无细胞蛋白质合成方法

专利名称：无细胞蛋白质合成方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的合成方法，该方法利用了无细胞系统。
背景技术：
基因组计划即将结束，其课题的中心迅速从遗传基因结构分析扩展到遗传基因功能分析。一般认为，细胞内的蛋白质本身不能单独发挥功能，其功能是通过多种多样的蛋白质基因、核酸、低分子种以及细胞膜成分等互相协调、相互作用发现的。另一方面，以其相互作用的总和在生物学领域发挥着功能。
作为后基因组计划的一个中心课题是分析多种多样蛋白质基因的聚合体结构与功能的关系。研究中所获得的成果，可以预见的在包括结构生物学和生物化学等基础生物学等的研究，及作为其应用的医学领域的遗传基因翻译产物同病因的关系的阐明，以至在医药研制的广阔领域中提供一种极其重要的理论。
作为在生物体外高效率地在细胞内进行蛋白质合成反应的方法，迄今为止，正在积极地研究，例如从生物体中提取细胞内含有的作为蛋白质翻译装置的核糖体等的成分；并在该提取液中加入翻译模板、作为基质的氨基酸、能量源、各种离子、缓冲液，而且通过再加入其它有效因子，在试管内合成蛋白质的所谓无细胞蛋白质合成法等。(特开平6-98790，特开平6-225783，特开平7-194，特开平9-291，特开平7-147992)。
在供无细胞蛋白质合成用的反应系，即无细胞蛋白质合成系中使用的蛋白质合成用的细胞提取液或生物体组织提取液的配制中，正在使用大肠杆菌、小麦胚芽或家兔网状红血球等。由于无细胞蛋白质合成系在肽合成速度和翻译反应的准确性两个方面保持了与细胞相媲美的性能，且具有不需要复杂的化学反应工序和繁杂的细胞培养工序的优点，迄今为止研制了实用性的系统。然而，一般从生物体细胞提取的细胞提取液，其蛋白质的合成性极其不稳定，因此蛋白质合成效率低，另外还因为保存中的细胞提取液的质量也显著下降，因此由无细胞蛋白质合成系获得的合成量只有放射性同位素标识可检测出的程度的很少的量，而不能用作实际生产蛋白质的手段。
作为解决现有无细胞蛋白质合成系缺点的方法，本发明人等此前提供了如下的无细胞蛋白质合成的方法(WO00/68412号公报)(WO01/27260号公报)(1)无细胞蛋白质合成用细胞提取物制剂以及无细胞蛋白质合成法；以及(2)具有通用性及高效率功能的模板分子以及利用其的无细胞蛋白质合成方法。
而且还报告了为提高蛋白质的合成效率、连续合成无细胞蛋白质的合成装置。作为现有的连续式无细胞蛋白质合成装置，可以举出如使用超滤膜法、透析膜法以及将翻译模板固定在树脂上的柱色谱法等[Spirin，A.，et al.，(1993)Methods in Enzymology，217，123～142]。其中，由于超滤膜法和透析膜法操作简便，因此被广泛使用。然而，在采用这些膜的连续法中也存在着尚待解决的难题①所使用的膜材料强度低；②由于网眼阻塞而导致膜功能下降；③由于操作繁杂，因而需要熟练的技术等。
而且，通过利用超滤膜法和透析膜法等，手动进行的连续式无细胞蛋白质合成方法虽在由少数遗传基因合成蛋白质中可利用，但高效率地从多数遗传基因生产蛋白质是很困难的。因此面对研制可高效率地从多数遗传基因生产蛋白质的高效率全自动多检测体蛋白质合成系统，解决现有连续式无细胞蛋白质合成方法缺点的新技术的开发乃是当务之急。

发明内容
本发明提供一种无细胞蛋白质的合成方法，该方法采用分批式连续扩散，其特点在于使含有生物体提取物的合成反应溶液(反应相)与基质以及能量源供给溶液(供给相)直接接触，通过两相的直接接触界面自由扩散，连续向反应相的翻译反应系提供供给相的基质以及能量源分子，同时排出在反应相生成的副产物，进而延长合成反应的延续时间，提高合成反应效率；而且本发明可获得一种无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于在上述无细胞蛋白质的合成方法中，使用小麦胚芽提取液作为生物体提取物；另外本发明可获得一种无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于在上述无细胞蛋白质的合成方法中，使用大肠杆菌提取液作为生物体提取物；而且本发明的范围也包括无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于在上述无细胞蛋白质的合成方法中，将反应相生成的副产物稀释、排出到供给相中；另外本发明的范围还包括无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于在上述无细胞蛋白质的合成方法中，在反应相和供给相间形成的直接接触界面为垂直面形状；而且本发明的一方面涉及一种无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于在将含有小麦胚芽提取液的无细胞蛋白质合成反应溶液预培养(预保温)后，加入基质和能量源供给溶液，稀释含有小麦胚芽提取液的无细胞蛋白质合成反应溶液；另外本发明的一方面涉及一种无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于在分批式无细胞蛋白质合成方法中，在合成反应停止后的反应溶液中使用凝胶过滤柱或半透膜，再次供给蛋白质合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP和磷酸肌酸等原料和能量源，同时通过从反应溶液排出反应中生成的副产物，以提高合成反应效率。


