专利名称：八棱丝瓜蛋白1的快速分离纯化及其晶体生长技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，特别是涉及到生物化学中一种核糖体失活蛋白的八棱丝瓜蛋白1的快速分离纯化及其晶体生长技术。
背景技术：
从高等植物中提取的核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein，简称RIP)，RIP是一类能使真核生物细胞的核糖体失活，从而抑制细胞内蛋白质合成的细胞毒素，其作用机制是具有RNAN-糖苷酶或叫多核苷酸·腺苷糖苷酶[EC3.2.2.22]活性。根据其分子结构，可以分为3类，类型1RIP是具RNA N-糖苷酶活性的单肽链蛋白，例如，来自葫芦科植物瓜蒌块根的天花粉蛋白(Trichosanthin，简称TCS)，苦瓜种子的α，β-苦瓜子蛋白(α，β-Momorcharin，简称α，β-MOM)和南瓜瓜瓢的南瓜蛋白(Cucurmosin，简称CUS)。类型2RIP是双肽链蛋白，例如，来自大戟科植物的蓖麻毒素(Ricin)和豆科植物相思树种子的相思子毒素(Abrin)，它是由一条具有RNA N-糖苷酶活性的A链和一条具凝集素活性的B链通过二硫键连接而成的。类型3RIP是一类茉莉酮诱导的蛋白(jasmonate-induced protein)，它是由具有RNAN-糖苷酶功能的N端结构域和一个未知功能的C端结构域组成，例如来自大麦的JIP60。从葫芦科植物中分离出来的类型1RIP，例如天花粉蛋白、苦瓜子蛋白、丝瓜子蛋白、白泻根蛋白等，均具有抗肿瘤抗病毒活性，特别是抗艾滋病毒活性。关于类型1RIP和类型2RIP已有很多的专利和文献报道。
ZL97112602.X提供了从八棱丝瓜种子中分离出的类型1RIP——八棱丝瓜蛋白1，并公开了它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为28kDa，其N端氨基酸顺序为Asp-Val-Ser-Phe-Ser，具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。CN1473847A提供了八棱丝瓜蛋白1的等电点、二级结构、糖苷酶活性和抗肿瘤活性及其应用。
发明内容
本发明的目的是基于上述现有技术基础，寻找一种八棱丝瓜蛋白1的快速分离纯化技术，以及其晶体生长技术，为八棱丝瓜蛋白1的结构与功能研究及应用提供空间结构数据。
本发明的技术方案是进一步优化八棱丝瓜蛋白1的纯化步骤，不采用繁琐的粉碎、硫酸铵分级沉淀和透析等步骤，通过包括以下四个步骤快速分离纯化得到八棱丝瓜蛋白11.八棱丝瓜种子用pH4.5 10mM醋酸缓冲液浸泡6个小时后，直接进行匀浆。
2.匀浆液用50％的冰醋酸调pH 3.5-4.0，然后在4℃条件下，16000×g离心30’，收集上清液。
3.加样到pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的Sp-Sepharose Fast Flow(购自Pharmacia公司)柱上，280nM实时检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液洗至基线，然后用0-0.6M NaCl(在pH 6.5，20mM磷酸盐缓冲液)进行梯度洗脱，收集第1峰。
4.合并峰1，用50％的冰醋酸调pH4，同时加2倍体积的pH4.5，20mM醋酸缓冲液，再加样到用pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的Sp-Sepharose FastFlow柱上，280nM实时检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH7.5，20mM磷酸盐缓冲液洗至基线，然后用0-1M NaCl在pH7.5，20mM磷酸盐缓冲液中进行梯度洗脱，收集主要的峰，该峰就是高度纯化的八棱丝瓜蛋白1。
