专利名称：南瓜蛋白的抗肿瘤活性及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，特别是涉及到生物化学中一种核糖体失活蛋白的抗肿瘤活性及其应用。
背景技术：
在本文中，抗肿瘤蛋白被定义为至少具有下列活性之一的蛋白质抑制人肿瘤细胞株活性，抑制鼠肿瘤细胞株活性。活性包括一定范围的拮抗效果，例如部分抑制或致死。该蛋白是寡聚的或是单肽链的蛋白质。
从高等植物中提取的核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein，简称RIP)，RIP是一类能使真核生物细胞的核糖体失活，从而抑制细胞内蛋白质合成的细胞毒素，其作用机制是具有RNA N-糖苷酶或叫多核苷酸·腺苷糖苷酶[EC3.2.2.22]活性。根据其分子结构，可以分为3类，类型1 RIP是具RNA N-糖苷酶活性的单肽链蛋白，例如，来自葫芦科植物瓜蒌块根的天花粉蛋白(Trichosanthin，简称TCS)，苦瓜种子的α，β-苦瓜子蛋白(α，β-Momorcharin，简称α，β-MOM)和西葫芦瓜瓢的西葫芦蛋白(Pepocin，简称PEP)。类型2 RIP是双肽链蛋白，例如，来自大戟科植物蓖麻毒素(Ricin)和豆科植物相思树种子的相思子毒素(Abrin)，它是由一条具有RNA N-糖苷酶活性的A链和一条具凝集素活性的B链通过二硫键连接而成的。类型3 RIP是一类茉莉酮诱导的蛋白(jasmonate-induced protein)，它是由具有RNA N-糖苷酶功能的N端结构域和一个未知功能的C端结构域组成，例如来自大麦的JIP60。从葫芦科植物中分离出来的类型1 RIP，例如天花粉蛋白、苦瓜子蛋白、丝瓜蛋白、白泻根蛋白等，均具有抗肿瘤抗病毒活性，特别是抗艾滋病毒活性。关于类型1 RIP和类型2 RIP已有很多的专利和文献报道。
中国专利99102290.4提供了从南瓜中分离出的类型1 RIP——南瓜蛋白(Cucurmosin)，并公开了它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为27kDa，等电点pI＞9，具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。南瓜蛋白已长出可供X-射线衍射用的单晶，晶体结构分析结果指出，南瓜蛋白与天花粉蛋白具有结构同源性[Chen et al.Acta Cryst.D56 2000，665-666；Shi etalChinese J.struct.chem.2003，22(2)，165-168]。
本发明是基于上述现有技术基础，证实了南瓜蛋白和天花粉蛋白一样具有RNA N-糖苷酶活性和抗肿瘤活性，提供了其应用的实验基础。
发明内容
本发明的目的是提供南瓜蛋白的抗肿瘤活性及其应用，实现本发明目的的技术方案如下采用温和的分离纯化方法，包括盐溶液抽提、DEAE-纤维素过滤、CM-纤维素或SP-琼脂糖等强或弱的阳离子凝胶介质二次离子交换层析分离，可以从南瓜果肉中分离到南瓜蛋白，SDS-PAGE检测分子量为27kDa，园二色谱检测其二级结构为α-螺旋，β-折叠，无序结构分别为30.8％，41.7％.27.4％，与天花粉蛋白相似。
本发明的核糖体失活蛋白可以用作引产药物原料用于治疗滋养层细胞有关的肿瘤、恶性肿瘤疾病，如绒癌等，也可以作为天花粉蛋白的替代药物原料，用于克服反复使用产生的免疫反应。
本发明的核糖体失活蛋白可以用作抗病毒，特别是抗艾滋病毒的药物原料，也可作为天花粉蛋白治疗艾滋病的替代药物原料，用于克服反复使用产生的免疫反应。
本发明的核糖体失活蛋白可以用作抗肿瘤药物原料，也可以作为天花粉蛋白治疗肿瘤的替代药物原料。
本发明的核糖体失活蛋白可以作为N-糖苷酶用于分子生物学和免疫学研究。
本发明的核糖体失活蛋白可以作为免疫毒素的毒素材料或融合蛋白的毒素材料，用于治疗肿瘤和病毒性疾病，特别是艾滋病。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果(1)南瓜蛋白的二级结构与天花粉蛋白相类似；(2)南瓜蛋白具有RNA N-糖苷酶活性；(3)南瓜蛋白对人白血病细胞株K562有较强的细胞毒作用。半数抑制浓度(IC50)为3.3×10-7mol/L。
现在对附图作图面说明图1.显示南瓜蛋白抗肿瘤活性，1、2为天花粉蛋白，3、4为南瓜蛋白，1、3为样品不经苯胺处理，2、4经苯胺处理后可见450个核苷酸特征片断；图2.显示南瓜蛋白圆二色性图谱；图3.显示南瓜蛋白抗肿瘤活性；▲为南瓜蛋白，●为天花粉蛋白。
具体实施例方式
下面结合附图通过实施例来进一步描述本发明实施例1.本发明的南瓜蛋白，按张祖传等的方法(生物化学与生物物理学报2000，32(5)495-498)测定其对大鼠肝核糖体RNA N-糖苷酶活性，并与天花粉蛋白比较，见图1，表明南瓜蛋白和天花粉蛋白一样具有RNA N-糖苷酶活性。
实施例2.本发明的南瓜蛋白，在日本Jasco-810型圆二色谱仪上测定，见图2，按最小二乘拟合法计算出它的二级结构含量与天花粉蛋白相类似
①见陈世芝等，生物物理学报1989，5(2)188-250实施例3.本发明的南瓜蛋白，按谢捷明等的方法(单克隆抗体通讯1995，11(1)39-42)测定其对人白血病细胞株K562有较强的细胞毒性，半数抑制浓度(IC50)为3.3×10-7mol/L，见图3。人白血病细胞株K562在含有15％灭活小牛血清的RPMI-1640培养液内，37℃，5％CO2条件下培养，用培养液将细胞浓度调整为5×105/ml，分别加入不同浓度的南瓜蛋白和天花粉蛋白，每孔100μl，3个复孔。阴性对照孔加入生理盐水，阳性对照孔加入细胞液，培养72h后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，继续培养3-4h，离心去上清液，每孔加100μl DMSO振荡溶解后，用酶标仪测定各孔A550值。
权利要求
1.一种南瓜蛋白的抗肿瘤活性，其特征在于，该蛋白的二级结构与天花粉蛋白相似；它具有RNA N-糖苷酶的活性；它具有抗肿瘤活性。
2.一种权利要求1的南瓜蛋白的应用，其特征在于，该蛋白作为制备治疗白血病药物的应用。
全文摘要
本发明涉及生物化学领域，特别是涉及到生物化学中一种核糖体失活蛋白的抗肿瘤活性及其应用。从南瓜果肉中分离出一种核糖体失活蛋白——南瓜蛋白，该蛋白显示了RNA N－糖苷酶活性和抗肿瘤活性。该蛋白具有作为制备治疗白血病药物的商业应用前景。
文档编号A61P35/00GK1603340SQ0314338
公开日2005年4月6日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者陈明晃, 谢捷明, 叶晓明, 石小莉 申请人:中国科学院福建物质结构研究所