专利名称：细胞色素c氧化酶复合体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种2-酮基-L-古洛糖酸的重组生产及其中有用的生物材料。
背景技术：
细胞色素C氧化酶(细胞色素aa3；EC 1.9.3.1)是在线粒体及许多细菌中的有氧呼吸电子传递系统中一种末端氧化酶。该酶是一种跨细胞质膜复合体，其催化最终的电子传出；周质表面的亚铁细胞色素C(电子供体)的再氧化/细胞质表面的分子氧(电子受体)向水的还原。这些反应与质子跨膜排出偶连，且这种偶连对于由底物氧化的生物能量储存是必不可少的。
不同类型的细胞色素复合体，例如，aa3，a1，caa3，o，bo，co，bd-型，已经被证实其具有末端氧化酶的功能；已经报道了一些末端氧化酶的纯化及表征。Matsushita等报道了醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)IFO3283含有两个末端氧化酶，细胞色素a1及o，并且对细胞色素a1进行了纯化及表征(美国国家科学院院报979863，1990；细菌学杂志174122，1992)。Matsushita等同时也报道了从葡糖杆菌属(Gluconobacter)中分离纯化细胞色素o(生物化学生物物理学通报，894304，1987)。Tayama等也揭示了醋化醋杆菌(A.aceti)中的末端氧化酶(细胞色素a1)基因(JP 93-317054)；他们纯化的氧化酶包括四个亚基(其分子量分别为72，34，21及13kDa)，且含有血红素a及b。醋杆菌属及葡糖杆菌属中的氧化酶同属醌醇氧化酶。细胞色素aa3(细胞色素C氧化酶)已从牛心，酵母，及包括脱氮副球菌(Paracoccousdenitrificans)(Solioz等，生物学化学杂志，2571579-1582，1982)及类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(Hosler等，生物学化学杂志.，26724264-24272，1992)的细菌中纯化。
哺乳动物(线粒体)细胞色素C氧化酶(aa3型)复合体含有13种不同的亚基；三种核心亚基I，II及III(CO I，II及III)由线粒体DNA编码，而其余的10种为核来源。细菌aa3型细胞色素C氧化酶也含有3种核心亚基，其与线粒体核心亚基同源。然而，据报道，纯化时CO III容易丢失，结果导致制品中只含有CO I及CO II(Ludwig等，美国国家科学院院报，77196-200，1980)。随着电化学质子梯度的产生，含有2种亚基(CO I及CO II)的细胞色素C氧化酶复合体显示出一种氧化还原活性。在使用脱氮副球菌(Haltia等，欧洲分子生物学杂志，102015-2021，1991)及类球红细菌(Cao等，基因，101133-137，1991)的情况中，两亚基型(CO I/CO II)型及三亚基型(CO I/II/III)复合体分别由不同的纯化方法分离。从遗传学角度来讲，编码CO II及III的基因位于操纵子中，而编码CO I的基因位于独立位点(Raitio等，欧洲分子生物学杂志，92825-2833，1987；Shapleigh等，美国国家科学院院报，894786-4790，1992)。
如上所述末端氧化酶在有氧条件下的生长中在还原分子氧过程中起到关键作用，在有氧发酵时，含有末端氧化酶的呼吸链对于完成底物氧化以产生氧化产物发挥了作用，在本申请中，其对于提高呼吸链的效率以有效氧化发酵至关重要。
氧化葡糖杆菌DSM 4025由L-山梨糖经L-山梨酮产生的2-酮基-L-古洛糖酸(以下称2KGA)，是L-抗坏血酸生产工艺过程中的一个重要的中间产物(T.Hoshino等，EP 0366922A)。底物L-山梨糖至2KGA的氧化被认为是通过呼吸电子传递链完成的。催化最终电子排至分子氧的末端氧化酶很可能是在2KGA生产系统及其他氧化还原组份中的一个动力学速率限制步骤。
负责从L-山梨糖形成2KGA的原初脱氢酶已被分离(T.Hoshino等，EP606621A)，然后该基因被克隆及测序；发现了四个同工酶(T.Hoshino等，EP832974A)，且他们的直接电子受体细胞色素c551被纯化，其基因被克隆(T.Hoshino等，EP 0869175A)。然而，末端氧化酶却未分离，其基因未克隆。
发明内容
本发明的目的就是提供一种物质，其可以提高细胞色素C氧化酶的数量及质量，且改善在使新的细胞色素C氧化酶的基因可得的情况下由细胞色素C氧化酶完成的氧化发酵。保藏号为No.DSM 4025的微生物氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，其为一个来源优选实例，其提供了本发明的新的细胞色素C氧化酶及其遗传物质。
本发明提供了一种新的细胞色素C氧化酶复合体，其从自然界进行分离或用遗传工程手段制备。这样一种具有细胞色素C氧化酶活性的酶复合体是可获得的，或者得自起源于被鉴定为氧化葡糖杆菌DSM 4025的微生物的生物学或遗传物质，或者得自具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴定特征的微生物的生物学和/或分类学上同源的培养物。这样本发明提供了一种新的细胞色素C氧化酶复合体，其用做呼吸链中介导电子传递的关键成分。
这里作为例证的一种细胞色素氧化酶C复合体显示出如下的物理化学特性(i)显示出至少两种核心亚基I(CO I)及II(CO II)的存在，其中使用SDS-PAGE分析手段所获得的CO I的表观分子量大约是43+/-10kDa；COII的表观分子量大约是36+/-10kDa，且(ii)吸收光谱显示出aa3-型细胞色素C氧化酶；其在还原型减去氧化型的差别光谱上表现为605+/-1nm峰。这样一种细胞色素C氧化酶复合体可以被提供为基本上均质的分离物，它来自鉴定为氧化葡糖杆菌DSM 4025的微生物的培养物，或者具有氧化葡糖杆菌DSM4025鉴定特征的微生物的生物学和/或分类学上同源的培养物。
本发明的一种新的细胞色素C氧化酶复合体同样可以以一种重组酶的形式提供，其可以包括一个重组多肽作为核心亚基I(COI)，其中的重组多肽可以选自含有具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，及那些具有与所述序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性的多肽。更进一步讲，其它两个亚基II(CO II)及III(CO III)可以为重组多肽，其选自含有如SEQ ID NOs4，6和/或8所示的氨基酸序列的多肽，及那些含有具有与所述任一种氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性的多肽。
作为本发明的另一方面，各自核心亚基，即CO I，CO II及CO III可以以重组多肽形式提供，其用于本发明的新的细胞色素C氧化酶复合体的组份。
这里作为例证的COI为一重组多肽，其包含于细胞色素C氧化酶复合体，其中多肽包含有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者该多肽具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性。一个重组的COI可以为能够为如本发明所述的复合体提供细胞色素C氧化酶活性的一种多肽，其被一种重组DNA片段编码，所述DNA片段包含选自下述组份的DNA序列(a)如SEQ ID NO1所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
这里同样作为例证的CO II为重组多肽，其包含于本发明的细胞色素C氧化酶复合体，其中多肽包含如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或者该多肽具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性。重组的CO II可以为能够向如本发明所述的复合体提供细胞色素C氧化酶活性的一种多肽，其被一种重组DNA片段编码，所述DNA片段包含选自下述组份的DNA序列(a)如SEQ ID NO3所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
而且，这里作为例证的COIII为重组多肽，其包含于本发明的细胞色素C氧化酶复合体。这类多肽包含有如SEQ ID NOs6及8中任一个或两者所示的氨基酸序列，或者该多肽具有与上述SEQ ID No 6和8的氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性。一个重组的COIII可以为能够向如本发明所述的复合体提供细胞色素C氧化酶活性的一种多肽，其被一种重组DNA片段编码，所述DNA片段包含选自下述组份的DNA序列(a)如SEQ ID NO5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO7所示的DNA序列，(c)编码具有如SEQ ID NO6所示氨基酸序列，或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)编码具有如SEQ ID NO8所示氨基酸序列，或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
作为本发明的又一方面，提供了用遗传工程手段制备各个核心亚基即CO I，COII及COIII有用的重组DNA片段。这些重组多肽对于包含在本发明的新细胞色素C氧化酶复合体的组份是非常有用的。正如如上解释的那样，这些多肽应该能够为本发明的复合体提供细胞色素C氧化酶活性。
这儿例证的COI的重组DNA片段是一种编码包含在细胞色素C氧化酶复合体的多肽的DNA片段，且包括一种选自下述的DNA序列(a)如SEQ ID NO1所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
这里同样作为例证的COII的重组DNA片段是一种编码包含在细胞色素C氧化酶复合体的多肽的DNA片段，且包括一种选自下述组份的DNA序列(a)如SEQ ID NO3所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
而且，这里同样作为例证的COIII的重组DNA片段是一种编码包含在细胞色素C氧化酶复合体的多肽的DNA片段，且包括一种或多种选自下述组份的DNA序列(a)如SEQ ID NO5所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO7所示DNA序列或，(c)编码具有如SEQ ID NO6所示氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)编码具有如SEQ ID NO8所示氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
此外，作为本发明的另一方面，其提供了一种含有一种或多种上述重组DNA片段的表达载体，其中载体对于在生物体如原核或真核宿主细胞中进行表达是适宜的。
更进一步说，提供一个重组生物体是本发明的另一方面，所述生物体导入了上述表达载体。本发明的这样一个重组生物体对于本发明的重组细胞色素C氧化酶复合体的遗传制备是非常有用的，且可用于在合适的培养基中从L-山梨糖或D-山梨糖醇制备2KGA的工艺。本发明所述重组生物体的宿主细胞可以是真核来源的，最好是哺乳动物或植物细胞，也可以是原核来源的。这些宿主细胞特别是可以从细菌中获得，最好是氧化葡糖杆菌DSM 4025或者具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴定特征的微生物的生物学和/或分类学上同源的培养物。
本发明也可直接用于生产细胞色素C氧化酶的工艺，其包括在合适的培养基中培养上述本发明重组生物体，特别是含有这里所例证的优选DNA序列的重组生物体，且从培养基中回收细胞色素C氧化酶。
更进一步，本发明也可直接用于从L-山梨糖或D-山梨糖醇中制备2KGA的工艺，其包括在合适的培养基中培养上述本发明的重组生物体，且从培养物中回收2KGA。
下述图及详细说明可以进一步阐述本发明。
图1显示的是氧化葡糖杆菌DSM4025的aa3型细胞色素C氧化酶的吸收光谱图。在室温下蛋白质浓度为0.08mg/ml的含有0.5％蔗糖单月桂酸及5％甘油的25mM Na-HEPES(pH7.5)中记录光谱。[A]显示的是氧化型的光谱，[B]显示的是还原型的光谱，[C]显示的是还原型减去氧化型的差异光谱。
图2显示的是通过SDS-PAGE分析的纯化的氧化葡糖杆菌DSM 4025的细胞色素C氧化酶aa3。通过与2％SDS，50mM二硫赤藓糖醇，62.5mMTris-HCl(pH6.8)及10％甘油在37℃下孵育5小时变性该纯化酶(在0.5mG/ml蛋白质浓度下)。按照Laemmli(自然，227680-685，1970)的方法在12.5％丙烯酰胺浓度下进行电泳，使用的缓冲液含有25mM Tris，0.192M甘氨酸，及0.1％SDS。A和B分别是6及3微克纯化酶，C是低分子量预染色的SDS-PAGE标准液(Bio-Rad实验室，CA，美国).
