具有对热或水分压力的抗性提高的活性的阿拉伯半乳聚糖蛋白质的制作方法

专利名称：具有对热或水分压力的抗性提高的活性的阿拉伯半乳聚糖蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码具有至少对热或水分压力的抗性提高的活性的阿拉伯半乳聚糖蛋白质的DNA，具有至少对热或水分压力的抗性提高的活性的阿拉伯半乳聚糖蛋白质，和这些基因和蛋白质在转基因植物等中的应用。
背景技术：
存在于自然界中的生物暴露于盐，高温，低温，冻结，干燥，水分压力等各种环境压力中。尤其是，盐压力是阻碍很多高等植物生长的最主要的因素之一。由于高等植物的耐盐性强化与农产物生产的增大相关，通过导入基因尝试使高等植物的耐盐性强化，现在正积极地发展。具有强化耐盐性功能的蛋白质可以大致分为合适溶质(甘氨酸甜菜碱，甘露糖醇，海藻糖，脯氨酸)合成酶，和与离子内环境稳定相关的酶(Na+/H+反向转运体)和控制这些基因表达的转录调节因子。近年来报道了许多在表达这些蛋白质的转化细胞中确认了耐盐性的提高的例子。例如，分别报道了在染色体DNA中导入了编码胆碱氧化酶的基因的桉树属的植物体(参照专利文献1)，编码耐盐性蓝藻(Aphanothece halopytica)来源的Na+/H+反向转运体的DNA(参照专利文献2)，特征在于抑制编码植物细胞内脯氨酸分解系的酶的基因的表达的使植物的压力抗性上升的方法(参照专利文献3)。但是，在表达上述耐盐性强化基因的生物(尤其是植物)中，仍然没有获得在含有约500mM的NaCl的海水中耐受的转化体，为了制备对海水耐受的转化体，一般认为只有合适溶质合成酶和与离子内环境稳定相关的酶并不充分。
另一方面，在自然界中存在着在其进化过程中获得了强力的耐盐性机制的植物(盐生植物)。预计通过单独使用或多种组合使用这种植物群具有的耐盐性因子，可以制作获得了一般盐生植物的强力的耐盐性的转化体(尤其是植物)。例如，本发明人着眼于盐生植物的其中一种红树，获得了已经建立了培养细胞系的海莲(Bruguiera sexangula)的培养细胞的分配，在100mM的NaCl存在下培养该细胞株，基于从培养细胞中提取的mRNA制作cDNA文库，尝试从中寻找与红树的耐盐性相关的基因，通过导入分离的与压力抗性相关的基因群中的1个基因，成功地使酵母，植物细胞(烟草培养细胞)，和植物体(烟草)的耐盐性强化(参照专利文献4)。此外，发现了红树的1种基因，秋茄中新型的耐盐性增强的基因，确定其碱基序列和其编码的氨基酸，再将该基因导入其它植物，确认了其耐盐性增大(参照专利文献5，6)。但是，至今为止，关于盐生植物来源的耐盐性因子的见解极少。
专利文献1特开2003-143988号公报专利文献2特开2003-180373号公报专利文献3特开2003-186879号公报专利文献4特开2001-333784号公报专利文献5特开2003-116546号公报专利文献6特表2003-512837号公报发明内容发明要解决的问题本发明的问题在于提供对盐，水分，热压力等环境压力，尤其是对水分压力的抗性提高的活性的蛋白质的基因，具有对环境压力的抗性提高的活性的蛋白质，以及对环境压力的抗性增强了的转基因植物等。
用于解决问题的方法本发明人，着眼于属于藜科的一年生草本，在盐湿地中形成群落，即使在含有1M左右的NaCl的环境中也可以生长的具有最强的耐盐性的盐生植物的中的1种-欧洲海蓬子(Salicornia europaea)。欧洲海蓬子可称为用于强化高等植物的耐盐性的珍贵的基因资源。不过，至今为止，几乎没有关于欧洲海蓬子的耐盐性基因的见解。一般认为其主要原因是，该种类存在由于海岸的开发而减少的倾向(指定为濒临灭绝种类)，在推进研究方面，难以获得稳定的植物材料。因此，本发明人逐步推进了即使在实验室中都可以稳定生长的培养细胞系的建立。其结果是，在明暗条件下连续培养，可以稳定维持红色，绿色，白色3种系统的愈伤组织。对这3个系统的愈伤组织在盐存在下的生长进行评价的结果是，任一系统均确认了在存在400mM的NaCl的极高的盐分存在下的生长。
