诊断应激的药物和方法

专利名称：：诊断应激的药物和方法诊断应激的药物和方法发明领域本发明总体上涉及测定免疫系统状态的方法和药物。更具体地说，本发明涉及以下用途的分子和试验定量或定性测定应激对免疫系统的影响，因应激导致免疫系统功能障碍而对疾病或病症易感，与监测动物对付应激的能力。本发明可用于检测对免疫调节治疗的反应，监测在应激状态下对天然疾病的免疫应答。在某些实施方案中，本发明可用于监测径赛动物的训练，检测衰老对应激和外部应激反应能力的影响，能够对因受应激作用而处于患病危险或易于患病动物作出更好治疗和处理决定。发明背景
发明内容免疫系统有保护生物免遭外来侵袭和攻击的作用。哺乳动物的宿主免疫系统按功能可分为适应性免疫和先天性免疫。先天免疫力往往是对外部攻击的第一道防线，由天然屏障组成，例如角质表面、分泌物和化学物质，如皮肤、粘膜、溶菌酶和急性期蛋白。大多数生物有先天免疫系统，它是非特异性的，作为先天免疫系统一部分的许多防御分子在广泛物种之间进化上保守(例如，在无脊椎动物进化早期己出现补体组分)。适应性免疫系统可产生特异性应答并"记住"感染或入侵因子从而使宿主对以后的攻击产生回忆应答。适应性免疫系统按功能也可分为体液和细胞免疫。体液免疫由可溶性因子组成，在哺乳动物中是抗体。高等生物的免疫系统细胞由淋巴(细胞)或骨髓(细胞)系组成。淋巴细胞在胸腺(T细胞)或骨髓(B细胞)中分化。B细胞和T细胞形态学相同。骨髓细胞有吞噬细胞和其它细胞，例如血小板和肥大细胞。吞噬细胞有单核细胞或多形核细胞。[免疫系统及其细胞和体液组分的概述见《基础免疫学》(EssentialImmunology),第十版，Roitt和Delves,BlackwellPublishing,2001;《免疫生物学.健康人和病人的免疫系统》(Immunobiology.TheImmunesysteminHealthandDisease),第四版，Janeway等，GarlandPublishing,1999〗。哺乳动物免疫系统的功能性研究已有大量文献，可采用许多试验来检测免疫系统的功能。与细胞免疫系统相比，体液免疫系统更易于进行功能性测试。例如，抗体与其靶分子特异性结合，可采用诸如抗体扩散与沉淀试验、酶联免疫吸附测定来直接检测，或可用于抗原捕获试验来检测是否存在侵入性生物。细胞免疫系统的功能更难于检测，往往包括用染色剂或细胞表面蛋白质的特异性抗体对细胞的不同亚群进行简单计数。例如，医学上最常见的血液检测之一是检测红细胞、白细胞和血小板数目的全血计数(CBC)。区别性白细胞计数采用瑞氏(Wright)染色来计数淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞与单核细胞。细菌感染往往导致外周血液样品中嗜中性粒细胞数量增加，寄生虫感染往往导致嗜酸性粒细胞数量增加。然而，对外周血液样品中白细胞类型的计数往往不是免疫系统功能的良好指标，它是非特异性的(不能确定感染或攻击的性质)，不能区分B和T细胞谱系的淋巴细胞。B淋巴细胞产生抗体，T淋巴细胞是免疫系统的主要调节(细胞)和效应(细胞)。根据B和T细胞表面蛋白质的不同(标记)可区分它们的各种亚群。B细胞在细胞表面表达免疫球蛋白(抗体)，T细胞根据它们的发育和功能阶段表达不同标记。已开发了许多不同的试剂(往往是抗体)来区分人与实验动物的T和B细胞不同亚群，许多试剂可购自例如AlexisCorporation(www.alexis-corp.com)等公司。此外，B和T细胞(包括亚群)简单计数不能提供这些细胞功能的信息。制备用于检测细胞表面标记的试剂是费力和高度专门化的工作。检测细胞免疫功能有更直接的方法，包括空斑形成、趋化、随机迁移、超氧化物阴离子释放、测定用植物凝集素体外刺激后循环CD4+细胞中的ATP浓度、耙细胞的荧光染料释放试验。但许多这些检验费力，需要预先制备细胞和纯化方法(往往影响随后试验的结果)，并且只能检测细胞某一特定亚组的功能。总之，目前需要更有效地检测免疫系统功能，特别是细胞免疫系统功能的方法。'竞赛动物不能将它们的健康状况告知它们的主人或训兽师。此外，人类运动员往往不知晓自己的健康状况(因为高强度训练)或不能将这种情况有效地告知教练或医师。因此，也需要更有效地监测细胞免疫系统(特别是竞赛动物)的方法。自从首次发现应激(状态)可激活对身体有益或有害的生理应答几乎已有70年了(SeyleH.，1936，Atowe，138:32)。应激是导致机体或精神紧张的一种物理、化学或情感因素，它可以是致病因素之一。Pedersen等(1994，/W"5iwrtoM^/.，15:5116-5121)发表文章综述了对应激与疾病领域所进行的工作。近年来，免疫学领域的高速发展对社会心理学、营养学和生理因素诱导的应激状态与免疫系统之间的相互作用产生了强烈兴趣。此工作的主要前提是应激可通过产生免疫抑制作用而提高对疾病的易感性。这在与免疫学机制，例如感染、恶性肿瘤和自身免疫疾病密切相关的疾病中尤其如此。证明应激可导致免疫力改变的研究包括许多模型，在这些模型中大多数类型的实验性和天然产生的应激与免疫系统诸组分的改变相关联。美国国家宇航局(NASA)进行了一些最早期的工作。NASA的研究显示在空间飞行急降落阶段(splash-downphase)白细胞和T淋巴细胞升高。然而，在回到地球后的前3天内促分裂原刺激的淋巴细胞增殖应答反应受损。在发射前，可能由于期待的原因也观察到淋巴细胞对这种刺激的应答略微降低。应激与免疫功能的概述见"应激、免疫力与疾病一综述"(Stress,ImmunityandIllness—AReview),Dorian和Garfmkel著，PsychologicalMedicine,17:393-407，(1987)。也已知身体活动与锻炼可产生免疫系统的各种改变。剧烈锻炼的作用看来可抑制免疫功能，损伤宿主对上呼吸道感染的防护能力。流行病学研究普遍显示运动越剧烈对上呼吸道感染的危险越大。参见Heath等，1992，S;oWMW"'we，14(6)353-365。除了身体活动和锻炼之外，外部因素例如创伤(身体的)、主要生命活动、身体健康状况和生活方式可导致应激状态。感知这些外部因素的作用方式与身体调整方式可影响最终的生理应答。主要由交感神经系统和下丘脑、垂体、肾上腺轴(HPA轴)组成的始停静止(allostatic)系统应对机体对应激的反应(McEwenB.，1998，WewEwg/am/Jowma/o/Me^"'"e，338:171-179)。术语"始停静止负荷"指启动复杂应答与停止此应答之间的平衡所致的生理应答量。不断的应激、对应激不适应、不能关闭始停静止应答与某一系统中缺乏始停静止应答导致另一系统应答增加可产生始停静止负荷。有强有力的证据表明始停静止负荷可导致对疾病的易感性、患病风险和发病率增加。例如，应激诱导的血压升高可激发人心肌梗塞与灵长类动物动脉粥样硬化(Muller等，1989，C7簡/加.o"，79:733-743，Kaplan等，1991C〖腦/油o",84增刊VI:VI-23-VI-32)。高强度田径训练增加的始停静止负荷可导致体重减轻、闭经和神经性厌食(Boyar等，1977，7Vew￡"g//M/.，296:190-193;Loucks等，1989，JC/fn.五mfocn'm/.Mefak/.，68:402-411)。小鼠的反复群居争斗失败(socialdefeat)(应激源)与已知是免疫抑制剂的皮质酮血浆浓度升高相关(Stark等，爿m.J.iegw/,/"feg/r.Com;.P/zjw.o/.,280:R1799陽R1805)。年龄与HPA轴能力关闭相关，对生理系统的长时间刺激通过HPA轴可导致大脑海马回受损及随后的认知缺陷(Lupien等，1994，JA^wmsc/.,14:2893-2903)。在确定具有遗传性HPA轴反应低下的Lewis大鼠中，炎性应答增加可导致自身免疫和炎性疾病发病率增加(Sternburg等，1989，尸rac.A^/.JcW.&/，fOS"，86:4771-4775)。也认为HPA反应低涉及人纤维肌痛(humanfibromyalgia)(Crofford等，1994，脸謂.，37:1583-1592)、慢性疲劳综合征(PoteliakhoffA.，1981，J尸^c/zosom.L，25:91-95)、婴儿异位性皮炎(Buske-Kirschbaum等，1997，i^yc/zosommet/.，59:419-426)和创伤后应激疾病(Yehuda等，1991，5/o.P^c/z/afr;;,30:1031-1048)。尝试了采用以下代谢和心血管生理学量度来模拟(approximating)始停静止负荷，包括收縮血压、过夜尿皮质醇含量和儿茶酚胺分泌量、腰围与臀围比例、糖基化血红蛋白值、血清总胆固醇浓度中血清高密度脂蛋白比例、硫酸脱氢表雄酮血清浓度和高密度脂蛋白胆固醇的血清浓度。检测这些参数(发现)具有较低始停静止状态的患者身体和精神功能较强，而心原的血清浓度高也与冠心病风险增加相关(Markowe等，1985，BritishMed.J,291:1312-1314)。此外，注意到用磁共振成像检测到应激诱导了海马回CA3区中的锥体神经元萎縮(SapolskyR.M.，1996，&/麵，273:749-750)。这些检测需要多种不同的试验，费用昂贵、费力且只能提供始停静止负荷的近似值。总之，需要更有效的检测始停静止负荷的方法。应激状态能影响免疫系统是熟知的(Hawkley和Cacioppo，2004，5ra/"/mm.，18:114-119;Engler等，2004，JA^w/w'mm.,148:106-115;Woods等，2003,5m/"_Se/wv./mw.，17:384-392;Mars等，1998，5/o//z>^.J"Cow肌，249:366-370;Bierhaus等，2003，/Voc,A/a",Jcad5W，(T/5^，100(4):1920-1925;Horohov等，1996，Fe〃mm而o/,/7wmmo;a仇，53:221-233)。应激主要通过交感神经系统和HPA轴导致儿茶酚胺、促肾上腺皮质激素和皮质醇(类固醇的一个例子)释放进而作用于免疫系统。已知这些分子具有免疫调节作用，但它们的作用机理尚未完全了解。例如，糖皮质激素(类固醇)，如皮质醇能与细胞外表的类固醇受体结合，然后直接转运入细胞核。一旦进入核中，类固醇激素可通过基因编码区上游的类固醇效应元件来调节基因表达进而调节免疫功能(Geng和Vedeckis，2004，Mo/.五Woot'"o/.，18(4):912-924)。按照对免疫系统的影响，可将应激状态分为急性(一次持续不到两天)和慢性形式(应激持续数日或数月)。已证实急性应激能通过使白细胞从血液再分配至各身体区室(bodycompartment),例如皮肤、淋巴结和骨髓而增强免疫力(Dhabhar等，1995，J./mmwo/.，154:5511-5527)，该作用部分是因内源性糖皮质激素释放所致。据报道急性应激的影响可持续3-5天(Dhabhar等，1996，J/wwwo/.，157:1638-1644)。另一方面，慢性应激可引发HPA轴和自主神经系统(失调)，降低细胞免疫应答并增加对疾病的易感性(McEwen等，1997，万ra/"i"^乂，23:79-113;Cohen等，1992，i^yc/zo/.Scz'.，3:301-304;Cohen等，1993，WM4，277:1940-1944;Peijie等，2003，h/e&/e"c^，72:2255-2262)。总之，需要更好的检测和监测始停静止负荷对免疫系统功能影响的方法。发明概述本发明代表了对目前定量测定始停静止负荷与检测和监测免疫功能技术的明显进步。对宿主细胞，特别是循环白细胞的某些功能性标记水平的检测部分是估计性的。更具体地说，本发明涉及的分子和试验可用于筛检和监测因应激状态导致免疫功能不全所致疾病或有患病风险的动物，测定动物对付或应付外部应激的能力，和监测给予免疫调节性药物时的免疫功能。本发明可实际应用于监测处于应激状态，特别是田径训练中的动物，检测衰老对外部应激起反应能力的影响，能够对因应激的作用而处于患病危险或易患病动物作出更好的治疗和处理决定。在某些实施方案中，本发明可实际应用于检测对疫苗接种或免疫调节治疗的反应，例如，处于应激状态的动物可能不会对疫苗接种或治疗产生适当的保护性应答。在其它实施方案中，当某动物处在应激状态时或因对应激的不恰当应答而处于危险中时，本发明可实际应用于监测对天然疾病的免疫应答。这代表了对处于应激状态的动物的筛选、监测和处理的明显且出乎意料的进步。因此，本发明致力于解决的问题是通过检测，例如可检测宿主细胞基因表达模式的差别(differentialgeneexpressionpattern)来检测是否存在生理学应激应答及其程度，或评估健康状况，包括免疫系统功能。优选的实施方案包括监测免疫系统外周白细胞中某些基因的表达，这反映在与始停静止负荷或免疫调节活动有关的RNA水平或蛋白质表达模式的改变。因此，本发明一方面提供测定测试对象中对应激的生理学应答或相关疾病的存在及其程度的方法。这些方法一般包括检测该对象中至少一种选自以下的基因(本文也称为"应激标记基因")的异常表达(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的基因SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、卯、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有编码与以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的基因。按照本发明，这些应激标记基因在对应激的生理学应答中或具有始停静止负荷的动物中表达异常。合适的相关疾病是免疫抑制疾病。存在对应激的生理学应答或相关状态与心理应激或身体应激(例如，身体强迫症(physicalduress),如田径训练和身体创伤)适当相关。示范性的心理疾病包括抑郁、全身性焦虑症、创伤后应激疾病、恐慌、慢性疲劳、疼痛性脑病(myalgicencephalopathy)、通过(行动)抑制产生的应激(stressthroughrestraint)、失眠、暴食和行为(自发性)调节(behavioral(operant)conditioning^其它心理疾病，特别是涉及兽医学应用的，包括但不限于与监禁、急转向、航运或人-动物相互作用相关的应激状态。身体应激的示范性例子包括身体强迫症，如田径训练和身体创伤。本文所用的应激标记基因多核苷酸表达产物称为"应激标记多核苷酸"。该应激标记基因的多肽表达产物在本文称为"应激标记多肽"。因此，在一些实施方案中，这些方法包括检测选自以下的应激标记多核苷酸的异常表达(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、,29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、,81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有编码与以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分至少含有该序列的15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少可在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它实施方案中，这些方法包括检测选自以下应激标记多肽的异常表达(i)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(ii)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少5个连续氨基酸残基；(iii)所含氨基酸序列与以下任一序列的至少15个连续氨基酸残基至少有30%(和至少31%-至少99%及其之间所有整数百分比)相似性的多肽SEQIDN0:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;和(iv)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、,36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少'5个连续氨基酸残基，并且与和(i)、(ii)或(iii)的序列具有免疫相互作用活性的抗原结合分子具有免疫相互作用活性。应激标记基因的异常表达一般通过以下步骤检测(1)检测得自对象生物学样品中至少一种应激标记基因表达产物的水平或功能活性，和(2)将所检测到的各表达产物水平或功能活性与得自一位或多位正常对象或一位或多位未处于应激状态对象的参比样品中相应表达产物的水平或功能活性作比较，其中与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性相比，该生物学样品中表达产物的水平或功能活性有差异，表明存在对应激的生理学应答。在一些实施方案中，当该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性与相应的该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性不同时，该方法还包括测定应激应答的程度(或应激水平)或免疫调节水平。在这些实施方案中，与各相应表达产物的水平或功能活性相比，该差异通常表示各表达产物的水平或功能活性至少增加约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，或者甚至至少增加约100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%;或者至少降低约10%、20%、30%40%、50°/。、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%，或者甚至至少降低约99.5%、99.9%、99.95%、99.99%、99.995%或99.999%，即本文所称的"异常表达"。在此类型的示范性例子中，通过检测至少一种选自以下应激标记多核苷酸的水平或功能活性降低来测定是否存在对应激的生理学应答(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、7、9、11、19、21、24、25、33、34、38、39、40、41、42、50、51、56、57、59、62、63、66、70、71、73、75、79、81、83、89、90、91、92、93、97、99、105、107、108、111、119、121、122、123、129、130、137、139、140、141、142、143或185，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸seqidno:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138，其中所述部分至少含有该序列的15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，通过检测至少一种选自以下应激标记多核苷酸的水平或功能活性的增加来确定是否存在对应激的生理学应答(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、13、15、16、17、23、26、28、29、30、32、35、37、44、46、48、52、54、55、64、68、77、85、87、95、96、101、103、113、115、117、118、125、126、131、133、135、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、183、184、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206或210，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211;(c)含有编码与以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211，其中所述部分至少含有该序列的15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，当该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性与相应的该表达产物或各表达产物的所检测水平或功能活性相同或相似时，该方法还包括测定是否不存在对应激的生理学应答。在这些实施方案中，各表达产物检测到的水平或功能活性与各相应表达产物检测到的水平或功能活性的差异不超过约20%、18%、16%、14%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1°/。或0.1%时，下文称为"正常表达"。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45种应激标记基因各表达产物的水平或功能活性。例如，这些方法可包括单独检测一种应激标记多核苷酸或联合检测多至44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种其它应激标记多核苷酸的水平或功能活性。在另一实施例中，这些方法可包括单独检测一种应激标记多肽或联合检测多至44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或l种其它应激标记多肽的水平或功能活性。在此类型的示范性例子中，这些方法包括检测与存在对应激的生理学应答或风险高度相关的至少1、2、3、4、5或6种应激标记基因(下文称为"一级相关应激标记基因水平")各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:89、90、103、125、126、163、178、182、184或190，或其互补序列；(b)含有编码包含以下氨基酸序列多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189，其中所述部分至少含有该序列的15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，这些方法包括检测与存在针对应激的生理学应答或风险高度相关的至少1、2、3、4、5、6、7或8种应激标记基因(下文称为"二级相关应激标记基因水平")各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有与以下任一序列具有至少50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:17、23、44、52、133、135、144、147、148、151、155、192、196、202或206，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207;(c)含有编码与以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207,其中所述部分至少含有该序列的15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，这些方法包括检测与存在对应激的生理学应答或风险中等相关的至少l、2、3、4、5、6、7、8、9或10种应激标记基因(下文称为"三级相关应激标记基因")各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、30、37、48、54、55、64、66、70、77、79、85、91、92、95、96、101、115、117、118、121、150、153、158、164、170、180、186或198,或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199,其中所述部分至少含有该序列的15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，这些方法包括检测与存在对应激的生理学应答或风险适度相关的至少l、2、3、4、5、6、7、8、9或10种应激标记基因(下文称为"四级相关应激标记基因")各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:7、15、16、19、21、24、25、26、28、35、38、39、42、46、57、68、73、81、83、97、99、107、113、123、160、165、175、187、188、194、195或200，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201，其中所述部分至少含有该序列的15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(C)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示范性例子中，这些方法包括检测与存在对应激的生理学应答或风险较低相关的至少l、2、3、4、5、6、7、8、9或10种应激标记基因(下文称为"五级相关应激标记基因")各表达产物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、9、11、13、32、33、34、40、41、50、51、56、59、62、63、71、75、87、93、105、111、119、127、129、130、131、37、139、141、143、145、156、161、167、169、171、173、176、185、204或210，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211;(c)含有编码与以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211，其中所述部分至少含有该序列的15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种一级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少I种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少l种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少l种二级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种三级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少3种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少3种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少4种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少5种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少6种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少1种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少l种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少2种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少3种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少4种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少5种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少1种四级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性和至少6种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在一些实施方案中，这些方法包括检测至少1种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少2种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在其它实施方案中，这些方法包括检测至少3种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少3种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少4种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少5种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。在还有其它实施方案中，这些方法包括检测至少6种五级相关应激标记基因表达产物的水平或功能活性。生物学样品优选通常含有白细胞的血液，特别是外周血。所述表达产物宜选自RNA分子或多肽。在一些实施方案中，所述表达产物与相应的表达产物相同。在其它实施方案中，所述表达产物是相应表达产物的变体(例如，等位基因变体)。在某些实施方案中，所述表达产物或相应的表达产物是靶RNA(例如，mRNA)或该耙RNA的DNA拷贝，其水平可用至少能在低严谨性条件下与该耙RNA或该DNA拷贝杂交的至少一种核酸探针来检测，该核酸探针至少含有某应激标记基因的15个连续核苷酸。在这些实施方案中，将该靶RNA或其DNA拷贝所检测到的水平或丰度按存在于同一样品中的参比RNA或该参比RNA的DNA拷贝的水平或丰度标准化。核酸探针宜固定在固体或半固体支持物上。在此类型的示范性例子中，该核酸探针形成诸核酸探针空间阵列的一部分。在一些实施方案中，通过杂交(例如采用核酸阵列)检测结合该靶RNA或该DNA拷贝的核酸探针的水平。在其它实施方案中，通过核酸扩增(例如，采用聚合酶链式反应(PCR))检测结合该靶RNA或该DNA拷贝的核酸探针的水平。在还有其它实施方案中，通过核酸酶保护试验检测结合该靶RNA或该DNA拷贝的核酸探针的水平。