图1以层叠方式为例说明连续扩散分批式无细胞蛋白质的合成方法，引出线所包围的部分是滴定盘的孔的横断面。
图2表示使用小麦胚芽提取液的连续扩散分批式无细胞蛋白质合成方法的绿色荧光蛋白质(GFP)合成。
图2A是通过14C-亮氨酸摄入量测量合成蛋白质的结果；纵轴蛋白质合成量；横轴培养时间；表示采用现有分批式(○-○)以及口径为7mm(□-□的大)、5mm(□-□ 的中)、及3mm(□-□的小)反应容器的连续扩散分批式(层叠方式)的蛋白质合成。■-■表示的是采用稀释分批式的蛋白质合成。表示纵轴蛋白质合成量的放射能读数是基于单位等量的胚芽提取液量来表示。图2(B)是合成生成物放射自显影谱。
图3表示通过使用小麦胚芽提取液的连续扩散分批式无细胞蛋白质合成方法的二氢叶酸还原酶(DHFR)合成。
图3A表示通过14C-亮氨酸吸入量测量合成蛋白质的结果。表示使用现有分批式(○-○)与使用口径为7mm反应容器的连续扩散分批式(层叠方式)合成蛋白质(■-■)。表示纵轴蛋白质合成量的放射能读数是基于单位等量的胚芽提取液量来表示。图3B是考马氏亮蓝着色的合成物的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳图。
图4表示通过采用大肠杆菌提取液的连续扩散分批式无细胞蛋白质合成方法的GFP合成。
图4A是表示通过14C-亮氨酸吸入量测量合成蛋白质的结果。表示使用现有分批式(○-○)和口径为7mm反应容器连续扩散分批式(层叠方式)合成蛋白质(■-■)。(□-□)表示通过稀释分批式无细胞蛋白质合成方法合成蛋白质，表示纵轴蛋白质合成量的放射能读数基于单位等量大肠杆菌提取液。图4B是合成生成物放射自显影谱。
图5表示通过使用小麦胚芽提取液的不连续凝胶过滤分批式无细胞蛋白质合成方法的GFP合成(□-□)。箭头表示进行反应液凝胶过滤处理的时刻；(■-■)表示未进行凝胶过滤处理时的结果。
图6表示具有通用性的质粒pEU1的结构。
具体实施例方式
本发明一方面涉及一种连续扩散分批式无细胞蛋白质合成方法，其是无细胞蛋白质合成方法，其特征在于使含有生物提取物的合成反应溶液(反应相)与基质以及能量源供给溶液(供给相)，不经半透膜或超滤膜等隔离，而直接接触，通过两相的接触界面的自由扩散，将供给相的基质和能量源分子连续供给反应相，同时通过使反应相中生成的副产物向供给相排出来延长反应的延续时间，以此来提高合成效率。
在上述连续扩散分批式无细胞蛋白质合成方法中，两相的界面可作为水平面形成，也可作为垂直面形成。要将该界面形成水平面，例如在反应容器首先加反应相形成下层，然后为不使两相界面发生紊乱，在该反应相上轻轻地层叠供给相(参照图1)。反应容器在其形态及尺寸上只要能赋予两相间的溶质的充分的扩散速度即可，例如可使用试管和多孔穴微型浓度滴定盘等，但不仅限于这些用具。另外在将合成反应溶液(反应相)与供给溶液(供给相)叠层后，通过对含有这些溶液的反应容器施加离心操作也可使两相界面形成垂直面状。
两相的接触界面面积大的时候通过扩散进行的物质交换率高，蛋白质的合成率高。因此，供给相对于反应相的最佳的容量比因两相界面面积而改变。供给相对反应相的容量比虽没有特别限制，例如界面为圆形，其直径为7mm时，则1∶4至1∶8时较理想，1∶5则更理想。
形成上述反应相的合成反应液含有形成无细胞蛋白质合成反应所需要的生物体提取物以及蛋白质合成的模板所需要的mRNA，以及含有现在已经使用的分批式无细胞蛋白质合成系中使用的组分构成。生物体提取物可使用在现有无细胞蛋白质合成法中使用的众所周知的生物体提取物，例如小麦胚芽提取物、大肠杆菌提取物或家兔网状红血球提取物等。这些提取物的配制可按照众所周知的方法进行。小麦胚芽提取物使用现刊[Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]、(WO00/68412号公报)中记载的方法配制是理想的。