接着，为了进行欧洲海蓬子的细胞水平的耐盐性机制的详细分析，尝试了悬浮培养细胞系的建立。其结果是，只有白色系统的愈伤组织实现了悬浮培养细胞化。于是，使用这种悬浮培养细胞，进行了耐盐性的评价，结果，在不含NaCl的液体培养基中培养开始后，约3周时间，相对于鲜重为135mg/ml，含有100mMNaCl的培养基中达到195mg/ml。此外，含有300mMNaCl的培养基中为124mg/ml，显示出与0mMNaCl的条件几乎同等的生长。一般而言，从盐生植物建立培养细胞系时，获得的培养细胞失去耐盐性的情况很多。不过，获得的欧洲海蓬子悬浮培养细胞维持了反映植物体显示的耐盐性(好盐性)的强耐盐性。此外，使用离子层析随时间测定欧洲海蓬子悬浮培养细胞中的钠离子含量，结果发现，在含有100mM，300mM NaCl的培养基中培养时，钠离子倾向于积累于细胞中。我们认为这显示出与欧洲海蓬子的叶中积累高浓度的盐分的现象类似的倾向。根据这些结果，获得的欧洲海蓬子悬浮培养细胞可有望成为用于在细胞水平分析欧洲海蓬子具有的强力的耐盐性机制的良好的模型系统。于是，着眼于与欧洲海蓬子的耐盐性机制相关的基因群(cDNA)的分离，通过采用大肠杆菌的基因表达系的功能筛选法，尝试寻找与欧洲海蓬子的耐盐性相关的基因。于是，发现了与拟南芥(Arabidopsisthaliana)的类成束蛋白(Fasciclin-like)阿拉伯半乳聚糖蛋白质具有部分同源性的由427个氨基酸构成的阿拉伯半乳聚糖蛋白质具有强化耐盐性，水分压力抗性(山梨糖醇抗性)，耐热性的功能，从而完成了本发明。还不知道阿拉伯半乳聚糖蛋白质具有热·水分压力抗性提高的活性。此外，还认为，对于这种阿拉伯半乳聚糖蛋白质的水分压力抗性(山梨糖醇抗性)和耐热性强化活性而言，推定为分泌性信号肽的氨基酸序列(1-25)或推定为GPI锚定信号序列的氨基酸序列(401-427)是必需的，分泌蛋白质中使微生物的水分压力或热压力耐性提高的实例至今尚不得知。
也就是说，本发明涉及(1)编码序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，和(2)编码由与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA，和(3)编码由序列号2所述的氨基酸序列中缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA，和(4)由序列号1所示的碱基序列或其互补的序列构成的DNA，和(5)由序列号1所述的碱基序列中缺失，取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成并且编码具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA，和(6)与上述(4)或(5)记载的DNA在严紧条件下杂交并且编码具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA。
此外，本发明还涉及(7)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质，和(8)由与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质，和(9)由序列号2所述的氨基酸序列中缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质，和(10)含有编码上述(7)-(9)任一项记载的蛋白质的DNA的重组载体，和(11)含有编码上述(1)-(6)任一项记载的DNA的重组载体，和(12)通过将上述(10)或(11)记载的重组载体导入宿主细胞获得的转化细胞。
进而，本发明还涉及(13)宿主细胞为植物细胞的上述(12)记载的转化细胞，和(14)宿主细胞为微生物细胞的上述(12)记载的转化细胞，和(15)具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的培养方法，特征在于培养上述(12)-(14)任一项记载的转化细胞，从该转化细胞或其培养液上清中回收重组蛋白质，和(16)具有至少热或水分压力抗性提高活性的转基因植物，其是通过在植物细胞中导入编码上述(7)-(9)任一项记载的蛋白质的DNA，使该植物细胞进行分裂增殖和再分化而获得的，和(17)具有至少热或水分压力抗性提高活性的转基因植物，其是通过在植物细胞中导入上述(1)-(6)任一项记载的DNA，使该植物细胞进行分裂增殖和再分化而获得的，和(18)具有至少热或水分压力抗性提高活性的转基因植物，其是通过在植物细胞中导入上述(12)或(13)记载的载体，使该植物细胞进行分裂增殖和再分化而获得的。