在其它实施方案中，所述表达产物或相应的表达产物是靶多肽，其水平可用能与该靶多肽免疫相互作用的至少一种抗原结合分子来检测。在这些实施方案中，将该靶多肽检测到的水平或丰度按存在于同一样品中的参比多肽的水平标准化。抗原结合分子宜固定于固体或半固体支持物上D在此类型的示范性例子中，该抗原结合分子形成抗原结合分子空间阵列的一部分。在一些实施方案中，通过免疫测定(例如利用ELISA)检测结合该靶多肽抗原结合分子的水平。在还有其它实施方案中，所述表达产物或相应的表达产物是靶多肽，其水平可用能与该靶多肽反应形成反应产物的至少一种底物来检测。在这些实施方案中，将该耙多肽检测到的功能活性按存在于同一样品中的参比多肽的功能活性标准化。在一些实施方案中，可用适当包括至少一个与基站(basestation)相耦联的终端站(endstation)的某系统来执行该方法。该基站宜(a)通过通信网络从终端站接受所述数据，其中所述数据代表生物学样品中至少一种表达产物所检测到的或标准化水平或功能活性相应的参数值，和(b)将所述数据与代表参比样品中至少一种相应表达产物的所检测到的或标准化水平或功能活性的预定数据作比较，从而测定与参比样品中相应表达产物水平或功能活性相比，该生物学样品中此表达产物的水平或功能活性的任何差异。基站还可理想地诊断应激应答是否存在、其程度或发生的风险。在这些实施方案中，基站还可通过通信网络将诊断指征传递至终端站。本发明另一方面提供测定检验对象中是否存在免疫抑制及其程度的方法。这些方法一般包括检测至少一种上述应激标记基因在对象中的异常表达。在还有另一方面，本发明提供治疗或预防检验对象中产生应激或相关疾病的方法。这些方法一般包括检测至少一种应激标记基因在对象中的异常表达，和处理该对象的环境以防止或尽可能不使该对象与致应激源接触和/或给予该对象有效量的药物以治疗或缓解症状，或者逆转或抑制该对象发生应激状态。在某些实施方案中，所述相关疾病是免疫抑制。因此，在一相关方面，本发明提供治疗或预防检验对象产生免疫抑制的方法。这些方法一般包括检测至少一种应激标记基因在对象中的异常表达，处理该对象的环境以防止或尽可能不使该对象与致应激源接触和/或给予对象有效量的药物以治疗或缓解症状，或者逆转或抑制该对象发生应激状态。在还有另一方面，本发明提供评估对象免疫系统对所选抗原产生免疫应答能力的方法。这些方法一般包括测定至少一种上述应激标记基因在对象中的正常还是异常表达，故而该应激标记基因或各应激标记基因正常表达表明产生免疫应答能力正常，而该应激标记基因或各应激标记基因异常表达表明产生免疫应答能力受损。在其它方面，本发明提供给予含有所选抗原的组合物来诱导检验对象对该抗原的免疫应答的方法。这些方法一般包括检测至少一种上述应激标记基因在该对象中的正常表达和给予该对象所述组合物。在一些实施方案中，这些方法还包括检测至少一种上述应激标记基因在对象中的异常表达，处理该对象的环境以防止或尽可能不使该对象与致应激源接触和/或给予该对象有效量的药物以逆转或抑制该对象发生应激状态，和给予该对象所述组合物。在一些实施方案中，当该应激标记基因或各应激标记基因在对象中正常表达时给予该对象所述组合物。在一相关方面，本发明提供改进检验对象对所选抗原免疫应答的方法，给予所述对象含该抗原的组合物。这些方法一般包括检测至少一种上述应激标记基因在该对象中的异常表达，处理该对象的环境以防止或尽可能不使该对象与致应激源接触和/或给予该对象有效量的药物以逆转或抑制该对象发生应激状态，这种处理或给药从而可使该应激标记基因或各应激标记基因在该对象中正常表达。在另一方面，本发明提供本文称为"应激标记多核苷酸"的分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互补序列；(b)含有包含以下任一序列一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，其中所述部分至少含有该序列或互补序列的15个连续核苷酸；(C)至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)或(b)的序列或其互补序列杂交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列的一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互补序列，其中所述部分至少含有该序列或互补序列的15个连续核苷酸并至少能在低严谨性、中严谨性或高严谨性条件下与(a)、(b)或(C)的序列或其互补序列杂交。在另一方面，本发明提供含有操作性连接于调节元件的上述多核苷酸的核酸构建物，该构建物可在宿主细胞中操作。在某些实施方案中，所述构建物是载体形式，特别是表达载体。在还有另一方面，本发明提供含有上述核酸构建物或载体的分离的宿主细胞。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞选自细菌细胞、酵母菌细胞和昆虫细胞。在还有另一方面，本发明提供用于所査询的核酸中是否存在上述多核苷酸的探针。这些探针一般包括至少能在低严谨性条件下与上述多核苷酸杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述探针基本上由对应于编码以下任一氨基酸序列的核苷酸序列一部分或与其互补的核酸序列构成SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、40、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分至少长15个核苷酸。在其它实施方案中，这些探针含有至少能在低严谨性条件下与编码以下任一氨基酸序列的核苷酸序列至少一部分杂交的核苷酸序列SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、,80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分至少长15个核苷酸。在还有其它实施方案中，这些探针含有至少能在低严谨性条件下与以下序列的至少一部分杂交的核苷酸序列SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，其中所述部分至少长15个核苷酸。用于检测本发明应激标记多核苷酸的代表性探针如SEQIDNO:250-1807(见表2)所示。在一相关方面，本发明提供在其上固定了至少一种上述核酸探针的固体或半固体支持物。在一些实施方案中，该固体或半固体支持物包含固定于其上的核酸探针空间阵列。在其它方面，本发明提供称为"应激标记多肽"的分离的多肽，所述多肽一般选自(i)含有与上述应激标记基因的多肽表达产物至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽，所述应激标记基因具体是例如含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、卯、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243;(ii)(i)所述序列的一部分，其中该部分至少含有该多肽的5个连续氨基酸残基；(iii)含有与(i)所述多肽的至少15个连续氨基酸残基至少有30%相似性(和至少31%-至少99%及其之间所有整数百分比)的氨基酸序列的多肽；和(iv)含有能与(i)、(U)或(iii)的序列发生免疫相互作用的抗原结合分子发生免疫相互作用的氨基酸序列的多肽。本发明还有一方面提供能与上述应激标记多肽发生免疫相互作用的抗原结合分子。在一相关方面，本发明提供在其上固定了至少一种上述抗原结合分子的固体或半固体支持物。在一些实施方案中，该固体或半固体支持物包含固定于其上的抗原结合分子空间阵列。本发明还有另一方面提供一种或多种上述应激标记多核苷酸、一种或多种上述探针、一种或多种上述应激标记多肽或一种或多种上述抗原结合分子在制备评估对象对应激的生理学应答或免疫功能的试剂盒中的应用。附图简述图1是比较(施加)应激后第28天与第0天(第0天是道路运输(roadtransport)2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判另ij功能评分(crossvalidatedcomponentsdiscriminantfunctionscores)制备。图2是比较(施加)应激后第28天与第2天(第0天是道路运输2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判别功能评分制备。图3是比较(施加)应激后第28天与第4天(第0天是道路运输2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判别功能评分制备。图4是比较(施加)应激后第28天与第7天(第0天是道路运输2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判别功能评分制备。图5是比较(施加)应激后第28天与第9天(第0天是道路运输2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判别功能评分制图6是比较(施加)应激后第28天与第11天(第0天是道路运输2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判别功能评分制备。图7是比较(施加)应激后第28天与第14天(第0天是道路运输2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判别功能评分制备。图8是比较(施加)应激后第28天与第17天(第0天是道路运输2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判别功能评分制备。图9是比较(施加)应激后第28天与第21天(第0天是道路运输2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判别功能评分制备。图10是比较(施加)应激后第28天与第24天(第0天是道路运输2天后)基因表达的接收器操作曲线(ROC)。ROC曲线根据交叉验证的组分判别功能评分制备。发明详述1.定义除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但本文所述的是优选的方法和材料。为本发明的目的定义了以下术语。本文所用的冠词"一"和"一个"指一个或多个(即至少一个)该冠词在语法上的宾语。例如，"一个元件"指一个元件或多个元件。本文用于描述应激标记基因表达的术语"异常表达"，指与取自健康对象或未遭受应激对象的细胞中某应激标记基因或其变体的表达水平相比，该应激标记基因过度表达或表达不足，和/或与取自健康对象或未处于应激状态对象的组织样品或体液中该应激标记基因产物(例如，转录产物或多肽)的水平相比，较高或较低。具体地说，如果与取自健康对象或未处于应激状态对象的细胞中某应激标记基因的表达水平相比，和/或与取自健康对象或未处于应激状态对象的组织样品或体液中该应激标记基因的表达水平相比，该应激标记基因高至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，或甚至至少约100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%,或者低至少约10%、20%、30%40%、50%、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%，或甚至至少约99.5%、99.9%、99.95%、99.99%、99.995%或99.999%，则该应激标记基因异常表达。"约"指与参比的量、水平、数值、数字、频率、百分比、维数、大小、用量、重量或长度相比，可多至30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%不同的量、水平、数值、数字、频率、百分比、维数、大小、用量、重量或长度。术语"扩增子"指扩增的靶序列和/或扩增的靶序列的扩增产物。在某些其它实施方案中，"扩增子"可包含用于扩增的探针或引物序列。"抗原结合分子"指对耙抗原具有结合亲和力的分子。应该知道该术语可扩展至显示具有抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。当本文所用的术语"特异性结合"、"特异性免疫相互作用"等指某抗原结合分子时，这些术语指能确定在蛋白质和其它生物制品的异质群体中存在该抗原的结合反应。因此，在所指定的免疫测定条件下，所述抗原结合分子能与其特定抗原相结合而不以明显量与样品中存在的其它蛋白质或抗原相结合。在这种条件下与某抗原特异性结合可能需要选择对该特定抗原有特异性的抗原结合分子。例如，可制备针对所选蛋白质抗原的抗原结合分子，该分子能与该抗原而非样品中其它蛋白质抗原相结合。可采用各种免疫测定方式来选择能与某特定蛋白质起特异性免疫相互作用的抗原结合分子。例如，常规采用固相ELISA免疫测定来选择能与某蛋白质发生特异性免疫相互作用的单克隆抗体。可用于测定特异性免疫反应的免疫测定方式和条件可参见Harlow和Lane，(1988)，"抗体，实验室手册"(Antibodies,ALaboratoryManual),ColdSpringHarborPublications，纽约。"生物学活性部分"指保留了亲代分子活性的全长亲代肽或多肽的一部分。本文所用的术语"生物学活性部分"包括具有亲代分子活性的缺失突变体和具有例如至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900、1000个连续氨基酸残基的肽。可用标准的重组核酸技术来获得或釆用常规液相或固相合成技术来合成此种类型部分。例如，可参考如BlackwellScientificPublications出版，Nicholson所编的名为《合成疫苗》(SyntheticVaccines)的出版物中Atherton和Shephard所著名为"肽合成"(PeptideSynthesis)的第9章中所述的液相合成或固相合成。或者，可用蛋白酶，例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本发明的肽或多肽来制备这类肽。可通过例如高效液相层析(HPLC)技术纯化所消化的片段。也可采用重组核酸技术来制备这种蛋白质。本文所用的术语"生物学样品"指从动物提取的、未处理、处理、稀释或浓縮的样品。生物学样品可包括生物学液体，例如全血、血清、血浆、唾液、尿、汗液、腹水、腹膜液、滑膜液、羊水、脑脊液、组织活检(样品)等。在某些实施方案中，生物学样品是血液、特别是外周血。应理解本文所用的术语"顺式作用序列"、"顺式作用元件"、"顺式调节区"或"调节区"或类似的术语指当置于某可表达遗传序列的适当位置时能调节，至少部分调节该遗传序列表达的任何核苷酸序列。本领域技术人员知道顺式调节区能在转录或翻译后水平上激活、沉默、增强、抑制或者改变基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。在本发明的某些实施方案中，顺式作用序列是能增强或刺激某可表达遗传序列表达的激活序列。除非文中另有需要，本说明书中的词语"包含"和"含有"应理解为指包括某所述步骤或元件或者一组步骤或元件，但不排除任何其它步骤或元件或者一组步骤或元件。"对应"或"对应于"指以下的多核苷酸(a)其含有的核苷酸序列与某参比多核苷酸序列的整体或一部分基本上相同或互补，或(b)其编码的氨基酸序列与某肽或蛋白质的氮基酸序列相同。该短语的范围也包括含有的氨基酸序列与参比肽或蛋白质的氨基酸序列基本上相同的肽或多肽。在治疗或预防某疾病的章节中，"有效量"指将该用量的活性(化合物)以单次剂量或连续剂量的一部分给予需要这种治疗或预防的个体，该用量可有效防止该疾病的症状发生、抑制该疾病的这种症状和/或治疗该疾病的已有症状。有效量依待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类学组、组合物的剂型、医学状况的评估和其它相关因素而不同。希望该用量可用常规试验测定具有较宽范围。术语"表达"或"基因表达"指产生信使RNA或信使RNA翻译为蛋白质或多肽。采用本文所述方法检测基因表达的这二种类型之一是本发明的一部分。"表达载体"指能指导该载体所含的多核苷酸转录和适当地合成该多核苷酸所编码的肽或多肽的任何自主遗传元件。本领域技术人员知道这种表达载体。本文所用的术语"基因"指细胞基因组的任何与所有的不连续编码区及其相关的非编码调节区。基因也指编码具体多肽的开放读框、内含子、参与表达调节的毗邻的5'和3'非编码核苷酸序列。在这点上，基因还可含有与某给定基因天然相关的调控信号，例如启动子、增强子、终止和/或聚腺苷酸化信号，或异源调控信号。DNA序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。可将基因引入合适的载体中而维持于染色体外或整合入宿主。"高密度多核苷酸阵列"等指每cm2至少含有400个不同特征元件(feature)的那些阵列。短语"高度鉴别性杂交条件"指可测定出一个碱基错配的杂交条件。本文用"杂交"表示互补核苷酸序列配对产生杂交DNA-DNA或杂交DNA-RNA。互补碱基序列是通过碱基配对原则相互关联的那些序列。在DNA中，A与T配对，C与G配对。在RNA中，U与A配对，C与G配对。在这点上，本文所用术语"匹配"和"错配"表示互补核酸链中配对核苷酸的杂交可能性。匹配的核苷酸能有效杂交，例如上述典型的A-T和C-G碱基配对。错配是不能有效杂交核苷酸的其它组合。短语"特异性杂交"等指在严谨性条件下，当某特定核苷酸序列存在于复杂的DNA或RNA混合物(例如，总细胞的)中时，某分子只与该序列结合、形成双螺旋或杂交。本文提及"免疫相互作用"包括提及分子之间(特别是在所述分子之一是或模拟免疫系统某组分的场合)的任何相互作用、反应或其它结合形式。"免疫功能"或"免疫反应性"指通过本领域熟知的标准试验检测免疫系统对外来抗原的反应能力。术语"免疫抑制"指应激或对应激的生理应答导致免疫系统的总免疫反应性降低。宜与不存在应激状态时的免疫反应性相比，其降低了至少20-40%，或至少50-75%、或者甚至至少80%。此外，术语"免疫抑制"的范围包括与未处于应激的对象相比，免疫应答发生滞后。免疫应答发生滞后可以是短时滞后，例如1小时-10天，即1小时，2、5或10天。免疫应答发生滞后也可以是长时间滞后，例如10天-10年(即，30天、60天、90天、180天，1、2、5或10年)。本发明的"免疫抑制"也可表示免疫应答强度降低，例如强度降低比未受应激损害对象的免疫应答低5-100%、25-100%或75-100%。"分离的"表示实质上或基本上不含其天然状态下正常伴有组分的物质。例如，本文所用的"分离的多核苷酸"指去除了天然状态下其侧接序列的纯化多核苷酸，例如DNA片段是从去除了该片段正常毗邻序列的片段。或者，本文所用的"分离的肽"或"分离的多肽"等指体外去除了其天然细胞环境和与之结合的细胞其它组分，即与体内物质不结合的分离和/或纯化的肽或多肽分子。"标记基因"表示能赋予表达该标记基因的细胞独特表型从而使这种转化细胞能与不含有该标记的细胞相区别的基因。可选择标记基因能根据对选择性因子(例如，除草剂、抗生素、辐射。热或其它破坏未转化细胞的处理方法)的抗性赋予"选择"特性。可筛选标记基因(或报道基因)能赋予可通过观察或检验，即通过"筛选"来鉴定的特性(例如，未转化细胞中不存在的P-葡糖醛酸酶、萤光素酶或其它酶活性)。本文所用的"天然产生的"核酸分子指具有天然产生的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如，天然存在的核酸分子能编码天然产生的蛋白质。"取自"表示某样品，例如细胞提取物或核酸或多肽提取物是分离自或衍生自特定来源。例如，可直接从对象的生物学液体或组织中分离提取物。本文所用的术语"寡核苷酸"指经磷酸二酯键相连的多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关的结构变体或合成类似物，包括含有修饰或取代糖基团等的核苷酸)构成的聚合物(或其相关的结构变体或合成类似物)。因此，尽管术语"寡核苷酸"通常指其中的核苷酸残基与残基之间的连接键是天然存在的核苷酸聚合物，但应知道该术语的范围也包括各种类似物，包括但不限于肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酉旨(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、亚磷酰胺、膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核酸等。该分子的确切大小视具体应用而不同。寡核苷酸是长200个以下碱基的多核苷酸亚组。寡核苷酸优选长10-60个碱基，最优选长12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。虽然寡核苷酸可以是双链，例如用于构建不同核酸序列，但寡核苷酸通常是单链的，例如探针。本发明的寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。术语"寡核苷酸阵列"指具有寡核苷酸探针的基板，在该基板表面的已知不连续位置沉积了不同的已知序列。例如，该基板可以是如美国专利号5,424,186所述的两维基板形式。这种基板可用于合成两维空间寻址的寡核苷酸(矩阵)阵列。或者，该基板的特征在于通过将两维平面的薄片巻成三维管状构型而形成管状阵列。该基板也可采取与光纤表面相连的微球或珠形式，例如Chee等在WO00/39587中所述的那样。这些寡核苷酸阵列至少具有两种不同的元件，其密度为每cm2至少400个元件。在某些实施方案中，这些阵列的密度可以是每cm2约500、至少一千、至少一万、至少十万、至少一百万或至少一千万个元件。例如，该基板可以是硅或玻璃，具有载玻片或盖玻片的厚度，或者可由其它合成聚合物构成。当在该基板上进行试验的方法包括光检测时，可用透光的基板。该术语也指探针阵列和与其相连形成晶片一部分的基板。本文所用的术语"操作性连接"或"操作性相连"表示将结构基因置于启动子的调控下，从而可控制该基因的转录和任选的翻译。在构建异源启动子/结构基因组合时，通常优选将遗传序列或启动子安置在与基因转录起始位点的距离与其天然设置中该遗传序列或启动子与其所调控的基因，即衍生该遗传序列或启动子的基因的距离大体相同。本领域己知可允许对此距离作一些变动而不丧失功能。类似地，调控序列元件与置于其控制下的异源基因的优选定位可由该元件在其天然设置，即衍生其的基因中的定位所确定。本文所用的术语"多核苷酸"或"核酸"指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常指至少长10个碱基的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二类核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链或双链形式。术语"多核苷酸变体"和"变体"指与参比多核苷酸序列的序列基本上相同的多核苷酸，或能在下述严谨性条件下与参比序列杂交的多核苷酸。这些术语也包括其中有一个或多个核苷酸添加或删除，或用不同的核苷酸取代的多核苷酸。在这点上，本领域熟知可按照参比多核苷酸对所述多核苷酸作出某些改变，包括突变、添加、缺失和取代，从而使改变的多核苷酸仍保留该参比多核苷酸的生物学功能或活性。术语"多核苷酸变体"和"变体"也包括天然产生的等位变体。"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体与合成的类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然氨基酸(例如，相应的天然氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物以及天然产生的氨基酸聚合物。术语"多肽变体"指通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代而与参比多肽相区别的多肽。在某些实施方案中，参比多肽的一个或多个氨基酸残基可用不同的氨基酸所取代。如下所述，本领域熟知一些氨基酸可以改变成具有大致相似性质的其它氨基酸而不会改变多肽的活性(保守取代)。"引物"表示当与DNA的一条链配对时在有合适的聚合试剂存在下能启动引物延伸产物合成的寡核苷酸。为使扩增效率最大，引物优选单链，但或者可以是双链。引物足够长从而能在聚合试剂存在时引发合成延伸产物。引物的长度取决于许多因素，包括应用领域、所采用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。例如，取决于靶序列的复杂性，引物的3'末端可比模板序列短至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500到1个碱基从而延伸核酸链，虽然引物5'末端长度可延伸超出模板序列的3'末端。在某些实施方案中，引物可以是大的多核苷酸，例如约35个核苷酸到数千碱基以上。可选出与模板序列"基本上互补"的引物，设计这些引物设计能与模板杂交并用作合成的起点。"基本上互补"表示该引物的互补性足够与靶多核苷酸杂交。引物和所设计的与其杂交的模板最好不含错配，但这不是必需的。例如，可将非互补核苷酸残基连接在引物的5'末端，而该引物序列的其余部分与模板互补。或者，可将非互补核苷酸残基或非互补核苷酸残基的延伸段间插入引物中，前提是该引物序列与和其杂交的模板序列足够互补从而可形成合成该引物的延伸产物所需的模板。"探针"指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语"探针"通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为"靶多核苷酸")结合的多核苷酸探针。取决于杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可直接或间接标记，其范围包括引物。本文所用的术语"重组多核苷酸"指通过操作核酸使其成为自然界中正常没有发现的形式而在体外形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以采取表达载体形式。这种表达载体一般包括操作性连接于该核苷酸序列的转录和翻译调节核酸。"重组多肽"表示采用重组技术，即通过重组子或合成多核苷酸表达而制备的多肽。"调节元件"或"调节序列"表示在具体宿主细胞中表达操作性相连编码序列所需的核酸序列(例如，DNA)。例如，适用于原核细胞的调节序列包括启动子和任选的顺式作用序列，如操纵子序列与核糖体结合位点。适用于真核细胞的控制序列包括启动子、聚腺苷酸化信号、转录增强子、翻译增强子、调节mRNA稳定性的前导和尾随序列，以及使转录的多核苷酸编码产物靶向细胞内区室或耙向胞外环境的引导序列。本文所用的术语"序列相同性"指二序列在比较窗上根据核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的相同性程度。因此，"序列相同性百分比"可通过以下步骤计算在比较窗上比较两条最佳比对的序列，测定两条序列中相同的核苷酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口的总位置数(即，窗口大小)，再将结果乘以100得到序列相同性百分比。为本发明的目的，应将"序列相同性"理解为用DNASIS计算机程序(适用于windows的2.5版；贝勾自HitachiSoftwareengineeringCo,，Ltd.,SouthSanFrancisco,力口禾!j福尼亚，美国)，采用该软件所附参考手册中使用的标准默认(参数)计算的"匹配百分比"。如下表3所定义，"相似性"指相同或构成保守取代的氨基酸百分数。可利用序列比较程序，例如GAP(Deveraux等，1984，NucleicAcidsResearch,12，387-395)测定相似性。长度与本文所述序列相似或基本上不同的序列可以此方式通过在排列中插入空格来比较，这种空格可通过例如GAP所用的比较算法确定。用于描述两条以上多核苷酸或多肽之间的序列相关性的术语包括"参比序列"、"比较窗口"、"序列相同性"、"序列相同性百分比"和"基本上相同"。"参比序列"的长度至少12个，但更多15-18个，往往至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。由于两条多核苷酸各含有(l)两条多核苷酸之间相似的序列(即，只是整个多核苷酸序列的一部分)，和(2)两条多核苷酸序列之间有差别的序列，则一般通过在"比较窗口"上比较这两条多核苷酸的序列来鉴定和比较局部区域的序列相似性从而在两条(以上)多核苷酸之间进行序列比较。"比较窗口"指具有至少6个，通常约50-约100个，更常见是约100-约150个连续位置的概念上的片段，其中某序列与参比序列最佳比对后，该序列与具有相同数目连续位置的参比序列作比较。为(进行)两条序列的最佳比对，与参比序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口可包含约20%以下的添加或缺失(即，空位)。为比对比较窗口，可通过计算机执行算法(GAP、BESTFIT、FASTA禾QTFASTA，WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI，USA)或通过目测和所选择的各种方法之一产生的最佳比对(即导致比较窗口上最高同源性百分比)，对诸序列进行最佳比对。也可参考如Altschul等，1997，Nucl.AcidsRes.，25:3389所述的BLAST程序族进行比对。序列分析的详述可见Ausubel等，《最新分子生物学方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)的第15章，第19.3单元，JohnWiley&SonsInc，1994-1998。在本文可互换使用的术语"对象"、"个体"或"患者"指需要治疗或预防的任何对象，特别是脊椎动物对象，更特别指哺乳动物对象。本发明范围中的合适脊椎动物包括但不限于灵长类动物、鸟类、家畜(例如，绵羊、母牛、马、驴、猪)、实验室检验动物(例如，家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如，猫、狗)和捕获的野生动物(例如，狐、鹿、野狗)。优选的对象是需要治疗或预防应激的马。然而，应该知道以上术语并未暗示有症状存在。本文的短语"基本上相似的亲和力"指靶序列在所选择的一组严谨性条件下与它们的互补或基本上互补的寡核苷酸探针杂交时具有相似的可检测强度。