胰多肽家族基序及含有这些基序的多肽的制作方法

专利名称：胰多肽家族基序及含有这些基序的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽化学，更特别地涉及胰多肽家族(“PPF”)多肽。
背景技术：
大量相关激素组成胰多肽家族(“PPT”)。胰多肽(“PP”)被发现是胰岛素提取物的污染物，是因其器官来源而不是功能价值命名的(Kimmel等人，Endocrinology 831323-30(1968))。PP是36个氨基酸的肽(SEQ ID NO1)，含有独特的结构基序(motif)。后来在肠的提取物中发现了一种相关肽，由于其N-和C-末端酪氨酸，所以命名为YY肽(“PYY”)(SEQ ID NO2)(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 792514-8(1982))。第三种相关肽后来在脑提取物中被发现，命名为神经肽Y(“NPY”)(SEQ ID NO4)(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795485-9(1982)；Tatemoto等人，Nature 296659-60(1982))。
据报导这三种相关肽已经发挥了多种生物学作用。PP的效应包括抑制胰分泌和胆囊舒张。中枢施用PP可以适度增加进食，这可以通过位于下丘脑和脑干的受体来调节(综述于Gehlert，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.2187-22(1998))。
PYY(SEQ ID NO2)的释放在餐后发生。PYY的替代分子形式是PYY(3-36)(SEQ ID NO3)(Eberlein等人，Peptides 10797-803(1989)；Grandt等人，Regul.Pept.51151-9(1994))。该片段组成人和犬科动物肠提取物的总PYY-样免疫反应性的大约40％，和禁食状态中总血浆PYY免疫反应性的大约36％，在餐后略微超过50％。显然地，它是PYY的二肽基肽酶-IV(DPP4)裂解产物。PYY(3-36)据报导是Y2和Y5受体的选择性配体，Y2和Y5受体在优选N末端截短的NPY类似物(即NPY类似物的C末端片段)中显示出药理学上的独特性。PYY的外周施用据报导降低了胃酸的分泌、胃的运动、胰腺外分泌(Yoshinaga等人，Am.J.Physiol.263G695-701(1992)；Guan等人，Endocrinology 128911-6(1991)；Pappas等人，Gastroenterology 911386-9(1986))，胆囊收缩和肠运动(Savage等人，Gut 28166-70(1987))。中枢注射PYY对胃排空、胃运动和胃酸分泌的作用，正如在后脑/脑干中或者其周围直接注射后所观察到的作用(Chen和Rogers，Am.J.Physiol.269R787-92(1995)；Chen等人，Regul.Pept.6195-98(1996)；Yang and Tache，Am.J.Physiol.268G943-8(1995)；Chen等人，Neurogastroenterol.Motil.9109-16(1997))，可能与外周注射后观察到的那些作用不同。例如，中枢施用PYY具有一些与此处针对外周注射的PYY(3-36)描述的那些作用相反的作用，在针对外周注射的PYY(3-36)的作用中，胃酸分泌被刺激，没有受到抑制。只有与TRH刺激结合在一起时，胃的运动才受到抑制，当单独施用时不会受到抑制；并且通过与PP受体的假定的相互作用，在较高剂量下才是真正刺激性的。PYY已经显示出在中枢给药后可以刺激食物和水的摄入(Morley等人，Brain Res.341200-3(1985)；Corp等人，Am.J.Physiol.259R317-23(1990))。
同样地，最早期报导的NPY(SEQ ID NO4)的中枢作用之一是增加食物摄取，尤其是在下丘脑(Stanley等人，Peptides 61205-11(1985))。PYY和PP据报导可以模拟这些作用，并且PYY更有效，或者与NPY同样有效(Morley等人，Brain Res.341200-3(1985)；Kanatani等人，Endocrinology 1411011-6(2000)；Nakajima等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.2681010-4(1994))。几个小组发现，NPY诱导的进食的强度高于以前所测试的任何药理学试剂所诱导的进食，并且非常持久。NPY诱导的进食刺激已经在大量物种中报导。在三个基本的常量营养物(脂肪、蛋白质和碳水化合物)中，碳水化合物的摄入被优先刺激。没有发现针对NPY的致食欲作用的耐受性，当在10天内重复施用该肽时，观察到体重增加的比率有显著增加。在饥饿过后，下丘脑PVN中NPY的浓度随着时间有所增加，在食物摄取后又快速回到了对照水平。
药理学研究和克隆努力已经显示了大量用于PP肽家族的七次跨膜受体，并且这些受体已经命名为Y1到Y6(和一个推定的PYY优先-受体Y7(PYY-preferring receptor))。这些受体的典型的信号反应与其它Gi/G0-偶联受体的信号反应类似，即腺苷酸环化酶的抑制。即使这些受体之间具有相当低的序列同源性，显而易见，在Y1、Y4和Y6受体之间仍有一簇氨基酸序列相似性，而Y2和Y5定义了其它家族。其它结合位点已经通过各种肽的效能的等级次序被鉴别出。NPY优先-受体Y7，其尚未被克隆，已经被称作Y3，并且PYY优先-受体Y7也已经显示出存在(推定的Y7)(综述在Michel等人，Pharmacol.Rev.50143-50(1998)；Gehlert，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.2187-22(1998)中)。
Y5和Y1受体已经被提示为食物摄取反应的主要介质(Marsh等人，Nat.Med.4718-21(1998)；Kanatani等人，Endocrinology 1411011-6(2000))。一个流行的观点是，通过这些受体，内源NPY增加了进食行为。针对肥胖症的推荐疗法总是针对NPY受体的拮抗作用，而用于治疗厌食的疗法是针对该配体家族的激动剂(例如参见美国专利5,939,462、6,013,622和4,891,357)。一般而言，PYY和NPY据报导是等效的，并且在所研究的所有Y1、Y5(和Y2)受体测定法中是相效的(Gehlert，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.2187-22(1998))。
在药理学上，Y2受体通过表现出针对神经肽Y的C-末端片段的亲和力与Y1区分开来。Y2受体是最经常通过神经肽Y(13-36)的亲和力进行区分的，尽管神经肽Y和肽YY的3-36片段提供了改进的亲和力和选择性(参见Dumont等人，Soc.for Neurosci.Abstracts 19726(1993))。通过Y1和Y2受体的信号传递被偶联于腺苷酸环化酶的抑制作用。也发现结合于Y2受体可以通过N型钙通道的选择性抑制来降低突触中胞内钙水平。此外，Y2受体，像Y1受体一样，表现出与第二信使的差别偶联(参见美国专利6,355,478)。Y2受体发现存在于多个脑区域中，包括海马、黑质-侧面、丘脑、下丘脑和脑干。人、鼠科动物、猴和大鼠Y2受体已经被克隆(例如参见美国专利6,420,352和美国专利6,355,478)。
推定的Y3受体的主要特征是它们识别NPY，而PYY至少在效能上低一个数量级。Y3受体代表显示出优先选择NPY的唯一的结合位点/受体。
存在一个额外的结合位点/受体，其显示出对PYY的优先性，名为PYY优先-受体，该受体在此处被称作Y7受体。已经报导了与该受体结合的不同的排名次序，或者受体的分类，这表明在该家族中可能有不止一种受体。在大多数报道中，描述了对PYY的效能比对NPY的效能高3到5倍的受体。国际药理联合会对于NPY、PYY和PP受体的命名法的推荐是，不使用术语PYY优先-受体，除非在PYY和NPY之间观察到至少20倍的效能差异(Michel等人，Pharmacol.Rev.50143-50(1998))。然而，对于本公开目的，谈及Y7受体，或者PYY优先-受体的药理学是指对PYY具有超过NPY的任何优先程度的受体。
肥胖症及其相关病症是常见的，在美国和全世界是非常严重的公众健康问题。上身肥胖型已知是2型糖尿病的最强的危险因素，并且是心血管疾病的强危险因素。肥胖症是如下疾病的公认的危险因素，即高血压、动脉硬化症、充血性心力衰竭、中风、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖疾病如多囊卵巢综合征、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌、以及全身麻醉并发症的增加的发生率(例如参见Kopelman，Nature 404635-43(2000))。肥胖症缩短了寿命，并且有上述疾病共同发病的严重风险，也有其它病症如传染病、静脉曲张、黑棘皮症(acanthosis nigrican)、湿疹、运动不耐受、胰岛素抵抗、高血压高胆固醇血症、胆石症、整形损伤和血栓栓塞疾病的极大风险(Rissanen等人，Br.Med.J.301835-7(1990))。肥胖症也是称作胰岛素抵抗综合征或者“综合征X”的疾病组的一个危险因素。对于肥胖症和相关疾病的医疗费用在全世界范围内的最新估计是1千5百亿美元。肥胖症的发病机理被认为是多因素的，但基本的问题是，在肥胖对象中，营养物可利用性和能量消耗不平衡，直到出现过量的脂肪组织。肥胖症目前是难以治疗的、慢性的、基本上难以消除的代谢失调。用于肥胖人群的体重降低的治疗药物可对他们的健康存在深远的有益影响。
仍然存在开发其它的PYY类似物多肽的需求。因此，本发明的一个目的是提供这样的PYY类似物多肽，以及用于产生和使用它们的方法。
尽管此处有全面的阐述，但此处所提到的所有文献被引入本发明中，作为参考。
发明概述本发明总的来说涉及胰多肽家族(“PPF”)多肽，其与PYY(3-36)的全长序列具有至少50％的序列同一性，也包括至少两个PPF基序，所述基序至少包括N末端聚脯氨酸PPF基序，和C末端尾PPF基序。本发明的其它PPF基序可能与PP家族多肽中的任何多肽的任何基序相对应，PP家族多肽包括PP、PYY和NPY。在某些实施方案中，PPF多肽不包括非天然氨基酸。在其它实施方案中，PPF多肽不包括已知的天然存在的物种变体。
一方面，本发明的PPF多肽包括PYY类似物多肽。仍然在本发明的另一个方面，本发明的PPF多肽包括PPF嵌合多肽，其包括PP、PYY或者NPY多肽的片段，所述片段共价连接到PP、PYY或者NPY多肽的至少一个额外的片段上，其中每一个PP、PYY或者NPY片段包括一个PPF基序。本发明的这样的PPF类似物多肽和PPF嵌合多肽将表现出与天然PYY(3-36)的全长序列具有至少50％的序列同一性。在某些实施方案中，期望的PPF嵌合多肽包括N末端PP片段，其与C末端PYY片段组合。在其它实施方案中，PPF嵌合多肽包括N末端PP片段，其与C末端NPY片段组合。在其它实施方案中，PPF嵌合多肽包括N末端PYY片段和C末端PP或者NPY片段。在其它实施方案中，PPF嵌合多肽包括N末端NPY，其与C末端PYY或者PP组合。在其它实施方案中，PPF嵌合多肽可能不包括与C末端NPY片段组合的N末端PP片段。仍然在其它实施方案中，PPF嵌合多肽可能不包括N末端NPY片段和C末端PYY片段。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗或者预防肥胖症的方法，其中该方法包括给对需要治疗或者预防的对象施用治疗上或者预防上有效量的本发明的PPF多肽。在优选的实施方案中，对象是肥胖或者超重对象。尽管“肥胖症”通常被定义为体重指数超过30，为了本公开内容的目的，任何对象，包括其体重指数低于30，需要或者希望减少体重的那些对象都包括在“肥胖”的范围内。对胰岛素具有抗性、葡萄糖不耐受或者具有任何类型的糖尿病(例如1、2型或者妊娠糖尿病)的对象可以从该方法受益。
仍然在本发明的另一个方面，本发明的化合物可以用于减少食物摄取、降低营养物可利用性、引起体重减轻、影响身体组成、改变身体能量含量或者能量消耗、以及改善脂质分布(包括降低LDL胆固醇和甘油三酸酯水平、和/或改变HDL胆固醇水平)的方法。因此，在某些实施方案中，本发明的方法可用于治疗或者预防特定状况或病症，这些状况或病症可以通过降低有需要的对象的营养物可利用性来减轻，包括给所述患者施用治疗上或者预防上有效量的本发明的PPF多肽。这样的状况或病症包括，但不限于高血压、脂质异常血症(dyslipidemia)、心血管病、进食紊乱、胰岛素抵抗、肥胖症、任何类型的糖尿病，包括I型、II型以及妊娠糖尿病。本发明的化合物也可以用于治疗或者预防与肥胖症相关的其它病症，包括中风、癌症(例如子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌)、胆囊疾病、睡眠性呼吸暂停、生殖力降低和骨关节炎(参见Lyznicki等人，Am.Fam.Phys.632185，2001)。
本发明的化合物也可以用于加强、诱导、增强或者恢复胰岛或者细胞中的葡萄糖反应性。这些作用也可以用于治疗或者预防与代谢失调相关的状况，如上面所描述的那些状况，以及美国专利US20040228846中描述的状况。
除了有需要的对象由于食物摄取减少、体重减轻以及治疗肥胖症所带来的高血压的改善外，本发明的化合物可以用于治疗或者预防低血压。
本发明的化合物也可以用于治疗或者预防任何数量的与肠电解质和水分分泌过多以及吸收减少有关的胃肠病症，例如感染性(例如细菌或者病毒)腹泻、炎症性腹泻、短肠综合征、或者通常在外科手术如回肠造口术之后发生的腹泻(例如参见arrison’s principles ofInternal Medicine，McGraw Hill Inc.，New York，12th ed.)。感染性腹泻的实例包括，但不限于，急性病毒性腹泻、急性细菌性腹泻(例如沙门氏菌、弯曲杆菌和梭状芽孢杆菌)或者由于原生动物感染引起的腹泻、或者旅行者腹泻(例如诺瓦克病毒或者轮状病毒)。炎症性腹泻的实例包括，但不限于，吸收不良综合征、热带口炎性腹泻、慢性胰腺炎、克隆氏疾病、痢疾和肠易激综合征。也已经发现，本发明的肽可以被用于治疗或者预防涉及胃肠病症的紧急状况或者威胁生命的状况，例如，在手术后或者由于霍乱导致的状况。进一步，本发明的化合物可以被用于治疗获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者的肠功能紊乱，尤其是在恶病质中。本发明的化合物也可以用于抑制小肠液和电解质分泌，加强营养运输，以及增加胃肠道内的细胞增殖，调节例如脂肪组织中的脂解，以及调节哺乳动物中的血流。
本发明的化合物也可以用于通过它们的胃肠保护活性治疗或者预防上述状况。因此，本发明的化合物可以用于治疗胃肠或者粘膜破坏。示例的破坏类型包括，但不限于，炎症性肠疾病、肠萎缩、以肠粘膜或者肠粘膜功能受损为特征的状况、以及胃肠道的其它状况，包括那些可能通过暴露于细胞毒性剂、辐射、毒性、感染和/或损伤引起的状况。而且，本发明的这些化合物可以与止痛剂、抗炎剂、生长激素、肝素、或者可能用于治疗炎性肠病或者上面所列的其它状况的任何其它治疗法组合。
进一步，本发明的化合物可以用于治疗或者预防可以通过它们的抗分泌特性减轻或者改善的疾病或者病症。这样的抗分泌特性包括抑制胃分泌和/或胰分泌，并且可以用于治疗或者预防以下疾病和病症，包括胃炎、胰腺炎、巴雷特食道和胃食道反流疾病。这些疾病也可以通过本发明所述化合物的胃肠保护功能治疗或者预防。
本发明的化合物也可以用于降低对象的中枢神经系统中的铝浓度，以便治疗或者预防与铝浓度异常相关的疾病或者状况(例如阿尔茨海默病患者，或者存在患阿尔茨海默病风险的患者，透析性痴呆患者，或者由于职业保留引起铝水平增加的患者)。
本发明也涉及药物组合物，其包括治疗上或者预防上有效量的本发明的至少一种PPF多肽，或者其药学可接受的盐，以及药学可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或可用于送递PPF多肽的载体。
参考下述优选的实施方案和详细描述，可以更加清楚地理解本发明的这些和其它方面。
附图简述

图1证明了本发明的某些PPF多肽在食物摄取测定中的活性。
图2证明了本发明的其它PPF多肽在食物摄取测定中的活性。
图3证明了本发明的其它PPF多肽在食物摄取测定中的活性。
图4证明了本发明的其它PPF多肽在食物摄取测定中的活性。
图5证明了本发明的某些PPF多肽在DIO小鼠模型中的活性。
图6证明了本发明的其它PPF多肽在DIO小鼠模型中的活性。
图7说明了大鼠的体重增加。
图8证明了与PYY(3-36)相比，本发明的一种PPF多肽在食物摄取测定和DIO小鼠模型中的活性。
图9A-9D证明了与PYY和PYY(3-36)相比，本发明的PPF多肽对于心率和血压的作用。
图10证明了本发明的PPF多肽对胃酸分泌的活性。
图11证明了本发明的PPF多肽对胃酸分泌的活性。
图12证明了本发明的PPF多肽对胃排空的活性。
图13证明了本发明的PPF多肽对胃排空的活性。
图14证明了本发明的PPF多肽对胃排空的活性。
图15证明了本发明的PPF多肽对胃排空的活性。
图16证明了本发明的PPF多肽对胃排空的活性。
图17证明了本发明的PPF多肽对胃排空的活性。
图18证明了本发明的PPF多肽对胆囊排空的活性。
图19证明了本发明的PPF多肽对胆囊排空的活性。
图20证明了本发明的PPF多肽对胃粘膜保护的活性。
发明详述本发明总的来说涉及胰多肽家族(“PPF”)多肽，其与PYY(3-36)的全长序列具有至少50％的序列同一性。本发明的PPF多肽也包括至少两个PPF基序，所述基序至少包括N末端聚脯氨酸PPF基序，和C末端尾PPF基序。本发明的其它PPF基序可能与PP家族多肽中的任何多肽的基序相对应，包括PP、PYY和NPY，例如PYY的II型-转角区域基序，或者PYY的C末端上的α-螺旋基序。在某些实施方案中，本发明的PPF多肽可能不包括任何非天然氨基酸。
本发明也涉及可以在代谢状况和紊乱的治疗和预防中有用的PPF多肽。在一个优选的实施方案中，与天然的人PP、PYY、PYY(3-36)或者NPY相比，本发明的PPF多肽可能在代谢状况和紊乱的治疗和/或预防中具有有可比较的或更高的效能。或者，与PP、PYY、PYY(3-36)或NPY相比，本发明的优选的PPF多肽可能表现出较低效能，但可能具有其它期望的特性，如改进的制造简易、稳定、和/或容易制剂化。
在一个优选的实施方案中，不受理论的限制，认为给对象外周施用本发明的新颖PPF多肽可降低营养物可利用性，因此在肥胖症和相关的代谢状况或者紊乱的治疗和预防中有用。同样地，本发明提供了PPF多肽组合物，以及使用这些组合物来降低有需要的对象的营养物可利用性的方法，这些方法用于治疗和预防可以从营养物可利用性的降低中获益的代谢状况或者紊乱。这些方法可用于治疗，例如肥胖症、糖尿病，包括但不限于2型或者非胰岛素依赖型糖尿病、进食紊乱、胰岛素抵抗综合征和心血管疾病。
各部分的标题在此处仅仅是用于组织目的，不应该以任何方式解释为限制所描述的主题。
本发明的PPF多肽及PPF基序正如上面所讨论的，本发明至少部分地涉及新颖的PPF多肽，其包括至少两个PPF基序，其中至少两个PPF基序至少包括N末端聚脯氨酸PPF基序和C末端尾PPF基序。本发明的PPF多肽与天然PYY(3-36)的全长序列具有至少50％的序列同一性。本发明的多肽将优选至少部分保留天然的人PP、PYY或者NPY的生物活性，例如本发明的多肽将通常是PP、PYY和/或NPY激动剂或者拮抗剂。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽将在代谢状况和紊乱的治疗和预防中表现出生物活性。进一步，本发明的PPF多肽可能包括内部接头化合物，可能包括内部氨基酸残基上的化学修饰，或者可能在N末端或者C末端残基上进行化学修饰。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽仅仅包括天然的L型氨基酸残基和/或修饰的天然L型氨基酸残基。或者，在一个优选的实施方案中，本发明的多肽不包括非天然氨基酸残基。
本发明的PPF基序可能与天然PP家族多肽，包括PP、PYY和NPY的任何多肽的任何基序相对应。“PPF基序”通常是天然PP家族多肽的结构组分，即一级、二级或者三级结构，该结构组分对于生物活性很重要，即生物活性在不存在所述基序或者破坏基序的情况下被显著降低。优选的PPF基序包括天然PP家族多肽的N末端聚脯氨酸II型基序，天然PP家族多肽的II型β-转角基序，天然PP家族多肽的C末端上的α-螺旋基序，和天然PP家族多肽的C末端尾基序。更特别地，在N末端聚脯氨酸区域中，对应于天然PP家族多肽的第5残基和第8残基的氨基酸一般是保守的，为脯氨酸。II型-转角基序将通常包括与天然PP家族多肽的残基12-14相对应的氨基酸。α-螺旋基序可能通常从对应于天然PP家族多肽的大约14位残基的氨基酸延伸到任何位点，最多延伸到C末端，包括C末端，只要α-螺旋基序包括足够数量的氨基酸残基，这样α-螺旋转角就可以在溶液中形成。α-螺旋基序也可以包括天然PP家族序列的氨基酸取代、插入和缺失，只要α-螺旋转角仍然在溶液中形成。C末端尾基序通常包括对应于天然PP家族多肽的大约最后10个残基的氨基酸，更优选地对应于天然PP家族多肽的最后7、6或者5个残基，更优选对应于氨基酸残基32-35。
在一个实施方案中，本发明的PPF多肽不包括任何非天然氨基酸残基，进一步的前提是本发明的PPF多肽不包括任何天然PPF多肽(例如PP，NPY(1-36)，NPY(3-36)，PYY(1-36)，PYY(3-36)，NPY(2-36)，NPY(4-36)，PYY(2-36)，PYY(4-36)，PP(2-36)，PP(3-36)，或者PP(4-36))。本发明的PPF多肽也优选地不包括Tyr1hPP，Lys4hPP，Asn7hPP，Arg19hPP，Tyr21hPP，Glu21hPP，Ala23hPP，Gln23hPP，Gln34hPP，Phe6Arg19hPP，Phe6Tyr21hPP，Phe6Glu21hPP，Phe6Ala23hPP，Phe6Gln23hPP，Pro13Ala14hPP，Ile31Gln34PP，Arg19Tyr20Tyr21Ser22Ala23hPP，Lys4Arg19Tyr20Tyr21Ser22Ala23hPP，Lys4Arg19Tyr20Tyr21Ser22Ala23hPP(2-36)，Ala1NPY，Tyr1NPY，Ala2NPY，Leu2NPY，Phe2NPY，His2NPY，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Tyr7pNPY，Ala7NPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Gly12NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Gly18NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala20NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Gly23NPY，Ala24NPY，Trp24pNPY，Ala25NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Ala27NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Ala29NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Phe30NPY，Ala31NPY，Trp31pNPY，Ala32NPY，Trp32NPY，Ala33NPY，Lys33NPY，Ala34NPY，Pro34NPY，Leu34NPY，Ala35NPY，Lys35NPY，Ala36NPY，Phe36NPY，His36NPY，Glu4Pro34pNPY，Arg6Pro34pNPY，Phe6Pro34pNPY，Cys6Pro34pNPY，Asn6Pro34pNPY，Phe7Pro34pNPY，Arg7Pro34pNPY，Cys7Pro34pNPY，Asp7Pro34pNPY，Phe8Pro34pNPY，Arg8Pro34pNPY，Cys8Pro34pNPY，Asp8Pro34pNPY，Asn8Pro34pNPY，Pro11Pro34pNPY，Ser13Pro14pNPY，Trp24，31pNPY，Ala31Pro32pNPY，Cys31Pro34pNPY，Leu31Pro34NPY，Phe32Pro34pNPY，Ala21，25Pro34pNPY，Pro11Tyr13Pro14Pro34pNPY，Ahx(9-22)pNPY，Ahx(9-17)pNPY，des-AA(10-20)-Cys7，21Pro34-pNPY，des-AA(10-17)-pNPY，des-AA(10-17)-Cys2，27-pNPY，des-AA(10-17)-Ala7，21-pNPY，des-AA(10-17)-Cys7，21-pNPY，des-AA(10-17)-Glu7Lys21-pNPY，des-AA(10-17)Cys7，21Pro34pNPY，des-AA(10-17)Glu7Lys21Pro34pNPY，des-AA(10-17)Cys7，21Leu31Pro34pNPY，des-AA(11-17)Cys7，21Pro34pNPY，Pro34PYY，His34PYY，Lys25hPYY(5-36)，Arg4hPYY(4-36)，Gln4hPYY(4-36)，Asn4hPYY(4-36)，Lys25hPYY(4-36)，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Tyr1，36pPYY，Pro13Ala14hPYY，Leu31Pro34PYY，FMS-PYY，FMS-PYY(3-36)，Fmoc-PYY，Fmoc-PYY(3-36)，FMS2-PYY，FMS2-PYY(3-36)，Fmoc2-PYY，Fmoc2-PYY(3-36)，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro34pNPY，hPP(19-23)-His34pNPY，rPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-Pro34pNPY，rPP(19-23)-His34pNPY，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(1-17)-His34pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-NPY(19-23)-His34hPP，hPP(1-17)-His34pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro34pNPY，hPP(19-23)-His34pNPY，rPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-Pro34pNPY，rPP(19-23)-His34pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(19-23)-hPP，pNPY(19-23)-Gln34hPP，pNPY(19-23)-His34hPP，pNPY(19-23)-Phe6Gln34hPP，pNPY(19-23)-Phe6His34hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-Gln34hPP，cPP(20-23)-Pro34-pNPY，cPP(21-23)-Pro34-pNPY，cPP(22-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7)-Pro34-pNPY，cPP(20-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7，20-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-His34hPP，或者cPP(1-7)-gPP(19-23)-hPP。