发明的效果由于本发明的编码具有至少热或水分压力耐性提高活性的蛋白质的DNA是盐生植物来源的基因，因此可望应用于高等植物，微生物等大范围的生物群的环境压力耐性(盐，水分，热压力等)的提高。尤其是，近年来，存在着由于土壤中盐分的累积可耕种土地正在激减的状态，本发明可以应用于农业中生产性的提高和沙漠绿化。此外，现在已知由微生物进行氨基酸等有用物质生产时，产生物(代谢产物)产生水分压力，这对微生物所具有的有用物质生产能力造成不利影响，但是可以不受水分压力的不利影响来进行有用物质的生产。进而，本发明中获得的成果也可以应用于各种微生物产业。


图1编码具有环境压力抗性强化能力的SeFLA的cDNA的碱基序列；图2具有环境压力抗性强化能力的SeFLA的氨基酸序列；图3具有环境压力抗性强化能力的SeFLA和编码它的cDNA的模式图。表示了用于制备通过PCR添加了起始密码子的亚克隆(SeFLAΔN，SeFLAΔC)中使用的引物；图4；表示导入了编码具有环境压力抗性强化能力的SeFLA的cDNA，进而其部分长度cDNA(通过PCR人工添加起始密码子)的转化大肠杆菌的盐，水分(山梨糖醇)和热压力抗性；图5表示导入了编码具有环境压力抗性强化能力的SeFLA的cDNA，进而其部分长度cDNA的转化酵母的盐，水分(山梨糖醇)和热压力抗性；图6表示导入了编码具有环境压力抗性强化能力的SeFLA的cDNA的转化烟草的盐，水分(山梨糖醇)压力抗性。
具体实施例方式
作为本发明的DNA，如果是(A)编码序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；(B)编码由与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA；(C)编码由序列号2所述的氨基酸序列中缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA；(D)由序列号1所示的碱基序列或其互补的序列构成的DNA；(E)由序列号1所述的碱基序列中缺失，取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成并且编码具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA；(F)与上述(D)或(E)的DNA在严紧条件下杂交并且编码具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA，没有特别的限制，此外，作为本发明的蛋白质，如果是(A)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质；(B)由与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质；(C)由序列号2所述的氨基酸序列中缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质，没有特别的限制，这里所谓“水分压力抗性提高活性”是指对于一定浓度的山梨糖醇显示出提高的抗性的活性，例如，表达具有水分压力抗性提高活性的蛋白质的植物和微生物，与不表达该蛋白质的植物和微生物相比，在一定浓度的山梨糖醇存在下显示出统计学上显著优异的增殖，但并不限于此。此外，所谓“热压力抗性提高活性”是指显示出对高温的提高的抗性的活性。例如，表达具有热压力抗性提高活性的蛋白质的植物和微生物与不表达该蛋白质的植物和微生物相比，在高温下显示出统计学上显著优异的增殖，但并不限于此。
此外，本发明的DNA编码具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质，但是优选编码除了具有上述热压力抗性提高活性和水分压力抗性提高活性，还具有对盐等环境压力的抗性提高的活性的蛋白质。而且，本发明的蛋白质具有至少热或水分压力抗性提高活性，但是优选除了具有热或水分压力抗性提高活性之外，还具有对盐等环境压力的抗性提高的活性的蛋白质。