本文所用的术语"模板"指用于产生与该"模板"链互补的核酸链的核酸。模板可以是RNA和/或DNA，其互补链也可以是RNA和/或DNA。在某些实施方案中，互补链可包括该"模板"的所有或部分互补序列，和/或可包含突变，因而其不与该"模板"完全互补。在本文所述的检测试验以及本领域己知的其它试验中，不与模板链完全互补的链可以与模板链特异性杂交，这种可用于检测试验中的互补链是本发明的一部分。术语"转化"表示通过引入外来或内源性核酸而改变某生物体，例如细菌、酵母菌、哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼或植物的基因型。"载体"表示可在其中插入或克隆入某多核苷酸的多核苷酸分子，合适的载体可以衍生自，例如质粒、细菌噬菌体、酵母菌、病毒、哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼的DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点并能在确定的宿主细胞，包括靶细胞或组织或其子代细胞或组织中自主复制，或能与确定的宿主细胞基因组整合从而可复制所克隆的序列。因此，载体可以是自主复制的载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如线形或闭环质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可含有任何确保自身复制的元件。或者，当将载体引入宿主细胞后它能整合入基因组中与所整合入的染色体一起复制。载体系统可包含一种载体或质粒，均包含待引入宿主细胞基因组的总DNA的两种以上载体或质粒，或转座子。选择载体一般取决于该载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体也可包含选择性标记，例如可用于选择合适转化子的抗生素抗性基因。本领域技术人员已知这种抗性基因的例子。术语"野生型"和"正常的"可互换使用，指大多数天然产生的物种的特征性表型，其相对的例子是突变体表型。2.縮写nt=核苷酸nts=多个核苷酸aa=氨基酸kb=千碱基或千碱基对kDa-千道尔顿d=曰h=小时s=秒3.应激标记及其应用本发明涉及检测感兴趣对象的应激水平或针对应激的生理应答。本发明公开了受到应激或感到处于应激状态下的对象的细胞，具体是血细胞，更具体是外周血细胞中的应激标记，这些标记采取所述序列的RNA分子或这些RNA分子所表达的多肽形式。这些标记是应激的指标，当它们差异性表达时可作为测试对象产生了对应激的生理应答的诊断指标。在此领域中，与现有技术相比，这种标记认为有许多优点。在某些利用外周血进行分析的优选实施方案中，监测对应激的应答的可能的，此外采集血样的侵入性很小且相对廉价。因此，本文所述的检测方法适用于广泛筛检对象。看来本文所述的核酸序列发现可用于评估对应激的应答以及处理和治疗应激的各种用途。本文范围内的这些应用的例子包括利用特异性引物扩增应激标记、通过与寡核苷酸标记杂交、将分离的核酸掺入载体、使掺入载体的核酸表达为RNA和蛋白质与使对应于该标记所编码产物的免疫学试剂显影来检测应激标记。所鉴定的应激标记进而可用于设计特异性寡核苷酸探针和引物。这种探针和引物可以是能与所鉴定的标记基因序列特异性杂交的任何长度，其至少长约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500个核苷酸，而探针可长达本文所鉴定的标记基因序列的全长。探针也可在其5'和/或3'末端包含其它序列从而能延伸超出与其杂交的靶序列。当联用核酸扩增方法时，这些探针和引物能快速分析生物学样品(例如，外周血样品)来检测或定量测定标记基因转录产物。这种方法包括本领域已知或本文所述用于复制或增加靶核酸或其互补序列的拷贝数或含量的任何方法或技术。所鉴定的标记也可用于从基因组DNA文库中鉴定和分离全长基因序列，包括基因表达的调节元件，它们宜为(但不限于)马来源的元件。本文鉴定的cDNA序列可用作杂交探针采用常规技术来筛检基因组DNA文库。一旦鉴定到部分基因组克隆，可通过"染色体行走"(也称为"重叠杂交")釆用，例如Chinault和Carbon(1979，G^e，5:11l-126)所述的方法来分离全长基因。一旦利用cDNA杂交探针分离得到部分基因组克隆，位于该部分基因组克隆两末端或附近的非复制型区段可用作杂交探针作进一步基因组文库筛检，最终分离得到感兴趣应激标记的整个基因序列。应知道可用本文所述的部分cDNA序列或短的表达序列标签(ETS)，采用例如Sambrook等，(《分子克隆.实验室手册》(MOLECULARCLONING.ALABORATORYMANUAL),(冷泉港出版社，1989)和Ausubel等，(《最新分子生物学方法》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY),JohnWiley&Sons,Inc.,1994)所述的标准技术获得全长基因。此外，可采用公开的，例如以上参考教材中所述的标准技术，利用所述序列来鉴定和分离得到全长cDNA序列。可采用本文所述的检测方法利用这些技术鉴定和分离的序列来检测应激标记基因，这些序列是本发明的一部分。作为本发明一部分，本领域普通技术人员能从所鉴定的标记基因中选择一些区段用于测定易感性，各种检测、诊断或预后方法，载体构建物，制备抗原结合分子，试剂盒和/或本文所述任何实施方案中。本发明需要使用的标记基因序列是以下SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109-、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、l卯、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248(参见表l)所示的序列。4.本发明的核酸分子如实施例和表1所述，本文提供了通过GeneChipTM分析正常和遭遇应激的马匹的血液鉴定到的134种应激标记(g卩，134种应激标记基因)。在这134种标记基因中，96种具有全长或基本上全长的编码序列，其余38种在它们的5'和3'末端的一端或两端具有部分序列信息。所鉴定的应激标记基因包括38种以前未特征鉴定的马基因。根据本发明，本文所述分离的核酸序列本身可用作杂交探针或扩增引物。这些核酸可用于，例如诊断性评估生物学样品或用于克隆全长cDNA或与其相对应的基因组克隆。在某些实施方案中，这些探针和引物提供了长度足以和自生物学样品提取的RNA或DNA样品特异性杂交的寡核苷酸。这些序列通常约10-20个核苷酸长，但可以更长。某些实施方案需要较长的序列，例如约30、40、50、100、500个核苷酸和甚至多达全长。本发明考虑了具有以下SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、卯、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248所示任一序列的约10、15、17、20、30、40、50、60、75或100或500个核苷酸的连续延伸段的核酸分子。本发明也考虑了与上述序列互补，能在高严谨性条件下与之结合的分子。这些探针可用于各种杂交实施方案，例如Southern和Northern印迹。在一些例子中，本发明考虑可使用能与多种靶序列杂交而不损伤它们有效检测应激应答能力的探针。总之，本发明考虑了本文所述杂交探针既可用作溶液杂交(如PCR中)的试剂来检测相应基因的表达以及可用于固相实施方案中。设计了围绕所述核苷酸序列的各种探针和引物。例如，在某些实施方案中，用于设计探针和引物的序列可包括通常连接于所鉴定标记基因RNA两末端的腺嘌呤核苷酸的重复延伸段(poly-A尾部)。在其它实施方案中，由于本领域普通技术人员可能认为某些区段更适用于所述检测方法，故可将探针和引物专门设计为不包括所鉴定标记基因的这些或其它区段。在任何情况中，普通技术人员均能为所选的应用选择引物或探针序列。用于检测应激标记基因的示范性探针序列见表2。引物可以是双链或单链形式，虽然单链形式更可取。可将探针设计为能与靶DNA或RNA结合(尽管可能引发(应答))而无需用于扩增方法中。在某些实施方案中，可用放射性物质(32P、"C、35S、3H或其它标记物)、荧光团(例如罗丹明、荧光素)或化学发光标记物(例如，萤光素酶)标记这些探针或引物。本发明提供可用作应激标记的96种基本上全长的cDNA序列以及59种EST或部分cDNA序列。然而，应该知道本文不限于这些公开的序列，特别是至少要包括能与含有所公开序列的核酸或这些核酸的变体杂交的分离的核酸。例如，可用核酸的部分序列来鉴定结构相关的基因或其所衍生的全长基因组或cDNA克隆。本领域已知可用作上述探针的耙序列的cDNA和基因组文库的制备方法(参见，例如Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)。所有这种核酸以及本文所述的特异性核酸分子统称为"应激标记多核苷酸。"此外，本发明的范围包括应激标记多核苷酸的分离或纯化的表达产物(即，RNA转录物和多肽)。因此，本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。"分离的"或"纯化的"核酸分子或蛋白质，或其生物学活性部分是基本上或在本质上不含有在该核酸分子或蛋白质天然存在环境中发现的与其正常相伴或相互作用的组分。因此，当分离或纯化的多核苷酸或多肽通过重组技术产生时其基本上不含其它细胞物质或培养基成分，或者当它们用化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。"分离的"多核苷酸宜不含产生该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的序列(即，位于该多核苷酸的5'和3'末端的序列)，特别是蛋白质的编码序列。例如，在各种实施方案中，分离的应激标记多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的产生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的核苷酸序列。基本上不含细胞物质的多肽包括含有少于约30%、20%、10%、5%(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当本发明的蛋白质或其生物学活性部分用重组方法制备时，培养基成分宜少于约30%、20%、10%或5%(以干重计)的化学前体或非感兴趣蛋白质的化学物质。本发明也包括应激标记基因的全长或基本上全长核苷酸序列的各部分，或者它们的转录物或这些转录产物的DNA拷贝。应激标记核苷酸序列的各部分可编码多肽部分或保留该天然多肽生物学活性的区段。或者，可用作杂交探针的应激标记核苷酸序列的各部分通常不编码保留这种生物学活性的氨基酸序列。因此，应激标记核苷酸序列的各部分至少含有编码本发明应激标记多肽的核苷酸序列的约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、80、90、100个核苷酸，或者几乎高达其全长的核苷酸序列。编码本发明应激标记多肽的生物学活性部分的应激标记核苷酸序列的一部分至少可编码全长应激标记多肽中的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、卯、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000、或者甚至至少约2000、3000、4000或5000个连续氨基酸残基，或者几乎高达其氨基酸总数。可用作杂交探针或PCR引物的应激标记核苷酸序列的各部分一般无需编码应激标记多肽的生物学活性部分。因此，应激标记核苷酸序列的一部分可编码应激标记多肽的生物学活性部分，或者它可以是用作本领域己知标准方法的杂交探针或PCR引物的片段。可通过分离一条本发明应激标记核苷酸序列的一部分，表达其所编码的应激标记多肽的一部分(例如通过体外重组表达)并评估所编码的该应激标记多肽的一部分(活性)来制备该应激标记多肽的生物学活性部分。作为应激标记核苷酸序列各部分的核酸分子至少含有全长应激标记核苷酸序列中的约15、16、17、18、19、20、25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650个核苷酸，或者几乎高达其核苷酸总数。本发明也考虑了应激标记核苷酸序列的变体。核酸变体可以是天然产生的，例如等位变体(同一基因座)、同源物(不同基因座)和直向同源物(不同生物体)或者可以是非天然产生的。可采用熟知的分子生物学技术，例如本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术鉴定天然产生在的变体，例如这些变体。可通过诱变技术，包括适用于多核苷酸、细胞或生物体的技术来制备非天然产生的变体。这些变体可含有核苷酸取代、缺失、倒位和插入。编码和/或非编码区可发生变异。变异既可导致保守性也可导致非保守性氨基酸取代(与编码产物相比)。就核苷酸序列而言，保守性变体包括因遗传密码子的简并性而编码本发明应激标记多肽之一的氨基酸序列的那些(核酸)序列。变体核苷酸序列也包括合成衍生但仍能编码本发明应激标记多肽的核苷酸序列，例如通过定点诱变产生的那些序列。总体上，通过本文所述的序列比对程序利用默认参数测定到本发明某特定核苷酸序列的变体与该核苷酸序列至少具有约30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%，一般至少约75%、80%、85%,优选约90%-95%以上，更优选约98%以上的序列相同性。本发明的应激标记核苷酸序列可用于分离其它生物体，特别是其它哺乳动物，尤其是其它品种马的相应序列与等位变体。核酸序列的杂交方法是本领域现有的不难获得。其它生物体的编码序列可通过熟知技术根据其与本文所述编码序列的序列相同性分离得到。在这些技术中，可将所有或部分的已知编码序列用作探针，与所选生物体的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群(即，基因组或cDNA文库)中存在的其它应激标记编码序列选择性杂交。因此，本发明也考虑了在下述严谨性条件下能与所述应激标记基因核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸。本文所用的术语"在低严谨性、中等严谨性、高严谨性或极高严谨性条件下杂交"描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指南可见Ausubel等(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6部分。该参考文献中描述了水性和非水性方法，二者均可用。本文提及的低严谨性条件包括至少约1-至少约15%v/v的甲酰胺和至少约1-至少约2M的盐，42'C杂交，与至少约1-至少约2M的盐，42"C洗涤。低严谨性条件也可包括1%牛血清白蛋白(BSA)、1mMEDTA、0.5MNaHPO4(pH7.2)、7%SDS，65。C杂交，与(i)用2XSSC、0.1%SDS;或(ii)用0.5%BSA、1mMEDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、5%SDS，室温洗涤。低严谨性条件的一个实施方案包括约45t:在6X氯化钠/拧檬酸钠(SSC)中杂交，然后至少在5(TC(低严谨性条件的洗涤温度可升高至55t:)用0.2XSSC，0.1。/。SDS洗涤两次。中等严谨性条件包括至少约16-至少约30%v/v的甲酰胺和至少约0.5-至少约0.9M的盐，42'C杂交，与至少约0.1-至少约0.2M的盐，55'C洗涤。中等严谨性条件也可包括1%牛血清白蛋白(BSA)、1mMEDTA、0.5MNaHPO4(pH7.2)、7%SDS，65。C杂交，与(i)用2XSSC、0.1%SDS;或(ii)用0.5%BSA、lmMEDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、5%SDS，60陽65。C洗涤。中等严谨性条件的一个实施方案包括约45'C在6XSSC中杂交，然后6(TC用0.2XSSC，0.1%SDS洗涤一次以上。高严谨性条件包括至少约31-至少约50%v/v的甲酰胺和约0.01-约0.15M的盐，42'C杂交，与用约0.01-约0.02M的盐，55。C洗涤。高等严谨性条件也可包括1%BSA、1mMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS，65。C杂交，与(i)用0.2XSSC、0.1。/。SDS;或(ii)用0.5%BSA、1mMEDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、1%SDS，在超过65'C的温度洗涤。高严谨性条件的一个实施方案包括约45'C在6XSSC中杂交，然后65。C用0.2XSSC，0.1%SDS洗涤一次以上。在某些实施方案中，本发明的应激标记多核苷酸在极高严谨性条件下与所述核苷酸序列杂交。极高严谨性条件的一个实施方案包括65'C在0.5M磷酸钠、7。/。SDS中杂交，然后65。C用0.2XSSC，1。/。SDS洗涤一次以上。本领域技术人员熟知其它严谨性条件，技术人员知道可操纵各种因素来优化杂交的特异性。可优化最终洗涤的严谨性以确保高程度杂交。详细例子可参见Ausubel等，同上，第2.10.1-2.10.16页和Sambrook等，(1989，同上)，第1.101-1.104部分。虽然一般在约42'C-68"C的温度下进行严谨性洗涤，但本领域技术人员知道其它温度也适合于严谨性条件。为形成DNA-DNA杂交，发生最大杂交率的温度一般比Tm低约2(TC-25。C。本领域熟知Tm是解链温度，或者是两条互补多核苷酸序列解离的温度。本领域熟知评估Tm的方法(参见Ausubel等，同上，第2.10.8页)。总体上，可利用以下公式预测DNA的最佳匹配双螺旋的Tm近似值Tm=81.5+16.6(logioM)+0.41(%G+C)-0.63(%甲酰胺)—(600/长度)其中M是Na+的浓度，优选0.01-0.4摩尔；％G+C是鸟苷和胞苷碱基之和占碱基总数的百分比，其范围在30%和75%G+C之间；％甲酰胺是以体积计的甲酰胺浓度的百分比；长度是DNA双螺旋中碱基对的数目。随机错配的碱基对数目每上升1%，双螺旋DNA的Tm降低约rC。高严谨性洗涤通常在Tm-15'C时进行，或者中等严谨性在Im-30'C进行。在杂交方法的一个例子中，含有固定DNA的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)42'C在含有标记探针的杂交缓冲液(50M去离子甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt溶液(0.1%ficoll、0.1%聚乙烯妣咯烷酮和0.1%牛血清白蛋白)、0.1。/。SDS和200mg/mL变性鲑鱼精子DNA)中杂交过夜。然后以中等严谨性条件连续洗涤该膜两次(即，45'C用2XSSC、0.1%SDS洗涤15分钟，然后5(TC用2XSSC、0.1%SDS洗涤15分钟)，在较高严谨性连续洗涤两次(即，55。C用0.2XSSC、0.1%SDS洗漆12分钟，然后65-68'C用0.2XSSC、0.1%SDS溶液洗涤12分钟)。5.本发明的多肽本发明也考虑了本发明的应激标记基因编码的全长多肽以及那些多肽的生物学活性部分，统称为"应激标记多肽"。全长应激标记多肽的生物学活性部分包括至少长约6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、60个氨基酸残基的具有免疫相互作用活性的部分。例如，本发明所考虑的免疫相互作用片段至少长6个，优选至少8个氨基酸残基，它们能在动物中引发免疫应答从而产生能与本发明的应激标记多肽发生免疫相互作用的抗原结合分子。这种抗原结合分子可用于筛检其它哺乳动物，特别是马类哺乳动物的与结构和/或功能相关的应激标记多肽。全长应激标记多肽的各部分一般可能参与某种相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或酶促相互作用(例如所述相互作用可以是瞬时性，可形成或打断某共价键)。全长应激标记多肽的生物学活性部分包括含有与某(假定的)全长应激标记多肽的氨基酸序列，例如以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示的氨基酸序列足够相似或衍生自该氨基酸序列的氨基酸序列的肽，这些序列含有少于全长应激标记多肽的氨基酸并至少显示该多肽的一种活性。生物学活性部分通常包含至少具有全长应激标记多肽的一种活性的结构域或基序。全长应激标记多肽的生物学活性部分可以是长，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、卯、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000，或者甚至至少约2000、3000、4000或5000个以上氨基酸残基的多肽。所述部分宜是含有不低于其所衍生的全长多肽的约1%、10%、25%、50%活性的"生物学活性部分"。本发明也考虑了应激标记多肽的变体。"变体"多肽包括通过以下方式从天然蛋白质中衍生的蛋白质在该天然蛋白质的N-末端和/或C-末端删除(称为截短)或添加一个或多个氨基酸；在该天然蛋白质的一个或多个位点处删除或添加一个或多个氨基酸；或者在该天然蛋白质的一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸。本发明的变体蛋白质是生物学活性的，即它们继续具有该天然蛋白质的所需生物学活性。例如，遗传多态性或人为操作可形成这种变体。通过本文所述的序列比对程序利用默认参数测定到本发明的天然应激标记蛋白质的生物学活性变体与该天然蛋白质的氨基酸序列可具有至少40%、50%、60%、70%，一般至少75%、80%、85%,优选约90%-95%以上，更优选约98%以上的序列相似性。本发明蛋白质的生物学活性变体与该蛋白质一般可有多达1000、500、400、300、200、100、50或20个氨基酸残基，或者宜少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(例如6-10个)、少至5个、少至4、3、2或者甚至l个氨基酸残基不同。可以各种方式改变本发明的应激标记多肽，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。本领域一般知道这种操作方法。例如，可通过DNA突变制备应激标记蛋白质的氨基酸序列变体。本领域熟知诱变与核苷酸序列改变的方法。参见，例如Kunkel(1985，尸麼.JcW.,,82:488-492)，Kunkel等，(1987，M"/zo&〖"￡>zz>wo/.,154:367-382)，美国专利号4,873,192;Watson，J,D.等，(《基因的分子生物学》(MolecularBiologyoftheGene)，第四版，Benjamin/Cummings，MenloPark,Calif.，1987)和它们所引用的参考文献。适当进行氨基酸取代而不影响感兴趣蛋白质的生物学活性的指南见Dayhoff等，(1978)，《蛋白质序列和结构图》(AtlasofProteinS叫uenceandStructure),(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C.)的模型。本领域已知筛选具有所选特性的通过点突变或截短(方法)制备的组合文库基因产物和筛选cDNA文库的基因产物的方法。这种方法适用于快速筛选通过组合诱变产生的应激标记多肽的基因文库。可联用能提高该文库中功能性突变体的频率的技术-递推集团诱变(REM)技术与筛选试验来鉴定应激标记多肽变体(Arkin和Yourvan，(1992)，尸亂淑/.爿cacf.,，S9:7811-7815;Degrave等，(1993)，尸她/w五，'廳"'"g，6:327-331)。下文详述了理想的保守性取代，例如用另一个具有相似特性的氨基酸替换某一氨基酸。与亲代应激标记氨基酸序列相比，应激标记多肽变体在沿它们序列的不同位置可含有保守性氨基酸取代。"保守性氨基酸取代"是用具有相似侧链的氨基酸残基取代某氨基酸残基。本领域定义了具有相似侧链是氨基酸残基家族，它们一般可再分为酸性该残基因在生理pH下失去H离子而带负电荷，该残基受水溶液吸弓|，因此当包含它的肽处于生理pH的水性介质中时，它吸附于该肽构型的表面位置。含有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。碱性该残基因在生理PH下或在其一两个pH单位内结合H离子而带正电荷(例如，组氨酸)，该残基受水溶液吸引，因此当包含它的肽处于生理pH的水性介质中时，它吸附于该肽构型的表面位置。含有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷的这些残基在生理pH时带电荷，因此包括含有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。疏水性这些残基在生理pH下不带电荷并被水溶液所排斥，因此当包含它的肽处于水性介质中时，它吸附于该肽构型的内部位置。含有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性/极性这些残基在生理pH下不带电荷，但水溶液不十分排斥它们，因此当包含该残基的肽处于水性介质中时，它吸附于该肽构型的内部位置。含有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。本说明书也将某些氨基酸特征鉴定为"小的"氨基酸，因为它们的侧链不够大(即使缺乏极性基团)因而不能赋予疏水性。除脯氨酸以外，"小的"氨基酸是当侧链上有至少一个极性基团时具有4个以下碳，和当侧链上没有极性基团时具有3个以下碳的那些氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸-脯氨酸因已知其对肽链的二级构型有影响而成为一种特殊情况。脯氨酸的结构不同于所有其它天然产生的氨基酸在于其侧链与a-氨基的氮以及oc-碳结合。例如Dayhoff等((197S)，"蛋白质进化改变的模型"(Amodelofevolutionarychangeinproteins))公开了几种氨基酸相似性矩阵(例如，PAM120矩阵和PAM250矩阵)。然而，刊于M.O.Dayhoff编的《蛋白质序列和结构图》(AtlasofProteinS叫uenceandStructure),第5巻，第345-358页，NationalBiomedicalResearchFoundation,WashingtonDC;禾口Gonnet等，1992，S"'e"ce，256(5062):144301445中用于测定远程关系的矩阵将脯氨酸包括在与甘氨酸、丝氨酸丙氨酸和苏氨酸的同一组中。因此，为本发明的目的将脯氨酸归类为"小"氨基酸。将(氨基酸)分为极性或非极性所需的吸引或排斥程度是随意的，因此本发明专门考虑的氨基酸可分为一类或另一类。可根据已知的性能对大多数未专门命名的氨基酸进行分类。氨基酸残基还可再分为环状或非环状、芳香族或非芳香族、根据残基的侧链取代基可自圆其说分类为小的或大的。如果某残基总共含有4个以下碳原子(包括羧基碳)，认为其是小氨基酸，前提是存在其它极性取代基；如果不存在其它极性取代基，总共含3个以下碳原子的残基可认为是小氨基酸。小残基当然总是非芳香族残基。可根据氨基酸残基的结构性能将其分为两种以上的种类。就天然产生的蛋白质氨基酸而言，根据此方案的亚分类见表3.保守性氨基酸取代也包括根据侧链的分类。例如，含有脂族侧链的一组氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；含有脂族-羟基侧链的一组氨基酸包括丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；含有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；含有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；与含有硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地希望用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺、丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构相关的氨基酸相似地取代某种氨基酸时不会严重影响所产生的变体多肽的性能。氨基酸改变是否能产生功能性应激标记多肽不难通过检验其活性来测定。保守性取代可见表4示范性取代的标题。更优选的取代见优选取代标题。本发明范围内的氨基酸取代一般通过选择其作用对(a)维持取代区域中肽骨架的结构，(b)维持该分子在耙位点的电荷或疏水性，或(C)维持侧链的体积的作用中没有明显不同的.取代来实现。引入取代后，筛选变体的生物学活性。或者，可根据侧链的相同性将制备保守性取代的相似氨基酸分为三类。如Zubay，G.，《生物化学》(S/ocAem/W;7)，第三版，Wm.C.BrownPublishers,(1993)所述，第一组包括均含有带电荷链的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸。因此，通常用同一侧链家族中的另一氨基酸残基取代应激标记多肽中预计的非必需氨基酸残基。或者，可沿着全部或部分应激标记基因编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，然后筛选得到的突变体有无亲代多肽的活性来鉴定保留了该活性的突变体。诱变编码序列后，可重组表达所编码的肽，测定该肽的活性。因此，本发明也考虑了天然产生的应激标记多肽序列的变体或它们的生物学活性片段，其中所述变体可通过添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基而与天然产生的序列相区别。总体上，变体可显示与亲代应激标记多肽序列，例如以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示任一序列具有至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的相似性。