合成反应溶液具体说来，例如使用小麦胚芽提取物作为生物体提取物时，将该提取物含量占48％总容量(浓度200A260nmunits/ml)，并含有下述最终浓度组分[1,000units/ml核糖核酸酶抑制剂(RNAsiin)、30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、1.2mM腺苷三磷酸(ATP)、0.25mM鸟苷三磷酸(GTP)、16mM磷酸肌酸、0.380mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40、600μg/ml mRNA]。合成反应溶液的组分不限于上述组分，只要能高效率地进行无细胞蛋白质合成反应的组分也可采用。例如代替上述mRNA，在含有质粒(对目的遗传基因进行编码)、RNA聚合酶、以及核苷酸类等的转录反应溶液中合成mRNA后，继续通过凝胶过滤法和透析膜法等使该转录反应溶液的组分转变成适于翻译反应的组分构成的溶液，所得到的溶液也可作为合成反应溶液(参照下述参考例1)。
而且，上述合成反应溶液的组分可根据所用生物体提取物的种类适当地加以改变。使用大肠杆菌作为生物体提取物时，可使用根据现刊[Pratt，J.M.，Transcription and Translation(1984)，179-209，Hames，B.D.&Higgins，S.J.，eds，IRLPress，Oxford]配制的大肠杆菌提取物，并可按照该方法组分配制蛋白质合成反应溶液。例如使大肠杆菌提取物含量占50％总容量，然后配制由下述最终浓度的组分[57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸钾、36mM醋酸铵、16mM醋酸镁、1.7mM二硫苏糖醇、0.3U/ml丙酮酸激酶、0.17mg/ml大肠杆菌tRNA混合液、34mg/ml L-5-甲酰基-5，6，7，8-四氢叶酸、6.7μg/ml质粒(对目的遗传基因编码)；33μg/ml T7 RNA聚合酶、1.2mMATP、各0.85mM的GTP、UTP和CTP、56mM磷酸烯醇丙酮酸、20种L型氨基酸(各0.2mM)]构成的转录反应溶液，首先在合成mRNA后，继续通过凝胶过滤法和透析法等将该转录反应溶液的组分转换成由适用于翻译反应组分构成的溶液，所得到的溶液也可用作合成反应溶液(参照下述参考例1)。而且在使用大肠杆菌提取液的合成无细胞蛋白质系时，如上所述，在转录反应液中首先合成mRNA后，通过在该转录反应溶液上将供给溶液层叠，在静置条件下以适于翻译反应的温度进行蛋白质合成反应也可以。合成反应溶液的组分并不仅限定于上述组分，如果是能高效率进行无细胞蛋白质合成反应的组分也可以使用。例如，也可以代替上述转录反应溶液中的质粒(对目的遗传基因进行编码)、T7 RNA聚合酶、UTP以及CTP，而适当添加用众所周知的方法(Gurevich，V.V.，(1996)Methods in Enzymology，275，383-397)配制的对目的遗传基因进行编码的mRNA，来配制出适于翻译反应的组分的合成反应溶液。
另一方面，也可在上述合成反应溶液中通过添加肌醇、木糖醇以及/或血糖醇(Ficoll)等糖醇，提高该合成反应液的粘度和密度，进而控制反应相与供给相的两相间的混合速度，以促进蛋白质合成反应更加稳定。
而且形成上述供给相的供给溶液含有基质和能量源，例如氨基酸、ATP、GTP、磷酸肌酸以及合成蛋白质反应所需要的其它离子以及缓冲液等。具体来说，例如在反应相中使用含有小麦胚芽提取液的上述蛋白质合成反应液时，可以使用由30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、1.2mMATP、0.25mM GTP、16mM磷酸肌酸、0.380mM精脒以及20种L型氨基酸(各0.3mM)的组分构成的供给溶液。此外，在反应相中使用含有大肠杆菌提取液的上述蛋白质合成反应溶液时，可以使用由组分例如57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸钾、36mM醋酸铵、16mM醋酸镁、1.7mM二硫苏糖醇、34mg/ml L-5甲酰基-5，6，7，8四氢叶酸、1.2mMATP、0.85mMGTP以及UTP和CTP、56mM磷酸烯醇丙酮酸、20种L型氨基酸(各0.2mM)构成的供给溶液。
在静置条件下进行蛋白质合成反应，反应温度是在各种无细胞蛋白质合成方法中通常使用的最佳温度。作为生物体提取物，在使用小麦胚芽提取物时，温度是20℃到30℃，理想的温度是26℃；使用大肠杆菌提取物时，温度为30℃到37℃，理想的温度是30℃。
而且本发明一方面涉及稀释分批式无细胞蛋白质的合成方法，该方法在利用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质合成方法中，将反应溶液预培养(预保温)后，通过添加稀释溶液稀释合成反应溶液，进而延长合成反应的延续时间，由此提高蛋白质合成效率。