上述所谓“缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列”是指缺失，取代或添加了例如1-30个，优选1-15个，更优选1-10个，更为优选1-5个任意数目的氨基酸的氨基酸序列。此外，所谓“缺失，取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列”是指缺失，取代或添加了例如1-30个，优选1-15个，更优选1-10个，更为优选1-5个任意数目的碱基的碱基序列。作为上述缺失了多个氨基酸的氨基酸序列，可以具体例举有缺失了N末端的25个氨基酸残基的氨基酸序列，和缺失了C末端的8个氨基酸残基的氨基酸序列。
例如，由缺失，取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成的DNA(变异DNA)也可以通过化学合成，基因工程法，突变诱变等本领域技术人员公知的任意方法来制备。具体而言，对于序列号1所示的碱基序列构成的DNA，使用使之与作为变异原的药剂的接触作用的方法，照射紫外线的方法，基因工程法等，通过在这些DNA中导入变异，可以获得变异DNA。基因工程法的其中一种定点诱变法由于是可以在特定位置导入特定变异的方法，因此有用，可以按照MolecularCloningA laboratory Mannual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989.(以后简称为“分子克隆”第2版)，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement1～38，John Wiley & Sons(1987-1997)等中记载的方法进行。通过使用适当的表达系使该变异DNA表达，可以获得由缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质。
上述所谓“与序列号2所示的氨基酸序列具有至少70％以上的同源性的氨基酸序列”如果是与序列号2所示的氨基酸序列的同源性在70％以上，没有特别的限制，是指例如70％以上，优选80％以上，更优选90％以上，95％以上，特别优选98％以上，最优选99％以上。
上述所谓“在严紧条件下杂交的DNA”是指通过使用DNA或RNA等核酸作为探针，采用克隆杂交法，噬斑杂交法或southern blot杂交法等可以获得的DNA，具体的是，可以例举有通过使用固定了克隆或噬斑来源的DNA或该DNA片段的滤膜，在0.7-1.0M的NaCl存在下，在65℃下进行杂交后，使用0.1-2倍左右的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠)，在65℃条件下清洗滤膜可以鉴定的DNA。杂交可以按照分子克隆第2版中记载的方法进行。
例如，作为在严紧条件下可以杂交的DNA，可以例举有与作为探针使用的DNA的碱基序列具有一定以上的同源性的DNA，例如可以最佳例举有具有70％以上，优选80％以上，更优选90％以上，更为优选95％以上，特别优选98％以上，最优选99％以上的同源性的DNA。
本发明的DNA的获得方法和制备方法没有特别的限定，可以通过根据本说明书中公开的序列号1或序列号2所示的氨基酸序列或碱基序列信息制备适当的探针和引物，使用它们来通过筛选预测存在该DNA的cDNA文库分离目的基因DNA，按照常规方法通过化学合成制备。
具体而言，通过从分离了本发明的基因DNA的欧洲海蓬子中按照常规方法制备DNA文库，接着，从该文库中使用本发明的基因DNA特有的适当的探针选择所希望的克隆，可以获得本发明的基因DNA。作为上述cDNA的来源，可以例举有上述植物来源的各种细胞或组织，此外，可以按照从这些细胞或组织的总RNA的分离，mRNA的分离和纯化，cDNA的获得和其克隆等任一种常规方法实施。从cDNA文库中克隆本发明的基因的方法，可以例举有例如分子克隆第2版中记载的方法等本领域技术人员常用的方法。
