基－1，2，4三唑－3－酰甲酯的与乙酸丙炔醇酯、对戊基苯乙炔、环己醇炔、环己烯炔或甲氧基苯乙炔在四氢呋喃或四氢呋喃和水的混合溶剂中，在Cu(I)催化下40－100℃反应得到所需的联三唑化合物。本发明制得的联三唑化合物不仅制备简单、价廉，而且可直接抑制植物病毒尤其是烟草花叶病毒的活性，从而可以作为植物病毒尤其是烟草花叶病毒的抑制剂，作为抗病毒药物的先导物。
文档编号C07D403/00GK1687059SQ200510018608
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月26日 优先权日2005年4月26日
发明者曲凡歧, 夏熠, 范志金, 李蔚, 彭玲 申请人:武汉大学