图3显示的是来自于氧化葡糖杆菌DSM 4025的CO I的部分氨基酸序列与来自其它生物的序列之对比。
图4显示的是来自于氧化葡糖杆菌DSM 4025的CO II的部分氨基酸序列与来自其它生物的序列之对比。
图5显示的是来自于氧化葡糖杆菌DSM 4025的CO III的部分氨基酸序列与来自其他生物的序列之对比。
图6显示的是来自于氧化葡糖杆菌DSM 4025的细胞色素C氧化酶复合体的部分CO I，II及III基因的PCR扩增的引物。
图7显示的是分别含有″CO I″及″CO II及III″基因的8.0kb PstI及9.3kb EcoRI片段的物理图谱.
图8显示的是来自于氧化葡糖杆菌DSM 4025的完整的CO I氨基酸序列与来自其他生物的序列之对比。
图9显示的是用于表达来自于氧化葡糖杆菌DSM 4025的细胞色素C氧化酶复合体的基因的pVKcoxes的遗传图谱。
本发明的新型细胞色素C氧化酶复合体属于这样的蛋白质家族，其功能为一个末端氧化酶及其基因。更为确切的讲，本发明的新型细胞色素C氧化酶可用作一个末端氧化酶氧化细胞色素C，脱氢酶的电子受体例如乙醇及乙醛脱氢酶(AADH)，因此在呼吸链中可用作介导电子转移的核心成份。本发明的细胞色素C氧化酶复合体可以是从自然界进行分离的，或者借助遗传工程的方式制备的。这样的一个具有细胞色素C氧化酶活性的酶复合体可从起源于鉴定为氧化葡糖杆菌DSM 4025的微生物的生物材料获得，或者从具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴别特征的微生物的生物学和/或分类学上同源培养物获得。
正如这儿所使用术语“具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴别特征的微生物的生物学和/或分类学上同源的培养物”指的是一种具有氧化葡糖杆菌DSM4025的下述14种特征中至少12种特征的微生物(a)从L-山梨糖生产2-KGA；(b)将乙醇氧化成乙酸；(c)将D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸及2-酮基-D-葡糖酸；(d)显示多元醇的生酮作用；(e)在pH为4及5甘露醇肉汤培养基中显示出菌膜及菌环生长(24小时培养)，而且，在pH为4.5葡萄糖肉汤培养基中表现出菌膜生长，(f)基本上不氧化甘油成二羟丙酮，(g)从山梨糖醇及葡糖二酸生产2-酮基-D-葡糖二酸，而不能从葡萄糖、果糖、葡萄糖酸、甘露醇或者2-酮基-D-葡糖酸生产，(h)呈多态状，无明显的缏毛，(i)从果糖中产生褐色色素，(j)当与巨大芽孢杆菌(B.megaterium)或其细胞提取液共同培养时表现出好的长势，(k)对于链霉素敏感，(l)具有圆形末端的杆状，(m)平均细胞直径大约为0.3-0.6毫米，(n)平均细胞长度大约为1-1.5毫米，且如HPLC所测，该微生物用HPLC进行测量在培养基中以至少0.01g/L的2-KGA水平从L-山梨糖生产2-KGA。除此之外，词组“具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴别特征的微生物的生物学上和/或分类学上同源的培养物”应该被理解为涵盖一种包含这样的多核苷酸序列的微生物，该多核苷酸序列在高度严格的条件下可与另一编码选自SEQ ID NO2，4，6，及8的多肽之多核苷酸序列进行杂交，正如本领域技术人员熟知的那样，基于氨基酸序列的同源性就可鉴别该微生物。本发明的细胞色素C氧化酶复合体显示出下列物理-化学特征该复合体显示出aa3型细胞色素C氧化酶在还原型减去氧化型差别光谱上的吸收波长，在605+/-1nm的吸收峰；在SDS-PAGE上，包含在细胞色素C氧化酶复合体的两个多肽的表观分子量大约为43+/-10kDa及36+/-10kDa。
本发明的一个新的重组酶复合体可以使用遗传物质进行制备，所述遗传物质即起源于鉴定为氧化葡糖杆菌DSM 4025的微生物或者具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴别特征的生物学上和/或分类学上同源的微生物的培养物的重组DNA片段。这样一种新的细胞色素C氧化酶复合体可以包含至少一种重组多肽作为核心亚基之一。作为所述复合体核心亚基I的重组多肽可以选自如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，和那些具有与上述序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性的多肽。同样，另外的核心亚基II(CO II)及III(CO III)之一或者二者均可为重组多肽。CO II可以选自有如SEQ ID NO4所示部分氨基酸序列的重组多肽，和那些具有与上述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性的多肽。CO III可以选自含有如SEQ IDNO6和8所示的部分氨基酸序列，和那些具有与各氨基酸序列有85％或者更高相同性的部分氨基酸序列的多肽，只要这些重组多肽能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性。
术语“相同性”优选地是指出现在各自位置的氨基酸不仅在其特性上相似，而且事实上也是相同的。在一个优选实施例中氨基酸序列的比较是以最佳模式进行的。
本发明也涉及包含在所述细胞色素C氧化酶复合体的多肽。包含在所述细胞色素C氧化酶复合体的多肽和描述于SEQ ID NOs2，4，6及8的氨基酸序列最多与包含在其他细胞色素氧化酶的多肽及相应的部分氨基酸序列显示出50-82％的同源性。例如，本发明的CO I多肽(SEQ ID NO2)与来自于脱氮副球菌的CO Iα(登记号No.P08305)和CO Iβ(登记号No.P98002)，及与来自于类球红细菌的CO I(登记号No.P33517)分别显示出77％，81％及79％的同源性。本发明的部分的CO II多肽(SEQ ID NO4)与分别来自于脱氮副球菌及类球红细菌的CO II多肽显示出73％及68％的同源性。本发明的部分CO III多肽(SEQ ID NO6)与来自于脱氮副球菌的CO III多肽显示出54％的同源性。另一种多肽(SEQ ID NO8)与分别来自于脱氮副球菌及类球红细菌的CO III多肽显示出71％及63％的同源性。这些同源性检索可以通过计算机程序来进行，例如通过这样的程序″SearchHomology″，Genetyx-SVIRC版本3.2.0(Genetyx软件发展公司，东京，日本)。
这样，各个核心亚基即COI，CO II及CO III可以以重组多肽提供，这些多肽可用作本发明的新的细胞色素C氧化酶复合体的组份。
复合体中的亚基COI可以是包含在本发明的细胞色素C氧化酶复合体中的重组多肽，该多肽包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者该多肽包含与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供如上所述的细胞色素C氧化酶活性。重组的COI也可以是能够为本发明的复合体提供细胞色素C氧化酶活性的多肽，其可以由含有选自下述DNA序列的重组DNA片段编码(a)如SEQ ID NO1所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
同样，亚基COII可以是包含在本发明的细胞色素C氧化酶复合体中的重组多肽，该多肽包含如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或者该多肽包含与所述氨基酸序列有85％或者更高的相同性的氨基酸序列且能够为所述复合体提供如上所述的细胞色素C氧化酶活性。重组的COII也可以是能够为本发明的复合体提供细胞色素C氧化酶活性的多肽。其可以由含有选自下述DNA序列的重组DNA片段编码(a)如SEQ ID NO3所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
更进一步说，亚基CO III可以为包含在本发明的细胞色素C氧化酶复合体中的重组多肽，其中多肽分别包含有如SEQ ID NO6及8任一或两者所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO6和8各个氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列，只要所述重组多肽能够为所述复合体提供细胞色素C氧化酶活性。重组的CO III可以为能够向本发明所述的复合体提供细胞色素C氧化酶活性的重组多肽，其被包含一种或多种选自如下的DNA序列的重组DNA片段编码(a)如SEQ ID NO5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO7所示的DNA序列，(c)编码具有如SEQ ID NO6所示氨基酸序列，或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)编码具有如SEQ ID NO8所示氨基酸序列，或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
更进一步讲，本发明还包括上述重组多肽的功能性衍生物。这些功能性衍生物是基于本发明的氨基酸序列确定的，其可以通过增加，插入，删除，和/或置换该序列的一个或多个氨基酸残基来进行，其中包含有这种衍生物的细胞色素C氧化酶复合体仍然具有可以通过本领域普通技术人员周知的检定方法或者此处描述的具体技术所测量的细胞色素C氧化酶活性。这些功能性衍生物可通过化学肽合成或者基于本领域业已周知和公开的手段如Sambrook等的方法(出处同上)(″分子克隆″二版，冷泉港实验室出版1989，纽约)制备。一般来说不改变该分子活性的蛋白质及肽中的氨基酸交换是本技术领域的公知常识，例如H.Neurath及R.L.Hill在″蛋白质″(学院出版社，纽约，1979，特别参见图6，14页)中所述。最常发生的交换为Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly，反过来也成立。