此外，作为由上述(B)-(F)任一项所示的碱基序列构成的本发明的变异基因或相同基因DNA，除了可以通过利用具有序列号1所示的碱基序列或其一部分的DNA片段，在适当条件下从其它生物体等中筛选该DNA的同系物来分离外，还可以通过前述变异DNA的制备方法来制备。
本发明的蛋白质的获得·制备方法没有特别的限制，可以是天然来源的分离的蛋白质，化学合成的蛋白质，也可以是通过基因重组技术制备的重组蛋白质的任一种。在获得天然来源的分离的蛋白质时，通过适当组合蛋白质的分离纯化方法可以从表达这种蛋白质的细胞或组织中获得本发明的蛋白质。在通过化学合成制备蛋白质时，按照例如Fmoc法(芴甲氧羰基法)，tBoc法(t-丁基羰基法)等化学合成法合成本发明的蛋白质。此外，也可以通过利用各种市售的肽合成机来合成本发明的蛋白质。在通过基因重组技术制备蛋白质时，可以通过在合适的表达系中导入由编码该蛋白质的碱基序列构成的DNA制备本发明的蛋白质。其中，优选通过较为容易的操作且可以大量制备的基因重组技术来制备。
例如，通过基因重组技术制备本发明的蛋白质时，为了从细胞培养物中回收纯化这种蛋白质，可以使用包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水性相互作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和植物凝血素层析的公知的方法，优选使用高压液相层析。尤其是，作为亲和层析中使用的柱，例如，结合了针对本发明的蛋白质的抗体等抗体的柱，在上述本发明的蛋白质添加了常规的肽标记时，通过使用结合了对这种肽标记具有亲和性的某种物质的柱，可以获得这些蛋白质的纯化物。此外，本发明的的表中在细胞膜表达时，使细胞膜分解酶作用后，通过进行上述纯化处理可以获得纯化标准品。
进而，基于表示编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列的一例的序列号1所示的碱基序列的信息，如果是本领域技术人员就可以适当制备或获得序列号2所示的氨基酸序列中缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质或者由与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。例如，以具有序列号1所示的碱基序列或其一部分的DNA作为探针，可以从欧洲海蓬子以外的生物中通过在适当条件下筛选该DNA的同系物来分离。在克隆该同系物DNA的全场DNA后，整合到表达载体中使之在适当宿主中表达，可以制备由该同系物DNA编码的蛋白质。
也可以通过使上述本发明的蛋白质与标记蛋白质和/或肽标记结合，形成融合蛋白质。作为标记蛋白质，如果是以往已知的标记蛋白质，没有特别的限制，例如，可以具体例举有碱性磷酸酶，HRP等酶，抗体的Fc区域，GFP等荧光物质等，此外，作为肽标记，可以具体例举有HA，FLAG，Myc等表位标记，GST，麦芽糖结合蛋白质，生物素化肽，低聚组氨酸等亲和性标记等以往已知的肽标记。这种融合蛋白质可以根据常规方法制备，其作为对于利用Ni-NTA和His标记的亲和性的本发明的蛋白质的纯化，本发明的蛋白质的检测，针对本发明的蛋白质的抗体的定量，以及该领域的其它研究用试剂是有用的。
如果使用上述本发明的DNA和蛋白质，可以使植物·动物及它们的组织，器官，细胞和细菌，酵母，霉菌等微生物的耐盐性，水分压力抗性(山梨糖醇抗性)，耐热性等环境压力抗性提高。
作为与本发明的蛋白质特异性结合的抗体，如果是与前述本发明的蛋白质特异性结合的抗体可以是任一种，作为这种抗体，可以具体例举有单克隆抗体，多克隆抗体，嵌合抗体，单链抗体，人源化抗体等免疫特异性抗体，可以使用由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质，或由与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质，或由序列号2所述的氨基酸序列中缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质作为抗原来制备。这些抗体，在例如了解具有环境压力抗性提高活性的蛋白质的分子机制方面有用。