在另一个实施方案中，本发明的这样的PPF多肽也不包括Thr27hPYY(3-36)，Ile30hPYY(3-36)，Ser32hPYY(3-36)，Lys33hPYY(3-36)，Asn34hPYY(3-36)，Lys35hPYY(3-36)，Thr36hPYY(3-36)，Lys25Thr27hPYY(3-36)，Lys25Ile30hPYY(3-36)，Lys25Ser32hPYY(3-36)，Lys25Lys33hPYY(3-36)，Lys25Asn24hPYY(3-36)，Lys25Lys35hPYY(3-36)，Lys25Thr36hPYY(3-36)，Thr27Ile28hPYY(3-36)，Thr27Val28hPYY(3-36)，Thr27Gln29hPYY(3-36)，Thr27Ile30hPYY(3-36)，Thr27Val30hPYY(3-36)，Thr27Ile31hPYY(3-36)，Thr27Leu31hPYY(3-36)，Thr27Ser32hPYY(3-36)，Thr27Lys33hPYY(3-36)，Thr27Asn34hPYY(3-36)，Thr27Lys35hPYY(3-36)，Thr27Thr36hPYY(3-36)，Thr27Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile30hPYY(3-36)，Phe27Ser32hPYY(3-36)，Phe27Lys33hPYY(3-36)，Phe27Asn34hPYY(3-36)，Phe27Lys35hPYY(3-36)，Phe27Thr36hPYY(3-36)，Gln29ne30hPYY(3-36)，Gln29Ser32hPYY(3-36)，Gln29Leu33hPYY(3-36)，Gln29Asn34hPYY(3-36)，Gln29Leu35hPYY(3-36)，Gln29Thr36hPYY(3-36)，Ile30Ile31hPYY(3-36)，Ile30Leu31hPYY(3-36)，Ile30Ser32hPYY(3-36)，Ile30Lys33hPYY(3-36)，Ile30Asn34hPYY(3-36)，Ile30Lys35hPYY(3-36)，Ile30Thr36hPYY(3-36)，Ile30Phe36hPYY(3-36)，Val30Ser32hPYY(3-36)，Val30Lys33hPYY(3-36)，Val30Asn34hPYY(3-36)，Val30Lys35hPYY(3-36)，Val30Thr36hPYY(3-36)，Ile31Ser32hPYY(3-36)，Ile31Lys33hPYY(3-36)，Ile31Asn34hPYY(3-36)，Ile31Lys35hPYY(3-36)，Ile31Thr36hPYY(3-36)，Ile31Phe36hPYY(3-36)，Leu31Ser32hPYY(3-36)，Leu31Lys33hPYY(3-36)，Leu31Asn34hPYY(3-36)，Leu31Lys35hPYY(3-36)，Leu31Thr36hPYY(3-36)，Ser32Lys33hPYY(3-36)，Ser32Asn34hPYY(3-36)，Ser32Lys35hPYY(3-36)，Ser32Thr36hPYY(3-36)，Ser32Phe36hPYY(3-36)，Lys33Asn34hPYY(3-36)，Lys33Lys35hPYY(3-36)，Lys33Thr36hPYY(3-36)，Lys33Phe36hPYY(3-36)，Asn34Lys35hPYY(3-36)，Asn34Phe36hPYY(3-36)，Lys35Thr36hPYY(3-36)，Lys35Phe36hPYY(3-36)，Thr27hPYY(4-36)，Phe27hPYY(4-36)，Ile28hPYY(4-36)，Val28hPYY(4-36)，Gln29hPYY(4-36)，Ile30hPYY(4-36)，Val30hPYY(4-36)，Ile31hPYY(4-36)，Leu31hPYY(4-36)，Ser32hPYY(4-36)，Lys33hPYY(4-36)，Asn34hPYY(4-36)，Lys35hPYY(4-36)，Thr36hPYY(4-36)，Phe36hPYY(4-36)，Lys25Thr27hPYY(4-36)，Lys25Phe27hPYY(4-36)，Lys25Ile28hPYY(4-36)，Lys25Val28hPYY(4-36)，Lys25Gln29hPYY(4-36)，Lys25Ile30hPYY(4-36)，Lys25Val30hPYY(4-36)，Lys25Ile31hPYY(4-36)，Lys25Leu31hPYY(4-36)，Lys25Ser32hPYY(4-36)，Lys25Lys33hPYY(4-36)，Lys25Asn24hPYY(4-36)，Lys25Lys35hPYY(4-36)，Lys25Thr36hPYY(4-36)，Lys25Phe36hPYY(4-36)，Thr27Ile28hPYY(4-36)，Thr27Val28hPYY(4-36)，Thr27Gln29hPYY(4-36)，Thr27Ile30hPYY(4-36)，Thr27Val30hPYY(4-36)，Thr27Ile31hPYY(4-36)，Thr27Leu31hPYY(4-36)，Thr27Ser32hPYY(4-36)，Thr27Lys33hPYY(4-36)，Thr27Asn34hPYY(4-36)，Thr27Lys35hPYY(4-36)，Thr27Thr36hPYY(4-36)，Thr27Phe36hPYY(4-36)，Phe27Ile28hPYY(4-36)，Phe27Val28hPYY(4-36)，Phe27Gln29hPYY(4-36)，Phe27Ile30hPYY(4-36)，Phe27Val30hPYY(4-36)，Phe27Ile31hPYY(4-36)，Phe27Leu31hPYY(4-36)，Phe27Ser32hPYY(4-36)，Phe27Lys33hPYY(4-36)，Phe27Asn34hPYY(4-36)，Phe27Lys35hPYY(4-36)，Phe27Thr36hPYY(4-36)，Phe27Phe36hPYY(4-36)，Gln29Ile30hPYY(4-36)，Gln29Val30hPYY(4-36)，Gln29Ile31hPYY(4-36)，Gln29Leu31hPYY(4-36)，Gln29Ser32，hPYY(4-36)Gln29Leu33hPYY(4-36)，Gln29Asn34hPYY(4-36)，Gln29Leu35hPYY(4-36)，Gln29Thr36hPYY(4-36)，Gln29Phe36hPYY(4-36)，Ile30Ile31hPYY(4-36)，Ile30Leu31hPYY(4-36)，Ile30Ser32hPYY(4-36)，Ile30Lys33hPYY(4-36)，Ile30Asn34hPYY(4-36)，Ile30Lys35hPYY(4-36)，Ile30Thr36hPYY(4-36)，Ile30Phe36hPYY(4-36)，Val30Ile31hPYY(4-36)，Val30Leu31hPYY(4-36)，Val30Ser32hPYY(4-36)，Val30Lys33hPYY(4-36)，Val30Asn34hPYY(4-36)，Val30Lys35hPYY(4-36)，Val30Thr36hPYY(4-36)，Val30Phe36hPYY(4-36)，Ile31Ser32hPYY(4-36)，Ile31Lys33hPYY(4-36)，Ile31Asn34hPYY(4-36)，Ile31Lys35hPYY(4-36)，Ile31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Ser32hPYY(4-36)，Val31Lys33hPYY(4-36)，Leu31Asn34hPYY(4-36)，Leu31Lys35hPYY(4-36)，Leu31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Ser32Lys33hPYY(4-36)，Ser32Asn34hPYY(4-36)，Ser32Lys35hPYY(4-36)，Ser32Thr36hPYY(4-36)，Ser32Phe36hPYY(4-36)，Lys33Asn34hPYY(4-36)，Lys33Lys35hPYY(4-36)，Lys33Thr36hPYY(4-36)，Lys33Phe36hPYY(4-36)，Asn34Lys35hPYY(4-36)，Asn34Phe36hPYY(4-36)，Lys35Thr36hPYY(4-36)，Lys35Phe36hPYY(4-36)，Thr27hPYY(5-36)，Phe27hPYY(5-36)，Ile28hPYY(5-36)，Val28hPYY(5-36)，Gln29hPYY(5-36)，Ile30hPYY(5-36)，Val30hPYY(5-36)，Ile31hPYY(5-36)，Leu31hPYY(5-36)，Ser32hPYY(5-36)，Lys33hPYY(5-36)，Asn34hPYY(5-36)，Lys35hPYY(5-36)，Thr36hPYY(5-36)，Phe36hPYY(5-36)，Lys25Thr27hPYY(5-36)，Lys25Phe27hPYY(5-36)，Lys25Ile28hPYY(5-36)，Lys25Val28hPYY(5-36)，Lys25Gln29hPYY(5-36)，Lys25Ile30hPYY(5-36)，Lys25Val30hPYY(5-36)，Lys25Ile31hPYY(5-36)，Lys25Leu31hPYY(5-36)，Lys25Ser32hPYY(5-36)，Lys25Lys33hPYY(5-36)，Lys25Asn24hPYY(5-36)，Lys25Lys35hPYY(5-36)，Lys25Thr36hPYY(5-36)，Lys25Phe36hPYY(5-36)，Thr27Ile28hPYY(5-36)，Thr27Val28hPYY(5-36)，Thr27Gln29hPYY(5-36)，Thr27Ile30hPYY(5-36)，Thr27Val30hPYY(5-36)，Thr27Ile31hPYY(5-36)，Thr27Leu31hPYY(5-36)，Thr27Ser32hPYY(5-36)，Thr27Lys33hPYY(5-36)，Thr27Asn34hPYY(5-36)，Thr27Lys35hPYY(5-36)，Thr27Thr36hPYY(5-36)，Thr27Phe36hPYY(5-36)，Phe27Ile28hPYY(5-36)，Phe27Val28hPYY(5-36)，Phe27Gln29hPYY(5-36)，Phe27Ile30hPYY(5-36)，Phe27Val30hPYY(5-36)，Phe27Ile31hPYY(5-36)，Phe27Leu31hPYY(5-36)，Phe27Ser32hPYY(5-36)，Phe27Lys33hPYY(5-36)，Phe27Asn34hPYY(5-36)，Phe27Lys35hPYY(5-36)，Phe27Thr36hPYY(5-36)，Phe27Phe36hPYY(5-36)，Gln29Ile30hPYY(5-36)，Gln29Val30hPYY(5-36)，Gln29Ile31hPYY(5-36)，Gln29Leu31hPYY(5-36)，Gln29Ser32，hPYY(5-36)Gln29Leu33hPYY(5-36)，Gln29Asn34hPYY(5-36)，Gln29Leu35hPYY(5-36)，Gln29Thr36hPYY(5-36)，Gln29Phe36hPYY(5-36)，Ile30Ile31hPYY(5-36)，Ile30Leu31hPYY(5-36)，Ile30Ser32hPYY(5-36)，Ile30Lys33hPYY(5-36)，Ile30Asn34hPYY(5-36)，Ile30Lys35hPYY(5-36)，Ile30Thr36hPYY(5-36)，Ile30Phe36hPYY(5-36)，Val30Ile31hPYY(5-36)，Val30Leu31hPYY(5-36)，Val30Ser32hPYY(5-36)，Val30Lys33hPYY(5-36)，Val30Asn34hPYY(5-36)，Val30Lys35hPYY(5-36)，Val30Thr36hPYY(5-36)，Val30Phe36hPYY(5-36)，Ile31Ser32hPYY(5-36)，Ile31Lys33hPYY(5-36)，Ile31Asn34hPYY(5-36)，Ile31Lys35hPYY(5-36)，Ile31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Ser32hPYY(5-36)，Val31Lys33hPYY(5-36)，Leu31Asn34hPYY(5-36)，Leu31Lys35hPYY(5-36)，Leu31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Ser32Lys33hPYY(5-36)，Ser32Asn34hPYY(5-36)，Ser32Lys35hPYY(5-36)，Ser32Thr36hPYY(5-36)，Ser32Phe36hPYY(5-36)，Lys33Asn34hPYY(5-36)，Lys33Lys35hPYY(5-36)，Lys33Thr36hPYY(5-36)，Lys33Phe36hPYY(5-36)，Asn34Lys35hPYY(5-36)，Asn34Phe36hPYY(5-36)，Lys35Thr36hPYY(5-36)，或者Lys35Phe36hPYY(5-36)。
在另一个实施方案中，本发明的PPF多肽不包括任何非天然氨基酸残基，并且优选地包括hPYY的C末端尾基序。C末端尾基序可能优选地包括hPYY的氨基酸残基32-35，例如Thr，Arg，Gln，Arg(SEQID NO351)。在这样的一个实施方案中，本发明的PPF多肽不包括任何天然的PPF多肽(例如NPY(1-36)，NPY(3-36)，PYY(1-36)，PYY(3-36))，NPY(2-36)，PYY(4-36)，PYY(5-36))，(2-36)NPY，(2-36)PYY，Gln34hPP，Ile31Gln34PP，Ala1NPY，Tyr1NPY，Ala2NPY，Leu2NPY，Phe2NPY，His2NPY，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Tyr7pNPY，Ala7NPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Gly12NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Gly18NPYAla19NPY，Lys19NPY，Ala20NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Gly23NPY，Ala24NPY，Trp24pNPY，Ala25NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Ala27NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Ala29NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Phe30NPY，Ala31NPY，Trp31pNPY，Ala36NPY，Phe36NPY，His36NPY，Ahx(9-22)pNPY，Ahx(9-17)pNPY，des-AA(10-17)-pNPY，des-AA(10-17)-Cys2，27-pNPY des-AA(10-17)-Ala7，21-pNPY，des-AA(10-17)-Cys7，21-pNPY，des-AA(10-17)-Glu7Lys21-pNPY，Lys25hPYY(5-36)，Arg4hPYY(4-36)，Gln4hPYY(4-36)，Asn4hPYY(4-36)，Lys25hPYY(4-36)，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Tyr1，36pPYY，Pro13Ala14hPYY，FMS-PYY，FMS-PYY(3-36)，Fmoc-PYY，Fmoc-PYY(3-36)，FMS2-PYY，FMS2-PYY(3-36)，Fmoc2-PYY，Fmoc2-PYY(3-36)，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-pNPY，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-pNPY，pNPY(19-23)-Gln34hPP，pNPY(19-23)-Phe6Gln34hPP，或者pNPY(1-7，19-23)-Gln34hPP。
在另一方面，包括hPYY的C末端尾基序的本发明的这样的PPF多肽也不包括Thr27hPYY(3-36)，Ile30hPYY(3-36)，Thr36hPYY(3-36)，Lys25Thr27hPYY(3-36)，Lys25Ile30hPYY(3-36)，Lys25Asn24hPYY(3-36)，Lys25Thr36hPYY(3-36)，Thr27Ile28hPYY(3-36)，Thr27Val28hPYY(3-36)，Thr27Gln29hPYY(3-36)，Thr27Ile30hPYY(3-36)，Thr27Val30hPYY(3-36)，Thr27Ile31hPYY(3-36)，Thr27Leu31hPYY(3-36)，Thr27Thr36hPYY(3-36)，Thr27Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile30hPYY(3-36)，Phe27Thr36hPYY(3-36)，Gln29Ile30hPYY(3-36)，Gln29Thr36hPYY(3-36)，Ile30Ile31hPYY(3-36)，Ile30Leu31hPYY(3-36)，Ile30Thr36hPYY(3-36)，Ile30Phe36hPYY(3-36)，Val30Thr36hPYY(3-36)，Ile31Thr36hPYY(3-36)，Ile31Phe36hPYY(3-36)，Leu31Thr36hPYY(3-36)，Thr27hPYY(4-36)，Phe27hPYY(4-36)，Ile28hPYY(4-36)，Val28hPYY(4-36)，Gln29hPYY(4-36)，Ile30hPYY(4-36)，Val30hPYY(4-36)，Ile31hPYY(4-36)，Leu31hPYY(4-36)，Thr36hPYY(4-36)，Phe36hPYY(4-36)，Lys25Thr27hPYY(4-36)，Lys25Phe27hPYY(4-36)，Lys25Ile28hPYY(4-36)，Lys25Val28hPYY(4-36)，Lys25Gln29hPYY(4-36)，Lys25Ile30hPYY(4-36)，Lys25Val30hPYY(4-36)，Lys25Ile31hPYY(4-36)，Lys25Leu31hPYY(4-36)，Lys25Thr36hPYY(4-36)，Lys25Phe36hPYY(4-36)，Thr27Ile28hPYY(4-36)，Thr27Val28hPYY(4-36)，Thr27Gln29hPYY(4-36)，Thr27Ile30hPYY(4-36)，Thr27Val30hPYY(4-36)，Thr27Ile31hPYY(4-36)，Thr27Leu31hPYY(4-36)，Thr27Thr36hPYY(4-36)，Thr27Phe36hPYY(4-36)，Phe27Ile28hPYY(4-36)，Phe27Val28hPYY(4-36)，Phe27Gln29hPYY(4-36)，Phe27Ile30hPYY(4-36)，Phe27Val30hPYY(4-36)，Phe27Ile31hPYY(4-36)，Phe27Leu31hPYY(4-36)，Phe27Thr36hPYY(4-36)，Phe27Phe36hPYY(4-36)，Gln29Ile30hPYY(4-36)，Gln29Val30hPYY(4-36)，Gln29Ile31hPYY(4-36)，Gln29Leu31hPYY(4-36)，Gln29Thr36hPYY(4-36)，Gln29Phe36hPYY(4-36)，Ile30Ile31hPYY(4-36)，Ile30Leu31hPYY(4-36)，Ile30Thr36hPYY(4-36)，Ile30Phe36hPYY(4-36)，Val30Ile31hPYY(4-36)，Val30Leu31hPYY(4-36)，Val30Thr36hPYY(4-36)，Val30Phe36hPYY(4-36)，Ile31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Thr27hPYY(5-36)，Phe27hPYY(5-36)，Ile28hPYY(5-36)，Val28hPYY(5-36)，Gln29hPYY(5-36)，Ile30hPYY(5-36)，Val30hPYY(5-36)，Ile31hPYY(5-36)，Leu31hPYY(5-36)，Thr36hPYY(5-36)，Phe36hPYY(5-36)，Lys25Thr27hPYY(5-36)，Lys25Phe27hPYY(5-36)，Lys25Ile28hPYY(5-36)，Lys25Val28hPYY(5-36)，Lys25Gln29hPYY(5-36)，Lys25Ile30hPYY(5-36)，Lys25Val30hPYY(5-36)，Lys25Ile31hPYY(5-36)，Lys25Leu31hPYY(5-36)，Lys25Thr36hPYY(5-36)，Lys25Phe36hPYY(5-36)，Thr27Ile28hPYY(5-36)，Thr27Val28hPYY(5-36)，Thr27Gln29hPYY(5-36)，Thr27Ile30hPYY(5-36)，Thr27Val30hPYY(5-36)，Thr27Ile31hPYY(5-36)，Thr27Leu31hPYY(5-36)，Thr27Thr36hPYY(5-36)，Thr27Phe36hPYY(5-36)，Phe27Ile28hPYY(5-36)，Phe27Val28hPYY(5-36)，Phe27Gln29hPYY(5-36)，Phe27Ile30hPYY(5-36)，Phe27Val30hPYY(5-36)，Phe27Ile31hPYY(5-36)，Phe27Leu31hPYY(5-36)，Phe27Thr36hPYY(5-36)，Phe27Phe36hPYY(5-36)，Gln29Ile30hPYY(5-36)，Gln29Val30hPYY(5-36)，Gln29Ile31hPYY(5-36)，Gln29Leu31hPYY(5-36)，Gln29Thr36hPYY(5-36)，Gln29Phe36hPYY(5-36)，Ile30Ile31hPYY(5-36)，Ile30Leu31hPYY(5-36)，Ile30Thr36hPYY(5-36)，Ile30Phe36hPYY(5-36)，Val30Ile31hPYY(5-36)，Val30Leu31hPYY(5-36)，Val30Thr36hPYY(5-36)，Val30Phe36hPYY(5-36)，Ile31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)。
在另一个实施方案中，本发明的PPF多肽不包括WO 03/026591和WO 03/057235中公开的那些与PPF相关的多肽，这两份专利被完整地引入于此作为参考。