本发明涉及重组DNA片段，其编码包含在所述细胞色素C氧化酶复合体的重组多肽，该复合体是呼吸链中介导电子传递的必须组分之一。
提供了可用于通过遗传工程手段制备各个核心亚基即CO I，CO II及CO III的重组DNA片段。这类重组多肽可用于包含在本发明所述的新的细胞色素C氧化酶复合体的组份。
CO I的重组DNA片段可以是编码包含在细胞色素C氧化酶复合体的多肽且含有选自有下列组份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO1所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列，或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
CO II的重组DNA片段可以是编码包含在细胞色素C氧化酶复合体的多肽且含有选自有下列组份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO3所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列，或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
更进一步说，CO III的重组DNA片段可以是编码包含在细胞色素C氧化酶复合体的多肽且含有一种或多种选自有下列组份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO7所示的DNA序列，(c)编码具有如SEQ ID NO6所示氨基酸序列，或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)编码具有如SEQ ID NO8所示氨基酸序列，或者具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
本发明的重组DNA片段也可以包括一种DNA序列，其在下文将给出更详尽论述的标准严格条件下能够与SEQ ID NO1，3，5或7所示序列进行杂交。
“标准条件”对于杂交来说意味着本领域普通技术人员用于检测特定杂交信息及如Sambrook等(出处同上)所描述的条件，或最好称为严格杂交及非严格清洗条件，或更优选称为中度严格条件，甚至更优选严格杂交条件及严格清洗条件，这些对于本领域普通技术人员都是熟知的，也是为如Sambrook等(出处同上)所描述过的。
本发明同时也提供了一种表达载体，其含有一种或多种上述重组DNA片段，其中载体对于在生物体如原核或真核宿主细胞中进行表达是适宜的。这样的表达载体可以通过将一种或多种上述重组DNA片段插入到可能携带有本领域所熟知的表达调控元件的合适的载体中进行构建。
此外，本发明的重组生物体可以通过将上述表达载体引入一个合适的宿主细胞进行制备。本发明的该重组生物体对于遗传制备本发明的重组细胞色素C氧化酶复合体是非常有用的，其同样适用于在合适的培养基中从L-山梨糖或D-山梨糖醇制备2KGA的工艺。本发明的重组生物体的宿主细胞可以是真核来源的，最好是哺乳动物或植物细胞，但也可以是原核来源的。这些宿主细胞尤其可以从细菌中获得，最好是氧化葡糖杆菌DSM 4025或者具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴别特征的微生物的生物学上和/或分类学上同源的培养物。此外，宿主细胞也可以选自下述细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，木醋杆菌(Acetobacter xylinum)，巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，醋化醋杆菌，汉氏醋杆菌(Acetobacterhansenii)，及氧化葡糖杆菌。
此外，本发明的另一目的是提供一种生产细胞色素C氧化酶的工艺，其包括在合适的培养基中培育上述定义的重组宿主细胞，且从该培养基中回收细胞色素C氧化酶。
本发明的细胞色素C氧化酶复合体同样适用于改进从L-山梨糖或D-山梨糖醇制备2KGA，此外，也适用于(不管是体内还是体外)在有醇及醛脱氢酶存在下从相应底物中生产醛类、碳酸类及酮类。
化合物2KGA是生产L-抗坏血酸的重要的中间物质，其可按照著名的Reichstein方法进行转化。通过发酵从L-山梨糖或D-山梨糖醇中制备2KGA的工艺已经已知[T.Hoshino等，EP 88116156A].已知葡糖杆菌属菌株可以经过山梨糖及山梨酮脱氢酶催化的反应来生产2KGA，正如农业生物化学，54(5)，1211-1218，1990[T.Hoshino等]及在EP 606621 A[T.Hoshino等]中揭示的那样。负责从L-山梨糖或D-山梨糖醇制备2KGA的原初脱氢酶基因已经获得[T.Hoshino等，EP 832974A]。此外，作为来自原初脱氢酶的电子受体的细胞色素C其基因同样也已经被分离[T.Hoshino等，EP 869175A]。这些脱氢酶及细胞色素C已经被用于体外生产2KGA。其基因已被用于构造从L-山梨糖和D-山梨糖醇中制备2KGA的重组生物体，例如，携带有醇/醛脱氢酶(AADH)基因的恶臭假单胞菌与细胞色素C一起可从L-山梨糖制备2KGA。
因此，本发明的细胞色素C氧化酶用于生产2KGA的用途也是本发明的一个目的。
本发明的细胞色素C氧化酶复合体的末端氧化酶活性可以通过使用TMPD(N，N，N′，N′-四甲基-对-苯二胺二盐酸盐)进行分光光度法测量。TMPD作为人工底物(电子供体)。反应混合物例如，含有2.5mM TMPD，0.05％Tween-20及0.1M 3(N-吗啉)丙磺酸钠(Na-MOPS)(pH 6.5)。TMPD氧化酶活性可以通过增加520nm的吸光值进行测量，TMPD的摩尔系数认为是6.1/mM/cm。一单位酶活性被定义为在室温下每分钟氧化1微摩尔的TMPD。
使用还原型减去氧化型的差别光谱通过检测在605nm峰周围的特征性阳性峰进行a-型血红素的分光光度鉴定和定量。每一样品的还原可以通过添加微量连二亚硫酸钠，氧化可以加入过硫酸铵。a-型血红素的摩尔系数峰(605nm-630nm)认为在11.7/mM/cm。
在以更详尽的方式描述本发明之前，先来描述一下由获自氧化葡糖杆菌DSM 4025的亚基COI及COII组成的纯化的细胞色素C氧化酶的物理化学特性。
(1)吸收光谱细胞色素C氧化酶复合体在还原型减去氧化型差别光谱的吸收图谱显示于图1。
(2)分子量SDS-PAGE分析显示，细胞色素C氧化酶的亚基CO I及CO II的表观分子量分别为大约43+/-10及36+/-10Kda，显示于图2。
(3)CO I及CO II的氨基酸序列使用制备型圆盘SDS-PAGE(NA-1800，Nippon Eido Co，.)将纯化的细胞色素C氧化酶复合体分解为CO I及II两个亚基。经过未鉴定的修饰封闭两个N-末端α-氨基酸残基。然后部分消化的肽片段(15-45KDa MW.)经过赖氨酰内肽酶处理获得，用从15％SDS-PAGE板上提取的条带进行分离，然后在Centricon-10(Amicon)中用15％甲醇及0.1％SDS洗，加入测序仪。分别从CO I及CO II获得“KDlGLLYLVAAGVVGF”(SEQ ID NO11)及“KASQFTHNTPLEIVWTIVPV”(SEQ ID NO14)序列。
用于分离本发明的细胞色素C氧化酶的多肽及基因的优选菌种为氧化葡糖杆菌菌株，其已按布达佩斯条约于1987年3月17日被保藏于德意志微生物保藏中心，Gottingen(德国)，保藏号为DSM 4025。而且，该菌株的传代培养物也按布达佩斯条约被保藏于工业科技代理处，发酵研究所，日本，保藏号为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)FERM BP-3812(保藏日期1992年3月30日)。此外，EP 278447也揭示了该菌株的特征。功能等同物，传代培养物，及所述微生物的变种及突变体也可用于本发明。具有菌株DSM4025鉴别特征的微生物的生物学或分类学上同源的培养物也可被用作本发明所述细胞色素C氧化酶的多肽及基因的来源。
本发明所提供的细胞色素C氧化酶可以如此制备，方法是通过培养一合适的生物体，破坏细胞，将其从破坏的细胞的无细胞提取物中分离，纯化，最好从生物体的可溶级分中分离并纯化。
生物体可在有氧条件下培养在补充合适的营养成分的含水的培养基中，在pH4～9之间进行培养，优选在含水的培养基中6～8之间进行培养。培养期的变化依赖于pH，温度及所使用的培养基，通常2～6天就会出现有利的结果。实施该培养的优选温度范围为约13℃到36℃，最好为约18℃到33℃。
一般情况下要求培养基含有下述营养组份可同化的碳源，可消化的氮源，及无机物质，维生素，微量元素及其它生长促进因子。作为可同化的碳源，甘油，D-葡萄糖，D-甘露醇，D-果糖，D-阿拉伯醇，L-山梨糖，D-山梨醇及其类似物可使用。
不同的有机或无机物也可用作氮源，可使用例如酵母提取液，肉膏提取物，蛋白胨，酪蛋白，玉米浸出液，尿素，氨基酸，硝酸盐，铵盐及其类似物。作为无机物，硫酸镁，磷酸钾，氯化铁和氯化亚铁，碳酸钙及其类似物。
下面将要详细描述经过培养从生物体中分离及纯化细胞色素C氧化酶及克隆基因/DNA序列的实施例。
(1)经过离心或过滤从发酵肉汤中收获细胞。
(2)细胞悬于缓冲液中，且用匀浆器、超声波仪处理或者用溶菌酶及其类似物处理得到细胞的裂解液。