在稀释分批式无细胞蛋白质合成方法中，使用现有的分批式无细胞蛋白质合成反应液，例如使用由上述组分构成的合成反应溶液，首先经15分钟至30分钟预培养，进行蛋白质合成。然后添加含有基质和能量源、如氨基酸、ATP、GTP、磷酸肌酸以及蛋白质合成反应中需要的其它离子类和缓冲液等的与上述连续扩散分批式蛋白质合成方法中的供给溶液相同组成的溶液，在反应液中含有的小麦胚芽提取液稀释到7％-12％程度的状态下进行合成反应。蛋白质合成反应的最佳温度，在使用小麦胚芽提取物时为20℃到30℃，最理想的温度是26℃。由于众所周知酶和翻译蛋白质因子一般在低浓度下稳定性降低，因此可以通过预先在合成反应液中添加众所周知的稳定剂，例如肌醇、木糖醇和血糖醇等，以图获得更高效率的合成反应。
上述稀释分批式蛋白质合成方法在使用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质的合成系中是非常有效的，但是在采用大肠杆菌提取物的系中却未发现这种效果。据认为其起因在于小麦胚芽提取液的特性。
而且一般认为，在该方法中，预培养是极其重要的工序，如果将该项操作省略，则会降低蛋白质合成反应效率，由此可认为在这种预培养时形成了稳定的翻译起始复合体。然而有关这种特异现象的分子结构的实体仍然是今后的课题。
另外，本发明一方面涉及无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于在分批式无细胞蛋白质合成方法中，对合成反应停止后的反应液使用凝胶过滤柱或半透膜，重新供给蛋白质合成所需要的基质和能量源，例如氨基酸、ATP、GTP以及磷酸肌酸等原料，同时从反应溶液中将反应生成的副产物排出，来提高合成反应的效率。该方式是蛋白质合成反应与向反应液中提供基质和能量源以及排除副产物的操作是由不连续的工序构成的分批方法，因此在基本上与Spirin等人的连续式无细胞蛋白质合成方法不同。
在该不连续分批式无细胞蛋白质合成方法中，使用反应容器，例如试管等，按照现有的方法开始分批式无细胞蛋白质合成反应。在合成反应停止后，通过将反应液的温度降低到0～4℃，使蛋白质合成反应完全停止。将反应停止后的反应液，加到使用预先由含有基质以及能量源例如氨基酸、ATP、GTP以及磷酸肌酸等溶液，进行平衡化的低分子化合物分离用的凝胶过滤粒子，例如交联葡聚糖G-25等的层析柱上。平衡化所使用的溶液可使用与上述连续扩散分批式蛋白质合成方法中的供给液组分相同的溶液。
由上述凝胶过滤操作，可使副产物排出到交联葡聚糖粒子中，而且可将通过新的氨基酸、ATP、GTP以及纤维酸磷酸等交换的无细胞蛋白质合成溶液回收成空隙级分。如果将所回收的溶液重新保温，则开始翻译反应，蛋白质合成反应将进行数小时。合成反应再次停止时，再反复上述凝胶过滤操作。通过循环采用这种方法可使在通常的分批式方法中在短时间内停止的合成反应延续很长时间，其结果可使蛋白质合成收量上升。
而且在上述不连续的分批式无细胞蛋白质合成方法中，以再供给基质以及能量源等以及排出副产物为目的，即使使用透析法代替上述凝胶过滤法，也可获得与其相同或超过以上结果的效果。
如上所述，涉及本发明的①使含有细胞提取液的合成反应溶液构成的反应相与含有氨基酸、ATP、GTP以及磷酸肌酸等的基质以及能量源供给液构成的供给相直接接触，通过两相接触界面由自由扩散，将供给相的基质以及能量源连续供给到反应相中，同时将反应相中产生的副产物排出到供给相中的扩散连续分批法；②在使用小麦胚芽的无细胞蛋白质合成系中，通过降低合成反应溶液中含有的细胞提取物浓度的稀释分批法；以及③蛋白质合成反应停止后，利用凝胶过滤法或透析法，重新将蛋白质合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP以及磷酸肌酸等基质以及能量源提供给合成反应溶液，同时将反应中生成的副产物不连续排出的不连续分批法，与现有的连续式无细胞蛋白质合成方法不同，作为无细胞蛋白质的合成方法是极其有效的。这些方法也可以分别单独加以实施，也可以进行组合利用。例如以提高蛋白质合成效率为目的，可组合实施扩散连续分批法和不连续分批法，也可以将稀释分批法与不连续分批法组合加以实施。另外，也可提高最初添加的细胞提取物或组织提取物的浓度，将上述三种方法配套加以实施。
另外，通过本发明，可延长无细胞蛋白质合成反应的延续时间，因此与现有的分批法相比，则可进一步提高蛋白质的合成效率；并建立了具有与利用Spirin等人建立的半透膜的连续式无细胞蛋白质合成方法[Spirin，A.，et al.，(1993)Methods in Enzymology，217，123-142]同等以上性能的无细胞蛋白质合成方法。
实施例现举出以下实施例，更详细地说明本发明。本发明不限于下述的实施例所限定的范围。
实施例1作为扩散连续分批式无细胞蛋白质合成方法的一个实施例，实施了由图1所示出的层叠式扩散连续分批式方法，使用小麦胚芽提取物实施了蛋白质合成。