在另一个实施方案中，本发明的多肽的长度是至少34个氨基酸。在其它实施方案中，PPF多肽的长度可以是至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或者33个氨基酸。进一步，在一个实施方案中，本发明的多肽仅仅包括天然的L型氨基酸残基，和/或修饰的天然L型氨基酸残基。或者，在另一个实施方案中，本发明的多肽不包括非天然氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明的PPF多肽可能与天然PYY(3-36)的全长序列具有至少60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。本发明的这样的PPF多肽也可能与天然PP具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。在另一个实施方案中，本发明的这样的PPF多肽可能与天然NPY具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。
更特别地，在第一个方面，本发明涉及新颖的PPF多肽，其包括至少两个PPF基序，其中至少两个PPF基序至少包括N末端聚脯氨酸PPF基序和C末端尾PPF基序，并且该PPF多肽不包括任何非天然氨基酸残基。本发明的这样的PPF多肽与天然PYY(3-36)的全长序列具有至少50％的序列同一性。在一个优选的实施方案中，这样的PPF多肽具有至少34个氨基酸残基。在另一个优选的实施方案中，本发明的这样的PPF多肽可与天然PYY(3-36)的全长序列具有至少60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。本发明的这样的PPF多肽也可与天然PP具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。仍然在另一个实施方案中，本发明的这样的PPF多肽也可与天然NPY具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。
另一方面，本发明的PPF多肽包括PYY类似物多肽。仍然在本发明的另一个方面，本发明的PPF多肽包括PPF嵌合多肽，其包括PP、PYY或者NPY多肽的一个片段，该片段共价连接到PP、PYY或者NPY多肽的至少一个额外的片段上，其中每一个PP、PYY或者NPY片段包括一个PPF基序。本发明的这样的PPF类似物多肽和PPF嵌合多肽与天然PYY(3-36)的全长序列具有至少50％的序列同一性。在一个优选的实施方案中，本发明的这样的PPF多肽可能与天然PYY(3-36)的全长序列具有至少60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。本发明的PPF多肽也可与天然PP具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。仍然在另一个实施方案中，本发明的PPF多肽与天然NPY具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。在某些实施方案中，期望的PPF多肽可能不包括与C末端NPY片段组合的N末端PP片段。
作为背景，PYY、NPY和PP构成C末端酰胺化肽家族，参与胃肠功能、血压和给食行为的调节。不受理论的限制，这些肽选择性地结合并且激活Y受体亚型的能力被认为强烈地依赖于稳定的溶液结构，包括所谓的“PP-折叠”。表1(下面)显示了已知受体上的PP家族配体效能，和多个配体的效能的排名次序。
表1 PP家族受体的受体药理学总结
研究已经建议Y受体亲和力的差异与二级和三级结构差异相关。例如参见Keire等人，Biochemistry 2000，39，9935-9942。天然的猪PYY的特征在于，包括两个位于残基17-22和残基25-33的C末端螺旋状片段，其通过一个位于残基23、24和25上的结，一个围绕在残基12-14周围的转角，和残基30和31附近折叠的N末端而分离。进一步，全长猪PYY的特征在于，包括PP折叠，其通过N和C末端上的残基之间的疏水相互作用稳定。参见上文引用的文献。
“PP”是指，从任何物种获得或者来源的胰肽多肽。因此术语“PP”包括人全长，如SEQ ID NO1中所示的36个氨基酸的肽，以及PP的物种变体，包括，例如鼠科动物、仓鼠、鸡、牛、大鼠和狗PP。在这个意义上，“PP”，“野生型PP”，和“天然PP”，即未修饰的PP，可以互换使用。
“NPY”是指从任何物种获得或者来源的神经肽Y多肽。因此，术语“NPY”包括人全长，如SEQ ID NO4中所示的36个氨基酸的肽，以及NPY的物种变体，包括例如鼠科动物、仓鼠、鸡、牛、大鼠和狗NPY。在这个意义上，“NPY”，“野生型NPY”，和“天然NPY”，即未修饰的NPY，可以互换使用。
“PYY”是指从任何物种获得或者来源的肽YY多肽。因此，术语“PYY”包括人全长，如SEQ ID NO2中所示的36个氨基酸的肽，以及NPY的物种变体，包括例如鼠科动物、仓鼠、鸡、牛、大鼠和狗PYY。在这个意义上，“PYY”和“野生型NPY”和“天然NPY”，即未修饰的NPY，可以互换使用。在本发明的上下文中，参考本发明的PYY类似物多肽所讨论的所有修饰都基于天然的人PYY的36个氨基酸的序列(SEQ ID NO2)。
“PP激动剂”、“PYY激动剂”或者“NPY激动剂”是指分别引起天然的人PP、PYY或NPY的生物活性的化合物。在优选的实施方案中，这些术语是指，引起营养物可利用性降低的生物效应的化合物，这与天然的人PP、PYY或NPY引起的生物效应类似，例如这样的化合物(1)在食物摄取、胃排空、胰分泌或者体重减轻测定中具有与天然的人PP、PYY或NPY类似的活性，和(2)在Y受体测定中，或者在竞争结合测定中与来自某些组织的标记的PP、PYY、PYY(3-36)或者NPY特异性地结合，所述某些组织具有Y受体的冗余，包括例如最后区的冗余。在优选的实施方案中，激动剂不是PP、PYY、PYY(3-36)和/或NPY。优选地，激动剂将在这样的测定法中以大于1μM的亲和力结合，更优选地以大于1-5nm的亲和力结合。这样的激动剂可以包括具有PPF基序的多肽，PP、PYY或NPY的活性片段、或者小化学分子。
“氨基酸”和“氨基酸残基”是指，天然氨基酸、非天然氨基酸和修饰的氨基酸。除非有相反的说明，提到任何氨基酸，一般地或者特别地通过名称提到，包括D型和L型立体异构体，前体是它们的结构允许这样的立体异构体形式。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括，但不限于，高赖氨酸、高精氨酸、铃兰氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟基赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、六氢吡啶羧酸、硫脯氨酸、肌氨酸和瓜氨酸。其它的非天然氨基酸包括修饰的氨基酸残基，它们被可逆或者不可逆地化学阻断，或者在它们的N末端氨基基团或者它们的侧链基团上被化学地修饰，例如，N-甲基化D型和L型氨基酸或者残基，其中侧链官能团被化学修饰为另一个官能团。例如，修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚砜；甲硫氨酸砜；天冬氨酸-(β-甲酯)，即天冬氨酸的修饰的氨基酸；N-乙基甘氨酸，即甘氨酸的修饰的氨基酸；或者丙氨酸羧酰胺，即丙氨酸的修饰的氨基酸。可以被引入的其它残基描述在Sandberg等人，J.Med.Chem.412481-91，1998中。
“Ahx”是指6-氨基己酸。
PPF中的肽的某些人序列如下(以传统的单字母氨基酸代码表示)PPAPLEPVYPGD NATPEQMAQY AADLRRYINM LTRPRY(SEQ ID NO1)PYYYPIKPEAPGE DASPEELNRY YASLRHYLNL VTRQRY(SEQ ID NO2)PYY(3-36)IKPEAPGE DASPEELNRY YASLRHYLNL VTRQRY(SEQ ID NO3)NPYYPSKPDNPGE DAPAEDMARY YSALRHYINL ITRQRY(SEQ ID NO4)人PYY的物种同源序列包括SEQ ID NOs.7-29的那些氨基酸序列。
正如上面所提及的，当在生理上表达时，这些肽在C末端被酰胺化，但不需要针对本发明的目的。换句话说，这些肽的C末端，以及本发明的PPF多肽，可能具有一个游离的-OH或者-NH2基团。这些肽也可能具有其它翻译后修饰。本技术领域的技术人员将意识到，本发明的PPF多肽也可以用N末端甲硫氨酸残基构建。
本发明的优选的PPF包括式(I)的PPF多肽(SEQ ID NO30)Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28Xaa29Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Ala，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正缬氨酸，Val，Leu，Pro，Ser，Thr或者不存在；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高赖氨酸，高精氨酸，Glu，Asp，或者不存在；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，Pro，或者高Ser；Xaa14是Pro，Ala，高-Pro，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser，或者Thr；
Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Asp，Thr，或者高丝氨酸；Xaa25是Arg，高精氨酸，Lys，高赖氨酸，Orn，或者Cit；Xaa26是His，Ala，Arg，高精氨酸，高赖氨酸，Orn，或者Cit；Xaa27是Tyr或者Phe；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa29是Asn或者Gln；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，Val，Ile，或者Met；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述PPF多肽不是天然的PPF多肽，NPY(2-36)，NPY(4-36)，PYY(2-36)，PYY(4-36)，PP(2-36)，PP(4-36)，Ala1NPY，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Ala7NPY，Tyr7pNPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Ala31NPY，Phe36NPY，His36NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Pro13Ala14hPYY，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，Tyr1NPY，Ala7NPY或者hPP(19-23)-pNPY。
在另一个实施方案中，式I的PPF多肽也不包括Phe27hPYY(3-36)，Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Gln29hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Lys25Phe27hPYY(3-36)，Lys25Ile28hPYY(3-36)，Lys25Val28hPYY(3-36)，Lys25Gln29hPYY(3-36)，Lys25Val30hPYY(3-36)，Lys25Ile31hPYY(3-36)，Lys25Leu31hPYY(3-36)，Lys25Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile28hPYY(3-36)，Phe27Val28hPYY(3-36)，Phe27Gln29hPYY(3-36)，Phe27Val30hPYY(3-36)，Phe27Ile31hPYY(3-36)，Phe27Leu31hPYY(3-36)，Phe27Phe36hPYY(3-36)，Gln29Val30hPYY(3-36)，Gln29Ile31hPYY(3-36)，Gln29Leu31hPYY(3-36)，Gln29Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
正如本技术领域的技术人员将意识到的，式I的多肽可以是游离酸的形式，或者可以在C末端被酰胺化。
本发明的PYY类似物多肽本发明的PYY类似物多肽将通常包括至少两个PPF基序，其包括N末端聚脯氨酸PPF基序和C末端尾PPF基序，并且通常将至少部分地保留天然的人PYY的生物活性，例如本发明的PYY类似物多肽将通常是PYY激动剂。而且，PYY类似物多肽将与PYY(3-36)具有至少50％的序列同一性。在一个优选的实施方案中，本发明的PYY类似物多肽将在代谢状况和紊乱的治疗和预防中表现出PYY活性。
在一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽不包括任何非天然氨基酸残基，并且进一步的前提是，本发明的PYY类似物多肽不包括任何天然PYY多肽或者其1-4N末端缺失(例如PYY(1-36)，PYY(2-36)，PYY(3-36))，PYY(4-36))。本发明的PYY类似物多肽也优选地不包括Pro34PYY，His34PYY Lys25hPYY(5-36)，Arg4hPYY(4-36)，Gln4hPYY(4-36)，Asn4hPYY(4-36)，Lys25hPYY(4-36)，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Tyr1，36pPYY，Pro13Ala14hPYY，Leu31Pro34PYY，FMS-PYY，FMS-PYY(3-36)，Fmoc-PYY，Fmoc-PYY(3-36)，FMS2-PYY，FMS2-PYY(3-36)，Fmoc2-PYY，或者Fmoc2-PYY(3-36)。
在另一个实施方案中，本发明的这样的PYY类似物多肽也不包括Thr27hPYY(3-36)，Ile30hhPYY(3-36)，Ser32hPYY(3-36)，Lys33hPYY(3-36)，Asn34hPYY(3-36)，Lys35hPYY(3-36)，Thr36hPYY(3-36)，Lys25Thr27hPYY(3-36)，Lys25Ile30hPYY(3-36)，Lys25Ser32hPYY(3-36)，Lys25Lys33hPYY(3-36)，Lys25Asn24hPYY(3-36)，Lys25Lys35hPYY(3-36)，Lys25Thr36hPYY(3-36)，Thr27Ile28hPYY(3-36)，Thr27Val28hPYY(3-36)，Thr27Gln29hPYY(3-36)，Thr27Ile30hPYY(3-36)，Thr27Val30hPYY(3-36)，Thr27Ile31hPYY(3-36)，Thr27Leu31hPYY(3-36)，Thr27Ser32hPYY(3-36)，Thr27Lys33hPYY(3-36)，Thr27Asn34hPYY(3-36)，Thr27Lys35hPYY(3-36)，Thr27Thr36hPYY(3-36)，Thr27Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile30hPYY(3-36)，Phe27Ser32hPYY(3-36)，Phe27Lys33hPYY(3-36)，Phe27Asn34hPYY(3-36)，Phe27Lys35hPYY(3-36)，Phe27Thr36hPYY(3-36)，Gln29Ile30hPYY(3-36)，Gln29Ser32hPYY(3-36)，Gln29Leu33hPYY(3-36)，Gln29Asn34hPYY(3-36)，Gln29Leu35hPYY(3-36)，Gln29Thr36hPYY(3-36)，Ile30Ile31hPYY(3-36)，Ile30Leu31hPYY(3-36)，Ile30Ser32hPYY(3-36)，Ile30Lys33hPYY(3-36)，Ile30Asn34hPYY(3-36)，Ile30Lys35hPYY(3-36)，Ile30Thr36hPYY(3-36)，Ile30Phe36hPYY(3-36)，Val30Ser32hPYY(3-36)，Val30Lys33hPYY(3-36)，Val30Asn34hPYY(3-36)，Val30Lys35hPYY(3-36)，Val30Thr36hPYY(3-36)，Ile31Ser32hPYY(3-36)，Ile31Lys33hPYY(3-36)，Ile31Asn34hPYY(3-36)，Ile31Lys35hPYY(3-36)，Ile31Thr36hPYY(3-36)，Ile31Phe36hPYY(3-36)，Leu31Ser32hPYY(3-36)，Leu31Lys33hPYY(3-36)，Leu31Asn34hPYY(3-36)，Leu31Lys35hPYY(3-36)，Leu31Thr36hPYY(3-36)，Ser32Lys33hPYY(3-36)，Ser32Asn34hPYY(3-36)，Ser32Lys35hPYY(3-36)，Ser32Thr36hPYY(3-36)，Ser32Phe36hPYY(3-36)，Lys33Asn34hPYY(3-36)，Lys33Lys35hPYY(3-36)，Lys33Thr36hPYY(3-36)，Lys33Phe36hPYY(3-36)，Asn34Lys35hPYY(3-36)，Asn34Phe36hPYY(3-36)，Lys35Thr36hPYY(3-36)，Lys35Phe36hPYY(3-36)，Thr27hPYY(4-36)，Phe27hPYY(4-36)，Ile28hPYY(4-36)，Val28hPYY(4-36)，Gln29hPYY(4-36)，Ile30hPYY(4-36)，Val30hPYY(4-36)，Ile31hPYY(4-36)，Leu31hPYY(4-36)，Ser32hPYY(4-36)，Lys33hPYY(4-36)，Asn34hPYY(4-36)，Lys35hPYY(4-36)，Thr36hPYY(4-36)，Phe36hPYY(4-36)，Lys25Thr27hPYY(4-36)，Lys25Phe27hPYY(4-36)，Lys25Ile28hPYY(4-36)，Lys25Val28hPYY(4-36)，Lys25Gln29hPYY(4-36)，Lys25Ile30hPYY(4-36)，Lys25Val30hPYY(4-36)，Lys25Ile31hPYY(4-36)，Lys25Leu31hPYY(4-36)，Lys25Ser32hPYY(4-36)，Lys25Lys33hPYY(4-36)，Lys25Asn24hPYY(4-36)，Lys25Lys35hPYY(4-36)，Lys25Thr36hPYY(4-36)，Lys25Phe36hPYY(4-36)，Thr27Ile28hPYY(4-36)，Thr27Val28hPYY(4-36)，Thr27Gln29hPYY(4-36)，Thr27Ile30hPYY(4-36)，Thr27Val30hPYY(4-36)，Thr27Ile31hPYY(4-36)，Thr27Leu31hPYY(4-36)，Thr27Ser32hPYY(4-36)，Thr27Lys33hPYY(4-36)，Thr27Asn34hPYY(4-36)，Thr27Lys35hPYY(4-36)，Thr27Thr36hPYY(4-36)，Thr27Phe36hPYY(4-36)，Phe27Ile28hPYY(4-36)，Phe27Val28hPYY(4-36)，Phe27Gln29hPYY(4-36)，Phe27Ile30hPYY(4-36)，Phe27Val30hPYY(4-36)，Phe27Ile31hPYY(4-36)，Phe27Leu31hPYY(4-36)，Phe27Ser32hPYY(4-36)，Phe27Lys33hPYY(4-36)，Phe27Asn34hPYY(4-36)，Phe27Lys35hPYY(4-36)，Phe27Thr36hPYY(4-36)，Phe27Phe36hPYY(4-36)，Gln29Ile30hPYY(4-36)，Gln29Val30hPYY(4-36)，Gln29Ile31hPYY(4-36)，Gln29Leu31hPYY(4-36)，Gln29Ser32hPYY(4-36)，Gln29Leu33hPYY(4-36)，Gln29Asn34hPYY(4-36)，Gln29Leu35hPYY(4-36)，Gln29Thr36hPYY(4-36)，Gln29Phe36hPYY(4-36)，Ile30Ile31hPYY(4-36)，Ile30Leu31hPYY(4-36)，Ile30Ser32hPYY(4-36)，Ile30Lys33hPYY(4-36)，Ile30Asn34hPYY(4-36)，Ile30Lys35hPYY(4-36)，Ile30Thr36hPYY(4-36)，Ile30Phe36hPYY(4-36)，Val30Ile31hPYY(4-36)，Val30Leu31hPYY(4-36)，Val30Ser32hPYY(4-36)，Val30Lys33hPYY(4-36)，Val30Asn34hPYY(4-36)，Val30Lys35hPYY(4-36)，Val30Thr36hPYY(4-36)，Val30Phe36hPYY(4-36)，Ile31Ser32hPYY(4-36)，Ile31Lys33hPYY(4-36)，Ile31Asn34hPYY(4-36)，Ile31Lys35hPYY(4-36)，Ile31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Ser32hPYY(4-36)，Val31Lys33hPYY(4-36)，Leu31Asn34hPYY(4-36)，Leu31Lys35hPYY(4-36)，Leu31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Ser32Lys33hPYY(4-36)，Ser32Asn34hPYY(4-36)，Ser32Lys35hPYY(4-36)，Ser32Thr36hPYY(4-36)，Ser32Phe36hPYY(4-36)，Lys33Asn34hPYY(4-36)，Lys33Lys35hPYY(4-36)，Lys33Thr36hPYY(4-36)，Lys33Phe36hPYY(4-36)，Asn34Lys35hPYY(4-36)，Asn34Phe36hPYY(4-36)，Lys35Thr36hPYY(4-36)，Lys35Phe36hPYY(4-36)，Thr27hPYY(5-36)，Phe27hPYY(5-36)，Ile28hPYY(5-36)，Val28hPYY(5-36)，Gln29hPYY(5-36)，Ile30hPYY(5-36)，Val30hPYY(5-36)，Ile31hPYY(5-36)，Leu31hPYY(5-36)，Ser32hPYY(5-36)，Lys33hPYY(5-36)，Asn34hPYY(5-36)，Lys35hPYY(5-36)，Thr36hPYY(5-36)，Phe36hPYY(5-36)，Lys25Thr27hPYY(5-36)，Lys25Phe27hPYY(5-36)，Lys25Ile28hPYY(5-36)，Lys25Val28hPYY(5-36)，Lys25Gln29hPYY(5-36)，Lys25Ile30hPYY(5-36)，Lys25Val30hPYY(5-36)，Lys25Ile31hPYY(5-36)，Lys25Leu31hPYY(5-36)，Lys25Ser32hPYY(5-36)，Lys25Lys33hPYY(5-36)，Lys25Asn24hPYY(5-36)，Lys25Lys35hPYY(5-36)，Lys25Thr36hPYY(5-36)，Lys25Phe36hPYY(5-36)，Thr27Ile28hPYY(5-36)，Thr27Val28hPYY(5-36)，Thr27Gln29hPYY(5-36)，Thr27Ile30hPYY(5-36)，Thr27Val30hPYY(5-36)，Thr27Ile31hPYY(5-36)，Thr27Leu31hPYY(5-36)，Thr27Ser32hPYY(5-36)，Thr27Lys33hPYY(5-36)，Thr27Asn34hPYY(5-36)，Thr27Lys35hPYY(5-36)，Thr27Thr36hPYY(5-36)，Thr27Phe36hPYY(5-36)，Phe27Ile28hPYY(5-36)，Phe27Val28hPYY(5-36)，Phe27Gln29hPYY(5-36)，Phe27Ile30hPYY(5-36)，Phe27Val30hPYY(5-36)，Phe27Ile31hPYY(5-36)，Phe27Leu31hPYY(5-36)，Phe27Ser32hPYY(5-36)，Phe27Lys33hPYY(5-36)，Phe27Asn34hPYY(5-36)，Phe27Lys35hPYY(5-36)，Phe27Thr36hPYY(5-36)，Phe27Phe36hPYY(5-36)，Gln29Ile30hPYY(5-36)，Gln29Val30hPYY(5-36)，Gln29Ile31hPYY(5-36)，Gln29Leu31hPYY(5-36)，Gln29Ser32，hPYY(5-36)，Gln29Leu33hPYY(5-36)，Gln29Asn34hPYY(5-36)，Gln29Leu35hPYY(5-36)，Gln29Thr36hPYY(5-36)，Gln29Phe36hPYY(5-36)，Ile30Ile31hPYY(5-36)，Ile30Leu31hPYY(5-36)，Ile30Ser32hPYY(5-36)，Ile30Lys33hPYY(5-36)，Ile30Asn34hPYY(5-36)，Ile30Lys35hPYY(5-36)，Ile30Thr36hPYY(5-36)，Ile30Phe36hPYY(5-36)，Val30Ile31hPYY(5-36)，Val30Leu31hPYY(5-36)，Val30Ser32hPYY(5-36)，Val30Lys33hPYY(5-36)，Val30Asn34hPYY(5-36)，Val30Lys35hPYY(5-36)，Val30Thr36hPYY(5-36)，Val30Phe36hPYY(5-36)，Ile31Ser32hPYY(5-36)，Ile31Lys33hPYY(5-36)，Ile31Asn34hPYY(5-36)，Ile31Lys35hPYY(5-36)，Ile31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Ser32hPYY(5-36)，Val31Lys33hPYY(5-36)，Leu31Asn34hPYY(5-36)，Leu31Lys35hPYY(5-36)，Leu31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Ser32Lys33hPYY(5-36)，Ser32Asn34hPYY(5-36)，Ser32Lys35hPYY(5-36)，Ser32Thr36hPYY(5-36)，Ser32Phe36hPYY(5-36)，Lys33Asn34hPYY(5-36)，Lys33Lys35hPYY(5-36)，Lys33Thr36hPYY(5-36)，Lys33Phe36hPYY(5-36)，Asn34Lys35hPYY(5-36)，Asn34Phe36hPYY(5-36)，Lys35Thr36hPYY(5-36)，或者Lys35Phe36hPYY(5-36)。