变体优选与亲代应激标记多肽序列，例如以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、29、22、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示任一序列具有至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相同性。此外，本发明考虑了通过添加、缺失或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、500个以上氨基酸而与天然或亲代序列不同但仍保留了该亲代应激标记多肽特性的序列。应激标记多肽也包括能在本文所定义的严谨条件下，68特别是高严谨条件下与上述本发明应激标记多核苷酸序列或其非编码链杂交的多核苷酸编码的多肽。在一个实施方案中，变体多肽与应激标记序列有至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基不同。在另一实施方案中，变体多肽与以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示的相应序列有至少1%但低于20%、15%、10%或5%的残基不同。(如果此比较(方法)需要比对，则应比对这些序列的最大相似性。因缺失或插入或错配所产生的"环"外序列可认为有差别)。这些差别优选是位于非必需残基的差别或改变或保守性取代。"非必需"氨基酸残基是可从某实施方案多肽的野生型序列中改变，而不破坏或基本上不改变其一种或多种活性的残基。所述改变优选基本上不改变这些活性，例如不改变野生型多肽的20%、40%、60%、70%或80%活性。"必需"氨基酸残基是当从本发明应激标记多肽的野生型序列中改变时会破坏该亲代分子的活性从而使野生型多肽存在的活性低于20%的残基。在其它实施方案中，变体多肽包括与应激标记多肽的相应序列，例如以下SEQIDNO..2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示任一序列具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、91%、92%、93%、94%95%、96%、97%、98%以上相似性并具有该应激标记多肽活性的氨基酸序列。可通过本领域技术人员已知的任何合适方法制备本发明的应激标记多肽。例如，可通过包括以下步骤的方法制备这些多肽(a)制备含有至少编码某应激标记多核苷酸的一部分并与调节元件操作性相连的核苷酸序列的嵌合型构建物；(b)将该嵌合型构建物引入宿主细胞；(C)培养该宿主细胞表达该应激标记多肽；和(d)从宿主细胞中分离该应激标记多肽。在示范性的例子中，所述核苷酸序列至少编码以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示序列的一部分，或其变体。嵌合型构建物通常釆取表达载体的形式，宜选自自身复制的染色体外载体(例如质粒)和能整合入宿主基因组中的载体。调节元件一般应适合于表达该应激标记多肽所用的宿主细胞。本领域己知各种宿主细胞的许多类型的表达载体和调节元件。此类型的示范性元件包括但不限于启动子序列(例如可以是天然产生的或含多种启动子的组合元件的组成型或可诱导启动子)、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、与增强子或激活序列。在一些实施方案中，所述表达载体包含可选择的标记基因以选择转化的宿主细胞。可选择标记基因是本领域熟知的并随所用的宿主细胞而不同。所述表达载体也可包含融合伴侣(通常由该表达载体提供)从而可将应激标记多肽表达制备为含有融合伴侣的融合多肽。融合伴侣的主要优点是它们有助于鉴定和/或纯化该融合多肽。为制备融合多肽，需要将应激标记多核苷酸连接入表达载体中从而使融合伴侣与应激标记多核苷酸的翻译读框重合。融合伴侣的熟知例子包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六个组氨酸(hexahistidine)(HIS6)，这些伴侣特别可用于通过亲和层析分离融合多肽。在一些实施方案中，可利用与融合伴侣结合的基质(例如但不限于谷胱甘肽-、直链淀粉-和镍-或钴-偶联树脂)通过亲和层析纯化这些融合多肽。许多这种基质可以"试剂盒"形式购买到，例如利用(HIS6)伴侣的QIAexpressTM系统(Qiagen)和PharmaciaGST纯化系统。本领域己知的其它融合伴侣是发光蛋白质，例如可用作荧光"标签"通过荧光显微术或流式细胞术来鉴定和/或分离融合多肽的绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶。流式细胞术方法，例如荧光激活细胞分选(FACS)法在该后一应用中特别有用。融合伴侣也优选含有蛋白酶切割位点，例如因子Xa或凝血酶的切割位点，从而使相关蛋白酶能部分消化该融合多肽而从融合构建物中释放应激标记多肽。随后可通过层析分离方法来分离所释放的多肽。融合伴侣的范围也包括"表位标签"，这些标签通常是可利用特异性抗体(纯化)的短肽序列。易于利用特异性单克隆抗体(纯化)的表位标签的熟知例子包括c-Myc、流感病毒、血凝素和FLAG标签。可通过包括"转导"和"转染"等适当方法将本发明的嵌合型构建物引入.宿主中，这在技术上意味着通过核酸介导的基因转移将核酸，例如表达载体引入受者细胞中。然而，"转化"指宿主的基因型因细胞摄入外源性DNA或RNA而改变的过程，例如转化细胞含有本发明的表达系统。将嵌合型构建物引入细胞有许多方法。所用的方法一般取决于宿主细胞的选择。本领域技术人员熟知将嵌合型构建物引入宿主细胞的技术。己描述了四类将核酸分子递送入细胞的方法(1)化学方法，例如磷酸钙沉淀、聚乙二醇(PEG)-介导的沉淀和脂质转染；(2)物理方法，例如显微注射、电穿孔、加速方法和真空渗入；(3)载体方法，例如细菌和病毒载体介导的转化；和(4)受体介导的转化。本领域技术人员熟知这些和其它类型的转化技术，而新的技术也不断涌现。具体选择转化技术取决于该技术转化特定宿主细胞的效率以及采用具体选择的方法实施本发明之人的经验和偏好。技术人员明显可知对本发明而言，将嵌合型构建物引入细胞中的转化系统的具体选择对本发明不是实质性的或对本发明的限制，只要该系统能实现可接受的核酸转移水平。可通过培养用嵌合型构建物转化的宿主细胞来制备重组应激标记多肽。适合表达应激标记多肽的条件随所选表达载体和宿主细胞而不同，技术人员通过常规实验不难确定这些条件。适合表达的宿主细胞可以是原核或真核细胞。表达本发明多肽的示范性宿主细胞是细菌。所用的细菌可以是大肠杆菌C&yc/2^7'cWfl或者，宿主细胞可以是酵母菌细胞或昆虫细胞，例如利用杆状病毒表达系统的s尸9细胞。可采用如Sambrook等，(1989，同上)，特别是第16和17部分；Ausubel等，(1994，同上)，特别是第10和16章；和Coligan等，《蛋白质科学的最新方法》(CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE),(JohnWiley&Sons，Inc.,1995-1997)，特别是第1、5和6章中所述的标准方法不难制备重组应激标记多肽。或者，可通过化学合成，例如采用如Atherton和Shephard，(同上)第9章和Roberge等，(1995，肠"ce，269:202)中所述的液相合成或固相合成来化学合成应激标记多肽。6.抗原结合分子本发明也提供可与本发明应激标记多肽发生特异性免疫相互作用的抗原结合分子。在一个实施方案中，该抗原结合分子包括多克隆全抗体。可通过，例如将本发明的应激标记多肽注射入能产生(抗体)的动物(包括小鼠和家兔)以获得多克隆抗血清来制备这种抗体。本领域技术人员熟知制备多克隆抗体的方法。可采用的示范性方法见，例如Coligan等，《免疫学最新方法》(CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY),(JohnWiley&Sons,Inc，199l)和Ausubel等，(1994-1998，同上)，特别是第ll章的第III部分。可采用，例如K池ler和Milstein(1975，iV倉e，256，495-497)所述的标准方法或采用，例如Coligan等，(1991，同上)所述的最新改进方法，用得自接种了一种或多种本发明应激标记多肽的产生(抗体的)动物的无限增殖脾细胞或其它抗体产生细胞来制备单克隆抗体，替代在产生(抗体的)动物中得到的多克隆抗血清。本发明也考虑用Fv、Fab、Fab'和F(ab')2免疫球蛋白片段作为抗原结合分子。或者，抗原结合分子可包括合成的稳定的Fv片段。此类型的示范性片段包括用肽接头分别桥连V/z结构域的N末端或C末端与V丄结构域的C末端或N-末端的单链Fv片段(sFv，通常称为scFv)。ScFv缺乏完整抗体的所有恒定区，因而不能激活补体。可根据，例如Kreber等(Kreber等，1997，J/mm朋o/.M"/zo&，201(1):35-55)所概述的方法制备ScFv。或者，可通过美国专利号5,091,513;欧洲专利号239,400或Winter和Milstein的文章(1991，Mm^e，349:293)和PKickthun等(1996，刊于《抗体工程改造一种实用方法》(J加》o办ewg&een'"g:爿prac"ca/appraac/z),203-252)所述的方法制备它们。在另一实施方案中，合成的稳定的Fv片段包括二硫键稳定的Fv(dsFv)，在该片段中将二个半胱氨酸残基引入Vi/和V丄结构域中从而在完全折叠的分子中此二残基彼此之间形成二硫键。产生dsFv的合适方法描述于，例如(Glockscuther等，飾c/j缀,29:1363-1367;Reiter等，1994,C/z謹,，269:18327-18331;Reiter等，1994，说oc/zem.，3丄5451-5459;Reiter等，1994，Omcer^M.，54:2714-2718;Webber等，1995，Mo/./wm丽o/.，32:249-258)。本领域已知制备抗-应激标记多肽的抗原结合分子的噬菌体展示与组合方法(例如，以下文献中所述的Ladner等，美国专利号5,223,409;Kang等，国际公布号WO92/18619;Dower等，国际公布号WO91/17271;Winter等，国际公布WO92/20791;Markland等，国际公布号WO92/15679;Breitling等，国际公布WO93/01288;McCafferty等，国际公布号WO92/01047;Garrard等，国际公布号WO92/09690;Ladner等，国际公布号WO90/02809;Fuchs等，(1991)Sw/rec/mo/ogv，2:1370-1372;Hay等，(1992)，//wm^""k^7/#/^/omw,2:81-85;Huse等，(1989)，謹:1275-1281;Griffths等，(1993)，￡MSO/，12:725-734;Hawkins等，(1992)，/M/淑，226:889-896;Clackson等，(1991)，A/fl&re，352:624-628;Gram等，(1992)，iW^4S，3576-3580;Garrad等，(1991)，说'o/Tec/mo/ogy，2:1373-1377;Hoogenboom等，(1991)，7W^爿c/c/b，J^:4133-4137;和Barbas等，(1991)，iWA5，丝7978-7982)。这些抗原结合分子可用于筛选应激标记多肽变体的表达文库。它们也可用于检测和/或分离本发明的应激标记多肽。因此，本发明也考虑可利用这些抗原结合分子，采用例如任何合适的免疫亲和方法(包括但不限于免疫层析和免疫沉淀)来分离应激标记多肽。合适的方法利用固相吸附，其中抗-应激标记多肽的抗原结合分子与合适的树脂相连，使该树脂与怀疑含有应激标记多肽的样品接触，然后从树脂上洗脱应激标记多肽(如果存在的话)。示范性树脂包括Sepharose(Pharmacia)、Poros⑧树月旨(RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis)、ActigelSuperflowTM树月旨(SterogeneBioseparationsInc.,CarlsbadCalif.)禾口Dynabeads(DynalInc.，LakeSuccess,N.Y.)。抗原结合分子可与某化合物，例如标记物，如放射性核素，或成像试剂，如放射性、酶活性(试剂)或其它试剂，如NMR对比试剂相偶联。优选能产生可检测放射性射线或荧光的标记物。为评估蛋白质表达的丰度和模式，可利用抗-应激标记多肽的抗原结合分子(例如，单克隆抗体)来检测应激标记多肽(例如，在细胞裂解物或细胞上清液中的)。在本发明的某些优选应用中，可用这种抗原结合分子来监测生物学样品(含有完整的细胞和液体)中的应激标记多肽水平而诊断是否存在应激状态及其程度或应激所致疾病的风险。将抗体与可检测物质(即，抗体标记)相偶联(S卩，物理连接)有助于检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素与亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三吖嗪胺荧光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、荧光素和水母蛋白；合适的放射性材料的例子包括U5l、131^35s或3h。标记物可选自色原、催化剂、酶、荧光基团、化学发光分子、镧系离子，如铕(Eu3勺、放射性同位素和直接可见的标记物。就直接可见标记物而言，可用胶体金属颗粒或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或含有信号产生物质的其它载体等制备标记。美国专利说明书U.S.4,366,241;U.S.4,843,000和U.S.4,849,338公开了大量可用作标记物的酶。本发明可用的酶标记物包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。溶液中酶标记物可单独使用或与第二种酶联用。7.检测应激标记基因异常表达或等位基因的方法本发明部分基于以下发现与未经受应激的马相比，经受应激的马的某些基因或者这些基因的某些等位基因(本文称为应激标记基因)异常表达。有人提出在处于应激状态下的其它动物中发现这些基因或它们的同源物或直向同源物的异常表达。因此，本发明的特征在于通过检测取自某对象(优选哺乳动物)的生物学样品中某应激标记基因的异常表达来评估该对象的应激状态或诊断应激或应激相关疾病(应激后遗症)的方法。按照一些实施方案，所述相关疾病的特征在于皮质类固醇或其调节剂(例如，促肾上腺皮质激素释放因子)的水平升高。这种相关疾病的示范性例子包括身体应激，例如田径训练和身体外伤；情感障碍，例如抑郁，包括重度抑郁、单一事件抑郁(single印isodedepression)、复发性抑郁(recurrentdepression)、虐待儿童诱导的抑郁(childabuseinduceddepression).季节性情感障碍、产后抑郁、胸腺机能障碍(dysthemia)、双相性精神障碍和循环性情感；焦虑症，包括恐慌、恐怖症、强迫性精神失调；创伤后应激疾病；应激诱导的睡眠障碍；炎症；疼痛；慢性疲劳综合征；应激诱导的头痛；癌症；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病；肠胃疾病，例如溃疡、激惹性肠综合征、克罗恩病、痉挛性结肠炎、腹泻、术后肠梗阻和病理心理学失调或应激相关的结肠过敏症，-饮食疾病，如厌食和神经性贪食；核上麻痹(supranuclearpalsy);肌萎縮性侧索硬化症；免疫功能降低或免疫抑制；出血性应激；应激诱导的精神病发作(stress-inducedpsychoticepisode);甲状腺机能不正常综合征；抗腹泻激素(ADH)不适当综合征；暴食或肥胖症；不育症；头部创伤；脊髓创伤；缺血性神经元损伤(例如，脑缺血，如脑海马回缺血)；兴奋性中毒神经元损伤；癫痫；心血管疾病，包括高血压、心动过速和充血性心力衰竭；中风；免疫功能失调，包括应激诱导的免疫失调(如应激诱导的发烧、猪应激综合征、牛航运热、马阵发性颤抖与小鸡禁闭、绵羊急转向(sheering)应激或狗的人-动物相互作用相的关应激诱导的失调)；自制；行为(自发的)调节；肌肉痉挛；尿失禁；阿尔茨海默型早老性痴呆；多发性脑梗死性痴呆；肌萎縮性侧索硬化症；化学物质依赖性和成瘾性(例如，酒精、可卡因、海洛因、苯并二氮杂蕈类或其它药物)；药物和酒精戒除症状；骨质疏松症；社会心理(psych0S0cial)侏儒症；低血糖血症；脱发；昼夜节律异常；和昼夜节律异常相关的疾病，例如时区改变综合征、季节性情感障碍、失眠、睡眠-清醒模式不规律、迟发性睡眠阶段综合征、晚期睡眠阶段综合征、非-24小时睡眠清醒障碍、光诱导的时钟重设置症、REM睡眠障碍、睡眠过度、深眠状态、嗜眠症、夜间遗尿、下肢不宁综合征、睡眠呼吸暂停、精神抑郁症与抗抑郁药物长期给药和停药相关的心率异常。为作出评估或诊断，需要定性或定量测定应激标记基因转录物的水平、某应激标记基因的特定等位基因的存在或水平或应激标记多肽的水平或功能活性。在一些实施方案中，当生物学样品中存在的某应激标记基因产物的可检测水平低于取自正常对象或未处于应激状态的对象的参比样品中存在的该基因的水平时，则可诊断存在应激状态、其程度或阶段或者存在发生应激后遗症的风险。在其它实施方案中，当生物学样品中存在的某应激标记基因产物的可检测水平高于取自正常对象或未受应激的对象的参比样品中存在的该基因的水平，则可诊断应激的存在、程度或阶段或者发生应激后遗症的风险。总之，当生物学样品中的某应激标记基因产物的水平或功能活性与参比样品中相应的应激标记基因产物的水平或功能活性相比至少有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％、92%、94%、96%、97%、98%或99%，或甚至至少约99.5%、99.9%、99.95%、99.99%、99.995%或99.999%,或甚至至少约100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%的差异时，可作出这种诊断。代表性应激标记基因表达水平的示范性升高或降低见表6。相应的基因产物通常选自生物学样品中存在的同一基因产物、含有等位变体或剪接变体的变体基因(例如，同源或直向同源基因)所表达的基因产物或它们的蛋白质产物。在一些实施方案中，该方法包括检测至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种应激标记基因的各表达产物的水平或功能活性。生物学样品一般含有血液，特别是外周血，或其组分或提取物。生物学样品通常含有血细胞，例如成熟、不成熟和发育的白细胞，包括淋巴细胞、多形核白细胞、嗜中性白细胞、单核细胞、网织红细胞、嗜碱性粒细胞、腔胞、血细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、巨噬细胞、树突细胞、天然杀伤细胞，或这些细胞的组分(例如，核酸或蛋白质部分)。在特定的实施方案中，生物学样品含有的白细胞，包括外周血单核细胞(PBMC)。7.1核酸诊断方法可按照标准方法(Sambrook等，1989，同上；Ausubel等，1994，同上)从生物学样品所含细胞中分离核酸用于多核苷酸试验。所述核酸一般是分级的(例如，polyA+RNA)或全细胞RNA。当将RNA作为检测对象时，需要将RNA转化为互补DNA。在一些实施方案中，采用模板依赖性核酸扩增技术扩增该核酸。可采用许多模板依赖性方法来扩增某给定模板样品中存在的应激标记序列。示范性核酸扩增技术是详述于美国专利号4,683,195;4,683,202和4,800,159;Ausubel等(同上)和Innis等，(《PCR方法》(PCRProtocols),AcademicPress,Inc.,SanDiegoCalif.，1990)中的聚合酶链式反应(称为PCR)。简言之，在PCR中，制备与该标记序列的相对互补链上区域互补的两条引物序列。向反应混合物中加入过量的脱氧核苷三磷酸和DNA聚合酶，例如化《聚合酶。如果某样品中存在同源应激标记序列，这些引物将与该标记(序列)结合，聚合酶可通过添加核苷酸使该引物沿着标记序列延伸。通过升高或降低反应混合物的温度，延伸的引物可与标记(序列)解离形成反应产物，过量的引物可与标记(序列)和反应产物结合，而反复进行该过程。为定量测定所扩增的mRNA含量，可采用逆转录酶PCR扩增方法。将RNA逆转录为cDNA的方法是熟知的，其描述于Sambrook等，1989,同上。其它逆转录方法利用热稳定的RNA依赖性DNA聚合酶。WO90/07641描述了这些方法。本领域熟知聚合酶链式反应方法。在某些优选实施方案中，模板依赖性扩增包括实时定量测定转录物。例如，可采用实时PCR技术(Higuchi等，1992，万Zo&c/mo/ogy，10:413-417)定量测定RNA或DNA。通过测定PCR反应中完成相同数目扩增轮次处于线性范围内的耙DNA扩增产物的浓度，可以测定原始DNA混合物中特异性靶序列的相对浓度。如果DNA混合物是从分离自不同组织或细胞的RNA合成的cDNA，则可测定产生该靶序列的各组织或细胞的特异性mRNA的相对丰度。PCR产物的浓度与mRNA相对丰度之间的这种直接正比例关系只在PCR反应的线性范围内才正确立。可通过反应混合物中试剂的利用率测定该曲线平台部分靶DNA的终浓度，该终浓度独立于该靶DNA的原始浓度。另一扩增方法是EPONo.320308所公开的连接酶链式反应("LCR")。在LCR中，制备两对互补探针，在靶序列存在下每对与靶序列的相反互补链结合从而使它们毗邻。在连接酶存在下，此两对探针可相连形成一个单位。与PCR中一样，通过温度循环，结合的连接单位从靶序列上解离，然后用作连接过量探针对的"靶序列"。美国专利号4,883,750描述了与LCR相似，使探针对和耙序列结合的方法。也可使用PCT申请号PCT/US87/00880所述的QP复制酶。在此方法中，在RNA聚合酶存在下将具有与靶序列某区域相互补区域的RNA复制序列加入样品中。聚合酶可拷贝该复制序列，然后检测。利用限制性核酸内切酶和连接酶扩增在一条链的限制性位点含有核苷酸5'a-硫代-三磷酸的耙分子的恒温扩增方法也可用于扩增本发明的核酸，Walker等，(1992，尸亂胸/.颠t/U^，89:392-396)。链置换扩增(SDA)是进行核酸恒温扩增的另一种方法，该方法包括多轮链置换与合成，即切口平移。称为修复链式反应(RCR)的相似方法包括使几种探针与扩增的整个靶区域上退火，然后只对四种碱基中的两种进行修复反应。为便于检测将另两种碱基作为生物素化衍生物加入。SDA中采用了类似的方法。也可采用循环探针反应(CPR)检测特异性靶序列。在CPR中，具有非特异性DNA3'和5，序列与特异性RNA中段序列的探针与样品中存在的DNA杂交。杂交后，用RNA酶H处理反应(混合物)，探针的产物鉴定为消化后释放的不同产物。使原始模板与另一循环探针退火，重复进行此反应。还可采用英国专利申请号2202328和PCT申请号PCT/US89/01025所述的另一种扩增方法。在前一申请中，将"修饰的"引物用于PCR-样的模板和酶依赖性合成中。可用捕获部分(例如，生物素)和/或检测部分(例如，酶)标记修饰这些引物。在后一申请中，将过量的标记探针加入样品。在靶序列存在下，探针结合并被酶催化切割。切割后，靶序列完整释放进而与过量探针结合。标记探针的切割是靶序列存在的信号。其它核酸扩增方法包括转录扩增系统(TAS)，包括核酸序列扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989，/VocAto/"6*2，86:1173;Gingeras等，PCT申请WO88/10315)。在NASBA中，可通过临床样品的标准苯酚/氯仿提取、热变性、裂解缓冲液处理和微量离心(minispin)柱分离DNA和RNA或通过氯化胍提取RNA来制备用于扩增的核酸。这些扩增技术包括使具有靶特异性序列的引物退火。聚合后，用RNA酶H消化杂交的DNA/RNA杂种，对双链DNA分子再进行热变性。在两种情况中，通过加入第二条靶特异性引物然后聚合从而将单链DNA制成完全双链。然后用RNA聚合酶，例如T7或SP6多次转录该双链DNA分子。在恒温循环反应中，将RNA逆转录为单链DNA，然后转变为双链DNA，接着用RNA聚合酶，例如T7或SP6再一次转录。得到的产物无论是截短的还是完整的均显示为靶特异性序列。Davey等，EPONo.329822公开了核酸扩增方法，包括可用于本发明的循环合成单链RNA("ssRNA")、ssDNA和双链DNA(dsDNA)。ssRNA是逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)延伸的第一引物寡核苷酸的模板。然后利用核糖核酸酶H(RNA酶H，对含DNA或RNA的双螺旋中RNA特异性RNA酶)的作用除去得到的DNA:RNA双螺旋中的RNA。得到的ssDNA是第二引物的模板，该引物在5'(端)也含有与该模板同源的RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)的启动子序列。然后用DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I的大"Klenow"片段)延伸此引物，得到双链DNA("dsDNA")分子，其序列与引物之间的与原始RNA的相同，在一末端还含有启动子序列。合适的RNA聚合酶可利用此引物序列制备该DNA的多份RNA拷贝。然后这些拷贝可再进入循环从而导致快速扩增。适当地选择酶，可恒温进行此扩增(方法)而无需在每轮加入酶。由于此方法的循环性质，可选择DNA或RNA形式的起始序列。Miller等在PCT申请WO89/06700中公开的核酸序列扩增方案根据启动子/引物序列与单链靶DNA("ssDNA")杂交，然后转录该序列的多份RNA拷贝。此方案不是循环性的，即得到的RNA转录物不会产生新模板。其它扩增方法包括"RACE"禾B"单边(one-sided)PCR"(Frohman，M.A.，刊于《PCR方法方法与应用指南》(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications),科学出版社，N.Y.，1990;Ohara等，1989，亂廳A^/."S丄86:5673-567)。也可采用在含有所产生的"二-寡核苷酸"序列的核酸存在下连接两条(或多条)寡核苷酸从而扩增该"二-寡核苷酸"的方法来扩增靶核酸序列。Wu等，(1989，G譜w/oy，4:560)。取决于所用的方式，可采用上述模板依赖性扩增或在扩增后用第二种已知的核酸直接鉴定样品中感兴趣的应激标记核酸。然后检测所鉴定的产物。在某些应用中，可通过目测方法进行检测(例如，凝胶溴化乙锭染色)。或者，检测可包括通过化学发光、放射性标记的放射性闪烁照相术或荧光标记物或甚至通过利用电或热脉冲信号的系统来间接鉴定产物(AffymaxTechnology;Bellus，1994，JMacromo/.Sc/.尸we，J;7p/.CAem.，A31(l):1355-1376)。在一些实施方案中，可目测扩增产物或"扩增子"以证实应激标记序列的扩增。一种典型的目测方法包括用溴化乙锭染色凝胶，在UV光下观察。或者，如果扩增产物整体用放射性或荧光标记的核苷酸作了标记，可在分离后使这些扩增产物曝光x-射线胶片或在合适的激发光谱下目测。在一些实施方案中，可间接进行目测。扩增产物分离后，使标记的核酸探针与扩增的应激标记序列接触。探针优选与生色团偶联，但也可放射性标记。或者，探针可与结合伴侣，例如抗原结合分子或生物素偶联，而结合对的另一成员携带可检测部分或报导分子。所涉及的技术是本领域技术人员熟知的，可在许多分子方法的标准教科书(例如，参见Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)中找到。例如，用生色团或放射性标记的探针或引物可在扩增期间或其后鉴定耙(序列)。在某些实施方案中，采用本领域技术人员熟知的印迹技术定量测定靶核酸。Sourthern印迹利用DNA作为耙子，而Northern印迹利用RNA作为耙子。各方法可提供不同类型的信息，虽然cDNA印迹在许多方面与上述印迹或RNA相似。简言之，探针用于靶向固定于合适的基质上，往往是硝酸纤维素膜上的DNA或RNA。不同种类核酸在空间上应分开以便分析。这一般通过核酸的凝胶电泳，然后"印迹"到膜上来实现。随后，在促进变性和再杂交(rehybridisation)的条件下共同培育印迹的靶(序列)与探针(通常是作标记的探针)。因为探针设计为可与靶(序列)碱基配对，探针可在复性条件下与靶序列的一部分结合。然后除去未结合的探针，如上所述进行检测。检测/定量测定后，可将某给定对象中观察到的结果与对照反应(结果)或正常对象或无应激对象的统计学有效参比组作比较。以此方式可使所检测的应激标记核酸含量与疾病的进程或严重性相关联。本发明也考虑了如Kristensen等，(Biotechniques，30(2):318-322)所述的基因分型方法和等位基因鉴别方法和技术，这些方法和技术包括采用单一核苷酸多态性分析、高效液相层析、TaqManTM、液相层析和质谱。本发明也考虑了生物芯片技术，例如Hacia等(1996，Ato"reGw拍'"，14:441-447)和Shoemaker等(1996,AtowwGe""/"，14:450-456)所述的技术。简言之，这些技术包括快速而精确地分析许多基因的定量测定方法。通过寡核苷酸给基因加标签或者利用固定的探针阵列，可用生物芯片技术将靶分子分隔成高密度阵列并根据杂交筛选这些分子。也参见Pease等(1994，Prac.W加/.JcWU^.，91:5022-5026);Fodor等(1991，Sc/e"ce，251:767-773)。简言之，制备应激标记多核苷酸的核酸探针，如本文所概述，将其与用于筛选和诊断方法的生物芯片相连。可将连接生物芯片的核酸探针设计为基本上与特异性表达的应激标记核酸，即靶序列(无论是样品的靶序列还是其它探针序列，例如夹心测定中的序列)互补，从而使得耙序列与本发明的探针发生杂交。此互补性无需完美；靶序列与本发明的核酸探针之间可存在干扰杂交的一定数量的碱基对错配。然而，如果错配的数量太大以致于即使在最低严谨性杂交条件下也不发生杂交，则该序列不是靶序列的互补序列。在某些实施方案中，每条序列可利用多种探针，可利用重叠的探针或针对靶序列不同部分的探针。艮口，可用两种、三种、四种以上的探针(优选三种)构建具体靶(序列)的冗余度。这些探针可以是重叠的(即某些序列相同)或分离的。本领域普通技术人员应该知道，可以各种方式将核酸连接于或固定于固体支持物。本文的"固定的"或其语法等价体表示核酸探针与固体支持物之间的连接或结合在下述的结合、洗涤、分析和去除条件下足够稳定。