本发明所分离纯化的八棱丝瓜蛋白1，在SDS-PAGE上呈现一条带，分子量为28kDa，在强阳离子预装柱Mono-S柱(购自Pharmacia公司)表现为单一峰见图1，在凝胶过滤预装柱Superdex-75(购自Pharmacia公司)上表现为一个峰见图2，说明在离子交换层析上和凝胶过滤层析上均表现为一个峰。高纯度的八棱丝瓜蛋白1已经用汽相扩散技术包括悬滴法和坐滴法，蛋白质母液配成12-20mg/ml，池液为磷酸盐缓冲液(0.05M-0.2M，pH6.0-pH7.8)、柠檬酸缓冲液(0.05M-0.2M，pH4.2-6.0)，或Tris-HCl缓冲液(0.05M-0.2M，pH7.3-pH8.9)，以聚乙二醇为沉淀剂(10％-40％(W/V))长出可供X-射线衍射用的单晶。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果(1)本发明的快速分离纯化技术，不经种子破碎和硫酸铵分级沉淀两个步骤，省却了许多人工繁琐操作。
(2)本发明优选用于分离纯化的缓冲液浓度、pH值，并选用了强阳离子交换剂，省却了透析的繁琐步骤。
(3)本发明所得出的八棱丝瓜蛋白1的纯度高，在离子交换预装柱和凝胶过滤预装柱上均表现为一个单峰，并已在磷酸盐缓冲液(0.05M，0.2M，pH6.0-pH7.8)、柠檬酸缓冲液(0.05M-0.2M，pH4.2-6.0)，或Tris-HCl缓冲液(0.05M-0.2M，pH7.3-pH8.9)条件下，以聚乙二醇为沉淀剂(10％-40％(W/V))长出晶体。
图1是八棱丝瓜蛋白1在Mono-S HR5/5柱上洗脱图，横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为mAU，八棱丝瓜蛋白1在洗脱液达9.18ml处即在0.209MNaCl(pH7.5 10mM磷酸盐缓冲液)时出峰，图中折线满标为1M NaCl。
图2是八棱丝瓜蛋白1在Supedex-75柱上洗脱图，横坐标为洗脱液ml数，纵坐标为mAU，八棱丝瓜蛋白1在洗脱液达12.98ml处出峰。
具体实施例方式
实施例1快速分离纯化八棱丝瓜蛋白1取100g八棱丝瓜种子，加500ml pH4.5，10mM醋酸缓冲液浸泡6h，在匀浆机上匀浆二次，然后用50％的冰醋酸调pH3.8，再在4℃条件下16000×g，离心30’，收集上清液，上清液加样到2.6×13cm的Sp-Sepharose FastFlow柱上(该柱已用pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡)，继续用PH4.5，20mM醋酸缓冲液洗出一个杂峰后，用pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液继续洗柱，又会洗出一个杂峰，然后用0-0.6M NaCl(在pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液中)梯度洗脱，收集第一峰。混合第一峰收集液，用50％冰醋酸调pH4，再加上2倍体积的pH4.5，20mM醋酸缓冲液，混匀后加样到1.6×13cm的Sp-Sepharose Fast Flow柱上(该柱已用pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡)，同样再用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗柱后，用pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液洗柱达到基线后，最后用0-1M NaCl(在pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液中)进行梯度洗脱，收集洗脱尖峰，就是八棱丝瓜蛋白1。
实施例2强阳离子预装柱Mono-S分析本发明分离纯化的八棱丝瓜蛋白1在Mono-S HR5/5柱上洗脱图(见图1)A液为10mM磷酸盐缓冲液pH7.5，B液为A液+1M NaCl，流速1ml/min，Mono-S柱用A液平衡后，加样，A液洗柱5ml，0-50％B液线性梯度洗脱10ml，然后100％B液洗5ml后，再用A液平衡5ml。八棱丝瓜蛋白1在洗脱液达9.18ml即NaCl浓度为0.209M时出峰。
实施例3凝胶过滤预装柱Superdex-75分析图2是本发明分离纯化的八棱丝瓜蛋白1在Superdex-75柱上洗脱图，洗脱缓冲液为0.1M NH4HCO3pH8，流速0.4ml/min，八棱丝瓜蛋白1在洗脱液达12.98ml时出一单峰。