在另一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽不包括任何非天然氨基酸残基，并且优选地包括hPYY的C末端尾基序。C末端基序可能优选地包括hPYY的氨基酸残基32-35，例如Thr，Arg，Gln，Arg(SEQ ID NO351)。在这样的一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽不包括任何天然PFF多肽或者其1-4N末端缺失(例如PYY(1-36)，PYY(2-36)，PYY(3-36)和PYY(4-36))。这样的PYY类似物也优选地不包括Lys25hPYY(5-36)，Arg4hPYY(4-36)，Gln4hPYY(4-36)，Asn4hPYY(4-36)，Lys25hPYY(4-36)，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Tyr1，36pPYY，Pro13Ala14hPYY，FMS-PYY，FMS-PYY(3-36)，Fmoc-PYY，Fmoc-PYY(3-36)，FMS2-PYY，FMS2-PYY(3-36)，Fmoc2-PYY，或者Fmoc2-PYY(3-36)。
另一方面，包括hPYY的C末端尾基序的本发明的这样的PYY类似物多肽也不包括Thr27hPYY(3-36)，Ile30hPYY(3-36)，Thr36hPYY(3-36)，Lys25Thr27hPYY(3-36)，Lys25Ile30hPYY(3-36)，Lys25Asn24hPYY(3-36)，Lys25Thr36hPYY(3-36)，Thr27Ile28hPYY(3-36)，Thr27Val28hPYY(3-36)，Thr27Gln29hPYY(3-36)，Thr27Ile30hPYY(3-36)，Thr27Val30hPYY(3-36)，Thr27Ile31hPYY(3-36)，Thr27Leu31hPYY(3-36)，Thr27Thr36hPYY(3-36)，Thr27Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile30hPYY(3-36)，Phe27Thr36hPYY(3-36)，Gln29Ile30hPYY(3-36)，Gln29Thr36hPYY(3-36)，Ile30Ile31hPYY(3-36)，Ile30Leu31hPYY(3-36)，Ile30Thr36hPYY(3-36)，Ile30Phe36hPYY(3-36)，Val30Thr36hPYY(3-36)，Ile31Thr36hPYY(3-36)，Ile31Phe36hPYY(3-36)，Leu31Thr36hPYY(3-36)，Thr27hPYY(4-36)，Phe27hPYY(4-36)，Ile28hPYY(4-36)，Val28hPYY(4-36)，Gln29hPYY(4-36)，Ile30hPYY(4-36)，Val30hPYY(4-36)，Ile31hPYY(4-36)，Leu31hPYY(4-36)，Thr36hPYY(4-36)，Phe36hPYY(4-36)，Lys25Thr27hPYY(4-36)，Lys25Phe27hPYY(4-36)，Lys25Ile28hPYY(4-36)，Lys25Val28hPYY(4-36)，Lys25Gln29hPYY(4-36)，Lys25Ile30hPYY(4-36)，Lys25Val30hPYY(4-36)，Lys25Ile31hPYY(4-36)，Lys25Leu31hPYY(4-36)，Lys25Thr36hPYY(4-36)，Lys25Phe36hPYY(4-36)，Thr27Ile28hPYY(4-36)，Thr27Val28hPYY(4-36)，Thr27Gln29hPYY(4-36)，Thr27Ile30hPYY(4-36)，Thr27Val30hPYY(4-36)，Thr27Ile31hPYY(4-36)，Thr27Leu31hPYY(4-36)，Thr27Thr36hPYY(4-36)，Thr27Phe36hPYY(4-36)，Phe27Ile28hPYY(4-36)，Phe27Val28hPYY(4-36)，Phe27Gln29hPYY(4-36)，Phe27Ile30hPYY(4-36)，Phe27Val30hPYY(4-36)，Phe27Ile31hPYY(4-36)，Phe27Leu31hPYY(4-36)，Phe27Thr36hPYY(4-36)，Phe27Phe36hPYY(4-36)，Gln29Ile30hPYY(4-36)，Gln29Val30hPYY(4-36)，Gln29Ile31hPYY(4-36)，Gln29Leu31hPYY(4-36)，Gln29Thr36hPYY(4-36)，Gln29Phe36hPYY(4-36)，Ile30Ile31hPYY(4-36)，Ile30Leu31hPYY(4-36)，Ile30Thr36hPYY(4-36)，Ile30Phe36hPYY(4-36)，Val30Ile31hPYY(4-36)，Val30Leu31hPYY(4-36)，Val30Thr36hPYY(4-36)，Val30Phe36hPYY(4-36)，Ile31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Leu31Thr36hPYY(4-36)，Leu31Phe36hPYY(4-36)，Thr27hPYY(5-36)，Phe27hPYY(5-36)，Ile28hPYY(5-36)，Val28hPYY(5-36)，Gln29hPYY(5-36)，Ile30hPYY(5-36)，Val30hPYY(5-36)，Ile31hPYY(5-36)，Leu31hPYY(5-36)，Thr36hPYY(5-36)，Phe36hPYY(5-36)，Lys25Thr27hPYY(5-36)，Lys25Phe27hPYY(5-36)，Lys25Ile28hPYY(5-36)，Lys25Val28hPYY(5-36)，Lys25Gln29hPYY(5-36)，Lys25Ile30hPYY(5-36)，Lys25Val30hPYY(5-36)，Lys25Ile31hPYY(5-36)，Lys25Leu31hPYY(5-36)，Lys25Thr36hPYY(5-36)，Lys25Phe36hPYY(5-36)，Thr27Ile28hPYY(5-36)，Thr27Val28hPYY(5-36)，Thr27Gln29hPYY(5-36)，Thr27Ile30hPYY(5-36)，Thr27Val30hPYY(5-36)，Thr27Ile31hPYY(5-36)，Thr27Leu31hPYY(5-36)，Thr27Thr36hPYY(5-36)，Thr27Phe36hPYY(5-36)，Phe27Ile28hPYY(5-36)，Phe27Val28hPYY(5-36)，Phe27Gln29hPYY(5-36)，Phe27Ile30hPYY(5-36)，Phe27Val30hPYY(5-36)，Phe27Ile31hPYY(5-36)，Phe27Leu31hPYY(5-36)，Phe27Thr36hPYY(5-36)，Phe27Phe36hPYY(5-36)，Gln29Ile30hPYY(5-36)，Gln29Val30hPYY(5-36)，Gln29Ile31hPYY(5-36)，Gln29Leu31hPYY(5-36)，Gln29Thr36hPYY(5-36)，Gln29Phe36hPYY(5-36)，Ile30Ile31hPYY(5-36)，Ile30Leu31hPYY(5-36)，Ile30Thr36hPYY(5-36)，Ile30Phe36hPYY(5-36)，Val30Ile31hPYY(5-36)，Val30Leu31hPYY(5-36)，Val30Thr36hPYY(5-36)，Val30Phe36hPYY(5-36)，Ile31Thr36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Phe36hPYY(5-36)，Leu31Thr36hPYY(5-36)，或者Leu31Phe36hPYY(5-36)。
本发明的PYY类似物多肽的长度优选地也是至少34个氨基酸。进一步，在一个优选的实施方案中，本发明的PYY类似物多肽仅仅包括天然L氨基酸残基和/或修饰的天然L氨基酸残基。或者，在一个优选的实施方案中，本发明的PYY类似物多肽不包括非天然氨基酸残基。
更特别地，一方面，本发明涉及PYY类似物多肽，其包括一个或多个氨基酸序列修饰。这样的修饰包括取代、插入和/或缺失，单独或者组合都可以。在一个优选的方面，本发明的PYY类似物多肽包括“非必需”氨基酸残基的一个或者多个修饰。在本发明的上下文中，“非必需”氨基酸残基是在天然的人PYY氨基酸序列中可以被改变的氨基酸残基，即被缺失或者取代，不会破坏或者显著降低PYY类似物多肽的PYY激动剂活性。优选地，关于降低营养物可利用性，本发明的PYY类似物多肽保留至少大约25％的天然的人PYY的生物活性，优选地是大约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、或99％。在另一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽表现出改进的PYY激动剂活性。优选地，就降低营养物可利用性而言，本发明的PYY类似物多肽表现出至少大约110％、125％、130％、140％、150％、200％、或更高的天然的人PYY的生物活性。
优选的PYY类似物多肽是在此处描述的测定(优选地是食物摄取、胃排空、胰分泌、或者体重减轻测定)之一中具有效能的PYY类似物多肽，所述效能等于或者大于相同测定中NPY、PYY或者PYY(3-36)的效能。或者，与PP、NPY、PYY或者PYY(3-36)相比，本发明的优选的PYY类似物多肽可能表现出改进的易于制造性、稳定性、和/或制剂化简单。
取代在一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽可在天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列中具有一个或多个取代，单独地，或者与一个或者多个插入或者缺失一起。优选地，取代不会破坏或者显著降低PYY类似物多肽的PYY激动剂活性。一方面，本发明涉及PYY类似物多肽，其在天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列中，具有单个取代、或者多于一个氨基酸残基的连续的或者不连续的取代。优选地，本发明的PYY类似物多肽包括一个、两个或者三个氨基酸取代。
优选地，PYY的螺旋C末端区域上(例如，残基20，24，25，27和29)的天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸残基，尾末端残基(32-36)，和/或5和8位的N末端脯氨酸没有被取代。在一个优选的实施方案中，在天然的人PYY(SEQ ID NO2)的32到36位，氨基酸残基没有被取代。在另一个实施方案中，在选自5、7、8、20、24、25、27、29、32、33、34、35、36或者其任意组合的一个或者多个氨基酸序列位置上，天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸残基没有被取代。
优选的取代包括保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链或者物理化学特征(例如静电、氢键键合、电子等排、疏水特征)的氨基酸残基取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本技术领域是已知的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)，β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在另一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽可以包括一个或者多个非天然氨基酸和/或非氨基酸的取代，例如氨基酸模拟物，取代到PYY(SEQ ID NO2)的序列中。在一个优选的实施方案中，插入到PYY(SEQ ID NO2)的序列中的非氨基酸可以是β-转角模拟物或者接头分子，如-NH-X-CO-，其中X＝(CH2)n(其中n可以是2-20)或者-NH-CH2CH2(-O-CH2CH2-O-)m-CH2-CO-(其中m＝1-5)。优选的接头分子包括氨基己酰基(“Aca”)、β-丙氨酰基和8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基。β-转角模拟物可以商购获得(BioQuadrant Inc，Quebec，Canada)，并且已经在文献中有所描述(Hanessian等人，Tetrahedron12789-854(1997)；Gu等人，Tetrahedron Letters 445863-6(2003)；Bourguet等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 131561-4(2003)；Grieco等人，Tetrahedron Letters 436297-9(2002)；Souers等人，Tetrahedron 577431-48(2001)；Tsai等人，Bioorganic & MedicinalChemistry 729-38(1999)；Virgilio等人，Tetrahedron 536635-44(1997))。优选的β-转角模拟物包括下面示意性说明的模拟物A和模拟物B。
含有氨基酸序列β-转角模拟物取代的优选的PYY类似物多肽包括天然的人PYY(SEQ ID NO2)，其中位置x和x+1上的氨基酸被选自模拟物A和模拟物B的β-转角模拟物取代，其中x选自天然的人PYY的8-14位氨基酸上的氨基酸。或者，已知的二肽转角诱导物可以被取代，例如Ala-Aib和Ala-Pro二肽。
含有氨基酸序列取代的其它优选的PYY类似物多肽包括式(II)的PYY类似物多肽(SEQ ID NO88)Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10
Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Ala，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正缬氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高赖氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高Ser；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，Val，Ile，或者Met；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然的PPF多肽，PYY(2-36)，PP(2-36)，Ala13NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，hPP(1-7)-pNPY或者hPP(1-17)-pNPY。
在另一个实施方案中，式II的PYY类似物多肽也不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
正如本技术领域的技术人员将认识到的，式II的多肽可以是游离酸形式，或者可以是C末端酰胺化的。
含有氨基酸序列取代的其它优选的PYY类似物多肽包括式(III)的PYY类似物多肽(SEQ ID NO348)Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正缬氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高赖氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，Pro，或者高丝氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；
Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，Val，Ile，或者Met；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然的PPF多肽，NPY(2-36)，PYY(2-36)，PP(2-36)，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Ala7NPY，Tyr7pNPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Ala31NPY，Phe36NPY，His36NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Pro13Ala14hPYY，Tyr1NPY，Ala7NPY，或者hPP(19-23)-pNPY。
在另一个实施方案中，式III的PYY类似物多肽也不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
正如本技术领域的技术人员将认识到的，式III的多肽可以是游离酸形式，或者可以是C末端酰胺化的。
含有氨基酸取代的其它优选的PYY类似物多肽包括式(IV)的PYY类似物多肽(SEQ ID NO349)Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Phe，Trp，或者不存在；
Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正缬氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高赖氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，Val，Ile，或者Met；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然PPF多肽，PYY(2-36)，Ala13NPY，Leu3hPYY(3-36)，或者Val3hPYY(3-36)。
在另一个实施方案中，式IV的PYY类似物多肽也不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
正如本技术领域的技术人员将认识到的，式IV的多肽可以是游离酸形式，或者可以是C末端酰胺化的。
含有氨基酸序列接头取代的其它优选的PYY类似物多肽包括PYY(1-4)氨基己酰基(14-36)(IUPAC[Aca5-13]PYY)(氨基己酰基被缩写为“Aca”)，PYY(1-4)Aca(15-36)，PYY(1-4)Aca(16-36)，PYY(1-4)Aca(22-36)(IUPAC[Aca5-21]PYY)，和PYY(1-4)Aca(25-36)(IUPAC[Aca5-24]PYY)(SEQ ID NOS180-184)。
缺失和截短在另一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽可以从天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列缺失一个或者多个氨基酸残基，单独地，或者与一个或者多个插入或者取代一起。一方面，本发明的PYY类似物多肽可以从天然的人PYY(SEQ ID NO2)的N末端或者C末端缺失一个或者多个氨基酸残基，前提是该多肽不是SEQ ID NO3。在另一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽可以从天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸2到35位缺失一个或者多个氨基酸残基。这样的缺失可以包括天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸2到35位的多于一个的连续或者不连续的缺失。在一个优选的实施方案中，天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸24到36位的氨基酸残基没有缺失。
在另一个实施方案中，在式I到V中描述的本发明的PPF多肽(见上下文)可以包括N或者C-末端截短，或者式I、II、III、IV或者V的2到35位氨基酸的内部缺失，只要天然PPF多肽的至少一种生物活性被保留。在优选的实施方案中，5到8位和24到36位的氨基酸残基，更优选地是5到8位和32到35位的氨基酸残基没有缺失。
插入在另一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽可以具有一个或者多个插入到天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列中的氨基酸残基，单独地或者与一个或者多个缺失和/或取代一起。一方面，本发明涉及PYY类似物多肽，其具有插入到天然的人PYY(SEQ ID NO2)的氨基酸序列中的单个插入，或者多于一个氨基酸残基的连续或者不连续的插入。在一个优选的实施方案中，氨基酸残基没有被插入到天然的人PYY(SEQ ID NO2)的24到36位。
在另一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽可以包括插入到PYY(SEQ ID NO2)的序列中的一个或者多个非天然氨基酸和/或非氨基酸的插入。在一个优选的实施方案中，插入到PYY(SEQ ID NO2)的序列中的非天然氨基酸可以是β-转角模拟物或者接头分子。优选的接头分子包括氨基己酰基(“Aca”)、β-丙氨酰基和8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基。优选的β-转角模拟物包括下面示意性说明的模拟物A和模拟物B，也包括Ala-Aib和Ala-Pro二肽。
在另一个实施方案中，本发明的PYY类似物多肽可以包括在多肽的任一末端上的聚氨基酸序列的插入(例如聚-his、聚-arg、聚-lys、聚-ala等等)，已知为“延伸”或者“尾”。
含有氨基酸插入序列的优选的PYY类似物多肽沿着天然的人PYY的长度，在每一个氨基酸位置上包括丙氨酸取代。这样的PYY类似物多肽包括PYY(+Axa)，其中x选自1’到36(SEQ ID NOS54-87)。
衍生物本发明也涉及本发明的PYY类似物多肽的衍生物。这样的衍生物包括偶联到一个或者多个水溶性聚合物分子上的PYY类似物多肽，如聚乙二醇(“PEG”)或者各种长度的脂肪酸链(例如硬脂酰、棕榈酰、辛酰)，这是通过加入聚氨基酸，如聚组氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸和聚丙氨酸，或者通过加入包括短烷基和约束烷基(constrainedalkyls)(例如支链的、环状、融合的金刚烷基)，和芳族基团的小分子取代基而实现的。水溶性聚合物分子的分子量将优选地为大约500到大约20,000道尔顿。
这样的聚合物缀合可以在PYY类似物多肽序列的范围内，在氨基酸残基的N或者C末端或者侧链上单一地发生。或者，沿着PYY类似物多肽可以有多个位点的衍生。具有赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或者半胱氨酸的一个或者多个氨基酸的取代可以提供其它衍生位点。例如参见美国专利5,824,784和5,824,778。优选地，PYY类似物多肽可以缀合到一个、两个或者三个聚合物分子上。
水溶性聚合物分子可以优选地连接到氨基、羧基或者硫羟基上，并且可以通过N或者C末端连接，或者在赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或者半胱氨酸的侧链上连接。或者，水溶性聚合物分子可以与二胺和二羧酸基团连接。在一个优选的实施方案中，本发明的PYY类似物多肽通过赖氨酸上的ε氨基基团缀合到一个、两个或者三个PEG分子上。
本发明的PYY类似物多肽衍生物也包括PYY类似物多肽，其具有一个或者多个氨基酸残基的化学改变。这样的化学改变包括酰胺化、糖基化、酰化、硫酸盐化、磷酸化、乙酰化和环化。化学改变可以单一地在PYY类似物多肽序列的范围内，在N或者C末端，或者在氨基酸残基的侧链上发生。在一个实施方案中，这些肽的C末端可以具有一个游离的-OH或者-NH2基团。在另一个实施方案中，N末端可以用异丁基氧羰基基团、异丙基氧羰基基团、正丁基氧羰基基团、乙氧羰基基团、异己酰基基团(isocap)、辛酰基团、辛基甘氨酸基团(G(Oct))、8-氨基辛酸基团或者Fmoc基团封端。在一个优选的实施方案中，环化可以通过形成二硫桥实现，例如参见SEQ ID NO.171。或者，沿着PYY类似物多肽可以有多个位点的化学改变。