(3)使用常用的蛋白质纯化法例如硫酸铵沉淀法，透析法，离子交换色谱法，凝胶过滤色谱法及亲和色谱法从生物体的破裂细胞的无细胞提取液中，优选地可溶性级分中分离和纯化细胞色素C氧化酶。
本发明所提供的细胞色素C氧化酶用作末端氧化酶氧化细胞色素C，来自属于脱氢酶的酶之电子受体，用于从醇类及醛类生产醛类，羧酸类及酮类，尤其是从L-山梨糖或D-山梨糖醇经过L-山梨酮(L-sorbosone)来生产2KGA。
简单来讲，本发明所用的细胞色素C氧化酶基因、DNA序列、重组表达载体及重组生物体(也可称为转化宿主细胞)均可以通过下述步骤获得(1)从本发明所述的能够提供细胞色素C氧化酶的重组生物体中分离染色体DNA，然后在大肠杆菌中构建染色体DNA基因文库。
(2)通过集落、噬菌斑、或Southern杂交法，PCR克隆法(聚合酶链式反应)或Western-blot分析法或类似方法；(3)由常用方法确定如上述所得细胞色素C氧化酶基因的核苷酸序列，以挑选含有所述细胞色素C氧化酶基因的重组DNA片段；且构建其中细胞色素C氧化酶基因可充分表达的表达载体。
(4)通过转化、转导、转接合及电穿孔技术构建携带有细胞色素C氧化酶基因的重组生物体。
用于本发明上述方面的材料和技术下面将详细例证说明总染色体DNA可以被本领域贯知技术纯化。通过下述方法，从总染色体DNA将编码细胞色素C氧化酶的基因克隆于质粒或噬菌体载体中(i)经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳从凝胶中分离整个蛋白质或肽酶处理的多肽片段，并且将其应用于蛋白质测序仪，例如应用生物系统自动气相测序仪470A(Perkin Elmer Corp.，Norwalk，Conn.，美国)确定来自于纯化的细胞色素C氧化酶亚基的部分氨基酸序列，使用DNA合成仪例如应用生物系统自动DNA测序仪381A(Perkin Elmer)按照上述获得的氨基酸序列来合成寡核苷酸探针，从带有目的基因的该菌株基因文库中分离携带有目的基因的克隆，方法是使用寡聚核苷酸探针通过集落、噬菌斑、或Southern杂交法；(ii)使用免疫学方法用针对细胞色素C氧化酶亚基的抗体，从基因文库中挑选表达细胞色素C氧化酶亚基的克隆；或者(iii)使用两个寡聚核苷酸(按照上述确定的氨基酸序列合成)，使用PCR方法从总染色体DNA中扩增DNA，然后通过集落、噬菌斑、或Southern杂交法用由此获得的PCR产物作为探针，从构建于大肠杆菌的基因文库中分离携带有细胞色素C氧化酶亚基的完整基因的克隆。上述作用于细胞色素C氧化酶亚基的抗体可以通过使用纯化的细胞色素C氧化酶亚基的蛋白质或者其片段使用如酶学方法，73卷，46页，1981所述方法获得。
细胞色素C氧化酶基因的核苷酸序列可以通过大家熟知的双脱氧链终止法使用M13噬菌体确定(Sanger F.等，美国国家科学院院报，745463-5467，1977)。
为了表达细胞色素C氧化酶复合体亚基的基因，可以使用多种启动子；例如最初的位于所述细胞色素C氧化酶亚基的基因上游的启动子，抗生素抗性基因的启动子，例如Tn5卡那霉素抗性基因(Berg，D.E.，和C.M.Berg.1983.生物/技术1417-435)，pBR322氨苄青霉素抗性基因，及大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因(lac)，trp-、tac-、trc-启动子，λ-噬菌体启动子，及其它在宿主中(包括这样的生物体，如细菌，诸如大肠杆菌，恶臭假单胞菌，木醋杆菌，巴氏醋杆菌，醋化醋杆菌，汉氏醋杆菌，及氧化葡糖杆菌，特别是氧化葡糖杆菌DSM 4025，和哺乳动物细胞及植物细胞)有功能的启动子。
为了上述目的，在编码序列导入的宿主细胞中为可操纵的其他一些调控元件如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主细胞中可操作的天然或合成序列)及转录终止子(反向重复结构，包括在宿主细胞中可操作的天然或合成序列)将被导入且与上述启动子一起使用。
宿主/克隆载体组合的广泛多样性可被应用于克隆双链DNA。克隆载体一般地说是质粒或噬菌体，其含有复制起点，调控元件，包含有多重克隆位点及选择标志如抗生素抗性基因(如氨苄青霉素，四环素，卡那霉素，链霉素，庆大霉素，壮观霉素等抗性基因)的克隆位点。
在大肠杆菌中表达目的基因的优选载体可从例如pBR322或其衍生物包括pUC18及pBluescript II，pACYC177，pACYC184[细菌学杂志，1341141-1156，1978]或其衍生物等一般用于大肠杆菌的载体中的任一个选择，也可从宽宿主范围质粒如RK2及RSF1010中选择。在包括氧化葡糖杆菌DSM 4025的葡糖杆菌属及恶臭假单胞菌中表达目的基因的优选载体可从在葡糖杆菌属和/或恶臭假单胞菌中，以及在优选的克隆生物(如大肠杆菌)中可复制的任何载体中选择。优选载体是宽宿主范围载体，如粘粒载体(如pVK102)及其衍生物，和RSF1010及其衍生物，以及这样的载体，其含有在葡糖杆菌属中有功能的复制起点及另一个在大肠杆菌中有功能的复制起点。为了稳定和有效表达克隆基因及有效培养携带有该克隆基因的宿主细胞，应仔细考虑该载体的拷贝数量及其稳定程度。含有转座因子如Tn5的DNA序列也可被用作载体，以将目的基因引入适宜的宿主细胞中去尤其是其染色体中去。含有从优选宿主细胞中分离出来的任一DNA的DNA序列与目的基因一起对于在优选宿主尤其是染色体上引入目的DNA序列是非常有用的。该DNA序列可以通过转化、转导、转接合或者电穿孔技术转移进入优选宿主。
可以作为宿主的有原核或真核起源的，且可包括生物体，哺乳动物细胞和植物细胞等。作为优选的生物体，这儿可能提到的细菌如大肠杆菌，恶臭假单胞菌，木醋杆菌，巴氏醋杆菌，醋化醋杆菌，汉氏醋杆菌，氧化葡糖杆菌，及其他任何可以生产重组细胞色素C氧化酶的革兰氏阴性菌。功能等同物，传代培养物，突变体，及所述生物体的变异体也可被用于本发明。优选的菌株为大肠杆菌K12及其衍生物，恶臭假单胞菌或者氧化葡糖杆菌DSM 4025及具有菌株DSM 4025鉴定特征的微生物的生物学或分类学上的同源培养物。
由本技术领域所熟知的方法，将编码本发明细胞色素C氧化酶的DNA序列连接到含有控制区域如启动子和核糖体接合位点及转录终止子的适宜载体中，所述控制区域在上述宿主细胞中可操作以产生表达载体。
为了构建携带有表达载体的宿主细胞，可使用多种DNA转移方法，包括转化，转导，接合交配(14及15章，普通及分子细菌学方法，Philipp Gerhardt等编，美国微生物学会，1994)，及电穿孔技术。构建转化宿主细胞的方法可以从分子细菌学领域熟知的方法中进行选择。一般的转化系统可用于大肠杆菌，假单胞菌属及醋杆菌属，转导系统可同样用于大肠杆菌接合转移系统，接合交配系统被广泛用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，包括大肠杆菌，恶臭假单胞菌及氧化葡糖杆菌。在WO 89106688已描述了优选的接合交配方法。接合可发生在液体介质或固体表面，生产细胞色素C氧化酶的优选受体选自大肠杆菌，恶臭假单胞菌及氧化葡糖杆菌。生产2KGA的优选受体选自大肠杆菌，恶臭假单胞菌及氧化葡糖杆菌，其可以用适宜重组表达载体产生活性的AADH及细胞色素C。生产2KGA的优选受体是氧化葡糖杆菌DSM4025。对于接合交配受体，经常增加一个选择性标记，例如，萘啶酮酸或利福平抗性被经常用到。
下述实施例进一步证明了本发明，但并不作为对本发明的任何限制。
具体的实施方式实施例1氧化葡糖杆菌DSM 4025细胞色素C氧化酶的鉴定和纯化末端氧化酶的活性可以通过使用人工底物(电子供体)TMPD((N，N，N′，N′-四甲基-对-苯二胺二盐酸盐)用分光光度法对其进行测量。反应混合物由2.5mM TMPD，0.05％ Tween-20及0.1M 3(N-吗啉)丙磺酸钠(Na-MOPS)(pH6.5)组成。TMPD氧化酶活性可以通过520nm的吸光度增加来测量，TMPD的摩尔系数认为是6.1/mM/cm。一单位酶活性被定义为在室温下每分钟氧化1微摩尔的TMPD。通过分析还原型减去氧化型的差别光谱检测在605nm峰周围的特征性正峰，分光光度法鉴定和定量α-型血红素。每一样品用连二亚硫酸钠还原，用过硫酸铵氧化。a-型血红素吸收峰的摩尔系数(605nm-630nm)认为是11.7/mM/cm。
氧化葡糖杆菌DSM 402530℃下有氧培养在5升FYC培养基中27小时，培养基组成为10％L-山梨糖(分别消毒)，0.05％甘油，1.6％尿素(分别消毒)，0.25％MgSO4x7H2O，6.25％面包酵母细胞，1.5％CaCO3(生产级，nacalai tesque，Kyoto，日本)及3.0％玉米浆，pH7.5(灭菌前)经过培养，固体物质如CaCO3及酵母细胞用低速离心进行沉淀并弃去(1,000rpm，5分钟)。存留在培养液上清液中的氧化葡糖杆菌DSM 4025细胞在8,000rpm下离心20分钟收集，并用含有0.25M NaCl及2mM MgCl2的25mM N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[4-丁磺酸]钠(Na-HEPES)(pH7.5)进行一次清洗。