针对具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的抗体，使用常用方法，带来通过给动物(优选人以外)给药含有该具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质或表位的片段，类似物或细胞产生的抗体，例如在制备单克隆抗体时，带来连续细胞系的培养物产生的抗体，可以使用杂交瘤法(Nature 256495-497，1975)，トリオ一マ技法(Immunology Today 4，72，1983)和EBV-杂交瘤法(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)等任意方法。
为了制备针对上述具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的单链抗体，可以使用单链抗体的制备法(美国专利第4,946,778号)。此外，为了使人源化抗体表达，也可以利用转基因植物或转基因动物等，使用上述抗体，分离鉴定表达具有这种环境压力抗性提高活性的蛋白质的克隆，用亲和层析纯化这种多肽。
作为本发明的重组载体，如果是含有前述本发明的DNA并且可以表达具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的重组载体，没有特别的限制，本发明的重组载体可以通过在表达载体中适当整合本发明的基因DNA来构建。作为这种表达载体，优选在宿主细胞中可以自我复制的表达载体，或者可以整合到宿主细胞的染色体中的表达载体，此外，可以最佳使用在可以表达本发明的基因的位置含有启动子，增强子，终止子等控制序列的表达载体。
例如，作为植物细胞用表达载体，可以例举有Ti质粒(Tumor inducing plasmid)，pSPORT1，pT7Blue-T载体，pIG121-Hm[Plant Cell Report，15，809-814(1995)]，pBI121[EMBO J.6，3901-3907(1987)]等质粒，或烟草花叶病毒，菜花花叶病毒，双生病毒(geminivirus)等植物病毒载体等。作为植物细胞用启动子，可以例举有菜花花叶病毒35S启动子[Mol.Gen.Genet(1990)220，389-392]，核酮糖二磷酸羧化酶小亚基启动子等，作为终止子，可以例举有例如胆脂碱合成酶基因的终止子。
作为酵母用的表达载体，可以例举有例如pYES2(Invitrogen)，YEp13(ATCC37115)，YEp24(ATCC37051)，Ycp5O(ATCC37419)，pHS19，pHS15等。作为酵母用的启动子，具体可以例举有例如PHO5启动子，PGK启动子，GAP启动子，ADH启动子，gal1启动子，gal10启动子，热激蛋白质启动子，MFα1启动子，CUP1启动子等启动子。作为表达载体，可以使用酵母用表达载体，植物细胞用表达载体，细菌用表达载体，动物用表达载体等，但优选采用酵母用表达载体和植物细胞用表达载体的重组载体。
作为细菌用表达载体，可以例举有例如pBTrP2，pBTac1，pBTac2(均由Boehringer Mannheim公司制)，pKK233-2(Pharmacia公司制)，pSE280(Invitrogen公司制)，pGEMEX-1(Promega公司制)，pQE-8(QIAGEN公司制)，pQE-30(QIAGEN公司制)，pKYP10(特开昭58-110600)，pKYP200[Agrc.Biol.Chem.，48，669(1984)]，PLSA1[Agrc Blol.Chem.，53，277(1989)]，pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)]，pTP5，pC194，pUC18[Gene，33，103(1985)]，pUC19[Gene，33，103(1985)]，pSTV28(宝酒造公司制)，pSTV29(宝酒造公司制)等。作为细菌用启动子，可以例举有例如trp启动子(Ptrp)，lac启动子(Plac)，PL启动子，PR启动子，PSE启动子等大肠杆菌或噬菌体等来源的启动子，SP01启动子，SP02启动子，penP启动子等。