优选的类似物和衍生物在本发明一个优选的方面，PYY类似物多肽包括上面描述的修饰的组合，即缺失、插入和取代的组合。
举例说明，优选的PYY类似物多肽可以包括N末端缺失，其组合了一个或者多个氨基酸取代。例如，优选的PYY类似物多肽包括PYY(3-36)，其具有一个或者多个下述的氨基酸取代Ala3，Leu3，Pro3，Ala4，Gly4，d-Ala4，高Lys4，Glu4，Ala5，Ala6，Val6，d-Ala7，Tyr7，His7，Ala8，Ala9，Ala10，Ala11，d-Ala12，Ala13，高Ser13，Ala14，Ala15，Gln15，Ala16，Ala17，Met17，Ala18，Ser18，正Val18，Ala19，N-Me-Ala19，Lys19，高Arg19，Ala20，Ala21，d-Ala22，Ala23，Ala24，Ala25，Lys25，高Arg25，Ala26，Ala27，Ala28，Ala29，Ala30，Ala31，Ala32，Ala33，Lys33，Ala34，Ala35，Ala36，His36，Trp36，N-Me-Tyr36，和Phe36。优选地，PYY类似物多肽包括一个、两个或者三个氨基酸取代。某些优选的PYY类似物多肽包括氨基酸缺失以及插入的组合。(例如参见SEQ ID NOS89-174)。
优选的PYY类似物多肽包括式(V)的多肽(SEQ ID NO350)Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Tyr Xaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31ThrArg Gln Arg Xaa36其中Xaa3是Ile，Ala，Pro，Ser，Thr，或者正缬氨酸；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Glu，Asp，d-Ala，高赖氨酸，或者高精氨酸；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala，Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，或者Ile；Xaa31是Ala或者Val；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，或者Trp；前提是所述多肽不是天然的PPF多肽。
正如本技术领域的熟练技术人员可以认识到的，式V的多肽可以是游离酸的形式，或者可以是C末端酰胺化的。
其它优选的PYY类似物多肽包括SEQ ID NOs31-87，93，95，96，110，114-116，118，120，124-129，131-132，137-141，146-156，158，160-164，167-168，170-171，174-217，221-222，225，228-229，231-239，242-245，247-249，251，255-258，260，264，266-286，和288-347。
式II到V的PYY类似物多肽也包括在本发明的范围内，其中所述的氨基酸残基被化学修饰或者衍生化(例如通过脂肪酸衍生化、PEG化、酰胺化、乙二醇化等等)。所述的氨基酸的D-氨基酸残基也预期在本发明的范围内。
在另一个实施方案中，优选的PYY类似物多肽包括具有内部缺失的式II到V的多肽，尤其在与C末端尾PPF基序不相应的区域内，正如此处所描述的。
含有非天然氨基酸的取代的优选的PYY类似物多肽包括PYY(3-36)，其中x和x+1位的氨基酸用选自模拟物A和模拟物B的β-转角模拟物取代，其中x选自8到14位(例如参见SEQ ID NOS211-217和231-237)。
本发明的PYY类似物多肽的优选衍生物包括聚合物缀合的PYY类似物多肽，其中PYY类似物多肽包括上面描述的插入、缺失、取代的任一种情况，或者其组合，聚合物分子在赖氨酸残基上缀合。
PYY类似物多肽的其它优选的衍生物包括PYY、PYY(3-36)或者PYY(4-36)，具有下述取代和改变[Lys4-脂肪酸链]PYY(3-36)；[Lys4-脂肪酸链]PYY(4-36)；[Ala2Lys19-脂肪酸链]PYY(3-36)；[Ile3-脂肪酸链]PYY(3-36)；[Ser13-OAc]PYY(3-36)(Oac是具有脂肪酸或者乙酰基的O-酰化)；[Ser23-OAc]PYY(3-36)；[Ile2-辛酰链]PYY(3-36)；[Lys19-辛酰链]PYY(3-36)；和[Lys19-硬酯酰链]PYY(3-36)。(例如参见SEQ IDNOS185-208)。
本发明PYY类似物多肽的进一步的实例提供在序列表中，在下面的实施例部分进行了讨论。
PPF嵌合多肽仍然在本发明的另一个方面，本发明的PPF多肽包括PPF嵌合多肽，其包括PP、PYY或者NPY多肽的一个片段，该片段共价连接到第二种PP、PYY或者NPY多肽的至少一个额外的片段上，其中每一个PP、PYY或NPY片段包括一个PPF基序。或者，本发明的PPF嵌合多肽可能包括连接到一个、两个、三个或者四个多肽片段上的PP家族多肽的一个片段，其中已连接多肽片段中的至少一个片段是第二个PP家族多肽的片段。在某些实施方案中，PPF多肽不包括具有C末端NPY片段的N末端PP片段。本发明的PPF嵌合多肽与天然PYY(3-36)的全长序列具有至少50％的序列同一性。在一个优选的实施方案中，本发明的这样的PPF嵌合多肽可能与天然PYY(3-36)的全长序列具有至少60％、65％、70％、80％或90％的序列同一性。本发明的这样的PPF嵌合多肽也可能与天然PP具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。仍然在另一个实施方案中，本发明的这样的PPF嵌合多肽可能与天然NPY具有至少50％、60％、65％、70％、80％或者90％的序列同一性。进一步，本发明的PPF嵌合多肽将优选地至少包括N-末端聚脯氨酸PPF基序和C-末端尾PPF基序。
而且，本发明的PPF多肽将通常保留，至少部分地保留，天然的人PP、PPY或NPY的生物活性。在一个优选的实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽将在代谢状况和紊乱的治疗和预防方面表现出生物活性。
多肽片段可以以本技术领域已知的任何方式共价连接在一起，包括但不限于，直接酰胺键或者化学接头基团。化学接头基团可以包括肽模拟物，其诱导或者稳定多肽构象。本发明的优选的PPF嵌合多肽包括PYY-PP、PYY-NPY、PP-PYY、PP-NPY、NPY-PP或者NPY-PYY嵌合体。
本发明的PPF嵌合多肽的长度可以是至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或者34个氨基酸。进一步，在一个优选的实施方案中，本发明的PYY类似物多肽仅仅包括天然L氨基酸残基和/或修饰的天然L氨基酸残基。或者，在一个优选的实施方案中，本发明的PYY类似物多肽不包括非天然的氨基酸残基。
进一步，正如上面所提及的，本发明的PPF嵌合多肽优选地不包括hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro34pNPY，hPP(19-23)-His34pNPY，rPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-Pro34pNPY，rPP(19-23)-His34pNPY，hPP(1-17)-His34pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-NPY(19-23)-His34hPP，hPP(1-17)-His34pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro34pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(19-23)-hPP，pNPY(19-23)-Gln34hPP，pNPY(19-23)-His34hPP，pNPY(19-23)-Phe6Gln34hPP，pNPY(19-23)-Phe6His34hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-Gln34hPP，cPP(20-23)-Pro34-pNPY，cPP(21-23)-Pro34-pNPY，cPP(22-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7)-Pro34-pNPY，cPP(20-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7，20-23)-Pro34-pNPY，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-His34hPP，cPP(1-7)-gPP(19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala31Aib32Gln34-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala31Aib32His34-hPP hPP(1-7)-Ala31Aib32-pNPY，hPP(1-17)-Ala31Aib32-pNPY，pNPY(1-7)-Ala31Aib32Gln34-hPP，或者pNPY(1-7，19-23)-Ala31Aib32Gln34-hPP。
在一个优选的实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽可以包括PP家族类似物多肽的片段。例如，PPF嵌合多肽可以包括此处描述的PPF类似物多肽，以及PP类似物多肽，和NPY类似物多肽。
优选的PYY类似物多肽是那些在此处描述的测定(优选地是食物摄取、胃排空、胰分泌或者体重降低测定)之一中具有效能的多肽，该效能等于或者大于相同测定中NPY、PYY或PYY(3-36)的效能。或者，与PP、NPY、PYY或PYY(3-36)相比，本发明的优选的PYY类似物多肽可以表现出改进的制造简易性、稳定性和/或易于制剂化。
优选地，关于营养物可利用性的降低、食物摄取的减少、体重增加的作用和/或代谢状况和紊乱的治疗和预防，本发明的PPF嵌合多肽保留至少大约25％，优选地大约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的天然的人PYY的生物活性。在另一个实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽表现出改进的PYY激动剂活性。优选地，关于营养物可利用性的降低、食物摄取的减少、体重增加的作用、和/或代谢状况和紊乱的治疗和预防，本发明的PPF嵌合多肽表现出天然的人PYY的至少大约110％、125％、130％、140％、150％、200％或更高的生物活性。
更特别地，一方面，PPF嵌合多肽优选地包括一个连接到PYY的片段上的PP的片段。在一个实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽包括在C末端连接到PYY或PYY类似物多肽的C末端片段上的PP或PP类似物多肽的N末端片段。在另一个实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽包括在C末端连接到PP或PP类似物多肽的C末端片段上的PYY、PYY(3-36)或PYY类似物多肽的N末端片段。
在另一个方面，PPF嵌合多肽优选地包括一个连接到NPY的片段上的PYY的片段。在一个实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽包括在C末端连接到NPY或NPY类似物多肽的C末端片段上的PYY、PYY(3-36)或PYY类似物多肽的N末端片段。在另一个实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽包括在C末端连接到PYY或PYY类似物多肽的C末端片段上的NPY或NPY类似物多肽的N末端片段。
仍然在另一个方面，PPF嵌合多肽优选地包括一个连接到NPY片段上的PP片段。在一个实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽包括在C末端连接到NPY或NPY类似物多肽的C末端片段上的PP或PP类似物多肽的N末端片段。在另一个实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽包括在C末端连接到PP或PP类似物多肽的C末端片段上的NPY或NPY类似物多肽的N末端片段。
PP、PP类似物多肽、PYY、PYY(3-36)、PYY类似物多肽、NPY或NPY类似物多肽的片段优选地是在任何位置包括PP、PP类似物多肽、PYY、PYY(3-36)、PYY类似物多肽、NPY或NPY类似物多肽的4到20个氨基酸残基的片段。在一个优选的实施方案中，对该片段的长度进行选择，以便获得长度为至少34个氨基酸的最终PPF嵌合多肽。
本发明的PPF嵌合多肽也可以包括进一步的修饰，包括但不限于，这样的PPF嵌合多肽的氨基酸序列的取代、缺失和插入，及其组合。在一个优选的方面，本发明的PPF嵌合多肽包括“非必需”氨基酸残基的一个或多个修饰。在本发明的上下文中，“非必需”氨基酸残基是在该片段的天然的人氨基酸序列中可以被改变，即可以被缺失或取代的残基，例如PP家族多肽片段，不会破坏或者显著降低PPF嵌合多肽的PYY激动剂活性。
本发明也涉及PPF嵌合多肽的衍生物。这样的衍生物包括缀合到一个或多个水溶性聚合物分子，如聚乙二醇(“PEG”)或者各种长度的脂肪酸链(例如硬酯酰基、棕榈酰基、辛酰基、油酰基等等)上的PPF嵌合多肽，或者通过加入聚氨基酸，如聚组氨酸、聚精氨酸、聚-赖氨酸和聚丙氨酸得到的衍生物。对PPF嵌合多肽的修饰也可以包括小分子取代基，如短烷基和约束烷基(例如支链的、环状、融合的金刚烷基)和芳族基团。水溶性聚合物分子的分子量将优选地为大约500到大约20,000道尔顿。
这样的聚合物-缀合和小分子取代基修饰可以单一地在PPF嵌合多肽的序列内，在氨基酸残基的N或C末端或者侧链上发生。或者，沿着PPF嵌合多肽可以有多个位点的衍生化。用赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸取代一个或者多个氨基酸可以提供其它衍生化位点。例如参见美国专利5,824,784和5,824,778。优选地，PPF嵌合多肽可以缀合到一个、两个或三个聚合物分子上。
水溶性聚合物分子优选地连接于氨基、羧基或者硫羟基，并且可以连接于N或C末端，或连接于赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的侧链。或者，水溶性聚合物分子可以用二胺和二羧酸基团连接。在一个优选的实施方案中，本发明的PPF嵌合多肽通过赖氨酸上的ε氨基基团缀合到一个、两个或三个PEG分子上。
本发明的PPF嵌合多肽衍生物也包括具有一个或多个氨基酸残基的化学改变的PPF嵌合多肽。这样的化学改变包括酰胺化、糖基化、酰化、硫酸盐化、磷酸化、乙酰化和环化。化学改变可以单一地在PPF嵌合多肽的序列内，在氨基酸残基的N或C末端或者其侧链上发生。在一个实施方案中，这些肽的C末端可以具有一个游离的-OH或-NH2基团。在另一个实施方案中，N末端可以用异丁基氧羰基基团、异丙基氧羰基基团、正丁基氧羰基基团、乙氧基羰基基团、异己酰基(isocap)、辛酰基基团、辛基甘氨酸(G(Oct))或者8-氨基辛酸基团封端。在一个优选的实施方案中，环化可以通过二硫桥的形成来实现。或者，沿着PYY类似物多肽可以有多个位点的化学改变。
在一个优选的方面，PPF嵌合多肽包括那些具有SEQ ID NOs.238-347的氨基酸序列的多肽。
本发明的PPF嵌合多肽的实例提供在序列表中，并且在下面的实施例部分进行了讨论。
PPF多肽在代谢状况或紊乱的治疗或预防中的用途通常已经承认，内源NPY(综述在Schwartz等人，Nature 404661-71(2000))和PYY(Morley等人，Brain Res.341200-3(1985)中)，通过它们的受体，增加了进食行为。针对肥胖症的治疗的方法一直在尝试拮抗Y受体，而用于治疗厌食的方法针对该配体家族的激动剂。然而，正如在共同未决的美国专利申请20020141985中描述和要求保护的，已经惊人的发现PYY类似物多肽的外周施用对于降低营养物可利用性具有强效(也参见Batterham等人，Nature 418650-4，2002；WO03/026591；和WO 03/057235)，而不是正如专利和科学文献中的报导所建议的增加了营养物可利用性(例如参见美国专利5,912,227和6,315,203，其公开了PYY受体激动剂增加体重的用途)。抑制食物摄取、减缓胃排空、抑制胃酸分泌、和抑制胰酶分泌的作用范围可以用于在代谢疾病中发挥临床作用，如1型、2型或者妊娠糖尿病，肥胖症和胰岛素抵抗综合征(综合征X)的其它表现，以及可以在用于降低营养物可利用性的任何其它用途中发挥临床作用。
因此，在本方发明的另一个方面，提供了治疗或者预防肥胖症的方法，其中该方法包括给有需要的对象施用治疗上或者预防上有效量的PPF多肽。在一个优选的实施方案中，对象是肥胖或者超重对象。而“肥胖症”通常被定义为体重指数超过30，对于本公开内容的目的，任何对象，包括需要或者希望降低体重的那些体重指数低于30的对象，也包括在“肥胖”的范围内。对胰岛素有抗性、葡萄糖不耐受或者具有任何类型的糖尿病(例如1型、2型或者妊娠糖尿病)的对象可以从该方法受益。
在本发明的其它方面，提供了减少食物摄取、降低营养物可利用性、引起体重减轻、影响身体组成并且改变身体能量含量或者增加能量消耗、治疗糖尿病、并且改善脂质分布(包括降低LDL胆固醇和三甘油酯水平和/或改变HDL胆固醇水平)的方法，其中这些方法包括给对象施用有效量的本发明的PPE多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的方法被用于治疗或者预防可以通过降低需要对象的营养物可利用性来减轻的状况或者紊乱，这些方法包括给对象施用治疗上或者预防上有效量的本发明的PPE多肽。这样的状况和紊乱包括，但不限于，高血压、脂质异常血症、心血管疾病、进食紊乱、胰岛素抵抗、肥胖症和任何类型的糖尿病。
不受理论的限制，认为外周施用的本发明的PPF多肽在减少食物摄取、延迟胃排空、降低营养物可利用性和导致体重减轻方面的效果，是通过与PP家族中一种或者多种独特的受体类型或类似于PP家族中一种或者多种独特的受体类型的相互作用而确定的。更特别地，似乎涉及与PPY-优选(或者Y7)受体类似的一个受体或者多个受体。
用于本发明的其它测定包括可以确定PPF化合物对身体组成的影响的那些测定。实例的测定可以涉及利用代谢疾病的饮食诱导的肥胖(DIO)的小鼠动物模型。在治疗期之前，从4周龄开始，给雄性C57BL/6J小鼠喂饲高脂肪饮食(#D12331，来自脂肪的卡路里是58％；ResearchDiets，Inc.)，给予6周时间。在研究期间，小鼠可以持续食用它们的高脂肪食物。在整个研究期间，可以随意地提供水。一组类似年龄的非肥胖小鼠被喂饲低脂肪食物(#D12329，来自脂肪的卡路里是11％)，目的在于与DIO组进行代谢参数的比较。
DIO小鼠被皮下(SC)植入肩胛内渗透泵，以便送递赋形剂(溶解在水中的50％二甲亚砜[DMSO])n＝20，或者送递本发明的化合物n＝12。后一组的泵被设置送递任意量的本发明的化合物，例如1000μg/kg/d，送递7天。
研究期间可以以规律的时间间隔测量体重和食物摄取。呼吸商(RQ，定义为CO2产生量÷O2消耗量)和代谢率可以使用整个动物的间接热量测定法(Oxymax，Columbus Instruments，Columbus，OH)来确定。小鼠可以通过过量异氟烷麻醉，并且测量肥胖指数(两侧附睾脂肪垫重量)。而且，在确定附睾重量之前，可以使用双能X射线吸收测量仪(DEXA)，根据制造商的说明书(Lunar Piximus，GEImaging System)，分析每一小鼠的身体组成(瘦肉量(lean mass)，脂肪量)。在本发明的方法中，本发明的优选的PPF多肽是那些在此处描述的测定法(优选地是食物摄取、胃排空、胰分泌、体重减轻或者身体组成测定法)之一中具有效能的多肽，该效能大于相同测定法中PP、NPY、PYY或PYY(3-36)的效能。
除了由于食物摄取减少、体重减轻或者肥胖症治疗可以导致需要对象的高血压有所改善，如此处在实施例4中的描述，本发明的化合物可以被用于治疗高血压。
本发明的化合物也可以用于加强、诱导、增强或者恢复胰岛或者细胞中的葡萄糖反应性。这些作用对于治疗或者预防与代谢紊乱有关的疾病有用，如上面描述的和美国专利US20040228846中描述的代谢疾病。用于确定这样的活性的测定法在本技术领域是已知的。例如，在已公开的美国专利US20040228846(被完整地引入于此作为参考)中，这些测定法被描述用于胰岛分离和培养，以及确定胎儿胰岛成熟。在专利申请US20040228846的实施例中，肠源激素肽，包括胰多肽(PP)、神经肽Y(NPY)、神经肽K(NPK)、PYY、促胰液素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和铃蟾肽是从Sigma购买的。XI型胶原酶是从Sigma获得的。RPMI 1640培养基和胎牛血清是从Gibco获得的。含有抗胰岛素抗体的放射性免疫测定试剂盒([125I]-RIA试剂盒)是从Linco，St Louis购买的。
产后大鼠胰岛是从P-02岁大鼠获得的。成年大鼠胰岛是从6-8周龄的大鼠获得的。胎鼠胰岛如下获得。将怀孕的雌性大鼠在怀孕第21天(e21)处死。从子宫中取出胎鼠。从每个幼仔解剖出10-14个胰腺，在Hanks缓冲液中洗涤两次。合并胰腺，悬浮在6ml的1mg/ml胶原酶(Type XI，Sigma)中，于37℃温育8-10分钟，温育的同时不断地振荡。通过加入10体积冰冷的Hanks缓冲液来终止消化，随后用Hanks缓冲液洗涤三次。然后通过Ficoll梯度离心纯化胰岛，在加入或者不加入1μM IBMX的10％胎牛血清(FBS)/RPMI培养基中培养。在5天的最后时间，将20个胰岛手工拣入每个管子中，测定静态胰岛素释放。通常，首先用KRP缓冲液洗涤胰岛，然后用1ml含有3mM(低)葡萄糖的KRP缓冲液于37℃温育30分钟。在收集上清后，用17mM(高)葡萄糖将胰岛于37℃温育1小时。通过放射性免疫测定(RIA)，使用[125I]-RIA试剂盒来测定从低或者高葡萄糖刺激释放的胰岛素。在存在200ng/ml PYY、PP、CCK、NPK、NPY、促胰液素、GLP-1或者铃蟾肽的情况下，将E21胎胰岛培养5天。
也提供了一种例证性的体内测定方法，其中使用Zucker糖尿病肥胖型(ZDF)雄性大鼠，即一种近交(＞F30代)大鼠模型，该模型在给予标准啮齿食物Purina 5008的所有fa/fa雄性中自发地表现出糖尿病。在ZDF fa-fa雄性中，高血糖症在大约7周龄时开始发展，到10-11周龄时，葡萄糖水平(餐后)通常达到500mg/DL。在糖尿病发展的过程中，胰岛素水平(餐后)较高。然而，到19周龄时，胰岛素下降到大约瘦对照同窝幼仔(lean control litter mates)的水平。肥胖大鼠的甘油三酸酯和胆固醇水平通常高于瘦大鼠的甘油三酸酯和胆固醇水平。在测定中，三组7周龄的ZDF大鼠，每组有6只大鼠，接受ALZA泵的输注治疗14天1)赋形剂对照，2)和3)，两种不同剂量的PYY，分别是100pmol/kg/hr和500pmol/kg/hr。在输注之前和之后第7天和第14天，获得四个参数1)血浆葡萄糖水平，2)血浆胰岛素水平，和3)血浆甘油三酸酯(TG)水平，以及口服葡萄糖耐受(OGTT)试验。因此，这些测定法可以与本发明的化合物使用，以测试期望的活性。
对于PPF多肽能预期到的其它用途包括降低中枢神经系统中的铝(Al)浓度的方法(参见美国专利6,734,166，完整地引入此处作为参考)，用于治疗、预防或者延迟阿尔茨海默病的发作。确定对铝的影响的测定法在本技术领域是已知的，可以在美国专利6,734,166中发现，其中使用了二倍体和Ts小鼠。这些小鼠在Nalgene牌代谢或者聚丙烯笼中单独饲养，在实验之前给予3天时间来适应笼子。在实验过程中，除了安乐死之前的16个小时不提供食物之外，小鼠可以随意获得食物(LabDietNIH Rat和Moust/Auto 6F5K52，St.Louis，Mo.)和水。每日给小鼠皮下注射活性化合物或者盐水。在13天的一轮实验和3天的另一轮实验结束时，处死这些小鼠，收集样品。在清洁的聚四氟乙烯衬垫上称取小鼠脑样品的重量，准备用于通过微波消化在低微量元素级硝酸中进行的分析。然后使用感应耦合等离子体质谱法分析样品的铝含量(Nuttall等人，Annals of Clinical and Laboratory Science 25，3，264-271(1995))。分析过程中所有的组织处理在清洁的室内环境中进行，使用HEPA空气过滤系统，以最小化背景污染。
本发明的化合物表现出很广范围的生物活性，一些活性与它们的抗分泌和抗迁移特性有关。这些化合物通过与上皮细胞直接相互作用，或者可能地，通过抑制刺激肠分泌的激素或者神经递质的分泌，来抑制胃肠分泌。抗分泌特性包括抑制胃分泌和/或胰腺分泌的抑制，在包括胃炎、胰腺炎、巴雷特(Barrett’s)食道和胃食道反流性疾病的疾病和病症的治疗或预防中有用。
本发明的化合物在任意数量的胃肠病症(例如Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，McGraw-Hill Inco，New York，12thEd.)的治疗中有用，这些病症与肠电解质和水分分泌过量以及吸收降低有关，例如感染性腹泻、炎症性腹泻、短肠综合征、或者通常在外科手术例如回肠造口术之后发生的腹泻。感染性腹泻的实例包括，但不限于，急性病毒性腹泻、急性细菌性腹泻(例如沙门氏菌、弯曲杆菌和梭状芽孢杆菌或者由于原生动物感染)、或者旅行者腹泻(例如诺瓦克病毒或者轮状病毒)。炎症性腹泻的实例包括，但不限于，吸收不良综合征、热带口炎性腹泻、慢性胰腺炎、克隆氏病疾病、痢疾和肠易激综合征。也已经发现，本发明的肽可以被用于治疗涉及胃肠病症，例如，在手术后或者由于霍乱导致的紧急状况或者威胁生命的状况。