小麦胚芽提取物是根据现刊[Madin K.et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]、(WO00/68412号公报)中记载的方法所获得的。
而且为了合成构成小麦胚芽无细胞蛋白质合成反应中的翻译模板的mRNA，利用了远藤建立的、具有通用性的质粒pEU1(图6)(WO01/27260号公报)。作为编码的目的蛋白质的遗传基因，使用水母的绿色荧光蛋白质(GFP)的遗传基因(gfp遗传基因)，按照通常方法插入到上述的质粒中。将所得到的质粒经HindIII切断，加工成直链型；并将其制成转录模板，采用通常方法合成mRNA。所合成的mRNA在5′终端不具有CAP，作为非翻译序列，在5′终端上具有AMV-Ω序列、在3′终端上具有质粒来源的500碱基。所谓上述 AMV-Ω序列，是指将苜蓿花叶病毒(AMV-mRNA)的5′终端引导结构与烟草花叶病毒mRNA(TMV-mRNA)的5′终端Ω序列直接结合所得的碱基序列(WO01/27260号公报)。由于添加这些非翻译序列，因而增强了RNA的稳定性。其结果若使用该mRNA，则提高无细胞蛋白质的合成效率。而且即使使用5′终端上具有CAP的mRNA，也可获得以下相同的结果。
然后，配制了小麦胚芽提取物含量占48％全容量(浓度为200A260nmunits/ml)，最终浓度如下的下述组分[1,000units/ml核糖核酸抑制剂(RNAsin)(宝公司制造)、30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、1.2mM腺苷三磷酸(ATP)、0.25mM鸟苷三磷酸(GTP)、16mM磷酸肌酸、0.380mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40、600μg/ml mRNA]构成的蛋白质合成反应液。为了测量蛋白质的合成量，对上述1ml的蛋白质合成反应液，添加4μCi的14C亮氨酸(300mCi/mmol)[Proc，Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]。
这种蛋白质合成反应液放入口径7mm、5mm以及3mm的反应容器(分别为微型浓度滴定盘、1.5ml容量的试管以及0.2ml容量的试管)中，为了不使界面出现紊乱，在其上部静静地将5倍容量的供给液[30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、1.2mM ATP、0.25mM的GTP、16mM的磷酸肌酸、0.380mM的精脒、以及20种L型氨基酸(各0.3mM)]层叠。在静止条件下，在26℃下经过3、6、9以及17个小时的培养，进行合成蛋白质的反应。所合成的蛋白质的量根据普通方法，以在放射性同位素的三氯醋酸难溶部分中的摄入量为指标进行测量。所合成的蛋白质的确认经x线放射自显影照片采用普通方法[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]进行。其结果表示在图2(A)以及图2(B)中。
为了对照，实施了现有的分批式无细胞蛋白质合成方法。在该方法中，mRNA、小麦胚芽提取物、以及含有这些物质的蛋白质合成反应液，虽与上述扩散连续分批式无细胞蛋白质合成方法中所使用的液体相同，但其不同点在于不添加供给溶液。
如图2(A)所示，在现有的分批式(○-○)方法中，在反应开始后的1小时，蛋白质的合成反应停止了。其结果与现刊[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，22 1-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]所记载的结果完全一致。
一方面，在采用口径为7mm的反应容器(界面的面积为0.385cm2)的层叠式(大型□-□)中，即使从反应开始经过了17小时后，合成反应还在继续，其合成量达到现有的分批方法的9倍以上。另一方面使用规格尺寸不同的反应容器，研究了对该合成反应的反应相与供给相间的界面面积的影响，其结果发现反应开始9小时后的合成效率，与使用口径7mm的反应容器时相比较，5mm口径的反应容器(界面的面积为0.196cm2)(中型□-□)中合成效率为91％；在口径3mm的反应容器(界面的面积为0.071cm2)(小型□-□)中合成效率为75％。
而且如图2(B)所示的放射自显影照片，关于由现有的分批法以及扩散连续分批式的两种方式合成的蛋白质合成反应时间经过与合成物分子量以及合成量，其结果均完全支持如图2(A)所示的采用14C-亮氨酸摄入量的测定研究蛋白质合成量所获得的实验结果。在图2(B)中，扩散连续分批式以层叠式表示。而且采用连续扩散分批式进行蛋白质合成的结果，仅表示出在口径为7mm反应容器所得到的结果。