实施例4八棱丝瓜蛋白1的晶体生长将本发明提纯的八棱丝瓜蛋白1制成冻干粉后，用0.02％NaN3的水溶液配成母液浓度为15.78mg/ml，池液用pH5.4，0.1M柠檬酸缓冲液，28％PEG6K为沉淀剂，用悬滴法长出单晶体。该单晶体在室内X-光机上和同步辐射光源上分别收集到一套2.6和一套1.4的衍射数据，该晶体属P1晶型，晶胞参数为a＝39.135，b＝46.813，c＝83.571，α＝89.068°，β＝80.009°，γ＝72.143°。
实施例5对肿瘤细胞生长抑制活性测定人白血病细胞株K562在含有15％灭活小牛血清的RPMI-1640培养液内，37℃，5％CO2条件下培养，用培养液将细胞浓度调整为5×105/ml，分别加入不同浓度的八棱丝瓜蛋白1和天花粉蛋白(作对照)，每孔100μl，3个复孔。阴性对照孔加入生理盐水，阳性对照孔加入细胞液，培养72h后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，继续培养3-4h，离心去上清液，每孔加100μlDMSO振荡溶解后，用酶标仪测定各孔A280。本发明提纯的八棱丝瓜蛋白1，测定其对人白血病细胞株K562有较强的生长抑制活性，半数抑制浓度IC50为0.95×10-6mol/L。与中国专利CN 1473847A报道的用旧法提纯的八棱丝瓜蛋白1对K562生长抑制活性为1.1×10-6基本一致。
权利要求
1.一种八棱丝瓜蛋白1的快速分离纯化技术，包括匀浆、调酸和两次强阳离子柱梯度洗脱，其特征在于，通过包括以下四个步骤快速分离纯化得到八棱丝瓜蛋白1(1)八棱丝瓜种子用pH4.5 10mM醋酸缓冲液浸泡6个小时后，直接进行匀浆；(2)匀浆液用50％的冰醋酸调pH 3.5-4.0，然后在4℃条件下，16000×g离心30’，收集上清液；(3)加样到pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的Sp-Sepharose Fast Flow柱上，280nM实时检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液洗至基线，然后用0-0.6M NaCl在pH 6.5，20mM磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集第1峰；(4)合并峰1，用50％的冰醋酸调pH4.0；同时加2倍体积的pH4.5，20mM醋酸缓冲液，再加样到用pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的Sp-Sepharose Fast Flow柱上，280nM实时检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH7.5，20mM磷酸盐缓冲液洗至基线，然后用0-1M NaCl在pH7.5，20mM磷酸盐缓冲液中进行梯度洗脱，收集主要的峰，该峰就是高度纯化的八棱丝瓜蛋白1。
2.一种八棱丝瓜蛋白1的晶体生长技术，其特征在于，该生长技术是在磷酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液中，用聚乙二醇为沉淀剂进行晶体生长。
全文摘要
本发明涉及生物化学领域，特别是涉及到生物化学中一种核糖体失活蛋白的八棱丝瓜蛋白1的快速分离纯化及其晶体生长技术。八棱丝瓜蛋白1(Luffaculin 1)的快速分离纯化技术是经缓冲液浸泡、匀浆、抽提后，用2次Sp－Sepharose Fast Flow强阳离子柱梯度洗脱，便可获得高纯度的八棱丝瓜蛋白1；八棱丝瓜蛋白1已在磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和Tris－HCl缓冲液中，以聚乙二醇为沉淀剂长出可供X－射线衍射的单晶体。本发明省却了许多人工繁琐操作，省却了透析的繁琐步骤，所得出的八棱丝瓜蛋白1的纯度高。
文档编号A61P35/00GK1958601SQ200510114000
公开日2007年5月9日 申请日期2005年11月1日 优先权日2005年11月1日
发明者陈明晃 申请人:中国科学院福建物质结构研究所