本发明的化合物也可以用于治疗或者预防肠损伤，而不是仅仅治疗与肠损伤(例如腹泻)相关的症状。这样的肠损伤可以是溃疡性结肠炎、炎性肠病、肠萎缩、肠粘膜损失和/或肠粘膜功能损失，或者由溃疡性结肠炎、炎性肠病、肠萎缩、肠粘膜损失和/或肠粘膜功能损失导致(参见WO 03/105763，将其完整地引入于此作为参考)。针对这样的活性的测定法，正如在WO 03/105763中描述的，包括11周龄雄性HSD大鼠，在250-300克之间，以12∶12光暗循环饲养，允许随意地食用标准的啮齿动物食物(Teklad LM 485，Madison，WI)和水。在实验之前让这些动物禁食24小时。Morris GP等人以前已经描述了慢性结肠炎症的一个简单并且可重复的大鼠模型，″Hapten-inducedmodel of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.″Gastroenterology.1989；96795-803。其表现出相对长的炎症和溃疡时间，为以特定对照方式研究慢性炎症性疾病的病理生理学提供了一个机会，以及为评价潜在地可用于人类炎性肠病的新的治疗提供了一个机会。
用3％异氟烷麻醉大鼠，将其放置到设置在37℃的一个可调型电热垫上。将灌饲针(gavage needle)通过直肠插入结肠7cm。将溶解在50％乙醇(v/v)中的半抗原三硝基苯磺酸(TNBS)通过灌饲针以30mg/kg的剂量送递到结肠腔中，总体积为00.4-0.6mL，正如Mazelin等人，″Protective role of vagal afferents in experimentally-inducedcolitis in rats.″Juton Nerv Syst.1998；733845中描述的。对照组通过结肠内接受盐水溶液(NaCl 0.9％)。
在结肠炎诱导后4天，切除麻醉大鼠的结肠，然后通过断头法施以安乐死。测量所切除的大肠和脾的重量，为结肠照像，以便计算总体外形损伤。炎症被定义为充血和肠壁增厚的区域。
本发明的化合物也被用于治疗或者预防胰腺肿瘤(例如抑制胰腺肿瘤的增生)。本发明的方法包括减少肿瘤细胞的增生。可以根据本发明来治疗的良性胰腺肿瘤细胞的类型包括浆液囊腺瘤、微囊性瘤和实体-囊性瘤(solid-cystic tumors)。该方法在降低恶性胰腺肿瘤细胞，如腺管、腺泡或胰岛产生的癌的增殖方面也有效。美国专利5,574,010(其完整地引入于此作为参考)提供了用于检测抗增殖特性的实验测定方法。例如，‘010专利提供了PANC-1和MiaPaCa-2是两种人胰腺癌细胞系，它们可以从供应商如美国典型培养物保藏中心，ATCC(Rockville，Md.)商购获得。将这两个肿瘤细胞系在RPMI-1640培养基中培养，该培养基补加了10％胎牛血清、29.2mg/L谷氨酰胺、25mu.g庆大霉素、5ml青霉素、链霉素和两性霉素B溶液(JRHBiosciences，Lenexa，Kans.)，培养温度为37摄氏度，在用NAPCO水夹套的5％CO2培养箱中进行。当得到汇合的单层肿瘤细胞时，将所有细胞系用0.25％胰蛋白酶(Clonetics，San Diego，Calif.)每周消化分离1到2次。将细胞以500g在冷冻离心机中于4摄氏度离心7分钟，并且重悬于不含胰蛋白酶的加强的RPMI 1640培养基中。在血球计数板上用台盼蓝对活细胞计数。
将每种类型的10,000、20,000、40,000和80,000个细胞加入到96孔微型培养板上(Costar，Cambridge，Mass.)，每孔培养基的总体积为200ul。在加入PYY或者测试肽之前，允许细胞贴壁24小时。在加入肽之前，更换为新鲜培养基。用PYY或者测试化合物进行的胰腺肿瘤细胞的体外温育持续6小时到36小时。将PYY以每孔250pmol、25pmol和2.5pmol(N＝14)的剂量加入到细胞中。测试化合物以每孔400pmol、40pmol和4pmol的剂量加入到细胞培养基中。对照孔接受2ul的0.9％盐水，以便在贴壁的肿瘤细胞上模拟体积和物理干扰。每一个96孔板合有18个对照孔，以便允许在实验期间在每一平板内进行比较。用不同浓度的PYY和测试化合物在PANC-1和MiaPaCa-2细胞中在九十六(96)孔平板上重复6次。
在温育结束的时候，将3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑，MTT溴化四唑(Sigma，St.Louis，Mo.)以0.5mg/ml加入到新鲜的培养基中。更换培养基，用含MTT溴化四唑的培养基于37摄氏度将肿瘤细胞温育4小时。在温育结束时，吸出培养基。将甲 结晶沉淀物溶解在200ul的二甲亚砜(Sigma，St.Louis，Mo.)中。通过ELISA读数器(Molecular Devices，Menlo Park，Calif.)上500nm波长处的吸光度读数来定量溶解的甲 。MTT测定法测量线粒体的NADH依赖性脱氢酶活性，并且该方法是体外定量测定肿瘤细胞化疗反应最敏感和可靠的方法之一。(Alley，M.C.，Scudiero，D.A.，Monk，A.，Hursey，M.L.，Dzerwinski，M.J.，Fine，D.L.，Abbott，B.J.，Mayo，J.G.，Shoemaker，R.H.and Boyd，M.R.，Feasibility of drug screening withpanels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assayCancer Res.，48589-601，1988；Carmichael，J.，DeGraff，W.G.，Gazdar，A.F.，Minna，J.D.and Mitchell，J.B.，Evaluation of a tetrazolium-basedsemiautomated colorimetric assayAssessment of chemosensitivitytesting.Cancer Res.，47936-942，1987；McHale，A.P.，McHale，L.，Useof a tetrazolium based colorimetric assay in assessing photoradiationtherapy in vitro.Cancer Lett.，41315-321，1988；and Saxton，R.E.，Huang，M.Z.，Plante D.，Fetterman，H.F.，Lufkin，R.B.，Soudant，J.，Castro，D.J.，Laser and daunomycin chemophototherapy of humancarcinoma cells.J.Clin.Laser Med.and Surg.，10(5)331-336，1992.)通过对相同测试条件的孔分组以及对对照组和各种不同浓度肽处理的试验组之间的差异进行一元方差分析来分析550nm处的吸光度读数。
也提供了一种例证性的体内测定法。通过肽YY和测试化合物检测人胰管腺癌Mia Paca-2的体内生长抑制。将70,000到100,000个人MiaPaCa-2细胞原位移植到48只雄性裸鼠体内。1周后，用PYY或者测试化合物以200pmol/kg/hr通过微渗透压泵将动物处理4周。配对的培养物接受盐水。在处死后，测量肿瘤大小和重量。组织切片显示，对照组小鼠具有显著的胰腺内人癌生长。在9周时，百分之九十(90％)的对照组小鼠具有显著的肿瘤转移。肿瘤重量在所测试被处理小鼠中减少了60.5％，在PYY处理小鼠中减少了27％。
对于所有适应症，在优选的实施方案中，将本发明的PPF多肽以每天大约0.5μg到大约5mg的剂量外周施用，以单次或者分次或者控制的连续释放，或者以每剂大约0.01μg/kg到大约500μg/kg，更优选地大约0.05μg/kg到大约250μg/kg，最优选地低于大约50μg/kg。这些范围内的剂量将随着每种类似物或衍生物的效能而改变，当然，可以由本技术领域的熟练技术人员来确定。
在本发明的方法中，本发明的PPF多肽可以单独地或者与一种或多种其它化合物和组合物一起施用，所述其它化合物和组合物表现出长期或者短期的降低营养物可利用性的作用，包括，但不限于含有支链淀粉或支链淀粉类似物激动剂、鲑鱼降钙素、缩胆囊素(CCK)或CCK激动剂、瘦蛋白(OB蛋白质)或瘦蛋白激动剂、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物激动剂、或者GLP-1或GLP-1类似物激动剂的其它化合物和组合物。合适的支链淀粉激动剂包括，例如[25，28，29Pro-]人支链淀粉(也已知为“普兰林肽”，并且描述在美国专利5,686,511和5,998,367中)。所用的CCK优选地是CCK八肽(CCK-8)。瘦蛋白已经被讨论，例如(Pelleymounter等人，Science 269540-3(1995)；Halaas等人，Science 269543-6(1995)；Campfield等人，Science 269546-9(1995))。合适的毒蜥外泌肽包括毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4，以及毒蜥外泌肽激动剂化合物，包括，例如PCT公开WO 99/07404，WO 99/25727和WO 99/25728中的那些。
多肽的制备和纯化此处描述的PPF多肽可以使用本技术领域已知的标准重组技术或化学肽合成技术来制备，例如使用自动化或半自动化肽合成仪，或者两者都使用。
本发明的PPF多肽可以在溶液或者固体载体中根据传统技术来合成。多种自动合成仪可通过商购获得，并且可以根据已知步骤使用。例如参见Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2d.ed.，PierceChemical Co.(1984)；Tam等人，J.Am.Chem.Soc.1056442(1983)；Merrifield，Science 232341-7(1986)；and Barany and Merrifield，ThePeptides，Gross and Meienhofer，eds.，Academic Press，New York，1-284(1979)。固相肽合成可以用自动多肽合成仪进行(例如Model 430A，Applied Biosystems Inc.，Foster City，California)，使用NMP/HOBt(选择1)系统，和封端的tBoc或者Fmoc化学(参见Applied BiosystemsUser’s Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer，Version 1.3B July1，1988，section 6，pp.49-70，Applied Biosystems，Inc.，Foster City，California)。肽也可以使用Advanced ChemTech多肽合成仪(型号MPS 350，Louisville，Kentucky)组装。肽也可以通过RP-HPLC(制备用和分析用)纯化，使用，例如Waters Delta Prep 3000系统和C4、C8或者C18制备柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia，California)。活性蛋白质易于合成，然后在用于鉴别反应肽的筛选试验中筛选。
本发明的PPF多肽可以替代地通过本技术领域熟知的重组技术制备。例如参见Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor(1989)。通过重组技术产生的这些PYY类似物多肽可以从多核苷酸表达。本技术领域的技术人员很容易理解，多核苷酸，包括DNA和RNA，其编码这样的被编码的PYY类似物多肽，可以从野生型PYY cDNA获得，并考虑到密码子选择的简并性。这些多核苷酸序列可以整合密码子，以便有助于微生物宿主内mRNA的转录和翻译。这样的操作序列可以容易地根据本技术领域熟知的方法构建，例如参见WO 83/04053。上面的多核苷酸也可以任选地编码N-末端甲硫氨酰残基。在本发明中有用的非肽化合物可以通过本技术领域已知的方法制备。例如，含有磷酸的氨基酸和含有这样的氨基酸的肽可以使用本技术领域已知的方法制备。例如参见Bartlett and Landen，Bioorg.Chem.14356-77(1986)。
多种表达载体/宿主系统可以使用，以包括并表达PPF多肽编码序列。这些包括但不限于微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染或者用细菌表达载体(例如Ti或者pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统。可用于重组蛋白质制备的哺乳动物细胞包括但不限于，VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、WI 38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。下面描述了蛋白质重组表达的例证性步骤。
同样地，本发明提供的多核苷酸序列可用于产生新的和有用的病毒和质粒DNA载体、新的和有用的转化的和转染的原核和真核宿主细胞(包括在培养物中生长的细菌、酵母和哺乳动物细胞)、以及新的和有用的能表达本发明的PPF多肽的宿主细胞的培养生长的方法。编码此处的PPF多肽的多核苷酸序列可用于基因治疗中，包括缓解PP、PYY或者NPY的生产不足，或者提高PP、PYY或者NPY的水平。
本发明也提供了用于本发明的PPF多肽的重组DNA生产的方法。提供了一种通过含编码这样的PPF多肽的核酸的宿主细胞表达PPF多肽的方法，该方法包括(a)在有利于这样的DNA分子表达的条件下，培养含有编码这样的PPF多肽的所述宿主细胞；和(b)获得这样的PPF多肽。
宿主细胞可以是原核或者真核的，并且包括细菌、哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴细胞、幼仓鼠肾细胞、癌细胞或者其它细胞)、酵母细胞和昆虫细胞。
用于表达重组蛋白质的哺乳动物宿主系统对于本技术领域的熟练技术人员也是熟知的。宿主细胞株可以针对可加工已表达蛋白质或者可进行某些对蛋白活性有用的翻译后修饰的特定能力进行选择。这样的多肽修饰包括，但不限于，乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。翻译后加工，其切割蛋白质“前原(prepro)”形式，对于正确的插入、折叠和/或功能也是重要的。不同的宿主细胞，如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38及其类似细胞，具有针对这样的翻译后活性的特定细胞机制和特征机理，也可以被选择以确保被引入的外源蛋白质的正确修饰和加工。
或者，酵母系统可以被用于制备本发明的PPF多肽。PPF多肽cDNA的编码区通过PCR扩增。编码酵母前-原-α前导序列的DNA在PCR反应中从酵母基因组DNA扩增，扩增中使用一个含有α交配因子基因的核苷酸1-20的引物，和另一个与该基因的核苷酸255-235互补的引物(Kurjan and Herskowitz，Cell，30933-43(1982))。前-原-α前导编码序列和PPF多肽编码序列片段被连接到含有酵母乙醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中，这样，启动子指导融合蛋白的表达，所述融合蛋白由与成熟PPF多肽融合的前-原-α因子组成。正如Rose和Broach在Meth.Enz.185234-79，Goeddel ed.，Academic Press，Inc.，San Diego，California(1990)中所指出的，该载体进一步包括克隆位点下游的ADH2转录终止子，酵母“2微米”复制起点，酵母leu-2d基因，酵母REP1和REP2基因，大肠杆菌β-内酰胺酶基因，和大肠杆菌复制起点。β-内酰胺酶和leu-2d基因分别用于在细菌和酵母中提供选择。leu-2d基因也有助于增加酵母中质粒的拷贝数，以诱导更高的表达水平。REP1和REP2基因编码调节质粒拷贝数的蛋白质。
在先前的段落中所描述的DNA构建体使用已知方法，例如乙酸锂处理(Steams等人，Meth.Enz.185280-97(1990))转化到酵母细胞中。一旦生长培养基中的葡萄糖被消耗，就诱导ADH2启动子(Price等人，Gene 55287(1987))。前-原-α序列影响细胞中融合蛋白的分泌。伴随地，酵母KEX2蛋白质从成熟的PYY类似物多肽切割前-原序列(Bitter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815330-4(1984))。
本发明的PPF多肽也可以使用商品化的表达系统根据制造商的说明书进行重组表达，例如Pichia表达系统(Invitrogen，San Diego，California)。该系统也依赖于前-原-α序列来指导分泌，但一旦通过甲醇诱导，插入片段的转录就可以通过醇氧化酶(AOX1)启动子驱动。所分泌的PPF多肽从酵母生长培养基纯化，例如通过用于从细菌和哺乳动物细胞上清液纯化PPF多肽的方法。
或者，编码PYY类似物多肽的cDNA可以被克隆到杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen，San Diego，California)中。然后根据制造商的说明书(PharMingen)使用含有该PPF多肽的载体，以感染不含sF9蛋白质的培养基中的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，并且产生重组蛋白质。使用肝素-琼脂糖柱(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)和顺序分子分级柱(Amicon，Beverly，Massachusetts)从培养基中分离并浓缩该蛋白质，并且重悬在PBS中。SDS-PAGE分析显示了单一条带，并且确认了该蛋白质的大小，在Proton 2090肽测序仪(Peptide Sequencer)上通过Edman测序法确认了其N末端序列。
例如，编码预测的成熟PYY类似物多肽的DNA序列可以被克隆到含有需要的启动子和任选的前导序列(例如参见Better等人，Science2401041-3(1988))的质粒中。该构建的序列可以通过自动化测序确认。然后，使用标准的CaCl2共孵育和热激法处理细菌(Sambrook等人，见上文)，该质粒被转化到大肠杆菌菌株MC1061中。转化的细菌在添加羧苄青霉素的LB培养基中培养，并且通过在合适的培养基中生长，诱导表达的蛋白质的产生。如果存在，前导序列将影响成熟PYY类似物多肽的分泌，并且在分泌过程中被切除。所分泌的重组蛋白质通过下面描述的方法从细菌培养基纯化。
或者，本发明的PPF多肽可以在昆虫系统中表达。用于蛋白质表达的昆虫系统对本技术领域的技术人员是熟知的。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)被用作载体，在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中或者粉纹夜蛾幼虫(Trichoplusialarvae)中表达外源基因。编码PPF多肽的序列被克隆到病毒的非必需区域中，如多角体蛋白基因，并且置于多角体蛋白启动子的控制下。PYY类似物多肽的成功插入将使多角体蛋白基因失活，并且产生缺乏衣壳蛋白的重组病毒。然后重组病毒被用于感染草地夜蛾细胞或者粉纹夜蛾幼虫，其中PYY类似物多肽被表达(Smith等人，J.Virol.46584(1983)；Engelhard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913224-7(1994))。
在另一个实例中，编码PPF多肽的DNA序列可以通过PCR扩增，并且克隆到适当的载体中，例如，pGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)。pGEX载体被设计以产生融合蛋白，该融合蛋白包括由该载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)以及由插入到载体的克隆位点上的DNA片段编码的蛋白。用于PCR的引物可以包括，例如适当的切割位点。然后重组的融合蛋白从融合蛋白的GST部分切割。pGEX-3X/PYY类似物多肽构建体被转化到大肠杆菌XL-1Blue细胞(Stratagene，La Jolla，California)中，分离各个转化体，并且于37℃在LB培养基(添加羧苄青霉素)中生长，至波长600nm处的光密度为0.4，随后在存在0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)的情况下进一步温育4小时。纯化来自各个转化体的质粒DNA，使用自动化测序仪部分地测序，以确认期望的PPF多肽基因以正确的方向插入质粒DNA。
预期在细菌中形成不可溶的包含体的融合蛋白可以如下纯化。离心收集细胞；在0.15M NaCl，10mM Tris，pH 8，1mM EDTA中洗涤；用0.1mg/mL溶菌酶(Sigma Chemical Co.)在室温下处理15分钟。溶菌液通过超声波降解法清除，细胞碎片以12,000xg离心10分钟沉淀。将含有融合蛋白的团状沉淀重悬在50mM Tris，pH 8，和10mM EDTA中，在50％甘油上分层，以6000xg离心30分钟。将团状沉淀重悬在不含Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲液(PBS)中。融合蛋白通过在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶(Sambrook等人，supra)中分级分离重悬的团状沉淀而进一步纯化。将凝胶浸入0.4M KCl中，以便使蛋白质显现，切除该蛋白质，并且在无SDS的凝胶电泳缓冲液中电洗脱。如果GST/PYY类似物多肽融合蛋白在细菌中以可溶的蛋白质产生，那么其可以使用GST纯化组件(Module)(Pharmacia Biotech)纯化。
融合蛋白可以进行消化以便从成熟的PYY类似物多肽切割GST。消化反应(20-40μg融合蛋白，20-30单位人凝血酶(4000U/mg，在0.5mL PBS中(Sigma))在室温下温育16-48小时，上样到变性SDS-PAGE凝胶上，以便分级分离反应产物。将凝胶浸入0.4M KCl以使蛋白质条带显现。与预期的PYY类似物多肽分子量相应的蛋白质条带的鉴别可以使用自动化测序仪(Applied Biosystems Model 473A，Foster City，California)通过部分氨基酸序列分析来确定。
在本发明的PPF多肽的重组表达的特别优选的方法中，可以用在pCMV载体(5’CMV启动子，3’HGH poly A序列)中含有PYY类似物多肽cDNA的质粒和含有pSV2neo(含有neo抗性基因)的质粒，通过磷酸钙方法，共转染293细胞。优选地，这些载体应该使用ScaI在转染之前线性化。类似地，通过类似pCMV载体构建的序列可替代地被使用，该类似的pCMV载体整合了neo基因。通过在含有0.5mg/mLG418(新霉素样抗生素)的生长培养基中有限稀释10-14天，从单细胞克隆中选择稳定的细胞系。通过ELISA或Western印迹法筛选表达PYY类似物多肽的细胞系，高表达细胞系被扩充以进行大规模生长。
优选地，已转化细胞被用于长期、高产率的蛋白生产，同样地，稳定表达是期望的。一旦这样的细胞用含有选择标记的载体以及期望的表达盒转化，在细胞被转换到选择性培养基之前，允许在富集培养基中生长1-2天。选择标记被设计以便赋予选择抗性，其存在允许成功表达被引入序列的细胞的生长和回收。稳定转化的细胞的抗性细胞簇可以通过适合于细胞的组织培养技术来增殖。
大量选择系统可以用于回收已经被转化用于表达重组蛋白质的细胞。这样的选择系统包括，但不限于，HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因，分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中。而且，抗代谢物抗性可以被用作选择的基础dhfr，赋予抗氨甲蝶呤抗性；gpt，赋予抗霉酚酸抗性；neo，赋予抗氨基糖苷抗性，G418，赋予抗chlorsulfuron抗性，和hygro，赋予抗潮霉素抗性。可能有用的其它可选择基因包括trpB，其允许细胞使用吲哚来代替色氨酸，或者hisD，其允许细胞使用histinol来代替组氨酸。对于转化体的鉴别给出直观指示的标记物包括花色素苷、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物、GUS和荧光素酶及其底物萤光素。
本发明的许多PPF多肽可以使用自动化肽合成以及重组技术的组合来产生。例如，本发明的PPF多肽可以含有包括通过聚乙二醇化进行的缺失、取代和插入的许多修饰。这样的PPF多肽可以分阶段产生。在第一阶段，含有缺失、取代、插入及其任意组合的修饰的中间产物PPF多肽可以通过所描述的重组技术产生。然后在下面描述的任选的纯化步骤后，中间产物PPF多肽通过用适当的PEG化试剂的化学修饰PEG化(例如来自NeKtar Therapeutics，San Carlos，California)，以产生目标PPF多肽。本技术领域的技术人员将意识到，上面描述的方法可以被推广用于含有选自缺失、取代、插入、衍生的各种修饰的组合的PPF多肽，以及本技术领域熟知的和本发明所预期到的其它修饰方法。
可能需要纯化本发明所产生的PPF多肽。肽纯化技术对于本技术领域的技术人员是熟知的。这些技术涉及，在一个水平上，细胞内容物(cellular milieu)粗分级分离为多肽和非多肽组分。从其它蛋白质分离出多肽后，感兴趣的多肽可以进一步使用色谱和电泳技术来纯化，以便获得部分或者完全的纯化(或者纯化到均质)。特别适合于制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。纯化肽的一个特别有效的方法是反相HPLC，随后通过液相色谱/质谱分析法(LC/MS)和基质辅助的激光解吸附电离(MALDI)质谱技术表征纯化的产物。纯度的另一种确认通过确定氨基酸分析来获得。