而且在该方法中，使用下述参考例1中所示出的转录、翻译一体型蛋白质合成法在转录反应液中合成mRNA后，继续通过凝胶过滤法或透析法等将该转录反应溶液的组分变换成适于翻译反应的组分构成的溶液，通过将所得到的溶液用作合成反应溶液，进而即使在上述相同地进行蛋白质合成反应时也获得了相同的结果。
从以上的结果可以看出①使用小麦胚芽提取液的扩散连续分批式蛋白质合成方法，比现有的分批法明显提高合成效率；②反应相与供给相间的界面面积越大其合成效率越优异。而且也判明了采用该方法导致的合成量上升是由于延续了合成反应的时间所造成的缘故。
实施例2作为稀释分批式无细胞蛋白质合成方法的一个实施例，进行了通过使用含有在实施例1中配制的小麦胚芽提取物以及对GFP进行编码的mRNA的蛋白质合成溶液，按现有的分批式在26℃进行15分钟的预培养，然后添加5倍容量的稀释溶液后，在静置条件下，进一步在26℃进行3、6、9小时培养，进行了蛋白质合成反应。稀释溶液使用了与在实施例1中配制的供给溶液相同组分的溶液。所合成蛋白质的量的测定进行了与实施例1相同的测定，其结果示于图2(A)(■-■)及图2(B)。
如图2(A)所表明的那样，与在1小时内合成反应停止的现有的分批式(○-○)比较，如果用稀释分批式进行无细胞蛋白质合成，则直到反应开始6小时止，呈线性延续了合成反应(■-■)。
而且图2(B)所示的放射自显影照片完全支持图2(A)示出的14C-亮氨酸摄取量研究蛋白质合成量所获得的实验结果。
该稀释分批式无细胞蛋白质合成方法的合成效率虽不如实施例1表示的扩散连续分批式，但蛋白质的合成量与现有的分批法相比，则约是它的3倍，而表现出相当高的合成效率。
而且在该方法中，下述参考例1示出的转录、翻译一体型蛋白质合成方法，在转录反应液中合成mRNA后，继续使用凝胶过滤法或透析法等将该转录反应溶液组分转换成适于翻译反应的组分构成的溶液，在将所得到的溶液用作合成反应溶液，进而进行了与上述相同的蛋白质合成反应，也获得了同样的结果。
而且在上述稀释分批式无细胞蛋白质合成方法中，在省略预培养反应操作时，未发现上述的那种合成反应显著延续现象。另外，在使用大肠杆菌提取液的无细胞蛋白质的合成系中也未发现稀释分批式的效果。
如上所述，在使用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质合成系中，证实了稀释分批式无细胞蛋白质的合成方法也是蛋白质合成的有效手段。
实施例3在扩散连续分批式无细胞蛋白质的合成方法中，证实了除实施例1中进行的GTP合成以外，也可合成大肠杆菌来源的二氢叶酸还原酶(DHFR)，从而确认了这种方法在合成一般蛋白质的分子种也是有效的。
除了mRNA是编码DHFR的mRNA以外，还使用与实施例1相同组分的蛋白质合成反应液进行与实施例1相同的蛋白质合成，其结果示于图3。测量所合成蛋白质的量是以按照常规方法将放射性同位素向三氯醋酸不溶级分的吸入量作为指标来进行，所合成蛋白质的确认使用由SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法进行的分离和考马氏亮蓝(CBB)染色法[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]进行的着色。
如图3(A)所示，在DHFR合成中，扩散连续分批式无细胞蛋白质合成方法(■-■)的合成反应时间也比现有的分批法(○-○)有明显地延续。采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法分析合成反应的时间经过与合成物量的结果[图3(B)，箭头表示DHFR的考马氏亮蓝着色带]完全支持图3(A)示出的结果。从测定合成DHFR的带着色强度可以判明采用扩散连续分批式无细胞蛋白质合成方法进行8小时反应，每1ml的反应容量可合成0.9mg的DHFR。
实施例4通过使用大肠杆菌提取液证实了扩散连续分批式无细胞蛋白质合成方法即使是使用从任何生物种配制细胞提取液的无细胞蛋白质合成系也是普遍有效的。
根据现刊[Pratt，J.M.，Transcription and Translation(1984)，179-209，Hames，B.D.&Higgins，S.J.，eds，IRL Press，Oxford]配制了大肠杆菌提取液。而且在本实施例中，首先用转录、翻译一体型无细胞蛋白质合成系(参照参考例1)合成mRNA，在通过凝胶过滤法将含有该mRNA的转录反应溶液转变成适于翻译反应的反应溶液组分后，加在反应容器中，通过与实施例1相同的方法将溶液层叠，在静置条件下在30℃进行了蛋白质合成反应。