最终的细胞(大约35g湿重)悬于大约200ml的含有0.5mM乙二氨四乙酸(EDTA)，0.5mM乙二醇-双-β-氨基乙醚(EGTA)，0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，1微克/毫升抑肽素A，1微克/毫升亮肽素，10微克/毫升DNaseI及10微克/毫升RNaseA的25mM Na-HEPES(pH7.5)中。悬浮细胞用French细胞压碎匀浆器在1500kg/cm2下处理两次。所得悬浮液在10,000rpm下离心10分钟以去除细胞碎片，收集上清液作为无细胞抽提液(424.0mg蛋白)。无细胞抽提液在55000rpm下进行超速离心1小时，以回收粗膜级分沉淀。粗膜级分在含有1.2％Tween 20，0.25M NaCl，2mM MgCl2，0.5mM PMSF，1微克/毫升抑肽素A，1微克/毫升亮肽素的50ml之25mM Na-HEPES(pH 7.5)中重悬浮，孵育1小时后洗去细胞膜。级分再一次在55000rpm下进行超速离心1小时以回收洗过的膜级分沉淀物质。洗过的膜级分在含有1.5％单月桂酸蔗糖(DOJIN Laboratories，Kumamoto，日本)，2mM EDTA及5％甘油的50ml之25mM Na-HEPES(pH7.5)中孵育1小时，以溶解膜结合蛋白，所得的悬浮液在55000rpm下进行超速离心1小时，以获得溶解的膜级分之上清液(50ml)。溶解膜级分的还原型减去氧化型差别光谱在605nm附近处显示出特征性正峰；该峰对应于每毫克粗蛋白内容物0.41nmole的a-型血红素。然后，溶解的膜级分中的膜结合蛋白被上样到DEAE-Toyopearl 650M(TOSOH，Tokyo，日本)柱(ID 2.2×5cm)中，其已经用含有0.5％单月桂酸蔗糖及5％甘油的25mM Na-HEPES进行平衡。用相同的缓冲液条件中线性梯度为0-0.35M的NaCl进行分级分离。显示a-型血红素光谱的级分(在还原型减去氧化型差别光谱上的605nm周围的正峰)及TMPD氧化酶活性在大约0.28M浓度的NaCl处洗脱。然后收集这些级分(64ml)，用含有45mM NaCl，5％甘油及0.5％单月桂酸蔗糖的45mM磷酸钾缓冲液[KPB](pH7.6)进行透析，酶溶液上样到羟基磷灰石(TONEN Co.，Tokyo，日本)柱(ID 1.5×6cm)，其己用相同的缓冲液进行平衡。柱子用相同的缓冲液洗涤，然后用含有500mMNaCl，5％甘油及0.5％单月桂酸蔗糖的500mM KPB(pH7.6)洗涤，活性级分用含有900mM NaCl，5％甘油及0.5％单月桂酸蔗糖的900mM KPB(pH7.6)进行洗脱且收集。来自羟基磷灰石柱的该级分(8.6mg蛋白)用含有0.5％单月桂酸蔗糖和5％甘油的25mM Na-HEPES(pH7.5)进行透析，使用YM-30膜(Amicon Inc.，MA，美国)经超滤浓缩，且以纯化蛋白储于-30℃。
在0.5％单月桂酸蔗糖存在下，该纯化蛋白用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)进行分析，该蛋白显示出一条呈绿色的可见条带(不经过蛋白染色)，其相应于单一的蛋白带(经过蛋白染色)。纯化蛋白具有2.6单位/毫克的TMPD氧化酶活性，且显示出aa3型细胞色素C氧化酶的典型的吸收光谱谱型(图.1)。a-型血红素的量估计为19.2nmole/mg纯化蛋白。就来自于洗涤膜的a-型血红素含量而言纯化倍数大约为100倍，回收率90％。这些结果表明纯化蛋白是在氧化葡糖杆菌DSM 4025中具有TMPD-氧化酶活性的主要成分(其可作为呼吸系统中的末端氧化酶)。在SDS-PAGE分析中，纯化蛋白被分解为两个蛋白组份一条显示出一个宽带，其表观分子量大约为43,000(命名为CO I)，另一条显示出一条窄带，其表观分子量大约为36,000(命名为CO II)(图.2)。
实施例2氧化葡糖杆菌DSM 4025细胞色素C氧化酶的氨基酸序列及与其它细胞色素C氧化酶复合体的同源性纯化的氧化葡糖杆菌DSM 4025细胞色素C氧化酶的两个组份(CO I及CO II)用制备型SDS-PAGE进行分离。并未从这两个组份获得天然N-端氨基酸序列。为了获得内部氨基酸序列，每一组份用赖氨酰内肽酶进行消化，所得片段用制备型SDS-PAGE进行分离，然后在氨基酸序列仪(应用生物系统470A型，The Perkin Elmer Corp.，Conn.，美国)上进行氨基酸测序。结果，从CO I片段(略低于初始分子量)中获得了部分氨基酸序列，KDIGLLYLVAAGWGF[SEQ ID NO11]，从CO II片段(比初始分子量低大约10000)获得了部分氨基酸序列，KASQFTHNTPLEIVWTIVPV[SEQ ID NO14]。由于在SDS-PAGE及分光光度特征上CO I及CO II与脱氮副球菌(B.Ludwig和G.Schatz，美国国家科学院院报，77，196-200，1980)的细胞色素C氧化酶的这些指标相似，通过序列对比(图3至图4)将CO I及COII亚基的部分氨基酸序列与脱氮副球菌和类球红细菌及牛线粒体之细胞色素C氧化酶复合体的总氨基酸序列进行比较。在这三种细胞色素C氧化酶复合体中的氨基酸序列的总体同源性在先前已经被报道了(C.Jianli等，生物化学杂志，267，24273-24278，1992).正如图3及图4所示，氧化葡糖杆菌DSM 4025细胞色素C氧化酶的CO I及CO II的氨基酸序列与其他复合体的序列进行了部分的同源性对比。特别是，在两种细菌序列(脱氮副球菌和类球红细菌)中观察到明显的同源性。
实施例3氧化葡糖杆菌DSM 4025细胞色素C氧化酶基因的克隆(1)通过PCR方法扩增部分细胞色素C氧化酶基因根据脱氮副球菌，类球红细菌及牛线粒体的总氨基酸序列对比以及纯化的CO I及CO II多肽的氨基酸序列(SEQ ID NOs11和14)，选择下述氨基酸序列用于PCR引物以扩增CO I及CO II基因的部分DNA序列SEQ IDNO9及SEQ ID NO10用于CO I基因；SEQ ID NO15及SEQ IDNO16用于CO II基因。已被报道包括在细胞色素C氧化酶复合体中的第三种组份(CO III)并不存在于从氧化葡糖杆菌DSM 4025中纯化的制品中；不存在的原因似乎是因为在纯化过程中已解离。为了证实且扩增编码推定的氧化葡糖杆菌DSM 4025的CO III基因的部分DNA序列(如果存在的话)，选择在脱氮副球菌、类球红细菌及牛线粒体的三个CO III基因编码的多肽中保守的两个氨基酸序列(图5.)SEQ ID NO17及SEQ ID NO18用于CO III基因。设计CO I，CO II或CO III各自的引物对(图-6)。使用GeneAmpTMDNA扩增试剂盒(Takara Shuzo，Kyoto，日本)且按照供应商的建议使用Parkin-Elmer Cetus Instruments热循环仪进行PCR反应，反应包括30个这样的循环1)在94摄氏度下热变性一分钟；2)在42或者50摄氏度下退火两分钟；及3)在72摄氏度下合成3分钟。反应混合物(100微升)包含有200微摩尔的dNTP，2.9微摩尔(用于32简并性)或5.8微摩尔的(用于64简并性)的各引物，2.2ng氧化葡糖杆菌DSM 4025的染色体DNA及2.5单位在提供的缓冲液中的Taq聚合酶。用琼脂糖凝胶电泳(AGE)通过使用溴化乙锭染色来检测PCR产物。结果，扩增了具有期望长度的DNA片段(CO I为大约180bp，CO II为大约180bp，CO III为大约300bp)。
(2)PCR扩增DNA片段的克隆和核苷酸测序从琼脂糖凝胶中纯化PCR扩增的DNA片段，且被直接克隆进入pCRTMII载体中(Invitrogen公司，美国)，DNA序列按照供应商的提示测定。由PCR产物的核苷酸序列推导出来的氨基酸序列与序列对比中目标位置的序列显示出很大的同源性(图3至图5)。编码CO I，CO II及CO III的部分氨基酸序列的PCR产物用32P进行标记，以分别获得探针Pco1，Pco2，及Pco3。这些探针被用于Southern-或者集落杂交以检测完整的CO I，CO II，及CO III基因。
(3)使用PCR产物作为探针进行氧化葡糖杆菌DSM 4025染色体DNA的Southern-印迹分析用多种限制性内切核酸酶消化的氧化葡糖杆菌DSM 4025染色体DNA通过使用探针进行Southern杂交。探针Pco1杂交于Pst I片段(8.0kb)，探针Pco2及Pco3杂交于EcoRI片段上(9.3kb)。
(4)在8.0kb PstI片段(CO I)及9.3kb EcoRI片段(CO II及CO III)中克隆完整的细胞色素C氧化酶基因氧化葡糖杆菌DSM 4025的染色体DNA用PstI或者ECoRI完全消化，对所得的片段进行琼脂糖凝胶电泳。切出大约9.3kb(7-12kb)的EcoRI消化产物和大约8kb(6-10kb)的Pstl-消化产物，从凝胶中洗脱出来。回收的DNA片段与用PstI或者EcoRI消化的pUC19载体进行连接以转化大肠杆菌JM109。大约获得了1,000个转化子作为PstI-或EcoRI-文库。用探针Pco1对PstI文库进行集落杂交，且对EcoRI文库用探针Pco2及Pco3杂交。从每一文库中，获得几个阳性克隆。从克隆中抽提质粒DNA，且用PstI或者EcoRI进行消化；8.0kb Pstl片段与探针Pco1显示出强的信号，9.3kb EcoRI片段与探针Pco2及Pco3均显示出强的信号。含有8.0kb PstI片段的质粒命名为pUCO01，含有9.3kb的EcoRI片段的质粒命名为pUCO23。
(5)8.0kb PstI和9.3kb EcoRI片段的物理图谱8.0kb PstI及9.3kb EcoRI片段的物理图谱可以通过使用探针Pco1，Pco2及Pco3对多种限制性内切核酸酶消化的片段进行Southern杂交分析来构建。编码9.3kb EcoRI片段的CO II及CO III基因的方向与距离可以用来自于部分核苷酸序列的引物(图7)通过PCR方法来确定。