本发明的某些方面涉及编码的蛋白或肽的纯化，并且在特别的实施方案中，涉及已编码蛋白或肽的基本上纯化。术语“已纯化的肽”在此处被用于指组合物，可以从其它组分分离，其中该肽被纯化到与其天然可获得状态相关的任何程度。因此已纯化的肽也指，脱离其可能天然存在的环境的肽。
一般地，“已纯化的”指肽组合物，该肽组合物经分级分离法去除多种其它组分，并且该组合物基本上保留了其表达的生物活性。在使用术语“基本上纯化”的情况下，该名称指其中主要组分为肽的组合物，例如肽占组合物中大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或更多。
适合在肽纯化中使用的各种技术对于本技术领域的熟练技术人员将是熟知的。这些技术包括，例如硫酸铵、PEG、抗体沉淀及其相似技术；热变性，然后离心；层析步骤如离子交换、凝胶过滤、反相、羟磷灰石和亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术和其它技术的组合。正如在本技术领域通常已知的，各种纯化步骤的次序可以改变，或者某些步骤可以被忽略，并且仍然可以产生基本上纯化的蛋白质或肽的合适的制备方法。
通常不要求肽总是以它们最纯化的形态提供。实际上，应该预期到没有充分纯化的产物在某些实施方案中将有用。部分纯化可以通过组合使用较少的纯化步骤来实现，或者通过使用相同的一般纯化方案的不同形式来实现。例如，应该意识到所进行的阳离子交换柱层析，使用了HPLC仪器，通常将导致比使用了低压层析系统的相同技术更大的“-倍数”纯化。表现出较低水平的相对纯化的方法在蛋白质产物的总体回收中有优势，或者在维持已表达蛋白质的活性中有优势。
可以从该方法中获得的其它组分中任选地纯化并且分离这样的PPF多肽。用于纯化多肽的方法可以在美国专利5,849,883中发现。这些文件描述了用于分离和纯化G-CSF组合物的特定的例证性方法，所述G-CSF组合物在本发明的PPF多肽的分离和纯化中有用。给出这些专利的公开内容后，本技术领域的熟练技术人员将了解用于从给定来源纯化PPF多肽的多种纯化技术。
也可以预期到，阴离子交换和免疫亲和层析的组合可以用于产生本发明的纯化的PPF多肽组合物。
药物组合物本发明也涉及药物组合物，其包括治疗上或者预防上有效量的本发明的至少一种PPF多肽，或者其药学可接受的盐，以及药学可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体，它们在PPF多肽的送递中有用。这样的组合物可以包括具有不同的缓冲液内容物(例如醋酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、TRIS)、pH和离子强度的稀释物；添加剂，如表面活性剂和增溶剂(例如失水山梨糖醇单油酸酯、卵磷脂、Pluronics、Tween 20&80、Polysorbate 20&80、丙二醇、乙醇、PEG-40、十二烷基硫酸钠)，抗氧化剂(例如一硫代甘油，抗坏血酸，乙酰半胱氨酸，亚硫酸盐(二亚硫酸盐和偏亚硫酸氢盐)，防腐剂(例如苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯(甲酯、丙酯、丁酯)，苯扎氯铵，氯丁醇，硫柳汞，苯基汞盐，(醋酸盐、硼酸盐、硝酸盐)，和渗透压调节剂/填充剂(甘油，氯化钠，甘露醇，蔗糖，海藻糖，右旋糖)；将材料引入到聚合化合物的颗粒制剂中，如聚乳酸，聚乙醇酸等等，或者与脂质体缔合。这样的组合物将影响本发明的PYY类似物多肽的物理状态、稳定性、体内释放率，以及体内清除率。例如参见Remington’s Pharmaceutical Sciences 1435-712，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1990)。
通常，从药理学性质考虑，本发明的PPF多肽与PP、PYY或者NPY以同样的方式起作用。一个优选的用途是外周施用这样的PPF多肽，用于治疗或者预防代谢状况和紊乱。尤其是，本发明的化合物具有作为降低营养物可利用性、减少食物摄取以及影响体重减轻的活性试剂。
本发明的PPF多肽可以被制剂化用于外周施用，包括用于注射、口服施用、经鼻施用、肺部施用、局部施用或本技术领域已知的其它施用类型的制剂。更特别地，根据本发明的药物组合物的施用可以通过任何普通途径进行，只要可通过该途径达到目标组织。在一个优选的实施方案中，药物组合物可以通过任何传统的外周方法引入对象，例如通过静脉、皮内、肌内、乳腺内、腹膜内、鞘内、球后、肺内(例如定期释放)；通过口服、舌下、鼻、肛门、阴道或者经皮送递或者通过在特定位置外科植入。在一定时期内可以进行单剂或者多剂处理。也可以预期到本发明的组合物的受控连续释放。
制剂可以是液体或者可以是固体，如冻干制剂，用于重配。本发明的水性组合物包括有效量的PPF多肽，其溶解或者分散在药学可接受的载体或者水性介质中。短语“药学或者药理学可接受的”是指，当施用于动物或者人时，不产生负反应、过敏反应、或者其它不适反应的分子实体和组合物。正如此处所用的，“药学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟剂及其类似物。这些介质和试剂用作药学上有活性的物质，这在本技术领域是熟知的。除了任何传统介质或者试剂与活性成分不相容的情况之外，其在治疗组合物中的用途是可以预期到的。附加活性成分也可以被引入组合物中。在一些情况下，可以方便地将PPF多肽和另一种减少食物摄取、减少血浆葡萄糖或改变血浆脂质的试剂，如支链淀粉或支链淀粉激动剂类似物、CCK或CCK激动剂、或瘦蛋白或消蛋白激动剂、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽肽激动剂类似物，和小分子大麻素(cannabinoid)CB1受体拮抗剂、β-羟基类固醇脱氢酶-1抑制剂、西布他明(sibutramine)和其它所出售的用于治疗肥胖症的药物提供在单一组合物或用于一起施用的容易中。在其它情况下，与所述PPF多肽分开施用其它试剂可能更有利。
本发明的PPF多肽可以制备为不含碱的溶液、或者药理学可接受的盐来施用，其在水中合适地与表面活性剂(例如失水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20)、聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80)、卵磷脂、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Pluronics)、羟丙基纤维素)或者配位剂(例如羟丙基-b-环糊精、硫丁醚-b-环糊精(Captisol)、聚乙烯吡咯烷酮)混合。药学可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的游离氨基形成)，用无机酸，例如盐酸或磷酸形成的盐，或者有机酸，如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸及其类似的有机酸形成的盐。用游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱，如钠、钾、铵、钙、或者氢氧化铁，和这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因及其类似物。这样的产物可以容易地通过本技术领域的熟练技术人员熟知的方法制备。分散体也可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中制备，以及在油中制备。在一般的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以防止微生物的生长。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物被制剂化，以便适合于肠胃外施用，例如通过注射或者输注。优选地，PPF多肽被悬浮在含水载体中，例如，在pH为大约3.0到大约8.0的缓冲溶液中，pH优选地为大约3.5到大约7.4，大约3.5到大约6.0，大约3.5到大约5.0，或者大约3.7到大约4.7。有用的缓冲液包括乙酸钠/乙酸、乳酸钠/乳酸、抗坏血酸、柠檬酸钠-柠檬酸、碳酸氢钠/碳酸、琥珀酸钠/琥珀酸、组氨酸、苯甲酸钠/苯甲酸，和磷酸钠，和Tris(羟甲基)氨基甲烷。可以使用一种储藏或者“储存”缓释制剂的形式，以便治疗上有效量的制剂在经皮注射或者送递后的许多个小时或者许多天之内被缓慢释放到血流中。
适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液或者分散体，以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时配制的无菌粉末。在所有情况下，该形式应该是无菌的，并且应该具有易于注射的流动性。要求本发明的PPF多肽在制备和储存条件下是稳定的，并且必须保护其不受微生物，如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或者分散介质，含有，例如水、乙醇、多元醇(例如，山梨糖醇、甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，及其类似物)，二甲基乙酰胺、cremorphor EL、其合适的混合物，以及油(例如大豆油、芝麻油、蓖麻油、棉籽油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、glycofurol、玉米油)。可以维持适当的流动性，例如通过使用包衣，如卵磷脂，通过在分散情况下维持所要求的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂。微生物作用的预防可以通过多种抗细菌抗真菌试剂来实现，例如间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯(甲酯、丙酯、丁酯)、氯丁醇、苯酚、苯基汞盐(醋酸盐、硼酸盐、硝酸盐)、山梨酸、硫柳汞及其类似物。在许多情况下，将优选地包括渗透压调节剂(例如，糖、氯化钠)。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和凝胶)来实现。
无菌可注射溶液可以通过在具有上面所列举的多种其它成分的适当溶剂中按照要求掺入所需数量的活性化合物来制备，随后过滤灭菌。一般地，分散体通过在无菌载体中掺入多种无菌活性成分来制备，所述无菌载体含有碱性分散介质和所需的上面所列举的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术通过其先前已经无菌过滤的溶液产生含活性成分和任何其它预期成分的粉末。
一般地，PPF化合物可以被制剂化成稳定的、安全的药物组合物，用于给患者施用。预期在本发明的方法中使用的药物制剂可以包括大约0.01到20％(w/v)，优选地0.05到10％的PPF化合物。PPF化合物可以是醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或者谷氨酸盐缓冲液，允许最终组合物的pH为大约3.0到大约7.0，含有碳水化合物或者多元醇作为渗透压调节剂，任选地，含有大约0.005到5.0％(w/v)的选自间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯以及苯酚的防腐剂。如果制剂化的肽将包括在多用途的产物中，那么通常包括这样的防腐剂。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，在该实施方案中，本发明的药物制剂可以含有浓度在如下范围的PPF化合物，例如，大约0.01％到大约98％w/w，或者大约1到大约98％w/w，或者优选地大约80％到90％w/w，或者优选地大约0.01％到大约50％w/w，更优选地大约10％到大约25％w/w。可以使用足够量的水用于注射，以便获得具有期望浓度的溶液。此处描述的药物制剂可以冻干。一种例证性的制剂可以是10mM乙酸钠缓冲溶液中含1mg/mL PPF化合物，该缓冲液的pH为4.2，含有9.3％蔗糖作为渗透压调节剂。
一般地，治疗上或者预防上有效量的本发明的PPF多肽将通过接受者的年龄、体重和疾病或疾病或代谢紊乱的严重程度来确定。例如参见Remington’s Pharmaceutical Sciences 697-773。也参见Wang andHanson，Parenteral Formulations of Proteins and PeptidesStabilityand Stabilizers，Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10，Supp.422S(1988)。典型地，可以使用大约0.001μg/kg体重/天到大约1000μg/kg体重/天的剂量，但正如熟练医师将认识到的，可以使用更多或者更少的剂量。定量给药可以是每天一次、两次、三次、四次或者更多次，或者频率低一些，如一周一次，一月一次，或者一季度一次，这依赖于该制剂，并且可以与此处描述的其它组合物一起使用。应该注意到，本发明不限于此处所列举的剂量。
适当的剂量可以通过使用已建立的用于确定代谢状况或者紊乱的测定方法并结合相关的剂量反应数据一起来确定。最终剂量方案通过主治医生来确定，要考虑改变药物作用的因素，例如药物的比活性，受损的严重程度和患者的反应，患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，任何感染的严重程度、施用时间和其它临床因素。随着研究的进展，关于适当剂量水平和用于特定疾病和状况的治疗时间的进一步信息将出现。
有效的剂量通常在大约0.5到30μg到大约5mg/天的范围内，优选地在大约10到30μg到大约2mg/天，更优选地在大约5到100μg到大约1mg/天，最优选地在大约5μg到大约500μg/天，单次施用，或以两次、三次、四次或更多次的分次施用。因此，例证性的剂量可以来自一天内所给予的药物总量和一天内所施用的剂数。例如，例证性剂量可以在大约0.125μg/剂(0.5μg，每天给予四次)到大约2mg/剂(2mg，每天给予一次)的范围内。其它剂量可以为大约0.01到大约100μg/kg/剂。将被施用的精确剂量可以由本技术领域的熟练技术人员来确定，该剂量依赖于特定化合物的效能，以及依赖于个体的年龄、体重和身体状况。施用应该在期望抑制营养物可利用性、食物摄取、体重、血糖或者血浆脂质降低的任何时候开始，例如在第一次有症状时，或者在诊断出肥胖症、糖尿病或者胰岛素抗性综合征后不久。施用可以通过任何途径进行，例如注射，优选地是皮下或者肌内、口服、经鼻、经皮等等。用于某些途径的剂量，例如口服施用，因其生物利用度的降低，可以增加，例如大约5-100倍。
在一个实施方案中，在药物制剂将被肠胃外施用的情况下，组合物是制剂，以便送递的PPF多肽的剂量为0.1μg/kg到100mg/kg体重/天，优选地是1μg/kg到大约50mg/kg体重/天的剂量。例证性的每日量的下限为2、5、10、20、40、60或80，上限为80、100、150、200或250。肠胃外施用可以用初始剂量进行，随后连续地输注以维持药物产品的治疗循环水平。本技术领域的普通技术人员将容易地最优化有效剂量和施用，正如可通过良好的医疗实践和个体患者的临床状况确定。
定量施用的频率将依赖于试剂的药物代谢动力学参数和施用途径。最优药物制剂将通过本技术领域的普通技术人员根据施用途径和所需剂量来确定。例如参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，supra，pages 1435-1712。这样的制剂可以影响所施用试剂的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。依赖于施用途径，可以根据体重、体表面积或者器官大小来计算合适的剂量。确定适当的治疗剂量所需要的进一步的精算由本技术领域的普通技术人员用常规方法确定，尤其是根据此处公开的剂量信息和测定方法，以及在动物或者人临床试验中所观察到的药物代谢动力学数据。
应该意识到，本发明的药物组合物和治疗方法在人类医学和兽医医学领域都有用。因此，将被处理的对象可以是哺乳动物，优选地是人类或者其它动物。对于兽医学的目的，对象包括，例如农场动物，包括牛、绵羊、猪、马和山羊，宠物如狗和猫，野生和/或动物园动物，实验室动物，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠；以及家禽如鸡、火鸡、鸭和鹅。
此外，本发明涉及一种试剂盒，其包括本发明的PPF多肽，适于制备用于药学应用的本发明所述PPF多肽的成分，和所述PPF多肽和药学应用成分的使用说明书。
为了有助于理解本发明，本发明包括了下面的实施例。与本发明相关的实验当然不应该被解释为特别地限制本发明，并且，将在本技术领域的普通技术人员范围内的、现在已知或者以后要开发的本发明的这些变化，被认为落入此处所描述的本发明以及后面权利要求所要求的范围内。
实施例参考下面的非限定性实施例，对本发明进行了更加详细的描述，提供这些实施例用于更全面地描述本发明，但不应该解释为限制其范围。这些实施例例证性说明了本发明的PPF多肽的制备，以及本发明的这些PPF多肽的体外和/或体内测试。本技术领域的普通技术人员将理解，在这些实施例中所描述的技术代表发明人所描述的技术，其在本发明的实践中可以发挥很好的作用，同样地，构成用于实践本发明的优选模式。然而，应该意识到，本技术领域的普通技术人员应该按照本发明的公开内容，意识到在所公开的特定方法中可以做出不背离本发明的精神和范围的很多变化，仍然可以获得相同或者类似的结果。
实施例1.PPF多肽的制备本发明的肽可以在Symphony肽合成仪(Protein Technologies，Inc)上组装，其中使用Rink酰胺树脂(Novabiochem)，其负载为0.43-0.49mmol/g，在0.050-0.100mmol。Fmoc氨基酸(5.0eq，0.250-.500mmol)残基以0.10M的浓度溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮中。所有其它试剂(HBTU，1-羟基苯并三唑水合物和N，N-二异丙基乙胺)制备为0.55M二甲基甲酰胺溶液。然后使用HBTU(2.0eq，0.100-0.200mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(1.8eq，0.090-0.18mmol)、N，N-二异丙基乙胺(2.4eq，0.120-0.240mmol)，使Fmoc保护的氨基酸偶联到与树脂结合的氨基酸上，结合2小时。在最后的氨基酸偶联之后，使用二甲基甲酰胺中的20％(v/v)哌啶对肽去保护1小时。一旦肽序列是完全的，Symphony肽合成仪根据程序来切割树脂。使用93％TFA、3％苯酚、3％水和1％三异丙基硅烷对进行1小时三氟乙酸(TFA)对来自树脂肽的切割。所切下的肽使用叔丁基甲醚沉淀，通过离心沉淀成团，并且冻干。将成团沉淀重新溶解在水中(10-15mL)，过滤并且通过反相HPLC，使用含有0.1％TFA的C18柱和乙腈/水梯度纯化。所得到的肽通过反相HPLC纯化到均质，纯度通过LCMS确认。
用脂肪酸(例如辛酸和硬脂酸)对本发明的肽进行N末端封端的一般方法如下rink酰胺树脂上的肽(0.1mmol)悬浮在NMP(5mL)中。在独立的小瓶中，将HBTU(0.3mmol)、HOBt(0.3mmol)溶解在DMF(5mL)中，随后加入DIEA(0.6mmol)。该溶液被加入到树脂中，将悬液振荡2小时。过滤溶剂，用NMP(5mL×4)和CH2Cl2(20mL)彻底洗涤，干燥，进行TFA切割1小时。切割和纯化后，目标肽的产率是约40mg。
PEG修饰可以在溶液中，在赖氨酸的游离ε-氨基或者已纯化肽的末端氨基上，使用商品化的活化PEG酯进行。所得到的PEG化衍生物通过反相HPLC被纯化到均质，纯度通过LC/MS和MALDI-MS确认。
本发明的PPF多肽可以使用本技术领域的普通技术人员通常已知的结合试验在多种Y-受体结合试验中检测。这样的测定方法包括下面描述的那些方法。
NPY Y1受体结合测定法从SK-N-MC细胞的汇合培养物制备膜，这些细胞可以内源地表达神经肽Y1受体。用60pM[125I]-人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)，以及用未标记的PPF多肽在96孔聚苯乙烯平板上在环境温度下与膜共温育60分钟。然后使用Perkin Elmer平板收集仪将孔内容物收集到96孔玻璃纤维平板上。将干燥的玻璃纤维平板与闪烁剂混合，在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。
NPY Y2受体结合测定法从SK-N-BE细胞的汇合培养物制备膜，这些细胞可以内源地表达神经肽Y2受体。用30pM[125I]-人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Scienees)，以及用未标记的PPF多肽在96孔聚苯乙烯平板上在环境温度下与膜共温育60分钟。然后使用Perkin Elmer平板收集仪将孔内容物收集到96孔玻璃纤维平板上。将干燥的玻璃纤维平板与闪烁剂混合，在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。
NPY Y4受体结合测定法将CHO-K1细胞用编码神经肽Y4基因的cDNA短暂转染，48小时后，从细胞的汇合培养物制备膜。用18pM[125I]-人胰腺多肽(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)，以及用未标记的PPF多肽在96孔聚苯乙烯平板上在环境温度下与膜共温育60分钟。然后使用Perkin Elmer平板收集仪将孔内容物收集到96孔玻璃纤维平板上。将干燥的玻璃纤维平板与闪烁剂混合，在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。
NPY Y5受体结合测定法将CHO-K1细胞用编码神经肽Y5基因的cDNA短暂转染，48小时后，从细胞的汇合培养物制备膜。用44pM[125I]-人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Seiences)，以及用未标记的PPF多肽在96孔聚苯乙烯平板上在环境温度下与膜共温育60分钟。然后使用Perkin Elmer平板收集仪将孔内容物收集到96孔玻璃纤维平板上。将干燥的玻璃纤维平板与闪烁剂混合，在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。
通过实施例的方式，表2示范性说明了本发明的某些优选的PPF多肽，以及这些PPF多肽在各种Y受体结合测定法中的活性，如上面所描述的Y受体结合测定法。








实施例2.PPF多肽在食物摄取测定试验中抑制食物摄取以0600的光照，12∶12小时光∶暗循环，将雌性NIH/Swiss小鼠(8-24周龄)分组饲养。除非另外表明，随意食用水和标准成粒的小鼠饲料。在实验前的一天，从大约1500小时开始，给动物禁食。在实验当天的早晨，将动物分为实验组。在典型的研究中，n＝4笼，每笼3只小鼠。
在t＝0分钟时，给所有动物腹腔注射赋性剂或者化合物，注射量在大约10nmol/kg到100nmol/kg的范围内，立即给予预先称重量(10-15g)的标准食物。取出食物，在30、60和120分钟称重，以确定所消耗的食物的量(Morley，Flood等人，Am.J.Physiol.267R178-R184，1994)。从最初在t＝0时刻所提供的食物的重量中，减去例如30、60、120、180和/或240分钟时间点后所保留的食物的重量，计算出食物摄取量。通过方差分析鉴别出有显著的处理效果(p＜0.05)。在存在显著差异的情况下，使用Dunnett检验(Prism v.2.01，GraphPadSoftware Inc.，San Diego，California)将实验方法与对照方法比较。
图1-4示范性说明了本发明的几个优选的PPF多肽在上面描述的食物摄取测定试验中减少累积食物摄取的能力。
实施例3.PPF多肽降低高脂肪喂饲的(饮食诱导的肥胖或者DIO)C57BL/6小鼠和高脂肪喂饲HSD大鼠的体重增加小鼠用高脂肪(HF，58％的饮食千卡为脂肪)或低脂肪(LF，11％的饮食千卡为脂肪)食物饲养雄性C57BL/6小鼠(在研究开始时为4周龄)。在喂饲4周后，将渗透泵(Alzet#2002)植入每一小鼠，该渗透泵可以皮下送递预定剂量的PPF多肽，持续送递两周。每周测量体重和食物摄取(Surwit等人，Metabolism-Clinical andExperimental，44645-51，1995)。实验化合物的效力被表示为每一处理组的至少14只小鼠的体重改变百分比(即从最初体重的改变百分比)的平均值+/-sd(p＜0.05ANOVA，Dunnett检验，Prism v.2.01，GraphPad Software Inc.，San Diego，California)。
大鼠在处理前一夜，将消耗高脂肪食物(45％的千卡来自脂肪)的雄性Sprague-Dawley大鼠(平均体重＝415)分为两个处理组，分组是基于相同的24小时食物摄取。在实验的晚上，在避光之前(1800h)，每只动物接受一次赋形剂(10％DMSO)或化合物(1mg/kg)的IP注射，然后单独放置到DietPro自动喂饲笼中。每一笼子有一个食物储藏箱，放置在连接到计算机的天平上，以及包括一个水瓶。在随后的24小时记录每小时的食物摄取(以克为单位)。动物连续六个夜晚接受注射。每晚记录体重。
图5-6示范性说明了本发明的几个PPF多肽在上面描述的DIO小鼠测定试验中降低体重的能力。图7示范性说明了，在几个夜晚，在高脂肪饮食的大鼠中，每日一次注射导致显著的体重降低(P＜.05)。进一步，图8示范性说明了，本发明的PPF多肽表现出比PYY(3-36)在食物摄取测定和DIO小鼠测定中的效能更高的效能。