首先配制含总容量的50％容量的大肠杆菌提取液、且含有下述的最终浓度组分，即57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸钾、36mM醋酸铵、16mM醋酸镁、1.7mM二硫苏糖醇、0.3U/ml丙酮酸酶、0.17mg/ml大肠杆菌tRNA混合液、34mg/ml的L-5甲酰基-5，6，7，8-四氢叶酸、6.7μg/m质粒(将GFP遗传基因编码)、33μg/mlT7RNA聚合酶、1.2mM的ATP、0.85mM的GTP以及UTP和CTP、56mM磷酸烯醇丙酮酸、20种L型氨基酸(各0.2mM)]组成的大肠杆菌无细胞蛋白质合成反应液，在30℃进行90分钟的培养，合成了mRNA。然后通过凝胶过滤法将上述溶液的组分转变成适于翻译反应的组分后，将该溶液25μl移送到反应容器(口径7mm微型浓度滴定盘)上，静静地将下述组分的供给溶液层叠，在30℃下合成蛋白质。在以氨基酸摄入作为指标测定蛋白质合成时，将4μCi14C-亮氨酸(300mCi/mmol)添加到1ml上述反应溶液中。
构成mRNA转录模板的质粒，使用以具有木川报告的T7-噬菌体启动子序列的pK7-RAS[Kigawa，T.，et al.，(1995)J.Biomol.NMR，6，129-134]为基础，由RAS遗传基因置换水母GFP遗传基因的序列。
大肠杆菌无细胞蛋白质合成系利用的供给溶液，由最终浓度如下的下述组分57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸钾、36mM醋酸铵、16mM醋酸镁、1.7mM二硫苏糖醇、34mg/ml的L-5甲酰基-5，6，7，8四氢叶酸、1.2mM的ATP、0.85mM的GTP以及UTP和CTP、56mM磷酸烯醇式丙酮酸、20种L型氨基酸(各0.2mM)构成。以摄入氨基酸量为指标对蛋白质合成进行测量时，对于1ml反应溶液，添加4μCi14C-亮氨酸。
图4(A)中示出了由14C-亮氨酸的摄入量来测定的蛋白质的合成结果。GFP的合成反应在现有的分批法(○-○)中，在反应开始后3小时完全停止，但在扩散连续分批式无细胞蛋白质合成方法(■-■)中，延续到直至反应开始17小时后。由氨基酸摄入量计算合成蛋白质量时，采用扩散连续分批式无细胞蛋白质合成方法的合成量达到分批法合成的蛋白质量的4倍以上。图4(B)示出的采用放射自显影谱对合成反应时间经过与合成物的分子量以及合成量的分析结果完全支持图4(A)的结果。另一方面，在上述蛋白质合成反应溶液(反应相)中，将上述供给溶液(供给相)层叠后，立即由涡流搅拌器将两相混合的对照性实验中，蛋白质合成量明显地低于现有的分批法。
这一事实与Kim的报告完全相同[Kin，D.M.，(1996)Eur.J.Biochem.239，881-886]，即在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系中提高制备反应溶液中的细胞提取液的浓度对提高合成效率是十分重要的。这一结果明确地表明，扩散连续分批式所观察到的蛋白质合成反应延续时间的延长现象，并不仅仅是由于反应溶液中蛋白质的合成中所需要的成分，例如不是由于核蛋白体等浓度的下降所引起的反应速度下降，而是扩散连续分批式无细胞蛋白质合成方法所具有的特性。
另一方面，使用大肠杆菌提取液，在转录翻译一体型无细胞蛋白质合成系(参照参考例1)中，首先在合成mRNA后，与实施例1相同，使供给液在反应溶液上层叠，在静置条件下即使在30℃进行蛋白质合成反应也可得到与上述相同的结果。
实施例5下面，说明通过利用凝胶过滤法的不连续分批式使用小麦胚芽的无细胞蛋白质合成方法的例。首先将与实施例1配制的溶液相同的蛋白质的合成溶液填加到普通的小型试管或96穴槽的浓度滴定盘上，在静置条件下按照通常的方法在26℃下进行反应。在该反应条件下，蛋白质合成经过数小时，例如在含有总容量的48％容量的小麦胚芽提取液的反应液时，反应开始1小时后合成反应完全停止。这一现象可从采用在蛋白质中氨基酸的摄入量的测量以及蔗糖密度梯度离心法进行核糖体分析中发现[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]。将上述合成反应停止的反应溶液，使用由预先在含有基质及能量源、例如氨基酸、ATP、GTP、蛋白质合成反应中所需要的其它离子与缓冲液的供给液中进行了平衡化的交联葡聚糖G-25色柱进行凝胶过滤后，另在26℃进行了蛋白质合成。该供给溶液的组分与实施例1中使用的供给溶液相同。
如在图5所示的14C-亮氨酸的摄入结果那样，在现有的分批式中，合成反应在反应开始后1小时完全停止(■-■)。但是，在反应开始3小时后，进行如上所述的凝胶过滤操作(图5中用箭头表示)，而且在培养后，再次开始了蛋白质的合成反应(□-□)。另外，从14C-亮氨酸的摄入速度梯度大致与反应开始初期的速度梯度相同，所以判明了与反应初期的蛋白质合成效率相比凝胶过滤后的蛋白质合成效率没有降低。