结合可以是共价或非共价的。本文的"非共价结合"与其语法等价体表示静电性、亲水性和疏水性相互作用的一种或多种。非共价结合包括分子，例如链霉亲和素与支持物的共价连接与生物素化探针与链霉亲和素的非共价结合。本文的"共价结合"及其语法等价体表示两部分、固体支持物与探针至少通过一根键，包括CT键、兀键和配位键相连。探针与固体支持物之间可直接形成共价键，或者可通过交联接头或通过固体支持物或探针或此两种分子上所含的特异性反应活性基团来形成共价键。固定化也可包括联用共价和非共价相互作用。总之，本领域技术人员知道可以各种方式使探针与生物芯片相连。如本文所述，可先合成核酸，然后与生物芯片相连，或者可直接在生物芯片上合成。生物芯片包含合适的固体或半固体基板或固体支持物。"基板"或"固体支持物"表示可经修饰而含有适合与核酸探针相连或结合的多个不连续位点并适用于至少一种检测方法的任何材料。本领域技术人员知道可用的基板很多，包括但不限于玻璃与改性或功能化玻璃，塑料(丙烯酸、聚苯乙烯与苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM等)，多糖，尼龙或硝酸纤维素，树脂，二氧化硅或含硅与修饰的硅、碳、金属、无机玻璃、塑料的二氧化硅材料等。总之，这些基板可用光学方法检测并且不带荧光。所述基板一般是平的，虽然本领域技术人员知道也可利用其它构型的基板。例如，为对流过的样品进行分析而尽可能降低样品体积，可将探针置于试管的内表面。类似地，所述基板可以是可弯曲的，例如可弯曲的泡沬塑料，包括特定塑料制成的闭孔泡沫塑料。在某些实施方案中，本领域己知可在基板上合成寡核苷酸探针。例如，利用光聚合化合物和技术的光活化技术。在一示范性例子中，采用熟知的光版印刷技术，例如WO95/25116;稀95/35505;美国专利号5,700,637和5,445,934及其引用的参考文献中所述的技术原位合成核酸；这些连接方法构成AffymetrixGeneChipTM技术的基础。在一示范性生物芯片分析的例子中，使生物芯片上的寡核苷酸探针在有助于特异性杂交的条件下与怀疑含有一种或多种应激多核苷酸的核酸样品接触。可从生物材料的悬液中制备样品的DNA或RNA提取物(无论单链或双链)，或者研碎生物材料，或者按照细胞裂解步骤制备，所述步骤包括但不限于用SDS(或其它洗涤剂)、渗透压冲击、异硫氰酸胍和溶菌酶处理进行裂解。可用于本发明方法的合适DNA包括cDNA。可采用多种常用方法之一制备这种DNA，例如见Ausubel等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述。可用于本发明方法的合适RNA包括信使RNA、DNA转录的互补RNA(cRNA)或基因组RNA或次基因组RNA。可采用标准方法制备这种RNA,例如Ausubd等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述。可通过，例如超声波处理或用限制性核酸内切酶处理使cDNA片段化。优选使cDNA片段化从而使得到的DNA片段长于固定的寡核苷酸探针，但足够小而可在合适的杂交条件下快速接触固定的探针。或者，可采用上述合适的核苷酸扩增技术来选择并扩增cDNA片段，这涉及利用合适的随机或特异性引物。通常作可检测性标记靶应激标记多核苷酸从而可测定它们与各探针的杂交。通常用报导分子可检测性标记靶多核苷酸，该报导分子的示范性例子包括色原、催化剂、酶、荧光染料、化学发光分子、生物发光分子、镧系离子(例如，Eu3勺、放射性同位素和直接可见标记物。对于直接可见标记物，可利用胶体金属颗粒或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或含有信号产生物质的其它载体等。此类型的示范性标记物包括大胶体，例如金属胶体，如金、硒、银、锡和钛氧化物胶体。在一些将酶用作直接可见标记物的实施方案中，将生物素化的碱基掺入靶多核苷酸中。通过与链霉亲和素-报导分子温育来检测杂交。合适的荧光染料包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、R-藻红蛋白(RPE)和得克萨斯红(TexasRed)。其它示范性荧光染料包括Dower等(国际公布WO93/06121)中所讨论的。荧光染料也可参考美国专利5,573,909(Singer等)；5,326,692(Brinkley等)。或者，荧光染料可参考美国专利号5,227,487;5,274,113;5,405,975;5,433,896;5,442,045;5,451,663;5,453,517;5,459,276;5,516,864;5,648,270和5,723,218中所述。可购得的荧光标记物包括，例如荧光素亚磷酰胺，如Fluoreprime(Pharmacia)、FluorediteTM(Millipore)禾卩FAM(AppliedBiosystemsInternational)。放射性报导分子包括，例如可通过X-射线或磷酸成像(phosphoimager)技术检测的32p。可在适合于寡核苷酸探针与测试核酸(包括DNA或RNA)杂交的条件下进行杂交形成步骤。就此而言，可参考例如《核酸杂交，一种实用方法》(NUCLEICACIDHYBRIDIZATION,APRACTICALAPPROACH),(Homes和Higgins编)，(IRLpress,WashingtonD.C.，1985)。总之，杂交是否发生受寡核苷酸探针和所测试寡核苷酸序列的长度、pH、温度、一价和二价阳离子的浓度、杂交形成区中G和C核苷酸的比例、介质粘度和可能存在的变性剂的影响。这些可变因素也影响杂交所需时间。因此，优选的条件取决于具体应用。然而，可用常规方法确定这些经验性条件而无需过多实验。某些优选实施方案采用高度鉴别性杂交条件。例如，可参考Wallace等(1979，A^c/.A^si"，6:3543)，他描述了与含有一个内部碱基对错配的相似寡核苷酸探针作比较，可区别与靶序列完美匹配和完全同源的11-17个碱基长的寡核苷酸探针的杂交条件。也可参考Wood等(1985，iVoc.Ato/.JcW.Sd.t/&4，82:1585)，他描述了利用3M氯化四甲铵使11-20个碱基长的寡核苷酸杂交条件，其中杂交物的解链温度只取决于寡核苷酸探针的长度，而无论其GC含量。此外，Drmanac等(同上)描述了6-10个核苷酸长的寡聚物的严谨杂交条件，利用核苷酸类似物，例如"锁定核酸"不难获得相似的条件(Christensen等，2001，BiochemJ，354:481-4)。杂交反应一般可在有杂交缓冲液存在下进行，所述缓冲液任选含有杂交优化试剂，例如稳定剂(isostabilisingagent)、变性剂和/或复性加速剂。稳定剂的例子包括但不限于甜菜碱和低级四烷基铵盐。变性剂是通过干扰双链核酸碱基之间的氢键或核酸分子的水合作用来降低双链核酸分子解链温度的组合物。变性剂包括但不限于甲酰胺、甲醛、二甲基亚砜、四乙基乙酸酯(tetraethylacetate)、脲、异硫氰酸胍(guanidiumisothiocyanate)、甘油和离液盐。杂交加速剂包括核内不均一核糖蛋白(hnRP)Al和阳离子洗涤剂，如十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)和十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)、聚赖氨酸、精胺、亚精胺、单链结合蛋白(SSB)、噬菌体T4基因32蛋白和乙酸铵与乙醇的混合物。杂交缓冲液可含有浓度为约0.005-约50nM、优选约0.5-5nM、更优选约1-2nM的耙多核苷酸。使含有耙应激标记多核苷酸的杂交混合物与探针阵列接触并在室温培育适当时间以使靶多核苷酸中的靶序列与任何互补探针杂交。接触可发生在任何合适的容器中，例如设计用于盛放其上连接有探针的固体支持物的碟或小室。培育温度通常为核酸杂交所用的温度，例如约20-约75°C、如约25°C、约30。C、约35。C、约40。C、约45。C、约50°C、约55°C、约60。C，或约65。C。长度超过14个核苷酸的探针优选20-5(TC。对较短的探针而言，优选较低温度。将靶多核苷酸样品与探针培育足够时间使靶多核苷酸中的靶序列与任何互补探针之间达到所需杂交水平。例如，可在约45'C+A10t:在甲酰胺中杂交1-2天。杂交物形成步骤后，用含有与杂交步骤所用相同浓度的杂交优化剂的杂交缓冲液洗涤探针以除去任何未结合的核酸。此洗涤步骤只留下结合的靶多核苷酸。然后可检测探针以鉴定哪种探针与靶多核苷酸杂交。然后可检测杂交反应以确定哪种探针与相应的靶序列杂交。取决于和靶多核苷酸连接的报导分子的性质，可通过以下方式用仪器检测信号用光照射荧光标记物，用荧光计检测荧光；提供酶系统以产生可用分光光度计检测的颜色-,或者利用光反射仪检测染料颗粒或有色的胶体金属颗粒或非金属颗粒；利用放射性标记物或化学发光分子时采用辐射计数器或放射自显影术。因此，检测装置应适用于检测或扫描标记物相关的光，所述光可包括荧光、冷光、聚焦光束或激光。此时，可用电荷耦合器件(CCD)或光龟池来扫描微阵列中各位置探针:靶多核苷酸杂交物发射的光并直接在数字计算机上记录数据。在一些情况中，无需检测电子信号。例如，在酶促产生与核酸阵列模式相关的颜色斑点情况中，目测该阵列就可解释阵列上的模式。在核酸阵列的情况中，检测装置优选与模式识别软件相连从而将阵列的信号模式转化为普通语言遗传分布模式。在某些实施方案中，不同应激标记基因产物的特异性寡核苷酸探针采取核酸阵列形式，利用"芯片阅读器"检测阵列上报导分子所产生的信号。可采用"芯片阅读器"的检测系统如Pimmg等(美国专利号5,143,854)所述。芯片阅读器通常也包括一些信号加工过程来确定某具体阵列位置或元件处的信号是真阳性或者可能是假信号。示范性芯片阅读器例如Fodor等(美国专利号5，925，525)所述。或者，当阵列是由各种可寻址型标记的微珠混合物制成时，可采用流式细胞术检测该反应。7.2蛋白质诊断与本发明一致的是，存在异常浓度的应激标记蛋白质表明存在应激状态、及其程度或阶段或有发生应激后遗症的风险。可采用本领域已知的任何合适方法检验生物学样品中应激标记蛋白质的水平。例如，当应激标记蛋白质是酶时，可根据其催化活性或根据样品所含该蛋白质分子数来定量测定该蛋白质。可采用抗体技术，例如免疫组织学和免疫组织化学方法来检测组织样品中感兴趣蛋白质的水平。例如，用一抗(多克隆或单克隆)提供特异性识别，用第二检测系统检测一抗的存在(或结合)情况。可将可检测标记物，例如荧光标记物、放射性标记物或能产生可定量测定(如有色的)的产物的酶(如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)与二抗相偶联。在另一合适的方法中，可检测性标记一抗本身。因此可对组织切片作免疫组织学标记。在一些实施方案中，从生物学样品(例如，组织、细胞)中制备分析用蛋白提取物。可采用常规免疫印迹方法(Jalkanen等，1985，丄C"/.肠/.,101:976-985;Jalkanen等，1987，/Ce//.5z'o/.，105:3087-3096)经western-印迹或斑点/狭线实验(分析)这种提取物(例如，洗涤剂提取物)中感兴趣蛋白质的水平。其它有用的抗体方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。例如，蛋白质特异性单克隆抗体可用作免疫吸附剂与酶标记探针来检测和定量测定感兴趣的应激标记蛋白质。可采用线性回归计算机算法(参见'Lacobilli等，1988，5reaWCa"cerie"arc/zam/7Vea加ew"11:19-30)，参考标准制剂中的含量来计算样品中这种蛋白质的含量。其它实施方案可用针对感兴趣蛋白质的两种不同单克隆抗体，一种作为免疫吸附剂，另一种作为酶标记探针。此外，蛋白质捕获阵列领域的最新进展使得能同时检测和/或定量测定大量蛋白质。例如，滤膜上的低密度蛋白质阵列，如通用蛋白质阵列系统(Ge，2000，A^c/w'cJc/&，28(2):e3)釆用标准ELISA技术和扫描电荷耦联器件(CCD)检测器拍摄组成阵列的抗原图像。也开发了能同时检测临床分析物的免疫传感器阵列。目前已能用蛋白质阵列来分析体液中，例如健康或患病对象以及药物治疗前后对象血清中的蛋白质表达分布模式。蛋白质捕获阵列一般包含多种蛋白质捕获剂，它们各自确定了该阵列上空间位置不同的元件。蛋白质捕获剂可以是能结合蛋白质并将其固定在阵列上的蛋白质捕获剂位点的任何分子或分子复合物。蛋白质捕获剂可以是一种蛋白质，其在细胞中的天然功能是能特异性结合另一种蛋白质，例如抗体或受体。或者，蛋白质捕获剂可以是能特异性结合某蛋白质的部分合成或全合成或重组的蛋白质。或者，蛋白质捕获剂可以是在体外根据对特异性靶蛋白质或肽的结合亲和力选自诱变、随机或完全随机化与合成文库的蛋白质。所用的选择方法任选可以是本领域已知的展示方法，例如核糖体展示或噬菌体展示方法。或者，经体外选择得到的蛋白质捕获剂可以是能特异性结合靶蛋白质的DNA或RNA适体(参见，例如Potyrailo等，1998,爿"a/.C/zem.，70:3419-3425;Cohen等，1998,iVoc.Ato/.爿cadScZ.f/S^，95:14272-14277;Fukuda等，1997，7Vwc/dc爿c/^5y^.&广，37:237-238;得自SomaLogic)。例如，用Selex方法从寡核苷酸文库中选择适体，可通过共价连接，例如掺入溴化脱氧尿苷和紫外光活化的交联(光适体)来提高它们与蛋白质的相互作用。适体的优点在于易通过自动寡核苷酸合成来制备和DNA的稳定性和强度优良；可采用通用荧光蛋白质染色技术来检测结合情况。或者，体外选择的蛋白质捕获剂可以是多肽(例如，抗原)(参见，例如Roberts和Szostak，1997，iVoc.A^/.Sc/.OS^，94:12297-12302)。捕获分子的另一种阵列是通过"分子印刷"技术制成的阵列，其中的肽(例如，来自蛋白质的C-末端区域)用作模板在可聚合基质中产生结构互补的序列特异性空隙；然后这些空隙能特异性捕获具有合适的一级氨基酸序列的(变性的)蛋白质(例如，得自ProteinPrintTM和AspiraBiosystems)。示范性蛋白质捕获阵列包括通常称为抗体阵列的含有空间上可寻址的抗原结合分子的阵列，该阵列有助于大规模同时分析众多蛋白质来确定蛋白质组或蛋白质亚组。抗体阵列显示具有所需的特异性性质和可接受的背景，一些阵列可购得(例如，BDBiosciences,Clontech，BioRad和Sigma)。制备抗体阵列的各种方法已有报道(参见，例如Lopez等，2003，J.C/zramaMgr.S，787:19-27;Cahill，2000，7>e"A/"5/Wec/mo/og;;，7:47-51;美国专利申请公布2002/0055186;美国专利申请公布2003/0003599;PCT公布WO03/062444;PCT公布WO03/077851;PCT公布WO02/59601;PCT公布WO02/39120;PCT公布WO01/79849;PCT公布WO99/39210)。这些阵列的抗原结合分子至少可识别某细胞或细胞群所表达蛋白质的亚组，其示范性例子包括生长因子受体、激素受体、神经递质受体、儿茶酚胺受体、氨基酸衍生物受体、细胞因子受体、胞外基质受体、抗体、凝集素、细胞因子、丝抑蛋白、蛋白酶、激酶、磷酸酶、ras-样GTP酶、水解酶、类固醇激素受体、转录因子、热激转录因子、DNA-结合蛋白、锌指蛋白、亮氨酸拉链蛋白、同源域蛋白、胞内信号转导调节剂和效应物、凋亡相关因子、DNA合成因子、DNA修复因子、DNA重组因子.、细胞表面抗原、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶和HIV蛋白酶。在噬菌体展示或核糖体展示文库(例如，得自CambridgeAntibodyTechnology,Biolnvent,Affitech和Biosite)中选择后可通过常规免疫方法(例如，多克隆血清和杂交瘤)，或作为通常在大肠杆菌中表达的重组片段制备抗体阵列的抗原结合分子。或者，可将含非共价缔合的VH和VL结构域的"混合体(combibody)"制备为产生双抗体细菌克隆(例如，得自Domantis)组合物所产生的矩阵形式。用作蛋白质捕获剂的示范性抗原结合分子包括单克隆抗体、多克隆抗体、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2免疫球蛋白片段、合成的稳定Fv片段(如单链Fv片段(scFv)、二硫键稳定的Fv片段(dsFv))、单可变区结构域(dAbs)小抗体(minibody)、混合体和多价抗体(如双抗体和多-scFv)、camelids的单种结构域或工程改造的人等价抗体。空间位置不同的各蛋白质捕获剂通常连接在一般是平的或有起伏的支持物表面。常规物理支持物包括载玻片、硅、微孔、硝酸纤维素或PVDF膜与磁性微珠和其它微珠。虽然广泛采用将蛋白质微滴递送到平面上，但有关的其它构造包括基于微流体学进展开发的CD离心装置(例如，得自Gyros)和专门化的芯片设计，例如平面中工程改造的微通道(例如，TheLivingChip,得自Biotrove)和硅表面的微小3D柱(例如，得自Zyomyx)。也可将悬浮液中的颗粒用作阵列的基础，只要它们有身份编码；这些系统包括用颜色编码的微珠(例如，得自Luminex、Bio-Rad禾nNanomicsBiosystems)、半导体纳米晶体(例如，Qdots,得自QuantumDots)、棒形编码珠(UltraPlex,得自Smartbeads)和多金属微杆(NanobarcodesTM颗粒，得自Surromed)。也可将这些珠在半导体芯片上组装成平面阵列(例如，得自LEAPStechnology和BioArraySolutions)。当用颗粒时，各蛋白质捕获剂通常连接于各颗粒以提供空间确定位置或分开的阵列。然后分别(但同时)以隔离方式，例如在微滴定板的孔中或不同试管中检测这些颗粒。在操作中，将蛋白质样品任选片段化形成肽片段(参见，例如美国专利申请公布2002/0055186)，在适合于蛋白质或肽结合的条件下递送到蛋白质捕获阵列；洗涤该阵列将样品中未结合或非特异性结合的组分从阵列上洗去。然而，利用合适的检测系统检测存在的与阵列上各元件相结合的蛋白质或肽，或含量。与阵列上某元件相结合的蛋白质含量可相对于与该阵列第二元件相结合的第二蛋白质的含量来测定。在某些实施方案中，样品中第二蛋白质的含量己知或已知是不变的。为分析两种细胞或细胞群之间蛋白质表达的差异，将第一种细胞或细胞群的蛋白质样品在适合于蛋白质结合的条件下递送到该阵列。将第二种细胞或细胞群的蛋白质样品以类似方式递送到与第一阵列相同的第二阵列。然后洗涤两阵列将样品中未结合或非特异性结合的组分从阵列上洗去。最后，将维持与第一阵列元件相结合的蛋白质含量和维持与第二阵列的相应元件相结合的蛋白质含量作比较。为测定两种细胞或细胞群之间蛋白质表达模式的差异，将与第一阵列各元件相结合的蛋白质含量从与第二阵列的相应元件相结合的蛋白质含量中扣除。在一示范性例子中，可利用荧光标记检测与阵列结合的蛋白质。将与解读DNA微阵列所用相同的仪器应用于蛋白质捕获阵列。为差别展示，可用得自两种不同状态细胞的蛋白质作荧光标记后检测捕获阵列(例如，抗体阵列)，两种状态中细胞裂解物用不同荧光团(例如，Cy-3和Cy-5)标记并混合，从而可将颜色作为靶分子丰度改变的读数。通过酪酰胺信号扩增(TSA)(例如，得自PerkinElmerLifesciences)可将荧光读数灵敏度提高10-100倍。平面波导技术(例如，得自Zeptosens)能迸行超灵敏的荧光检测，其另一优点是无需洗涤。利用藻红蛋白作标记物(例如，得自Luminex)或利用半导体纳米晶体(例如，得自QuantumDot)性能的悬浮珠和颗粒也能实现高灵敏度。已采纳荧光共振能量转移来检测可用于阵列的未标记配体的结合(例如，得自Affibody)。已开发了几种其它读出装置，包括以下方法的改进装置表面等离振子共振(例如，得自HTSBiosystems和IntrinsicBioprobes)、滚动循环DNA扩增(例如，得自MolecularStaging)、质i普(例如，得自SenseProteomic，Ciphergen,Intrinsic和Bioprobes)、共振光散射(例如，得自GeniconSciences)和原子力显微镜(例如，得自BioForceLaboratories)。NextGen禾口PerkinElmerLifeSciences共同开发了用于样品与载玻片上的阵列自动培育和洗涤的微流体系统。在某些实施方案中，用于检测应激标记表达产物的技术包括内部或外部标准品来定量或半定量测定那些产物，从而能有效地比较生物学样品中这些表达产物与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性。技术人员采用标准方法可以确定这种标准品。具体实施例中测定了各表达产物的水平或功能活性的绝对值。在特定的实施方案中，可利用如国际公布号WO02/090579和2003年11月14日提交的待批PCT申请号PCT/AU03/01517中所述的，包括至少一个与基站相耦联的终端站的系统来执行此诊断方法。基站通常与一个或多个数据库相耦联，这些数据库含有来自大量个体的代表应激标记表达产物的水平或功能活性的预定数据以及代表收集这些预定数据时这些个体实际状态征候令(例如，应激存在与否、其程度、阶段或发生应激后遗症的风险)。在操作中，基站一般通过通信网络从终端站接受数据并将所述数据与存储在数据库中的预定数据作比较，所述数据代表对应于取自测试对象的生物学样品中至少一种表达产物的检测或标准化水平或功能活性。将该对象的数据与预定数据作比较使基站能根据比较结果确定该对象的状态。因此，基站试图鉴定具有相似参数值的个体与测试对象，一旦根据该鉴定(结果)而确定了状态，基站会将诊断指令送至终端站。7.3试剂盒可将检测与定量测定应激标记基因表达产物所需的所有必需材料和试剂一起组装在试剂盒中。这些试剂盒也任选装有检测标记物的合适试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微滴定板稀释缓冲液等。例如，核酸检测试剂盒可装有(i)应激标记多核苷酸(可用作阳性对照)，(ii)能与某种应激标记多核苷酸特异性杂交的引物或探针。也可装有适用于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(逆转录酶，Taq，S叫uenaseTMDNA连接酶等，取决于所采用的核酸扩增技术)，脱氧核苷酸和缓冲液以提供扩增所需的反应混合物。这种试剂盒一般以合适的方式装有各种试剂和酶以及各种引物或探针的不同容器。或者，蛋白质检测试剂盒可装有(i)应激标记多肽(可用作阳性对照)，(ii)能与某应激标记多核苷酸发生免疫相互作用的抗原结合分子。该试剂盒的特征也在于装有进行本文所述试验的各种装置和试剂；和/或印制的用该试剂盒定量测定应激标记基因表达的使用说明书。7.4监测免疫功能本发明也提供通过检测某对象的一种或多种应激标记基因表达产物水平或功能活性来监测免疫功能的方法。当所检测的水平或功能活性与取自一位或多位正常对象或一位或多位未处于应激状态下的对象的参比样品中相应表达产物检测到的水平或功能活性相同或相似时，这一般表明该对象未处于应激状态下，具有正常的免疫功能。相反，当所检测的水平或功能活性与相应表达产物检测到的水平或功能活性不同时，这一般表明该对象处于应激状态下，因而免疫功能降低(或免疫抑制)。正常免疫功能对有效抵御疾病和天然攻击的最后保护很重要。此外，免疫功能对获得对疫苗接种的有效免疫应答很关键，就此而言，所鉴定的应激标记也可用作监测个体的免疫系统何时接种疫苗方能产生导致最佳保护水平的免疫应答。例如，就竞赛动物，如人类运动员和赛马而言，以此方式监测免疫系统能使竞赛动物(performanceanimal)或其教练降低可能导致对疫苗接种产生不适当或非保护性免疫应答的潜在应激状态。如利用所鉴定的应激标记测定的那样，当竞赛动物的免疫系统恢复后，可进行疫苗接种。所鉴定的应激标记也可用于评估免疫系统对疫苗制剂的应答。对疫苗接种产生不适当免疫应答时，可决定再次接种，或改变接种方案，或延迟接种方案直至除去了潜在的应激状态(影响免疫功能的)和动物的免疫系统恢复。例如，已知已有可用于马疱疹病毒的疫苗制剂。它在兽医学领域广为使用，特别是用于妊娠母马从而可通过传递乳汁抗体(初乳)赋予幼驹一定的保护作用。妊娠和产后时期是高应激和免疫调节时期。可利用所鉴定的应激标记监测这些时期的免疫功能来安排疫苗接种时间从而产生合适的与保护性疫苗应答。或者，可利用应激标记水平根据监测到的对疫苗接种的免疫应答来修改疫苗接种方案。8.治疗或预防方法在对象有发生应激后遗症风险诊断阳性后，本发明也可拓展至治疗或预防对象的应激状态。总体上，治疗包括给予诊断阳性对象有效量药物或疗法以改善症状或逆转应激的发生，或降低或消除上述应激相关疾病，或降低对象发生应激相关疾病的可能性。目前适用于治疗应激的药物包括但不限于美国专利号6，723，721;6,670,371;6,664,261;6,586,456;6,548,509;6,323,312;6,255,310所述的促肾上腺皮质激素释放因子拮抗剂；美国专利申请公布号20020169152公开的糖皮质激素受体拮抗剂；美国专利号6,642,209所述的腺苷化合物；美国专利号6,455,542所述的一氧化氮供体；美国专利号6,444,700;6,391,332和6,218,420所述的营养组合物；美国专利号6,416,795公开的草药提取物；美国专利号6，087，348公开的NK-1受体拮抗剂；美国专利号6,077,867所述的脂肪酸组合物；美国专利申请公布号20040101934公开的酵母菌产生的肽衍生物；和美国专利申请号20020183300所述的锌离子载体。或者，可采用本领域已知的应激缓解方法治疗对象，包括例如去除或降低对象环境中的应激源水平；如美国专利申请公布号20030233124所述，用电场改变通过细胞膜的离子流。然而，应该知道本发明包括可用于治疗或预防应激的任何药物或方法，并不限于上述的示范性化合物和制剂。应激缓解药物一般与药学上可接受的载体组成药物(或兽医学)组合物以有效量给予来达到它们所需的目的。给予对象的活性化合物的剂量应在一段时间内足以在对象中实现有益应答，例如降低或减轻应激症状。待给予的药学活性化合物的用量取决于待治疗的对象，包括其年龄、性别、体重和全身健康状况。就此而言，所给予的活性化合物的精确用量取决于从业医师的判断。在确定给予治疗或预防应激的活性化合物的有效量过程中，医师或兽医可评估应激存在相关症状的严重性，包括上述应激后遗症相关症状。在任何情况中，本领域技术人员不难确定应激缓解药物的合适剂量与合适的治疗方案而无需过多实验。应激缓解药物可与辅助性治疗联合给予以降低对象的异常免疫应答。这类辅助性治疗的示范性例子包括但不限于除去应激源、瑜伽、冥想、针灸、按摩、适度运动和呼吸锻炼。为便于理解本发明和付诸实施，通过以下非限制性实施例描述了特别优选的实施方案。实施例实施例1鉴定应激的特异性诊断基因利用含有马白细胞所表达的几千种基因的GeneChipsTM(使用方法详述于下文"基因表达数据的产生")分析取自经受48小时期运输应激的20只动物的血液样品。分析这些数据(参见下文"鉴定应答基因与证明诊断潜力")揭示第0天到第28天特异性基因有差别表达。利用至少一种，优选至少两种应激标记基因设计的试验可以检测样品中的RNA水平，所述应激标记基因的代表性序列如下所示SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248。丽与方法采血从马匹(非激动状态)采血提取高质量的RNA或蛋白质。收集、保藏、转运和分离RNA的合适采血试管包括PAXgeneTM试管(PreAnalytixInc.,Valencia,CA，USA)。或者，可将血液采集入含有设计用于保藏核酸的溶液(得自Roche，Ambion，Invitrogen和ABI)的试管中。为测定蛋白质水平，将50ml血液收集入含有4ml4%柠檬酸钠的试管中防止凝结。分离白细胞和血桨，冷冻保藏用于随后特异性蛋白质的分析与检测。将PAXgene试管维持于室温，然后提取RNA。以标准格式记录临床体征。提取总RNAQiagenInc(Valencia,CA，USA)的试剂盒装有用于分离收集在PAXgene血液RNA试管中2.5ml血液的总RNA的试剂和使用说明书。分离从离心沉淀PAXgene血液RNA试管中的核酸开始。用含有蛋白酶K的优化缓冲液洗涤、重悬并培育沉淀物以消化蛋白质。再离心一次除去残留的细胞碎片，将上清液转移至新鲜的微离心管中。加入乙醇调节结合条件，将裂解物加到PAXgeneRNA旋转柱上。在简单离心期间，RNA选择性地与硅胶膜结合，而污染物流出。经三次有效洗涤步骤除去残留的污染物，然后用缓冲液BR5洗脱RNA。提取前要用Agilent生物分析仪和分光光度计以吸光度260/280比值定量和定性测定RNA。DNA提取QiagenInc(Valencia,CA，USA)的试剂盒装有用于分离收集在PAXgene血液RNA试管中8.5ml血液的总DNA的试剂和使用说明书。分离从加入额外的裂解溶液开始然后离心。用含有蛋白酶K的优化缓冲液洗涤、重悬并培育沉淀物以消化蛋白质。乙醇沉淀DNA，再离心一次沉淀核酸。洗涤除去残留污染物，然后将DNA重悬于缓冲液BG4中。提取前要用分光光度计或琼脂糖凝胶龟泳定量和定性测定DNA。产生基因表达数据选择方法可采用各种技术检测组织样品中的特异性RNA水平。本领域熟知的两种常规且易于使用的技术是采用Affymetrix技术的GeneChip⑧分析；实时聚合酶链式反应(例如，AppliedBiosystems的TaqMan)。GeneChips⑧通过检测与构建在硅基板上的短寡核苷酸杂交的标记cRNA来定量测定RNA。该技术和方法详见www.affymetrix.com。实时聚合酶链式反应(RT-PCR)利用两种PCR引物、标记的探针和热稳定的DNA聚合酶来定量测定RNA。PCR产物产生时将一种染料释放入溶液，检测之。内部对照，例如18SRNA探针常用于测定样品中总RNA的起始水平。各基因与内部对照分别测定。该技术和方法详见www.appliedbiosytems.com或www.qiagen.comorwww.biorad.com。AppliedBiosystems提供以下服务即客户提供DNA序列信息并负费，作为回馈该公司提供对各基因进行RT-PCR所需的全部试剂。GeneChip⑧分析的优点在于一次能分析数千个基因。然而，该分析花费大且进行一次试验要3天以上。RT-PCR—般一次只能分析一种基因，但廉价并且能在一天内完成。如果待分析的具体基因数量少于20，则RT-PCR是可选的基因表达分析方法。当需要同时分析许多基因时，GeneChip⑧或其它基因表达分析技术(例如Illumina珠阵列)是可选的方法。用于产生和分析GeneChip⑧数据与实时PCR的方法概述于下文。