实施例4.PPF多肽降低血压使用遥测技术，将以12∶12小时光照∶黑暗循环，在22.8±0.8℃的温度下饲养的雄性Harlan Sprague Dawley大鼠用于研究PPF多肽对循环系统的影响。试验在光照循环下进行。遥测技术允许实时读取血液动力学参数，包括动脉血压、心率和动脉dP/dt，通过在有知觉的、未麻醉的、未受到抑制的大鼠中植入的无线电发射器读取。在本实施例中，通过远程静脉内定量施用对大鼠注射赋形剂，10nmol/kg PYY，10nmol/kg PYY(3-36)或者10nmol/kg的几种PPF多肽。远程静脉内定量施用通过埋入的血管接触端口(Access Technologies(Skokie，IL))实现。该端口缝合于肩胛骨之间的紧挨皮肤下面的肌肉内。导管位于颈静脉中。在注射后收集最多60分钟的数据。
正如图9A-B所示，化合物1增加平均动脉压的效果类似于PYY(3-36)的效果。图9C-D表明，尽管化合物3增加平均动脉压并且降低心率的效果与PYY(1-36)的效果类似，但那些效果被化合物2减弱。
实施例5.PYY和PYY激动剂的抗分泌效果胃酸的分泌将雄性Harlan Sprague Dawley大鼠以12∶12小时光照∶黑暗循环，在22.8±0.8℃的温度下饲养。试验在光照循环中进行。这些动物，喂饲大鼠食料(Teklad LM 485，Madison，WI)进行饲养，在试验前大约20小时禁食。它们可以随意进水，直到试验开始。
通过外科手术给大鼠(11-16周龄，体重291-365g)配备上由DavidOsborne(Department of Biology，UCLA)定制生产的胃瘘管。称量过夜禁食大鼠的体重，去掉它们的胃瘘管的盖子，连接到有弹性的Tygon管子(3/8×1/16)上，该管子被连接到一条延伸到胃中的PE205管子上。通过狭窄的PE205管子注射盐水，收集Tygon管子的流出物。为了确保瘘管和空胃适当的流动，用约5ml的室温盐水溶液将胃冲洗几次，直到流动容易，并且流出物清澈。通过注射5mL的盐水(pH 7.0)，随后注射3ml的空气，并且收集流出物，以10分钟为时间间隔测量胃酸分泌。使用pH计(Beckman model number PHI34 Fullerton，CA)，用0.01N氢氧化钠将3ml每一胃抽出物滴定到7.0。每次滴定所需要的碱的量，校正为所收集的总体积，被用于计算每一样品中酸的摩尔数。
在收集了基线样品后，记录所回收的体积，给动物皮下注射125μg/kg五肽胃泌素(Sigma，lot#40K0616)，然后再次持续2小时的10分钟胃取样。在注射五肽胃泌素40分钟后，当典型地观察到胃酸分泌的稳定平台时，给大鼠皮下注射(PYY[3-36])，每只动物的剂量为1、3、10、100μg，或者盐水(n分别为3、2、4、4、6)，(3.45、10.34、34.5、344.8μg/kg)。
正如图10中所示，胃酸排出表示为五肽胃泌素刺激的分泌的百分比，计算为注射五肽胃泌素后，在时间点20、30和40分钟的平均值。在注射40分钟后对五肽胃泌素产生应答，胃酸分泌从9.3±5.8μmol/10分钟的基本速率增加到62.8±3.8μmol/10分钟，增加了6.8倍(总平均P＜0.01)。在注射五肽胃泌素40分钟后注射PYY(3-36)，其剂量依赖地并且显著地抑制胃酸产生。用10μg和100μg PYY(3-36)的剂量，酸分泌被分别降低了74.7±7.2％和84.7±9.7％(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01；t-检验，PYY(3-36)注射后20分钟)(参见图11-17中的t＝60分钟)。PYY(3-36)抑制五肽胃泌素刺激的酸分泌的剂量反应如图11所示。PYY(3-36)的抗酸效果的ED50是11.31μg/kg±0.054log单位。
胃的排空为了确定PYY[3-36]对于胃排空的影响，使用最后区(APx)有真空抽吸损伤的有知觉的、未禁食的雄性Harlan Sprague Dawley大鼠，和假手术大鼠。试验在手术后至少2周进行(体重426±8g)，3周后再次进行试验(体重544±9g)。将大鼠随机地分为处理组。所有大鼠在22.7℃饲养，以12∶12小时光照∶黑暗为循环(试验在光照循环中进行)，并且随意地喂饲并且饮水(diet LM-485 Teklad，Madison，Wisconsin，USA)。
在1ml 5μCi D-[3-3H]-水溶葡萄糖(lot #3165036 Dupont，Wilmington，DE，USA)灌胃前5分钟，将溶解在盐水中的PYY[3-36]以0.1ml皮下注射施用，剂量为0、1或者10μg。在给动物给予口服液体食物后，皮下给予赋形剂或者不同剂量的PYY。
有15个处理组(1)对照盐水n＝4(2)对照3μg/kg n＝3(3)对照30μg/kgn＝4(4)对照90μg/kgn＝5(5)对照300μg/kg n＝5(6)假盐水 n＝5(7)假3μg/kg n＝2(8)假30μg/kg n＝4(9)假90μg/kg n＝3(10)假300μg/kgn＝5(11)Apx盐水n＝5(12)APx 3μg/kgn＝3(13)APx 30μg/kg n＝3(14)APx 90μg/kg n＝3(15)APx 300μg/kg n＝5在灌胃后-15、0、5、15、30、60和90分钟，从麻醉的大鼠尾收集血液用于测量，分离血浆以测量血浆葡萄糖来源的氚(CPM/10μl，在β-计数器中计数)。血浆中氚的出现以前已经显示出反映了胃的排空。使用梯形法计算血浆中出现的总氚，作为高于氚灌胃之前的氚水平的增量(曲线下面的面积，计算30分钟)。
在未手术大鼠中，PYY[3-36]剂量依赖性地抑制了标记物的出现，(对于30μg/kg，90μg/kg，300μg/kg PYY[3-36]，分别为10.5±1.5，7.26±1.52和3.20±1.21cpm/μL分钟；P＜0.0001ANOVA；图12)。与盐水注射的对照组相比，在假-AP大鼠中，10μg(n＝4)和30μg PYY[3-36]注射(n＝3)也剂量依赖地延迟了标记物的出现(分别为11.89±3.23，9.88±2.45，18.94±3.23cpm/μL/min；P＜0.05)。与完全没有手术的大鼠相比，假手术动物中PYY的最大效力比较小，ED50也低于未手术动物(从43.77下降到10.20μg/kg PYY[3-36]。在APx大鼠中，与假APx或未手术大鼠(9.38±3.25cpm/μL/min；P＜0.05，0.05)中的胃排空相比，其胃排空被减慢，但没有因为施用PYY[3-36]而有所改变。回归分析确认了不存在剂量依赖性。
结果显示PYY9[3-36]有效地调节了正常Sprague Dawley大鼠中的胃排空速率。在注射PYY(10，30和100μg/大鼠)后，观察到依赖于剂量的胃排空抑制。100μg剂量的PYY产生了与支链淀粉(10μg)所引起的抑制类似数量级的抑制。与未手术和假手术大鼠(n.s.)相比，AP-损伤的动物有延迟胃排空的倾向。PYY[3-36]施用在AP损伤的动物中对胃排空没有额外的影响。
胆囊的排空为了确定PYY[3-36]对胆囊排空的影响，将8周龄的雄性NIHSwiss小鼠，在22.8±0.8°的温度下，以12∶12光∶黑暗循环饲养，并且允许随意地食用标准的啮齿动物食物(Teklad LM 7012，Madison，WI)和水。在试验前3小时将大鼠的食物拿走。在t＝0时，PYY(3-36)、CCK-8或盐水被皮下注射到有知觉的大鼠体内。30分钟后，通过颈脱位法给小鼠施以安乐死，施行中线剖腹手术，切除胆囊并且称重。
处理组A组在t＝0皮下给予盐水100μl，n＝14。
B组在t＝0皮下给予PYY(3-36)1μg/kg，n＝6。
C组在t＝0皮下给予PYY(3-36)10μg/kg，n＝10。
D组在t＝0皮下给予PYY(3-36)100μg/kg，n＝8。
E组在t＝0皮下给予CCK-81μg/kg，n＝3。
F组在t＝0皮下给予CCK-810μg/kg，n＝3。
G组在t＝0皮下给予PYY(3-36)10μg/kg+CCK-81μg/kg，n＝4。
H组在t＝0皮下给予PYY(3-36)10μg/kg+CCK-810μg/kg，n＝4。
结果如图18和19中所示。PYY(3-36)剂量依赖性地抑制了基础胆囊排空，ED50值为9.94μg/kg±0.24对数单位。相对于在注射盐水的对照组中所观察的胆囊重量(A组)，最大剂量(D组)使胆囊重量增加了168％(P＜0.005)。PYY(3-36)不影响CCK-8刺激的胆囊排空。这些数据表明PYY[3-36]通过不依赖于CCK的途径抑制了胆囊排空。应答外源CCK的胆囊排空不受PYY(3-36)的影响。类似的结果可以用PYY[1-36]在有知觉的狗中获得；400ng/kg快速浓注+800pmol/kg/h输注不抑制CCK-8刺激的胆囊收缩。
通过迷走神经-胆碱能途径调节PYY(3-36)对胆囊排空的影响是可能的。该思路得到如下发现的支持，即特定肽YY(PYY)结合位点最近已经在大鼠的最后区、孤束核以及背运动核区域(总称为背髓迷走复合体(DVC))中通过放射自显影技术得到测定。这些脊髓脑干区域负责胃肠功能的迷走-迷走反射控制，包括运动和分泌。PYY(3-36)抑制通过迷走神经-胆碱能机理调节的其它消化功能，如胃排空。
实施例6.PYY和PYY激动剂的胃保护作用将雄性Harlan Sprague Dawley大鼠，在22.8±0.8°的温度下，以12∶12光∶黑暗循环饲养，允许随意食用标准啮齿动物食物(TekladLM 485，Madison，WI)和水。在试验前大约20小时，对这些大鼠禁食，大鼠重200-220gm。
在t＝-30，皮下注射PYY(3-36)或盐水。在t＝0，灌胃1ml无水乙醇(乙醇-200标准无水乙醇U.S.P.，punctilious)或盐水。在t＝30，用5％异氟烷麻醉大鼠。采用中线剖腹切开术。露出胃，并且在幽门和下食管括约肌上连接。切除胃，沿着胃小弯打开，外翻露出粘膜。用盐水轻轻地冲洗粘膜，由不知道处理的观察者评价其损害(溃疡、扩张的血管、粘膜衬的脱落)。粘膜损害的得分在0(没有损害)和5(充血和溃疡覆盖了100％的胃)之间。
处理组A组在t＝-30皮下给予盐水100μl，在t＝0灌胃1ml H2O，n＝4。
B组在t＝-30皮下给予盐水100μl，在t＝0灌胃1ml无水乙醇，n＝6。
C组在t＝-30给予PYY(3-36)1μg/kg，在t＝0灌胃1ml无水乙醇，n＝5。
E组在t＝-30给予PYY(3-36)100μg/kg，在t＝0灌胃1ml无水乙醇，n＝5。
F组在t＝-30给予PYY(3-36)300μg/kg，在t＝0灌胃1ml无水乙醇，n＝5。
在注射10、100和300μg/kg的PYY(3-36)后，PYY(3-36)剂量依赖性地降低损伤得分，分别降低了27.4±6.4，29.3±11.6和53.7±7.9％(n＝4，5，5，p＜0.05ANOVA)(图20)。PYY[3-36]在大鼠中显示了胃保护作用。内源循环PYY[3-36]在控制胃酸分泌以及保护胃粘膜中起着生理作用。
下表给出了某些优选的PPF多肽，但也可以预见到其它多肽。




















尽管已经根据优选的实施例和实施方案对本发明进行了描述，但可以理解，对本技术领域的普通技术人员而言可以做变化和修饰。因此，可以预期到所附权利要求覆盖了所有等同的变化，这些变化在本发明所要求保护的范围内。
权利要求
1.一种PPF多肽，其包括式(I)的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28Xaa29Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Ala，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正缬氨酸，Val，Leu，Pro，Ser，Thr或者不存在；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高赖氨酸，高精氨酸，Glu，Asp，或者不存在；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，Pro，或者高丝氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser，或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Asp，Thr，或者高丝氨酸；Xaa25是Arg，高精氨酸，Lys，高赖氨酸，Orn，或者Cit；Xaa26是His，Ala，Arg，高精氨酸，Lys，高赖氨酸，Orn，或者Cit；Xaa27是Tyr或者Phe；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa29是Asn或者Gln；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，Val，Ile，或者Met；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述PPF多肽不是天然PPF多肽，NPY(2-36)，NPY(4-36)，PYY(2-36)，PYY(4-36)，PP(2-36)，PP(4-36)，Ala1NPY，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Ala7NPY，Tyr7pNPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Ala31NPY，Phe36NPY，His36NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Pro13Ala14hPYY，hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，Tyr1NPY，Ala7NPY，或hPP(19-23)-pNPY。
2.如权利要求1的PPF多肽，进一步的前提是所述PPF多肽不包括Phe27hPYY(3-36)，Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Gln29hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Lys25Phe27hPYY(3-36)，Lys25Ile28hPYY(3-36)，Lys25Val28hPYY(3-36)，Lys25Gln29hPYY(3-36)，Lys25Val30hPYY(3-36)，Lys25Ile31hPYY(3-36)，Lys25Leu31hPYY(3-36)，Lys25Phe36hPYY(3-36)，Phe27Ile28hPYY(3-36)，Phe27Val28hPYY(3-36)，Phe27Gln29hPYY(3-36)，Phe27Val30hPYY(3-36)，Phe27Ile31hPYY(3-36)，Phe27Leu31hPYY(3-36)，Phe27Phe36hPYY(3-36)，Gln29Val30hPYY(3-36)，Gln29Ile31hPYY(3-36)，Gln29Leu31hPYY(3-36)，Gln29Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，或者Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
3.如权利要求1的PPF多肽，其中所述PPF多肽进一步包括一个或多个插入。
4.如权利要求3的PPF多肽，其中所述一个或多个插入包括一个或者多个氨基酸插入。
5.如权利要求3的PPF多肽，其中所述多肽包括选自SEQ ID NO54-SEQ ID NO87的氨基酸序列。
6.如权利要求3的PPF多肽，其中所述一个或多个插入包括一个或者多个选自修饰的氨基酸、非天然氨基酸和非氨基酸的插入。
7.如权利要求6的PPF多肽，其中所述多肽包括选自SEQ ID NOs131-132，150-156，160，180-186，207-210，219-220，252，265，275，281，286，287，289-293和313的氨基酸序列。
8.如权利要求1的PPF多肽，其中所述多肽被连接到一个或者多个水溶性聚合物上。
9.如权利要求8的PPF多肽，其中所述聚合物选自聚乙二醇和脂肪酸分子，其中所述聚乙二醇和脂肪酸分子连接到多肽的N末端或者C末端，或者多肽的序列内的赖氨酸或丝氨酸残基的侧链上。
10.如权利要求9的PPF多肽，其中所述多肽选自SEQ ID NOs187-197。
11.如权利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括一个β-转角的插入，所述β-转角包括选自模拟物A、模拟物B、Ala-(2-氨基异丁酸)和Ala-Pro的二肽。
12.如权利要求11的PPF多肽，其中所述多肽选自SEQ ID NOs211-247。
13.如权利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括式II的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Ala，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正缬氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高赖氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，Val，Ile，或者Met；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然PPF多肽，PYY(2-36)，PP(2-36)，Ala13NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，hPP(1-7)-pNPY，或hPP(1-17)-pNPY。
14.如权利要求13的PPF多肽，进一步的前提是所述PPF多肽不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
15.如权利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括式III的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正缬氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高赖氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala，Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，Pro，或者高丝氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，Val，Ile，或者Met；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然PPF多肽，NPY(2-36)，PYY(2-36)，PP(2-36)，Ala3NPY，Ala4NPY，Ala6NPY，Ala7NPY，Tyr7pNPY，Ala9NPY，Ala10NPY，Ala11NPY，Ala13NPY，Gly14NPY，Ala15NPY，Ala16NPY，Ala17NPY，Ala19NPY，Lys19NPY，Ala21NPY，Ala22NPY，Lys25NPY，Ala26NPY，Phe27NPY，Ala28NPY，Gln29NPY，Ala30NPY，Ala31NPY，Phe36NPY，His36NPY，Leu3hPYY(3-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Pro13Ala14hPYY，Tyr1NPY，Ala7NPY，或者hPP(19-23)-pNPY。
16.如权利要求15的PPF多肽，进一步的前提是所述PPF多肽不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
17.如权利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括式IV的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19TyrXaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31Thr Arg Gln Arg Xaa36其中Xaa1是Tyr，Phe，Trp，或者不存在；Xaa2是Pro，Gly，d-Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，或者不存在；Xaa3是Ile，Ala，正缬氨酸，Val，Leu，Pro，Ser或者Thr；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Arg，d-Ala，高赖氨酸，高精氨酸，Glu，或者Asp；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，或者Tyr；Xaa9是Gly，Ala Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu，Ile，Val，或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，Val，Ile，或者Met；Xaa31是Ala，Val，Ile，或者Leu；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，Trp，或者Phe；前提是所述多肽不是天然PPF多肽，PYY(2-36)，Ala13NPY，Leu3hPYY(3-36)，或者Val3hPYY(3-36)。
18.如权利要求17的PPF多肽，进一步的前提是所述PPF多肽不包括Ile28hPYY(3-36)，Val28hPYY(3-36)，Val30hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Val30Ile31hPYY(3-36)，Val30Leu31hPYY(3-36)，Val30Phe36hPYY(3-36)，或者Leu31Phe36hPYY(3-36)。
19.如权利要求1的PPF多肽，其中所述多肽包括式V的氨基酸序列Xaa3Xaa4Pro Xaa6Xaa7Pro Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Tyr Xaa21Xaa22Xaa23Leu Arg Xaa26Tyr Xaa28Asn Xaa30Xaa31ThrArg Gln Arg Xaa36其中Xaa3是Ile，Ala，Pro，Ser，Thr，或者正缬氨酸；Xaa4是Lys，Ala，Gly，Glu，Asp，d-Ala，高赖氨酸，或者高精氨酸；Xaa6是Glu，Ala，Val，Asp，Asn，或者Gln；Xaa7是Ala，Asn，His，Ser，Tyr；Xaa9是Gly，Ala，Ser，肌氨酸，Pro，或者Aib；Xaa10是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa11是Asp，Ala，Glu，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa12是Ala或者d-Ala；Xaa13是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa14是Pro，Ala，高脯氨酸，羟脯氨酸，Aib，或者Gly；Xaa15是Glu，Ala，Asp，Asn，Gln，Pro，Aib，或者Gly；Xaa16是Glu，Ala，Asp，Asn，或者Gln；Xaa17是Leu，Ala，Met，Trp，Ile，Val，或者正缬氨酸；Xaa18是Asn，Asp，Ala，Glu，Gln，Ser或者Thr；Xaa19是Arg，Tyr，Lys，Ala，Gln，或者N(Me)Ala；Xaa21是Tyr，Ala，Met，Phe，或者Leu；Xaa22是Ala，Ser，Thr，或者d-Ala；Xaa23是Ser，Ala，Thr，或者高丝氨酸；Xaa26是His或者Ala；Xaa28是Leu或者Ala；Xaa30是Leu，Ala，正缬氨酸，或者Ile；Xaa31是Ala或者Val；和Xaa36是Tyr，N(Me)Tyr，His，或者Trp；前提是所述多肽不是天然PPF多肽。
20.一种PPF多肽，其包含选自SEQ ID NOs93，95-96，110，114-115，118，120，124-129，139-141，146-149，158，161-164，167-168，170-171，174-186，198-SEQ ID NO206，253-254，294，300-301和SEQ ID NOs314-317的氨基酸序列。
21.一种PPY多肽，其包括选自SEQ ID NOs7-29的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及新颖的胰多肽家族(“PPF”)多肽。本发明的PPF多肽一般地包括至少两个PPF基序，与PYY(3－36)的全长序列具有至少50％的序列同一性，并且通常将保留，至少部分地保留，PP、PYY或者NPY的生物活性。本发明的优选PPF多肽是那些在此处描述的测定(优选地是食物摄取、胃排空、胰分泌或者体重减轻测定)之一中具有效能的多肽，该效能大于相同测定试验中PP、NPY、PYY或PYY(3－36)的效能。一方面，本发明的PPF多肽包括新颖的PYY类似物多肽。另一方面，本发明的PPF多肽包括PPF嵌合多肽，其包括一个连接到第二个PP家族多肽上的PP家族多肽的片段，其中两个片段都包含PPF基序。也公开了使用本发明的PPF多肽的方法，和包括本发明的PPF多肽的药物组合物。
文档编号C07K14/575GK101065133SQ200580004687
公开日2007年10月31日 申请日期2005年2月11日 优先权日2004年2月11日
发明者O·E·莱维, C·M·乔德卡, S·S·高希, D·G·帕克斯, R·A·皮特纳, L·J·德索扎, J·S·阿恩, K·S·普里克特 申请人:安米林药品公司