(6)完整的CO I基因的核苷酸测序pUCO01上的COI基因的核苷酸序列可以通过双脱氧链终止法进行测定。如图7所示，一个来自于HindIII位点的上游的2.9kb的片段被测序，并在该片段上发现了一个开放阅读框(1,674bp的CDS，存在于如SEQ ID NO1所示的序列中)。该ORF编码558个氨基酸序列的蛋白(序列表SEQ ID NO2)，其包含一个与来自于纯化的CO I的多肽片段的氨基酸序列(SEQ ID NO11)，及从CO I的大约180bp的PCR产物[参见3-(1)]之DNA序列推断的氨基酸序列(SEQ ID NO13)相一致的区段。氧化葡糖杆菌DSM 4025的COI氨基酸序列与类球红细菌，脱氮副球菌及牛线粒体相比较，分别显示出78.7％，76.0％及53.3％的同源性(图8)(7)编码全部CO I，CO II，及CO III基因的表达质粒的构建经过完全的HindIII及部分的EcoRI消化以一个3.5kb的片段从在pUCO01的8.0kb PstI片段中分离COI基因(图7)。按照pUCO23上的9.3kbECORI片段的物理图谱，CO II及CO III基因经过完全的KpnI消化及部分Psd消化以产生一个串联形式的6.0kb的片段(图7)。每一片段亚克隆进pBluescript II SK+载体以获得含有CO I基因的3.5kb片段的质粒pBCO01及含有CO II和CO III基因的6.0kb片段的质粒pBCO23。
正如图9所示，含有COI基因的3.5kb片段及含有CO II及CO III基因的6.0kb片段被共同整合入一个表达载体中去，用于功能性表达细胞色素C氧化酶复合体(CO I，CO II，及CO III)的基因。首先，通过平端连接，将含有来自于pBCO23的CO II及CO III基因的6.0kb XbaI-KpnI片段插入质粒载体pVK101的EcORI位点。然后，将含有来自于pBCO01的CO I基因的3.5kbXbaI-HindIII片段插入具有6.0kb的XbaI-KpnI片段的pVK1O1的BgI II位点。所得质粒载体被命名为pVKcoxes。
实施例4氧化葡糖杆菌DSM 4025衍生物中的细胞色素C氧化酶基因的过度表达使用三亲接合交配法将携带有在pVK1O1，pVKcoxes中的细胞色素C氧化酶基因的质粒引入氧化葡糖杆菌DSM 4025的利福平抗性衍生物，GOS2RPM[一个GOS2R的单菌落分离株；T.Hoshino等，欧洲专利公报832974A2]中。GOS2RPM的细胞培养在30摄氏度10ml的T培养基中，该培养基由3％胰酶解大豆肉汤(Bacton Dickinson，Cockeysville，Md.，美国)及0.3％酵母提取液(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)和100微克/毫升的利福平组成(TR培养基)。供体菌株，(携带有pVKcoxes(Tcr，Kmr)或者pVK102(Tcr，Kmr)的大肠杆菌HB)及辅助菌株(携带有pRK2013(Kmr)的大肠杆菌HB101)被培养在含有合适抗生素的Luria Bertani培养基中37摄氏度过夜培养。这些过夜培养物(10ml的GOS2RPM培养物及2ml的大肠杆菌培养物)被分别离心，细胞沉淀悬浮在2ml的T培养基中。混和100微升的细胞悬液，取50微升混合的细胞悬液点入置于NS2琼脂培养基的表面的硝酸纤维滤膜上，所述培养基含有5.0％D-甘露醇，0.25％MgSO4.7H20，1.75％玉米浆，5％面包酵母(东方酵母公司，东京，日本)，0.5％CaCO3，0.5％尿素(分别灭菌)，及2.0％琼脂，pH7.0(灭菌前)。平板在27摄氏度下过夜培养。所得的细胞涂布到含有100微克/毫升利福平及3微克/毫升四环素的T琼脂培养基中(TRT琼脂平板)。由此获得的转化接合子通过在TRT琼脂平板上划线进行纯化以去除大肠杆菌及不含质粒的GOS2RPM细胞。
培养所得的转接合子GOS2RPM(pVKcoxes)及GOS2R(pVK102)，两种转接合子细胞按照实施例1的方法制备。通过下列实验测定，GOS2RPM(pVKcoxes)中的细胞色素C氧化酶水平类似于GOS2RPM(pVK102)。从这两个菌株中，溶解的细胞膜级分按照实施例1的方法制备。首先，通过还原型减去氧化型差别光谱法(实施例1)，对应于GOS2RPM(pVKcoxes)及GOS2R(pVK102)a-型血红素含量分别为0.031及0.022hmole/毫克细胞蛋白。其次，测量细胞色素C(购买于Sigma，马心脏VI型)比氧化速率。还原型的细胞色素C以连二亚硫酸钠作为还原剂制备，过量的还原剂由PD-10柱(Pharmacia)处理两次去除。反应混合物由33mM还原型细胞色素C，25mM Na-HEPES(pH7.2)，2％蔗糖单月桂酸及0.5mM EDTA组成。还原型细胞色素C的氧化速率由在550nm处吸收峰的减少来进行测量，摩尔系数认为是21.1/mM/cm。分别对应于GOS2RPM(pVK102)及GOS2R(pVKcoxes)的还原型细胞色素C的比氧化速率分别为1.58及2.00nmole/毫克细胞蛋白每分钟。第三，CO I及CO II组份的含量通过针对组份CO I或COII的抗体之Western-blot分析比较获得。在GOS2RPM(pVKcoxes)上可以观察到更强的条带强度(使用CCD照相机，对于CO I增加60％，对于CO II增加41％)。这些结果提示，引入pVKcoxes导致在产生2KGA的氧化葡糖杆菌DSM 4025衍生物中细胞色素C氧化酶复合体水平的功能性扩增。
序列表<110>F.HOFFMANN-LA ROCHE AG<120>细胞色素C氧化酶及其基因<130>细胞色素C氧化酶及其基因<140>
<141>
<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1674<212>DNA<213>氧化葡糖杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1674)<400>1atg gca gac gcc gcc att cac ggc cat gac cac cat gag aag caa ggc48Met Ala Asp Ala Ala Ile His Gly His Asp His His Glu Lys Gln Gly15 10 15ttc ttc acg cgc tgg ttc atg tcg acc aac cac aaa gac atc ggt ctg96Phe Phe Thr Arg Trp Phe Met Ser Thr Asn His Lys Asp Ile Gly Leu20 25 30cta tac ctt gta gcg gct ggt gtt gtt ggt ttc att tcc gtc ctg ttc144Leu Tyr Leu Val Ala Ala Gly Val Val Gly Phe Ile Ser Val Leu Phe35 40 45acc gtc tac atg cgc ctt gag ctg atg gat ccg ggt gtt cag tac atg192Thr Val Tyr Met Arg Leu Glu Leu Met Asp Pro Gly Val Gln Tyr Met50 55 60
tgc ctt gaa ggc gca cgt ctg atc gcg gat gcc tcg cag aca tgt acg240Cys Leu Glu Gly Ala Arg Leu Ile Ala Asp Ala Ser Gln Thr Cys Thr65 70 75 80gcg aac gga cac ctg tgg aac gtc atg gtt acc tac cat ggt att ctg288Ala Asn Gly His Leu Trp Asn Val Met Val Thr Tyr His Gly Ile Leu85 90 95atg atg ttc ttt gtg ggt atc ccc gca ttg ttc ggt ggt ttt ggt aac336Met Met Phe Phe Val Gly Ile Pro Ala Leu Phe Gly Gly Phe Gly Asn100 105 110tat ctg atg ccg ctg caa atc ggc gct ccg gat atg gcc ttc ccg cgg384Tyr Leu Met Pro Leu Gln Ile Gly Ala Pro Asp Met Ala Phe Pro Arg115 120 125atg aac aac ctg tcg ttc tgg ctg ttc att gcc ggt acc gcg atg ggc432Met Asn Asn Leu Ser Phe Trp Leu Phe Ile Ala Gly Thr Ala Met Gly130 135 140gtg gct tcg ctg ttc gca ccg ggc ggt gac ggt cag ctg ggt tcg ggc480Val Ala Ser Leu Phe Ala Pro Gly Gly Asp Gly Gln Leu Gly Ser Gly145 150 155 160gtt ggt tgg gtt ctg tac ccg ccg ctg tcg acc cgc gaa gct ggc tat528Val Gly Trp Val Leu Tyr Pro Pro Leu Ser Thr Arg Glu Ala Gly Tyr165 170 175tcg atg gac ctc gcg att ttc gcg gtt cac ttg tcg ggt gcc tcc tcg576Ser Met Asp Leu Ala Ile Phe Ala Val His Leu Ser Gly Ala Ser Ser180 185 190