产生GeneChip⑧数据制备cDNA和cRNA以下用于从总RNA制备cDNA和cRNA的方法采用Affymetrix(www.affymetrix.com)提供和推荐的方法。步骤是总共3pg的总RNA用作模板来制备双链cDNA。制备cRNA并用生物素化尿嘧啶(dUTP)作标记。纯化(clean)生物素作标记的cRNA，利用分光光度计和MOPS凝胶分析定量测定。将作标记的cRNA片段化为300bp大小。利用Agilent"Lab陽on-a-Chip"系统(AgilentTechnologies)测定RNA含量。杂交、洗涤和染色步骤是制备含有0.05pgL作标记和片段化的cRNA、spike-in阳性杂交对照和Affymetrix寡核苷酸B2、bioB、bioC、bioD和cre的杂交混合物。将终体积(80pL)的杂交混合物加入GeneChipTM药盒中。将该药盒置于恒定转速的杂交炉中，16小时。去除GeneChipTM中的液体并保存。将GeneChipTM置于流体站中。将各GeneChip的实验条件以.EXP文件记录。加入合适的溶液后，Affymetrix流体站执行所有的洗涤和染色过程。洗涤GeneChip,用链霉亲和素-藻红蛋白染料染色，然后用低盐溶液再次洗涤。洗涤完成后，用激光"激发"探针阵列上的染料，用Affymetrix扫描仪(Agilent制造)通过CCD照相机拍摄图像。扫描和产生数据文件扫描仪和MAS5软件产生一站GeneChipTM的图像文件，称为.DAT文件(参见背面的图)。预处理.DAT文件后进行统计学分析。数据的预处理步骤(在任何统计学分析之前)包括.DAT文件的质量控制(QC)。产生.CEL文件。测量和标准化。.DAT文件的质量控制.DAT文件是一种图像。手工检査这些图像有人为因素(artifact)(例如，高/低强度斑点，划痕，高局部性或总背景)。(通过改变产生边界的强度模式和阵列名称不难鉴定B2寡核苷酸阵列的杂交性能)。MAS5软件利用B2寡核苷酸边界来比对图像上的栅格从而可集中和鉴定各方块的寡核苷酸。利用其它尖头(spiked)杂交对照(bioB、bioC、bioD和cre)通过读取随信号值增加，反映它们相对浓度的"本"基因检测呼叫来评估样品的杂交效率。(如果.DAT文件具有合适的质量，用AffymetrixMAS5软件将其转化为强度数据文件(.CEL文件))。产生.CEL文件用MAS5软件从.DAT文件产生的.CEL文件包含计算的该探针组的原始强度。从各细胞(测定)值中扣除计算的背景值得到基因表达数据。为除去阴性强度值，应用基于最低2%背景值的标准偏差的局部噪声值的噪声校正组分。将GeneChipTM产生的所有.CEL文件应用于特定的质量衡量标准参数。一些衡量标准由Affymetrix常规推荐，可从作为GeneChipTM的一部分提供的Affymetrix内部对照测定。其它衡量标准根据经验和包括许多GeneChipTM的处理加工。分析GeneChip⑧数据可用于数据标准化的三种示范性方法是AffymetrixMAS5算法。Irizarry的可靠多芯片分析(RobustMulti-chipAnalysis)(RMA)算法(Wzarray等，2002，(印刷中))。可靠多芯片分析保留模型(RobustMulti-chipAnalysisSavedmodel)(RMAS)本领域技术人员应知道可采用许多其它方法而不会对本发明有实质影响。AffymetrixMAS5算法AffymetrixMAS5软件利用.CEL文件来标准化或测量数据。将一块芯片的测量数据与另一芯片的相似测量数据作比较。对.CEL文件应用MAS5算法的默认"球形定标(GlobalScaling)"选项来实现AffymetrixMAS5标准化。此方法扣除了探针值的分布中心的可靠估计值，再除以探针可变性的可靠估计值。这产生了在探针水平具有共同位置和量度的一组芯片。通过对某给定基因的所有探针对采用可靠求平均方法产生基因表达指数。将结果强制定为非阴性。鉴于在探针水平而不是在基因水平进行测量，那即使标准化后在总体基因表达水平上也可能存在芯片与芯片的差异。将标准MAS5标准化后，根据芯片强度中值使各基因值去趋势(de-trend)。SP，各基因值根据芯片强度中值回归，计算残差。取这些残差作为各基因表达去趋势的估计值。用AffymetrixMAS5算法计算芯片强中值度，但量度因子固定为一。RMAS分析除了用chip.cel文件的长期文库建立探针权重和耙分位数(quantile)，和不对这些具体芯片再重复计算外，此方法与RAM方法相同。在探针水平再次进行标准化。产生实时PCR数据在例如http:〃dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html禾卩BustinSA的综述(2000，J7kfo/五/^/ocnV70/，25:169-193)中可获得执行实时PCR的背景信息。TaqManTM引物和探针设计指南1.PrimerExpress(ABI)软件设计了解链温度(Tm)为58-60。C的引物和Tm值为l(TC以上的探针。两种引物的Tm应该相同；2.引物应长15-30个碱基；3.G+C含量优选30-80%。如果G+C含量较高无法避免，则需要采用高退火和解链温度，用共溶剂，例如甘油、DMSO或7-脱氮杂-dGTP;4.应避免成串的相同核苷酸。这对G而言尤其重要，不可以有4个以上的G串；5.引物3'末端的最后5个核苷酸中G和C的总数应不超过2个(较新版本的该软件具有自动执行此功能的选项)。这有助于在引物的3'末端引入相对不稳定性从而减少非特异性引发。引物条件与SYBRGreen试验的相同；6.最大扩增子的长度不应超过400bp(优选50-150个碱基)。较小的扩增子能得到更一致的结果，因为PCR更有效且对反应条件更耐受(长度短的需求与5'核酸酶活性的功能无关)；7.该探针不应含有成串的相同核苷酸(特别是4个以上的连续G)，G+C含量应为30-80%，C应比G多，5'末端不应是G。C的数量越多，产生的ARn越高。应先选择探针；8.为避免因扩增了cDNA制剂中污染性基因组DNA所致的假阳性，引物宜跨越外显子-外显子连接区。这样不会扩增基因组DNA(用于人GAPDH扩增的PDAR试剂盒装有这种引物)；9.如果用设计的TaqManTM探针来区别等位基因，错配的核苷酸(多态性位点)应在探针中间而不是两端；10.可利用3'末端附近含有dA核苷酸的引物从而可用AmpEraseUNG有效地降解所产生的任何引物二聚体(见EZRT-PCR试剂盒手册的第9页；P/N402877)。如果不能选择在这些末端附近含有dA核苷酸的引物，则应考虑利用具有3'末端dU-核苷酸的引物。(也可参见Invitrogen的《PCR引物设计》(PCRPrimerDesign)的普遍原理)。通用方法1.用随机六聚体(不含有寡聚-dT)将总RNA逆转录为cDNA。如果不得不用寡聚-dT，则应避免上游大于两千碱基的长mRNA转录产物或扩增子，18SRNA不能用作标准品；2.多重PCR只在对照引物有限时可正确进行(ABI对照试剂不限制它们的引物)；3.靶cDNA用量范围是10ng-lpg。如果用DNA(主要用于等位基因鉴别研究)，最佳用量是100ng-l叱；4.理想地是用不含RNA酶的DNA酶处理各RNA制品以避免基因组DNA污染。即使是最佳的RNA提取方法也会产生一些基因组DNA。当然最好有根本不扩增基因组DNA的引物，但有时这不可能；5.为得到最佳结果，试剂(在制备PCR混合物之前)和PCR混合物本身(加样之前)应充分振荡(vortex)与混合。否则在PCR的早期轮次(0-5)中Rn值可能会有漂移。在配制试剂混合物之前将探针加入缓冲液组分使其在室温下平衡也很重要。TaqManTM引物和探针定购自ABI的中等规模(midi-scale)TaqManTM探针收到时是100pM的混悬液。如果制备l/20稀释液，则得到5^M溶液。此储备溶液应分为等份、冷冻并闭光保存。在50pL反应体积中其用量为1^L得到推荐的100nM终浓度。引物收到时是冻干的，含量以pmol标在试管上(例如150.000pmol等于150nmol)。如果将Xnmol的引物重悬在X^L水中，得到的溶液是1mM。最好将此储备液分成等份冷冻。当将1mM储备液稀释IOO倍时，得到的工作溶液是10^M。为使50反应体积中的最终引物浓度为推荐的50-卯0nM，应每次反应用0.25-4.50fiL(500nM终浓度用2.5pL)。PDAR引物和探针以保存于一个试管中的混合物提供。它们在50pL反应体积中用量为2.5^L。设置一步TaqManTM反应一步实时PCR将RNA(与cDNA相反)用作模板。如果RNA溶液浓度低则优选此方法，但只是在进行单重反应时。缺点是防止酶AmpErase作用而剩下的RNA不能用于一步反应中。在此方法中，逆转录和实时PCR发生在同一试管中。下游PCR引物的作用也是逆转录酶的引物(随机六聚体或寡聚-dT不能用于一步RT-PCR中的逆转录)。一步反应需要较高的dNTP浓度(大于或等于300mM与200mM)，因为该反应合并了各自需要dNTP的两种反应。GoldRT-PCR试剂盒的一步PCR所用的典型反应混合物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>如果用PDAR，则用2.5的引物+探针。此反应优选用10pg-100ngRNA。注意将模板用量从100ng降低至50ng将使CT值增加1。为使&值降低3，起始的模板用量应增加8倍。ABI宣称此系统可检测到2皮克的RNA,RNA的最大用量可以是1微克。为进行常规分析，可用lOpg-100ng的RNA和100pg-1pg基因组DNA。一步PCR的循环参数逆转录(MuLV)，48°C30分钟。AmpliT叫活化，95°CIO分钟。PCR:95t:变性15秒，6(TC退火/延伸1分钟(重复40次)(OnABI7700，最低维持时间是15秒)。最新介绍的EZone-stepRT-PCR试剂盒可利用UNG，因为利用了热稳定性逆转录酶使得逆转录的培育时间是6CTC。此温度也是避免48"C形成引物二聚体和非特异性结合的较好选择。操作ABI7700:开始运行前应确认以下事项1.运行的循环参数正确；2.光谱补偿的选择正确(单重反应选0#，多重反应选O");3.AnalysisOptionsbox(分析选项框)(Analysis(分析)/Options(选项))中的"NumberofPCRStages(PCR阶段数)"选择正确。如果扩增图中没有数据，但在平面图中可见，并且扩增(图)的X-轴显示O-l轮，则在运行一次后必须手动设定此(参数)。4.模板对照(TemplateControl)不如此标记(为精确计算ARn);5.数据分析前应正确选择染料组分；6.你必须在运行开始前给予名称(不能维持未命名)并保存；7.在运行结束时，先保存数据再开始分析；(使用)ABI软件需要极其谨慎。揿下Run(运行)按钮后不要试图停止运行。你有问题并如果需要开关机器时，必须等至少1小时才能重新启动运行。当分析数据时，记住默认的基线设置是3-5。如果任何CT值<15，应随之改变基线(基线停止值应比最小的CT值小1-2)。此问题的有用讨论见《ABI基线与阈值设置指南》(ABITutorialonSettingBaselinesandThresholds)。(有趣的是，此问题的最佳讨论见TaqManTM人内源性对照板(HumanEndogenousControlPlate)的手册中)。如果结果没有意义，检查原始光谱看运行期间CDC照相机(是否)可能饱和。利用光学盖(opticalcap)而不是光学粘性罩(opticaladhesivecover)可防止CDC照相机饱和。当利用SYBRGreenI、多重(反应)和高浓度探针时，更可能发生(CDC照相机饱和)。结果解析每次反应结束时，所记录的荧光强度用于以下计算Rn+是含所有组分的反应的Rn值；Rir是未反应样品的Rn值(基线值或NTC中检测的值)。ARn是Rn+与Rn-之间的差异。它是PCR产生的信号数量级指标。定量测定模板含量有三种示范性方法1.绝对标准方法:在此方法中，用含量已知的标准品，例如体外翻译的RNA(cRNA)。2.相对标准方法:每次运行的试验设计中包括己知量的靶核酸；3.比狡性Ct方法:此方法不用含量已知的标准品，而是比较靶序列的相对量与选择的任何参比值，结果以相对于参比值(例如静息淋巴细胞或标准细胞系的表达水平)给出。基因表达的相对定量测定的比较性CT方法(AACT):此方法在观察相对于活性参比对照物(标准品)的表达水平时无需制作标准曲线即能相对地定量测定模板并增加样品处理量。为成功实施此方法，应使靶标和参比物的动态范围相似。控制此(动态范围)的灵敏方法是观察AC丁(同一起始模板用量作两次PCR所得两个CT值之间的差异)如何随模板的稀释度而变化。如果这两种扩增子的效率大致相等，将输入量的对数与ACT作图得到接近水平的线(斜率〈0.10)。这表示在起始模板用量范围内进行的两次PCR效率相同。如果该图显示效率不相等，应采用标准曲线方法来定量测定基因表达。应测定(l)靶标的精确最低和最高浓度和(2)两种基因含量的精确最低和最高比例这二者的动态范围。在常规竞争性RT-PCR中，该动态范围限制在靶标-竞争物比例约为10:1-1:10(1:1的比例可获得最佳精确性)。实时PCR能实现更广泛的动态范围。在不同试管中扩增耙标和内源对照物与采用标准曲线方法几乎不需要优化和验证。采用比较性CT方法的优点在于无需制作标准曲线(样品可利用更多的孔)。该方法也消除了制作标准曲线样品可能产生的任何稀释误差的负面影响。只要靶标和标准品具有相似的动态范围，比较性Ct方法(AACt方法)是最实用的方法。预计标准品比靶标的表达水平高(因此，Ct僮狡低)。从得到靶标和标准品的CT值之间的差异(ACT)开始定量计算ACT=CT(靶标)-CT(标准品)计算待定量的各样品的此值(除非靶标的表达水平高于标准品，此值应为阳性值。如果是阴性也无害)。每次比较选择这些样品之一作为参比品(基线)。比较性AACT计算包括找到各样品ACT与基线ACT之间的差异。如果基线值表示最低表达水平，则预计AACT值是阴性(因为基线样品的ACT最大，由于它具有最大CT值)。如果一些样品中表达增加，而另一些中减少，AACT值将是阴性和阳性数值的混合值。定量测定的最后一步是将这些数值转化为绝对值。此计算公式是比较性表达水平=2_AACT与基线水平相比，(样品)表达增加约23=8倍，而(样品)表达降低约为参比品水平的2-3=1/8。通过简单地输入Ct值用微软Excel进行这些计算(ABI在http:〃www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/7700amp/有关于利用扩展层程序(spreadsheetprogram)来产生扩增图的在线指南；TaqMan人内源性对照板(HumanEndogenousControlPlate)方法也包括有关用MSExcel进行实时PCR数据分析的详细说明)。其它(绝对)定量方法概述于ABI用户公告(http:〃docs.appliedbiosystems.com/search.taf_UserReference=A8658327189850A13A0C598E)。公告#2和#5对全面理解实时PCR和定量最有用。推荐方法1.利用正位移移液管(positive-displacementpipette)以避免移液不精确；2.实时PCR的灵敏度可检测出2pg总RNA中的靶标。反应中总RNA的拷贝数宜足够从而可通过25-30轮即产生信号(优选低于100ng)。为实现此目的应降低或增加用量；3.各试剂的最佳浓度如下；i.氯化镁的浓度应是4-7mM。对用PrimerExpresssoftware(引物表达软件)设计的引物/探针而言最佳是5.5mM;ii.除dUTP夕卜(如果使用的话)，各dNTP的浓度应平衡。用dUTP取代dTTP来控制PCR产物残留需要dUTP浓度是其它dNTP的两倍。虽然dNTP浓度的最佳范围是500mM(—步RT-PCR)，但典型的TaqMan反应(只是PCR)的各种dNTP采用200(400的dUTP);iii.通常向每50pL反应中加入0.25pL(1.25U)AmpliTaqDNA聚合酶(5.0UL)。这是最低要求。如果需要，可将此量增加0.25U达到最优；iv.最佳探针浓度是50-200nM，引物浓度是100-900nM。应对三种不同温度(TaqMan引物的58、60和62。C)和三种浓度(50、300、900nM)的各种组合优化各对引物。这意味着设置了不同的三组(三种温度)，每组利用固定量的靶模板有九种反应(50/50mM、50/300mM、50/卯0、300/50、300/300、300/，、900/50、900/300、900/900mM)。如果需要，可(进行)第二轮优化来改善结果。可通过选择可提供最低CT和最高ARn的引物浓度来实现最佳性能。类似地，应将探针浓度优化为25-225nM;4.如果用AmpliTaqGoldDNA聚合酶，为实现此目的需要在PCR前于92-95T加热9-12分钟。如果用AmpliTaqGoldDNA聚合酶，无需将反应设置在冰上。典型的T叫Man反应包括50°C2分钟UNG(参见下文)培育；95°C10分钟活化聚合酶；和95°C15秒(变性)40轮与60°C1分钟(退火与延伸)。如果起始材料是总RNA，在TaqMan反应之前应进行典型的逆转录循环，该循环(cDNA合成)由25。C10分钟(引物培育)，48。C30分钟(利用常规逆转录酶进行逆转录)和95°C5分钟(灭活逆转录酶)；5.向该反应中加入AmpErase尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)来除去掺入扩增子中的任何尿嘧啶防止残留的PCR产物再扩增。这是PCR反应中为何使用dUTP而不是dTTP的原因。UNG在55'C以上不起作用，不切割含末端dU核苷酸的单链DNA。除非逆转录和PCR使用rrADNA聚合酶，否则含UNG的主混合物不应与一步RT-PCR联用(TaqManEZRT-PCR试剂盒)；6.每块反应平板中必需包含至少三份非扩增对照(NAC)以及三份非模板对照^丁(:)(为在确定的耙标扩增+/-阈值这达到99.7%可信度水平，必须进行一式六份NTC)。NAC加样板含有样品，不含酶。需要排除样品中或热循环仪的加热块(heatingblock)中荧光污染物的存在(这些污染物可导致假阳性)。如果PCR后NAC的绝对荧光大于NTC，样品中或热循环仪的加热块中可能存在荧光污染物。7.如果要将AACT方法用于相对定量测定，应核査引物/探针系统及其标准品的动态范围。通过以5种RNA浓度(例如，0、80pgL、400pgL、2ng/^L和50ng/^iL)进行(一式三份)反应来实现此核查。相同的总RNA浓度范围的靶标和标准品进行实时RT-PCR得到的起始含量的对数与CT值作图(标准曲线)应该是(接近)直线；8.被动参比物是加入'反应中的染料(ROX)(存在于TaqMan通用PCR主混合物中)。它不参与5'核酸酶反应。它提供了背景发射荧光的内部参比物。可用此来标准化受体-染料信号。对孔与孔之间(浓度或体积差异)或随时间变化发生的非PCR相关荧光波动进行此标准化，不同于对cDNA用量或PCR效率进行的标准化。将报导染料的发射光强度除以被动参比物的发射光强度实现标准化。得到的比值定义为Rn;9.如果进行多重(反应)，更丰富的靶标将在其它靶标得以扩增之前耗尽所有的反应成分。为避免此种情况，对更丰富靶物质应限制引物的浓度；10.TaqMan通用PCR主混合物应保存于2-8°C(不是-20°C);11.用JOE报导染料标记TaqManGoldRT-PCR试剂盒提供的GAPDH探针，用VIC标记Pre-DevelopedTaqManAssayReagents(PDAR)试剂盒提供的同一探针。设计的这些人GAPDH试验的引物不会扩增基因组DNA;12.为防止酶残留，需要在48t:培育的一步RT-PCR法不能用AmpEraseUNG，但EZRT-PCR试剂盒中可用；13.单重反应只能用一步RT-PCR法，逆转录法只能选择下游引物(非随机六聚体或寡聚-dT);14.优选进行一式两份(反应)来控制移液误差，但这不可避免会增加成本；15.如果进行多重(反应)，在运行前应核查光谱补偿选项(在AdvancedOptions(高级选项)中)；16.利用反应中的被动参比物(ROX)将荧光波动(值)标准化，和用内源性对照物(例如GAPDH，活性参比物)将cDNA/PCR用量的效率标准化是不同的方法；17.ABI7700不仅可用于定量RT-PCR也可用于终点PCR。后者包括存在/不存在的检测试验或等位基因鉴别试验(例如SNP分型)；18.PCR的早期轮次(0-5轮)中Rn值漂移表示反应诸组分最初不平衡，但不影响最终结果，只要重新设置基线范围的下限值；19.如果注意到扩增图异常(CT值<15，在早期轮次中检测到扩增信号)，应降低基线范围的上限值，应稀释样品以提高CT值(污染也可能提高CT值)；20.ARn值低(或高于预计的Ct值)表明PCR效率不佳或者耙标的拷贝数低；21.Ct值的标准偏差〉0.16表明移液不精确；22.纯色彩设置(PureDyeSetup)中的SYBR绿色条目(SYBRGreenentry)以大写字母縮写为"SYBR"。任何其它縮写或小写字母会产生问题；23.ABI7700的SDS软件与8.1版的Macintosh操作系统有冲突。不应在这种计算机上分析数据。24.ABI7700不应长期停用。如果将其关闭，在运行前应预热至少1小时。推荐将仪器随时开着，这对激光有益。如果运行前刚开机，可能会出现显示操作系统版本冲突的出错框。如果发生此情况，选择"AutoDownload(自动下载)"选项。25.ABI7700只是可得到的实时PCR系统中的^种，其它包括BioRad、Cepheid、CorbettResearch、Roche禾卩Stratagene的系统。基因型分析许多方法可用于分析DNA的基因型。等位基因鉴别方法的综述见Kristensen等(Biotechniques,30(2):318-322，(2001))。本文只描述了一种方法，等位基因特异性PCR法。引物设计可利用随意得到的计算机程序，例如Primer3(http:〃frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3—code.html)来设计对具体等位基因的特异性上游和下游PCR引物。或者，可利用诸如ClustalW(http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw/)程序和针对存在DNA序列差异但保持留足够特异性而能确保扩增正确扩增子的区域设计的特异性引物，比对各等位基因的DNA序列。优选将PCR扩增子设计为在一个等位基因中具有限制性酶切位点，而在其它等位基因中没有。引物通常长18-25个碱基对，具有相似的解链温度。PCR扩增对PCR反应组成的描述随处可见(《PCR的临床应用》(ClinicalApplicationsofPCR)，DennisLo(编)，BlackwellPublishing,1998)。简言之，此反应含有引物、DNA、缓冲液和热稳定性聚合酶。反应在热循环仪，例如PTC-96V型MJResearch热循环仪上通过变性、杂交和DNA延伸的温度步骤进行循环(最多50次)。DNA分析可用各种方法，包括用质谱、毛细管凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳进行分子大小鉴别来分析PCR产物。如果将PCR扩增子设计为含有不同的限制性酶切位点，可用DNA-结合柱或沉淀和用水重悬，然后用合适的限制性酶进行限制性切割来纯化PCR反应中的DNA。然后将限制性切割的DNA作琼脂糖凝胶电泳，利用电流对DNA进行大小分离。某基因的各种等位基因根据是否含有限制性位点而具有不同大小。实施例2基因鉴定和基因的优先排序按照EmpiricalBayes方法(Lonnstedt禾卩Speed,2002，5toZWca<S7m'c<3，12:3146)，根据第28天的所有动物与第0、2、4、7、9、11、14、17、21和24天的动物作比较对(表达变化)有统计学意义的基因排序。用经验性Bayes方法提供各组内各基因方差的减少估算量(shrinkageestimator)。利用此减少估算量根据t检验计算各p值。采用Holms方法调整t检验的p值以有力控制基因家族I型误差(familywisetypeIerrorrate)。在各天(表达变化)有统计学意义(pO.05)的总共783种基因是表5所列的基因。通过去除(表达变化)有统计学意义不到两天并且pX).OOl的那些基因来修正此基因列表。然后按照它们的p值对剩余的基因以升序排列。应注意此基因列表不排除可用于诊断应激的基因(也参见最低预测设置和基因本体论(geneontology))。表6所列基因按它们的统计学t检验值排序可解释为信号-噪声比。该表格也显示了1og2倍变化(M值)与调整的p值。具有负t值(因此M也是负值)的基因表达下调。具有正的t和M值的基因表达上调。根据应激诱导后第一天(表达变化)有统计学意义(pO.001)的各基因和至少3次取样时间检测(表达变化)有统计学意义的基因的t值增加值进行基因的优先排序。实施例3证明对测定应激应答具有诊断潜力根据基因表达计算的主要组分评分(Jolliffe，I.T.，《主要组分分析》(Principalcomponentsanalysis),Springer-Verlag，1986)采用辨另U分析(Venables和Ripley，2002，《统计学在S中的现代应用》(ModernAppliedStatisticsinS)，Springer)评估了整组基因的诊断潜力。对遭遇应激之后立即获得的和遭遇应激后第2、4、7、9、11、14、17、21、24和28天获得的样品作比较。整个方法经交叉验证。灵敏度和特异性经计算均为优先级(uniformprior)。这可解释为是一种对减少的调节，此减少的估算值位于减小范围(reducedspace)内。然后利用辩别函数评分(discriminantfunctionscores)的交叉验证估算值来构建ROC曲线(LloydC丄，1998，"采用平滑ROC曲线进行总结和比较的诊断系统"(TheuseofsmoothedROCcurvestosummarizeandcomparediagnosticsystems),Jowma/o/爿mm'ca"iSY加Wca/jmocZ油'ow，93:1356-1364)。ROC曲线根据具有用Lloyd方法(同上)选择的平滑窗的经验性累积分布函数与核心密度估算值制备。比较每天与第28天的ROC曲线分别见图1-10。经历运输应激状态后基因表达改变的数量级足以产生优秀的诊断潜力。实施例4具有预测功能的最小基因组虽然鉴定到大量具有诊断潜力的基因，但通常进行诊断所需可接受的只是很少数目的基因。表7显示根据选自具有诊断潜力基因组的两种基因进行线性辩别分析获得交叉验证分类结果、灵敏度和特异性。提出的诸对基因是能产生最高预测结果的基因，许多其它基因对得到可接受的分类结果。本领域技术人员不难鉴定其它基因对。鉴定基因对的技术包括(但不限于)正向可变性选择(VenablesW.N.和RipleyB.D.，《统计学在S中的现代应用》(ModernAppliedStatisticsinS)，第四版，2002.，Springer)、最佳亚组选择、反向(backward)消除(VenablesW.N.和RipleyB.D.，2002，同上)、逐步(stepwise)选择(VenablesW.N.和RipleyB.D.，2002，同上)和随机可变消除(FigueradoM.A.，《监督学习的适应性稀疏》(AdaptiveSparsenessforSupervisedLearning))。表8显示根据用选自诊断组三种基因进行线性辩别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组三种基因。本领域技术人员不难明白可根据三种应激标记基因作出其它合适的诊断选择。表9显示根据选自诊断组的四种基因，线性判别分析得到的交叉验证分类结果。只给出了20组四种基因。本领域技术人员不难明白根据四种应激标记基因作出其它合适的诊断选择。表10显示根据用选自诊断组五种基因进行线性辩别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组五种基因。本领域技术人员不难明白可根据五种应激标记基因作出其它合适的诊断选择。表11显示根据用选自诊断组六种基因进行线性辩别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组六种基因。本领域技术人员不难明白可根据六种应激标记基因作出其它合适的诊断选择。表12显示根据用选自诊断组七种基因进行线性辩别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组七种基因。本领域技术人员不难明白可根据七种应激标记基因作出其它合适的诊断选择。表13显示根据用选自诊断组八种基因进行线性辩别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组八种基因。本领域技术人员不难明白可根据八种应激标记基因作出其它合适的诊断选择。表14显示根据用选自诊断组九种基因进行线性辩别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组九种基因。本领域技术人员不难明白可根据九种应激标记基因作出其它合适的诊断选择。表15显示根据用选自诊断组十种基因进行线性辩别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组十种基因。本领域技术人员不难明白可根据十种应激标记基因作出其它合适的诊断选择。表16显示根据用选自诊断组二十种基因进行线性辩别分析得到的交叉验证分类结果。只提供了20组二十种基因。本领域技术人员不难明白可根据二十种应激标记基因作出其它合适的诊断选择。实施例5特异性的证实应激标记基因的特异性难以定义，因为这种测试是一种评估而不是诊断。然而，可将整组"应激基因"用于850GeneChipTM的基因表达数据库的训练组。数据库中的基因表达结果得自患有以下各种疾病和病症的马匹样品慢性和极性诱导的EPM、EPM的临床病例、疱疹病毒感染、退变性骨关节炎、红球菌感染、内毒素血症、蹄叶炎、胃溃疡综合征、田径训练动物和临床上正常动物。这些动物的应激状态事先未知。利用该训练组中的基因计算各GeneChipTM中的应激指数评分。由于是从经调整的辨别函数计算该评分可将大评分值与产生应激状态的高度可能性相关联，评分的方差应约为1。根据此评分将GeneChipTM测定结果从最通过改变阳性诊断的阈值检测了此法的特异性。各阈值的特异性定义为真阳性(样品)阳性结果的比例(S卩，GeneChipTM指数评分高于该阈值)。采用2个阈值(即，两个标准偏差)。