而且，在该方法中，使用下述参考例1中示出的转录翻译一体型蛋白质的合成方法在转录反应溶液中合成mRNA后，继续通过凝胶过滤法或透析法等将该转录反应溶液的组分转换为由适于翻译反应的组分构成的溶液，并将所得到的溶液用作合成反应液，在进行与上述同样的蛋白质合成时也获得了相同的结果。
由于使用小麦胚芽的上述无细胞蛋白质合成系是极其稳定的[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]，因此，通过反复进行该凝胶过滤操作，可使反应时间延续很长时间。因此，上述不连续分批式无细胞蛋白质合成方法，例如作为在使用小麦胚芽的无细胞蛋白质的合成系中的高效率蛋白质合成方法是有用的。
参考例1由转录翻译一体型蛋白质合成方法在转录反应溶液中合成mRNA后，继续通过凝胶过滤法或透析法等将该转录反应溶液的组分转换为由适于翻译反应的组分构成的溶液，可将所得到的溶液用作合成反应溶液。
首先，作为反应容器，使用安装了凝胶过滤器的旋转柱，在同一容器内添加由模板DNA、4种基质核糖核苷-5′-3磷酸，以及按照需要添加的CAP分子、RNA聚合酶、精脒、镁离子以及适当的缓冲液等构成的转录反应溶液[80mMHEPES-KOH(pH7.6)、16mM醋酸镁、2mM精脒、10mM二硫苏糖醇、2.5mMATP、2.5Mm GTP、2.5mM CTP、2.5mM的UTP、1U/μL核糖核酸酶抑制剂、3U/μL SP6RNA聚合酶(宝公司制造)]。另外，配制了从上述的转录反应溶液除去模板DNA、RNA聚合酶以及核糖核酸酶抑制剂的溶液并用作透析外液，进行透析式连续合成mRNA。
在mRNA合成后，将旋转柱低速离心旋转，通过使用实施例1中示出的蛋白质合成溶液(不含mRNA)，进行凝胶过滤操作，将上述转录反应溶液转换为适于翻译反应的蛋白质合成溶液。
工业实用性涉及本发明的上述无细胞蛋白质的合成方法不使用利用了半透膜的超滤膜法和透析膜法，以及使用在树脂上将翻译模板固定的柱层析法等[Spirin，A.，et al.，(1993)Methods in Enzymology，217，123-142]的繁杂方法，通过在传统的分批式方法中分别引用3种高效率合成反应技术，或即使通过任意一种手段，都可以高效率地在利用组织、细胞提取物的无细胞系中合成蛋白质。
涉及本发明的蛋白质合成方法，不具有使用现在正在进行的连续式无细胞蛋白质合成方法中所发现的膜材料强度的低下、以及因网眼阻塞而导致膜性能的下降、以及操作的繁杂性等缺点，因此与传统方法比较，可更高效率地进行蛋白质的合成。所以，涉及上述本发明的技术将是对今后基因组项目结束而同时带来的构成数量庞大的遗传基因的功能解析及、结构解析的基础的遗传基因产物(蛋白质)的生产自动化所需要的基础重要技术。可以认为尤其是作为多被测体用全自动无细胞蛋白质合成机械手的研制等无细胞蛋白质合成系统的自动化之重要技术是不可欠缺的。
权利要求
1.一种无细胞蛋白质合成方法，其特征为，包括以下步骤(1)使用分批式无细胞蛋白质合成方法来开始蛋白质合成；(2)将反应溶液提供到凝胶过滤柱或半透膜上；(3)再向反应溶液供给蛋白质合成所需要的基质；(4)在步骤(3)的同时，从反应溶液中排出反应中所生成的副产物；(5)使用分批式无细胞蛋白质合成方法再开始蛋白质合成。
2.权利要求1所述的无细胞蛋白质合成方法，其中从步骤(2)到步骤(5)至少被重复1次。
3.一种无细胞蛋白质合成方法，其特征为，将含有小麦胚芽提取液的无细胞蛋白质合成反应溶液进行预培养，然后添加基质及能量源供给液，从而稀释含有小麦胚芽提取液的无细胞蛋白质合成反应溶液。
全文摘要
本发明的目的是提供一种无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于(1)该方法不用半透膜等将含有生物体提取物的合成反应溶液(反应相)与基质以及能量源供给溶液(供给相)隔开，而使它们直接接触，通过接触界面使供给相的基质及能量源分子自由扩散，连续向反应相供给，同时将反应相生成的副产物排出到供给相，以延长反应的延续时间，提高反应效率；(2)该方法通过在将含有小麦胚芽提取物的反应溶液预培养后，添加稀释溶液加以稀释，以延长合成反应的延续时间，提高反应效率；(3)分批式的该方法在合成反应停止后的反应液中使用凝胶过滤柱和半透膜将蛋白质合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP以及磷酸肌酸等基质以及能量源再供给，同时不连续排出反应中的副产物，进而提高反应效率。
文档编号C07K1/00GK101092446SQ200510090538
公开日2007年12月26日 申请日期2001年8月28日 优先权日2000年8月29日
发明者远藤弥重太, 泽崎达也, 小笠原富夫 申请人:株式会社无细胞科学