atc atg ggc gcg atc aac atg atc acg acc ttc ttg aac atg cgc gcc624Ile Met Gly Ala Ile Asn Met Ile Thr Thr Phe Leu Asn Met Arg Ala195 200 205ccc ggc atg acg ctg cac aaa gtg ccg ttg ttc tcg tgg tcg atc ttt672Pro Gly Met Thr Leu His Lys Val Pro Leu Phe Ser Trp Ser Ile Phe210 215 220atc acg gct tgg ctg atc ctg ctg gcg ctg ccg gtt ctg gct ggt gca720Ile Thr Ala Trp Leu Ile Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala Gly Ala225 230 235 240atc acc atg ctg ctg acc gac cgt aac ttc ggc acg acc ttc ttc aat768Ile Thr Met Leu Leu Thr Asp Arg Asn Phe Gly Thr Thr Phe Phe Asn245 250 255cct gct ggc ggc ggt gac ccg att ctg tac caa cac atc ctg tgg ttc816Pro Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ile Leu Tyr Gln His Ile Leu Trp Phe260 265 270ttt ggg cac ccg gaa gtg tac atc atc att ctg ccc ggc ttt ggc atc864Phe Gly His Pro Glu Val Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Gly Phe Gly Ile275 280 285atc agc cat gtc gtg tcg acc ttc tcg aaa aag ccg gtc ttc ggt tac912Ile Ser His Val Val Ser Thr Phe Ser Lys Lys Pro Val Phe Gly Tyr290 295 300ctg ccg atg gtc tat gca atg gtg gca atc ggt gtt ctg ggc ttt gtc960Leu Pro Met Val Tyr Ala Met Val Ala Ile Gly Val Leu Gly Phe Val305 310 315 320
gtc tgg gcg cac cac atg tac acc gtt ggt atg tcg ctg acc cag caa1008Val Trp Ala His His Met Tyr Thr Val Gly Met Ser Leu Thr Gln Gln325 330 335tcc tac ttc atg ctg gcc acc atg gtg atc gcg gtg ccg acc ggc att1056Ser Tyr Phe Met Leu Ala Thr Met Val Ile Ala Val Pro Thr Gly Ile340 345 350aag atc ttc tcg tgg atc gcc acg atg tgg ggc ggc tcg gtt gag ttc1104Lys Ile Phe Ser Trp Ile Ala Thr Met Trp Gly Gly Ser Val Glu Phe355 360365aaa tcg ccg atg ctc tgg gcc ttt ggc ttt atg ttc ctg ttc acc gtg1152Lys Ser Pro Met Leu Trp Ala Phe Gly Phe Met Phe Leu Phe Thr Val370 375 380ggt ggt gtg acc ggt atc gtg ctg gcc caa gcg ggt ctg gac cgt gca1200Gly Gly Val Thr Gly Ile Val Leu Ala Gln Ala Gly Leu Asp Arg Ala385 390 395 400tat cac gac acc tat tac gtg gtg gcg cac ttc cat tat gtg atg tcg1248Tyr His Asp Thr Tyr Tyr Val Val Ala His Phe His Tyr Val Met Ser405 410 415ctg ggt gcg atc ttt gcg atc ttc gcc ggt atc tac ttt tac atg ccg1296Leu Gly Ala Ile Phe Ala Ile Phe Ala Gly Ile Tyr Phe Tyr Met Pro420 425 430aag ttc tcg ggc cgc gct ttc ccg gaa tgg gct gca aag ctg cac ttc1344Lys Phe Ser Gly Arg Ala Phe Pro Glu Trp Ala Ala Lys Leu His Phe435 440 445
tgg acc ttc ttc atc ggt gcg aac gtc acg ttc ttc ccg cag cac ttc1392Trp Thr Phe Phe Ile Gly Ala Asn Val Thr Phe Phe Pro Gln His Phe450 455460ctg gga cgt cag ggt atg ccg cgc cgt tac atc gac tat ccc gaa gcc1440Leu Gly Arg Gln Gly Met Pro Arg Arg Tyr Ile Asp Tyr Pro Glu Ala465 470 475 480ttc gcg ctg tgg aac aaa gtc tcg tcc tat ggt gcg ttc ctg gcc ttc1488Phe Ala Leu Trp Asn Lys Val Ser Ser Tyr Gly Ala Phe Leu Ala Phe485 490 495gcc tcg ttc ctg ttc ttc atc gtg atc ttt gtc tat acg ctg gtt gct1536Ala Ser Phe Leu Phe Phe Ile Val Ile Phe Val Tyr Thr Leu Val Ala500 505510ggc cgc cgc gag acc cgt ccg aac ccg tgg ggc gaa ttc gcc gat acg1584Gly Arg Arg Glu Thr Arg Pro Asn Pro Trp Gly Glu Phe Ala Asp Thr515 520 525ctg gaa tgg acg ctg cca tca ccg cct ccg gcc cac acg ttc gaa acg1632Leu Glu Trp Thr Leu Pro Ser Pro Pro Pro Ala His Thr Phe Glu Thr530 535540ctg ccc aag cgc tcg gac tgg gac aag cat ccc tcg cac taa 1674Leu Pro Lys Arg Ser Asp Trp Asp Lys His Pro Ser His545 550 555<210>2<211>557<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌
<400>2Met Ala Asp Ala Ala Ile His Gly His Asp His His Glu Lys Gln Gly15 10 15Phe Phe Thr Arg Trp Phe Met Ser Thr Asn His Lys Asp Ile Gly Leu20 25 30Leu Tyr Leu Val Ala Ala Gly Val Val Gly Phe Ile Ser Val Leu Phe35 40 45Thr Val Tyr Met Arg Leu Glu Leu Met Asp Pro Gly Val Gln Tyr Met50 55 60Cys Leu Glu Gly Ala Arg Leu Ile Ala Asp Ala Ser Gln Thr Cys Thr65 70 7580Ala Asn Gly His Leu Trp Asn Val Met Val Thr Tyr His Gly Ile Leu85 90 95Met Met Phe Phe Val Gly Ile Pro Ala Leu Phe G1y Gly Phe Gly Asn100 105110Tyr Leu Met Pro Leu Gln Ile Gly Ala Pro Asp Met Ala Phe Pro Arg115 120 125Met Asn Asn Leu Ser Phe Trp Leu Phe Ile Ala Gly Thr Ala Met Gly130 135 140Val Ala Ser Leu Phe Ala Pro Gly Gly Asp Gly Gln Leu Gly Ser Gly145 150 155 160Val Gly Trp Val Leu Tyr Pro Pro Leu Ser Thr Arg Glu Ala Gly Tyr165 170 175