当利用四种主要组分和整个基因组(3105)时，对不属于该诱导应激试验一部分的数据库的59只动物经鉴定具有应激相关的免疫应答改变与辨别函数的两个标准差高于0。在这59只动物中，10只进行了蹄叶炎试验，14只有马红球菌(R.叫ui)感染，9只患有胃炎。用作"对照"的13只动物中3只近期经历转运，两只处于试验中，3只临床上不正常，5只是接触马红球菌的幼驹。12只临床上正常的动物进行了应激标记鉴定。根据此信息，可以说该应激标记用于含有850个以上样品的数据库时其特异性超过90%。当利用四种主要组分和表1所列独特的应激标记基因时，对不属于该诱导应激试验一部分的数据库的79只动物经鉴定为具有应激相关的免疫应答改变，与辨别函数的两个标准差高于O。在这79只动物中，15只进行了蹄叶炎试验，8只有马红球菌感染，24只患有胃炎。用作"对照"的21只动物中12只处于试验中，3只临床上不正常。9只临床上正常的动物进行了应激标记鉴定。根据此信息，可以说该应激标记用于含有850个以上样品的数据库时其特异性超过卯％。实施例7基因本体为根据功能、代谢过程或细胞组分对基因分组，采用BLAST算法(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D丄，(19卯)，"局部序列比对基本检索工具"(Basiclocalalignmentsearchtool),M/.5/o/.，215:403-410)将基因序列与GeneBank数据库作比较，并进行基因同源性和基因本体检索。根据这些标准和当时可得到的信息，表17列出了这些基因的分组。也参见含有各基因序列信息的表1。本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的内容全文纳入本文作为参考。本文所引用的任何参考文献不应理解为承认该参考文献是可用于本申请的"现有技术"。整篇说明书的目的是描述本发明的优选实施方案而不是将本发明限制于某一实施方案或特征的特定组合。本领域技术人员应知道借助本文内容可对示例的具体实施方案作出各种改进与改变而不脱离本发明的范围。所有这种改进与改变要包括在附加的权利要求书的范围内。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>基因名称<image>imageseeoriginaldocumentpage123</image><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage151</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table>.<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table>基<table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table>基因名称Gen^ank同源性『NA照!j/a断的氨基酸序列，。,:6121GGAATTGAATTTCATTTATACACTAATTCCTTGGATTTTGCACAGTTACCTAACGGTTTT6181AGTCTGGAGTTAAATTCAGATGCATGGMTCCTGAAGG嵐ATGGTAGCTT丁TTAATCTT6241T丁丁GTGTGTGTGTGAGTCTTTTAAATCMGTACTGATTMCTATTAAGTACMCTTTGAG6301AnTTAGTTTTAACTCTTCAGAAGCCAGTGTG織TAGMTTGGTTATTCTCAAAGACTC6361AGGATMACTAAATAAGCTATATATAGAGTACATTTAMATGTACMCAC磁TTGGAAA6421TAAAATMGTTACMGATAAGTTTACAGGGATATATTGCTTACAATTTTTMAAGGCAGT6481TTGTTTTTTATGTGAATATGTTTCTTAGTGAMTTTTACATTCCTTTGTTTTGGAAGATT6541GGCGATATTTGAAGAGTTMAAATAGTACAGAAATGTGAAGTTTGGTATaCT磁TGTG6601TTGTACTTGACTTTCTTTTTTATTTTGTTTTTTTTTTTTTTTGACTACTTAGAATTTTCA6661CAATTCTAATAAGATTGTTTCCMGTCTCTCATGTGCMGCTTTAAAGGATGCACTCTTG6721CCATTTTATGTACTGGMGATCATTGGTCAGATGAATACTGTGTCTGACAAMATGTAAA6781CTGTATAAACTGAGGAACCTCAGCTAATCAGTATTACTTTGTAGATCACCATGCCCACCA6841CATTTCMACTCMACTATCTGTAGATTTCMMTCCATTGTGTTTGAGTTTGTTTGCAG6901TTCCCTCAGCTTGCTGGTAATTGTGGTGTTTTGTTTTTTGnTTGTTTTCAATGCAAATG6961TGATGTAATATTCTTATTTTCTTTGaTCAMGCTGGAC丁GGAMTTG丁ATCG丁GTAATT7021ATTTTTGTGTTCTTAATGTTATTTGGTACTCAAGTTGTAMTAACGTCTACTACTGTTTA7081TTCCAGTTTCTACTACCTCAGGTGTCCTATAGATTTTTCTTCTACCAMGTTCACTTTCA7141CMTGMATTATATTTGCTGTGTGACTATGATTCCTAAGATTTCCAGGGCTTAAGGGCTA7201ACTTCTATTAGCACCTTACTGTGTAAGCAMTGTTACAMAAAAAAAAMAAAMTCTCT7261GGGTTAAGMAATTTGGCTTAAATGTATCCTTTGTTATTT丁AMTATATTGAGATATT丁T7321MTTAAAATTTTTACCCCATTGMCCGATTTTATAGTATTTGTACCTATTTTGGTGTTTT7381TGTCTTTATAGTMATAAMGTTTTTGMC1MGSQALQEWGQREPGRWPDPSEQIDNO:581ATGGGCAGCCAGGCCC丁GCAGGAGTGGGGACAGAGGGMCCCGGCCGGTGGCCCGACCCT21AGKKDVRREASDSGRAGTWP61GCAGGGAAGMGGACGTGCGGCGAGMGCATCGGATTCGGGGAGGGCCGGGACCTGGCCG41RTAKEKLKIDGDTRLPSSPQ121AGGACAGCCAAGGAAAAACTAAAGATCGACGGGGACACCCGCCTCCCTTCCTCGCCCCM61RFLRGCGDLHQKPKLELILS181CGGTTTCTCAGAGGCTGTGGGGACTTGCACCAGAAACCCMGTTGGAACTMTTCTTTCT81FGRCNSPPASSAVPGRDCRE241TTCGGMGGTGCMCTCCCCTCCCGCGAGCTCCGCGGTGCCGGGCCGAGATTGCCGAGAG101已AAQRCRQGSSCRRCGRDYL301GMGCGGCGCAGCGCTGCCGCCMGGCTCCTCCTG丁CGCCGG丁GCGGCCGGGACTACCTGAARRGPSECSPREKMAAAAG361GCGGCGCGGCGCGGGCCGAGCGMTGTAGCCCGCGAGAGAAAATGGCGGCGGCGGCGGGG20058002624L2转溢齿雜158/4455t<table>tableseeoriginaldocumentpage177</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage178</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage179</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage180</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage183</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage184</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage185</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage186</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage187</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage188</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage189</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage190</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage191</column></row><table>基因<table>tableseeoriginaldocumentpage192</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage193</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage194</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage195</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage196</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage197</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage198</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage199</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage200</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage201</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage202</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage203</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage204</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage205</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage206</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage207</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage208</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage209</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage210</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage211</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage212</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage213</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage214</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage215</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage216</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage217</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage218</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage219</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage220</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage221</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage222</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage223</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage224</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage225</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage226</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage227</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage228</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage229</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage230</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage231</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage232</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage233</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage234</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage235</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage236</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage237</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage238</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage239</column></row><table><table>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ble>tableseeoriginaldocumentpage324</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage325</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage326</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage327</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage328</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage329</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage330</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage331</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage332</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage333</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage334</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage335</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage336</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage337</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage338</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage339</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage340</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage341</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage342</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage343</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage344</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage345</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage346</column></row><table>基因<table>tableseeoriginaldocumentpage347</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage348</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage349</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage350</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage351</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage352</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage353</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage354</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage355</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage356</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage357</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage358</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage359</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage360</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage361</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage362</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage363</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage364</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage365</column></row><table>NO:223<table>tableseeoriginaldocumentpage366</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage367</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage368</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage369</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage370</column></row><table>,基因名称GenBapk同缚性:DNA序列/推断W氨^酸序列.序列标识符皿301LGDVEKGDPKNDSWIFALAVCTGGGCGATGTGGA嵐GGGTGACCCTAAGAATGACTCCTGGATCTTTGCCCTGGCTGTG121361LLCSTFVYNSMSTINHQALECTCCTGTGCAGCACCTTTGTCTACMCAGCATGAGCACCA"TCAACCACCAGGCCCTGGAG141421QLHYVTELTELIRAKSSPRPCAGCTGCATTATGTGACAGAGCTCACAGAGCTCATCAGGGCAAAGTCTTCCCCMGACCT161481DEVQDSTEFVSFFPDFIWTVGATGMGTACAAGATTCCACAGAGTTTGTGAGTTTCT丁TCCAGACTTTATCTGGACTGTA皿RDFTLELKLDGHPITEDEYLCGGGATTTCACCCTGGAGCTGMG丁TAGACGGTCACCCTATCACAGMGATGAGTACTTG201601ENALKLIPGKNPKVQASNLPGAGAATGCCTTGAAGCTGATTCCAGGCAAGMTCCCMAGTCCAAGCGTCCAATCTACCC221661RECIRLFFPKRKCFVFDRPIAGAGAGTGCATCAGGCTATTCTTTCCAAAACGGAAATGTTTTGTATTTGACCGGCCAATA241721NDKALLADIENVSENE乙DSKAACGACAAAGCACTCCTAGCTGACATTGAGAATGTGTCTGAAAACGAACTGGATTCTMA261781FQEQINKFCSHIFTHARPKTTTCCAAGAACAAATAAACMGTTCTG丁TCTCACATCTTCACCCATGCAAGACCTAAGACT281841LREGIMVTGNRLRTLVVTYVCTTAGAGAGGGAATCATGGTCACTGGGAATCGGCTGAGGACTCTGGTGGTGACCTATGTG301901DTINTGAVPC乙ENAVRTLAQGATACCATCAATACTGGAGCAGTGCCTTGTTTGGAGMTGCAGTGAGMCTCTGGCCCM321961LENSVAMQKAADHYSEQMAECTTGAGMCTCAGTGGCCATGCAGAAGGCAGCGGACCATTACAGTGAGCAGATGGCCGAG3411021KLKLPTDTLQELLDVHTACEAAATTGAAGTTGCCCACAGACACACTCCAGGAGCTGCTGGACGTGCACACAGCCTGTGAG361藤REAIAFFMEHSFKDENQEFQAGAGAGGCCATTGCATTTTTCATGGAGCACTCCTTCMGGATGAAAATCAGGAATTCCAG381KKFMET丁MNKKGDFLLQNEE200580026241.2转溢齿被353/4453<table>tableseeoriginaldocumentpage372</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage373</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage374</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage375</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage376</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage377</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage378</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage379</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage380</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage381</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage382</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage383</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage384</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage385</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage386</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage387</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage388</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage389</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage390</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage391</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage392</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage393</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage394</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage395</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage396</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage397</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage398</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage399</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage400</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage401</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage402</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage403</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage404</image><table>tableseeoriginaldocumentpage405</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage406</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage407</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage408</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage409</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage410</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage411</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage412</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage413</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage414</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage415</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage416</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage417</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage418</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage419</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage420</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage421</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage422</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage423</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage424</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage425</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage426</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage427</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage428</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage429</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage430</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage431</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage432</column></row><table>表3氨基酸亚类<table>tableseeoriginaldocumentpage433</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage434</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage435</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage436</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage437</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage438</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage439</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage440</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage441</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage442</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage443</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage444</column></row><table>根据应激诱导后第一天t值增加值具有统计学意义(pO.OOl)的各基因和至少3个取样时间(表达变化)有统计学意义的基因进行基因的优先排序。表7选择的两种基因<table>tableseeoriginaldocumentpage445</column></row><table>表8选择的三种基因<table>tableseeoriginaldocumentpage446</column></row><table>表9选择的四种基因<table>tableseeoriginaldocumentpage447</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage448</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage449</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage450</column></row><table>表12选择的<table>tableseeoriginaldocumentpage451</column></row><table>表13选择的八种基因<table>tableseeoriginaldocumentpage452</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage453</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage454</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage455</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage456</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage457</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage458</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage459</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage460</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage461</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage462</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage463</column></row><table>权利要求1.一种测定测试对象中对应激的生理学应答或相关疾病的存在或程度的方法，包括检测测试对象中至少一种选自以下的应激标记基因的异常表达(a)其具有的多核苷酸表达产物含有与以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的基因SEQIDNO1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互补序列；(b)其具有的多核苷酸表达产物含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249；(c)其具有的多核苷酸表达产物含有编码与以下序列至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO22、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)其具有的多核苷酸表达产物含有至少在低严谨条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的基因。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，包括检测选自以下的应激标记多核苷酸的异常表达(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、17、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、2U、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于，包括检测选自以下的应激标记多肽的异常表达(i)含有与以下任一序列至少有50%序列相似性的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(ii)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、135、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少5个连续氨基酸残基；(iii)所含的氨基酸序列与以下任一序列的至少15个连续氨基酸残基至少有30%相似性的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;和(iv)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少5个连续氨基酸残基，并且与和(i)、(ii)或(iii)的序列具有免疫相互作用活性的抗原结合分子具有免疫相互作用活性。4.如权利要求l所述的方法，其特征在于，通过以下步骤检测所述的异常表达(1)检测得自测试对象的生物学样品中的至少一种应激标记基因表达产物的水平或功能活性，和(2)将所检测到的各表达产物的水平或功能活性与得自一位或多位正常对象或一位或多位未处于应激状态对象的参比样品中相应表达产物的水平或功能活性作比较，其中与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性相比，该生物学样品中该表达产物的水平或功能活性有差异表明该测试对象存在对应激的生理学应答。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括当该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性比相应的该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性低10%时，诊断该测试对象中对应激的生理学应答的存在、阶段或程度。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过检测至少一种选自以下的应激标记多核苷酸的水平或功能活性降低来确定是否存在对应激的生理学应答(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、7、9、II、19、21、24、25、33、34、38、39、40、41、42、50、51、56、57、59、62、63、66、70、71、73、75、79、81、83、89、90、91、92、93、97、99、105、107、108、111、119、121、122、123、129、130、137、139、140、141、142、143或185，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括当该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性比相应的该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性高10%时，诊断该测试对象对应激的生理学应答的存在、阶段或程度。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过检测至少一种选自以下的应激标记多核苷酸的水平或功能活性增加来确定是否存在对应激的生理学应答(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、13、15、16、17、23、26、28、29、30、32、35、37、44、46、48、52、54、55、64、68、77、85、87、95、96、101、103、113、115、117、118、125、126、131、133、135、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、183、184、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206或210，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括当该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性与相应的该表达产物或各表达产物检测到的水平或功能活性相同或相似时，诊断不存在对应激的生理学应答。10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，各表达产物检测到的水平或功能活性与相应的各表达产物检测到的水平或功能活性的差异不超过5%。11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括检测至少约2种应激标记基因各表达产物的水平或功能活性。12.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括检测至少一种选自以下的一级相关应激标记基因各表达产物的水平或功能活性(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:89、90、103、125、126、163、178、182、184或l卯，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。13.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括检测至少一种选自以下的二级相关应激标记基因各表达产物的水平或功能活性(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:17、23、44、52、133、135、144、147、148、151、155、192、196、202或206，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。14.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括检测至少一种选自以下的三级相关应激标记基因各表达产物的水平或功能活性(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、30、37、48、54、55、64、66、70、77、79、85、91、92、95、96、101、115、117、118、121、150、153、158、164、170、180、186或198，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。15.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括检测至少一种选自以下的四级相关应激标记基因各表达产物的水平或功能活性(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:7、15、16、19、21、24、25、26、28、35、38、39、42、46、57、68、73、81、83、97、99、107、113、123、160、165、175、187、188、194、195或200，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。16.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括检测至少一种选自以下的五级相关应激标记基因各表达产物的水平或功能活性(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、9、11、13、32、33、34、40、41、50、51、56、59、62、63、71、75、87、93、105、111、119、127、129、130、131、137、139、141、143、145、156、161、167、169、171、173、176、185、204或210，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。17.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包括血液。18.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包括外周血。19.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物学样品包括白细胞。20.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物是RNA分子。21.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物是多肽。22.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物与相应的表达产物相同。23.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物是相应表达产物的变体。24.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物或相应表达产物是靶RNA或该靶RNA的DNA拷贝，其水平用至少在低严谨性条件下与该靶RNA或其DNA拷贝杂交的至少一种核酸探针来检测，其中所述核酸探针含有应激标记多核苷酸的至少15个连续核苷酸。25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述靶RNA或其DNA拷贝的所检测水平或丰度按存在于同一样品中的参比RNA或该参比RNA的DNA拷贝的水平或丰度标准化。26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述核酸探针固定在固体或半固体支持物上。27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述核酸探针形成核酸探针空间阵列的一部分。28.如权利要求24所述的方法，其特征在于，通过杂交检测与该靶RNA或其DNA拷贝结合的核酸探针的水平。29.如权利要求24所述的方法，其特征在于，通过核酸扩增检测与该耙RNA或其DNA拷贝结合的核酸探针的水平。30.如权利要求24所述的方法，其特征在于，通过核酸酶保护试验检测与该靶RNA或其DNA拷贝结合的核酸探针的水平。31.如权利要求24所述的方法，其特征在于，检测应激标记多核苷酸的所述探针含有SEQIDNO:250-1807之一所示的序列。32.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述表达产物或相应的表达产物是靶多肽，其水平采用与该耙多肽具有免疫相互作用活性的至少一种抗原结合分子来检测。33.如权利要求24所述的方法，其特征在于，包括将所述靶多肽检测到的水平按存在于同一样品中的参比多肽的水平标准化。34.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述抗原结合分子固定在固体或半固体支持物上。35.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述抗原结合分子形成抗原结合分子空间阵列的一部分。36.如权利要求24所述的方法，其特征在于，通过免疫测定检测与靶多肽结合的抗原结合分子的水平。37.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达产物或相应的表达产物是靶多肽，其水平采用与该靶多肽反应形成反应产物的至少一种底物来检测。38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，将所述靶多肽检测到的功能活性按存在于同一样品中的参比多肽的功能活性标准化。39.如权利要求4所述的方法，其特征在于，利用包括至少一个与基站相连接的终端站的系统来执行该方法，其中所述基站用于(a)通过通信网络从所述终端站接受对象数据，其中所述对象数据提供了对应于生物学样品中至少一种表达产物所检测的或标准化的水平或功能活性参数值，和(b)将所述对象数据与代表参比样品中至少一种相应表达产物所检测的或标准化的水平或功能活性的预定数据作比较，从而确定与参比样品中相应表达产物的水平或功能活性相比，该生物学样品中该表达产物的水平或功能活性有无任何差异。40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述基站还用于诊断对应激的生理学应答的存在或程度。41.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述基站还经通信网络将诊断出的适应症传递至所述终端站。42.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测到异常表达表明对应激的生理学应答的存在或风险。43.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述测试对象是马。44.一种治疗、预防或抑制对象中产生应激状态的方法，所述方法包括检测该对象中至少一种应激标记基因的异常表达，并给予该对象有效量药物来治疗或缓解症状或者逆转或抑制该对象中产生应激状态，其中所述应激标记基因选自(a)其具有的多核苷酸表达产物含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的基因SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、卯、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互补序列；(b)其具有的多核苷酸表达产物含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)其具有的多核苷酸表达产物含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)其具有的多核苷酸表达产物含有至少在低严谨条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的基因。45.—种选自以下的分离的应激标记多核苷酸(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互补序列；(b)含有包含以下任一序列一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，其中所述部分含有该序列或互补序列的至少15个连续核苷酸；(c)至少在低严谨性条件下与(a)或(b)的序列或其互补序列杂交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互补序列，其中所述部分含有该序列或互补序列的至少15个连续核苷酸并至少在低严谨性条件下与(a)、(b)或(c)的序列或其互补序列杂交。46.—种含有与调控元件操作性相连的如权利要求45所述应激标记多核苷酸的核酸构建物，所述调控元件在宿主细胞中可操作。47.—种含有如权利要求46所述核酸构建物的分离的宿主细胞。48.—种含有至少在低严谨性条件下与如权利要求45所述多核苷酸杂交的核苷酸序列的探针。49.如权利要求48所述的探针，其特征在于，所述探针含有能至少在低严谨性条件下与以下任一序列的至少一部分杂交的核苷酸序列SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，其中所述部分的长度至少为15个核苷酸。50.如权利要求49所述的探针，其特征在于，所述探针含有SEQIDNO:250-1807之一所示的序列。51.—种在其上固定有至少一种如权利要求48所述探针的固体或半固体支持物。52.以下物质在制备用于诊断对象中对应激的生理学应答的存在情况的试剂盒中的应用(i)一种或多种选自以下的应激标记多核苷酸(a)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、l卯、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互补序列;(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%(和至少51°/。-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、,58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、2H、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸；或(ii)一种或多种含有至少在低严谨性条件下与(i)所述应激标记多核苷酸杂交的核苷酸序列的探针；(iii)一种或多种选自以下的应激标记多肽(1)含有与以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之间所有整数百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、M6、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(2)含有以下任一序列的一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少5个连续氨基酸残基；(3)所含有的氨基酸序列与以下任一序列的至少15个连续氨基酸残基至少有30%(和至少31%-至少99%及其之间所有整数百分比)相似性的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;和(4)含有以下任一序列的—部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、LV1、，A2;U、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有该序列的至少5个连续的氨基酸残基，并且与和(l)、(2)或(3)的序列具有免疫相互作用活性的抗原结合分子具有免疫相互作用活性；或(iv)—种或多种与(iii)所述应激标记多肽具有免疫相互作用活性的抗原结合分子。53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述针对应激的生理学应答选自身体应激；情感障碍；焦虑症；炎症；疼痛；慢性疲劳综合征；应激诱导的头痛；癌症；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；神经退变性疾病；肠胃道疾病；核上麻痹；肌萎縮性侧索硬化症；免疫功能降低或免疫抑制；出血性应激；应激诱导的精神病发作；甲状腺机能不正常综合征；抗腹泻激素(ADH)不适当综合征；暴食或肥胖症；不育症；头部创伤；脊髓创伤；缺血性神经元损伤；兴奋性中毒神经元损伤；癫痫；心血管疾病；中风；免疫功能失调；抑制；行为(自发性)调节；肌肉痉挛；尿失禁；阿尔茨海默型早老性痴呆；多发性脑梗死性痴呆；肌萎缩性侧索硬化症；化学物质依赖性和成瘾；药物和酒精戒除症状；骨质疏松症；社会心理侏儒症；低血糖症；脱发；昼夜节律异常；和昼夜节律异常相关疾病。54.—种诊断测试对象中是否存在对应激的生理学应答的方法，包括检测测试对象中至少一种选自以下的应激标记多核苷酸的异常表达(a)含有与以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、或248，或其互补序列；(b)含有编码包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有编码与以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>247或249，其中所述部分含有该序列的至少15个连续氨基酸残基；和(d)含有至少在低严谨性条件下与(a)、(b)、(c)的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。全文摘要本发明公开了定性或定量测定应激对免疫系统影响，因应激导致免疫系统失调而对发生疾病或病症易感性和监测动物对付应激的能力的分子和试验。本发明可用于检测对免疫调节治疗的应答，和监测在应激状态下对天然疾病的免疫应答。文档编号C07K14/47GK101133157SQ200580026241公开日2008年2月27日申请日期2005年6月3日优先权日2004年6月3日发明者M·R·托马斯,R·B·布兰登申请人:阿什洛米克斯控股有限公司