Ser Met Asp Leu Ala Ile Phe Ala Val His Leu Ser Gly Ala Ser Ser180 185 190Ile Met Gly Ala Ile Asn Met Ile Thr Thr Phe Leu Asn Met Arg Ala195 200 205Pro Gly Met Thr Leu His Lys Val Pro Leu Phe Ser Trp Ser Ile Phe210 215 220Ile Thr Ala Trp Leu Ile Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala Gly Ala225 230 235 240Ile Thr Met Leu Leu Thr Asp Arg Asn Phe Gly Thr Thr Phe Phe Asn245 250 255Pro Ala Gly Gly Gly Asp Pro Ile Leu Tyr Gln His Ile Leu Trp Phe260 265 270Phe Gly His Pro Glu Val Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Gly Phe Gly Ile275 280285Ile Ser His Val Val Ser Thr Phe Ser Lys Lys Pro Val Phe Gly Tyr290 295 300Leu Pro Met Val Tyr Ala Met Val Ala Ile Gly Val Leu Gly Phe Val305 310 315 320Val Trp Ala His His Met Tyr Thr Val Gly Met Ser Leu Thr Gln Gln325 330 335
Ser Tyr Phe Met Leu Ala Thr Met Val Ile Ala Val Pro Thr Gly Ile340345 350Lys Ile Phe Ser Trp Ile Ala Thr Met Trp Gly Gly Ser Val Glu Phe355 360365Lys Ser Pro Met Leu Trp Ala Phe Gly Phe Met Phe Leu Phe Thr Val370 375380Gly Gly Val Thr Gly Ile Val Leu Ala Gln Ala Gly Leu Asp Arg Ala385 390 395 400Tyr His Asp Thr Tyr Tyr Val Val Ala His Phe His Tyr Val Met Ser405 410415Leu Gly Ala Ile Phe Ala Ile Phe Ala Gly Ile Tyr Phe Tyr Met Pro420 425 430Lys Phe Ser Gly Arg Ala Phe Pro Glu Trp Ala Ala Lys Leu His Phe435 440 445Trp Thr Phe Phe Ile Gly Ala Asn Val Thr Phe Phe Pro Gln His Phe450 455460Leu Gly Arg Gln Gly Met Pro Arg Arg Tyr Ile Asp Tyr Pro Glu Ala465 470 475 480Phe Ala Leu Trp Asn Lys Val Ser Ser Tyr Gly Ala Phe Leu Ala Phe485 490495Ala Ser Phe Leu Phe Phe Ile Val Ile Phe Val Tyr Thr Leu Val Ala500 505510
Gly Arg Arg Glu Thr Arg Pro Asn Pro Trp Gly Glu Phe Ala Asp Thr515 520 525Leu Glu Trp Thr Leu Pro Ser Pro Pro Pro Ala His Thr Phe Glu Thr530 535 540Leu Pro Lys Arg Ser Asp Trp Asp Lys His Pro Ser His545 550 555<210>3<211>132<212>DNA<213>氧化葡糖杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(132)<400>3ccg ctg gaa atc gtc tgg acg att gtt ccg gtt gtg att ctg gtc ttc48Pro Leu Glu Ile Val Trp Thr Ile Val Pro Val Val Ile Leu Val Phe15 10 15atc ggt gcg ttc tcg ctg ccg gtg ctg ttc aaa cag caa gag ttc ccc96Ile Gly Ala Phe Ser Leu Pro Val Leu Phe Lys Gln Gln Glu Phe Pro20 25 30gag ggt gac atc gtc atc aac gtc gag ggt cgt agc 132Glu Gly Asp Ile Val Ile Asn Val Glu Gly Arg Ser35 40<210>4<211>44<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌
<400>4Pro Leu Glu Ile Val Trp Thr Ile Val Pro Val Val Ile Leu Val Phe15 1015Ile Gly Ala Phe Ser Leu Pro Val Leu Phe Lys Gln Gln Glu Phe Pro20 25 30Glu Gly Asp Ile Val Ile Asn Val Glu Gly Arg Ser35 40<210>5<211>114<212>DNA<213>氧化葡糖杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(114)<400>5atc gtc cac ggc gac cgc aag aaa acc gcg att ggc cta gcg att gcc48Ile Val His Gly Asp Arg Lys Lys Thr Ala Ile Gly Leu Ala Ile Ala1 510 15atc ggc ctt ggc tgg atc ttt acc ctg tgc caa gcc tat gaa tat tat96Ile Gly Leu Gly Trp Ile Phe Thr Leu Cys Gln Ala Tyr Glu Tyr Tyr20 25 30gaa atc gtc cat acc gaa114Glu Ile Val His Thr Glu35<210>6<211>38<212>PRT
<213>氧化葡糖杆菌<400>6Ile Val His Gly Asp Arg Lys Lys Thr Ala Ile Gly Leu Ala Ile Ala1 5 10 15Ile Gly Leu Gly Trp Ile Phe Thr Leu Cys Gln Ala Tyr Glu Tyr Tyr20 25 30Glu Ile Val His Thr Glu35<210>7<211>87<212>DNA<213>氧化葡糖杆菌<220>
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Gly Tyr Leu Pro Met Val Tyr Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Leu Gly35 40 45Phe Val Val Trp Ala His His Met50 55<210>14<211>20<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌<220>
<22l>PEPTIDE<222>(1)..(20)<400>14Lys Ala Ser Gln Phe Thr His Asn Thr Pro Leu Glu Ile Val Trp Thr15 10 15Ile Val Pro Val20<210>15<211>6<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌<400>15Gln Phe Thr His Asn Thr15<210>16<211>7<212>PRT<213>类球红细菌<400>16Trp Tyr Trp Gly Tyr Glu Tyr15
<210>17<211>6<212>PRT<213>类球红细菌<400>17Thr Trp Ala His His Ala15<210>18<211>7<212>PRT<213>类球红细菌<400>18Trp Tyr Trp His Phe Val Asp1权利要求
1.一种从L-山梨糖或D-山梨糖醇中制备2-酮基-L-古洛糖酸的方法，该方法包括在合适的培养基中培养重组生物体并从培养基中回收2-酮基-L-古洛糖酸，所述重组生物体载有编码多肽的重组DNA，所述多肽包含于具有细胞色素c氧化酶活性的细胞色素c氧化酶复合体中，它可获自或来源于鉴定为氧化葡糖杆菌DSM 4025的微生物或具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴定特征的微生物的生物学和/或分类学上同源的培养物的生物学或遗传材料。
2.根据权利要求1的方法，其中将所述2--酮基-L-古洛糖酸进一步转化为维生素C。
全文摘要
本发明提供了一种新的细胞色素C氧化酶复合体，用于制备所述复合体的遗传材料，例如包含在细胞色素C氧化酶复合体的重组多肽，重组DNA片段，表达载体，重组生物体及其类似物。这些新的细胞色素C氧化酶复合体及遗传材料可起源于具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴定特征的微生物。本发明同样也提供了一种制备所述新的重组细胞色素C氧化酶复合体的方法及一种生产2－酮基－L－古洛糖酸(2KGA)的方法。
文档编号C07C59/347GK1807651SQ20051011432
公开日2006年7月26日 申请日期2000年11月17日 优先权日1999年11月17日
发明者浅仓昭, 星野长尾, 真城正子 申请人:Dsm Ip资产有限公司