此外，作为本发明的转化细胞，如果是被导入上述本发明的重组载体并且表达具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的转化细胞，没有特别的限制，可以例举有转化植物细胞，转化动物细胞，转化细菌，转化酵母等，但是最佳可以例举有转化大肠杆菌，转化酵母，转化植物细胞等。这些转化大肠杆菌，转化酵母，转化植物细胞等转化细胞可以最佳应用于氨基酸生产等各种微生物产业中。
作为可以在转化植物细胞的制备中使用的宿主植物细胞，其种类没有特别的限定，可以从花卉、果实植物、野菜、根菜、谷类、赏叶植物、包括果树在内的树木等植物、例如属于茄科、禾本科，油菜科、菊科、芝麻科、木犀科、桃金娘科、蔷薇科、豆科、槟榔科或茜草科的植物的培养细胞中适当选择。为了制备这种转化植物细胞，可以采用使用含有本发明的基因DNA的上述本发明的重组载体，将该重组载体导入于植物细胞中，在植物细胞中的基因组DNA中导入本发明的基因DNA的方法。植物的转化，可以根据植物的种类等，适当使用叶盘共存培养法，电穿孔法，农杆菌法，基因枪法等公知的方法进行。此外，也可以通过以物理或化学方式提高植物细胞的渗透性在受体细胞中直接获得本发明的重组载体来制备转化植物的方法。
作为可以在转化酵母的制备中使用的酵母的宿主细胞的具体实例，可以列举有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)等。作为将重组载体导入酵母宿主的方法，可以例举有电穿孔法，农杆菌法，醋酸锂法等。
作为可以在转化细菌的制备中使用的细菌的宿主细胞的具体实例，可以列举有属于埃希杆菌属(Escherichia)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，短杆菌属(Brevibacterium)，芽胞杆菌属(Bacillus)，细杆菌属(Microbacterium)，沙雷菌属(Serratia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，农杆菌属(Agrobacterium)，节杆菌属(Arthrobacter)，欧文(氏)菌属(Erwinia)，甲基杆菌属(Methylobacterium)，红色细菌属(Rhodobacter)，链霉菌属(Streptomyces)，酵单胞菌属(Zymomonas)属等的微生物，作为将重组载体导入细菌宿主的方法，可以例举有使用钙离子的方法或原生质体法等。
此外，作为制备本发明的具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的方法，如果是培养上述本发明的转化酵母，转化细菌，转化植物细胞等转化细胞，从该转化细胞或其培养液的上清中回收重组蛋白质的方法，没有特别的限制。进而，作为本发明的转基因植物，如果是可以通过在植物细胞中导入编码前述具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA或前述载体，使该植物细胞进行分裂增殖和再分化获得的转基因植物，没有其它的限制。以下，对上述本发明的载体，转化细胞，具有环境压力抗性提高活性的蛋白质的制备方法以及转基因植物进行说明。
如上所述，本发明的DNA可以用于制备重组蛋白质。重组蛋白质的制备，可以通过以下方式进行在适当的表达载体中导入上述本发明的DNA，将该载体导入适当的宿主细胞中，使该DNA表达，然后，从表达蛋白质的该转化细胞中或其培养上清中回收。作为可以在重组蛋白质的表达中使用的宿主表达系，可以例举有例如IMPACT-CN系统(宿主大肠杆菌菌株ER2566，载体pTYB1，pYB2，pYB11，pYB12(BioLabs公司))或pET Expression System(宿主Epicurian Coli BL21，载体pET3系列(Novagen公司))。作为向宿主细胞导入载体的方法，可以例举有电穿孔法和热激法(基因文库的制备法，羊土社(1994)，植物细胞工程入门，学会出版中心(1998))。此外，用于使重组蛋白表达的转化体的培养可以在本领域技术人员一般使用的方法和条件下进行。被表达的蛋白质，在利用IMPACT-CN系统时可以用甲壳质珠(Biolabs公司)纯化，在利用pET表达系统时可以用His结合树脂(Biolabs公司)纯化。
上述本发明的DNA可以应用于制备至少热或水分压力抗性被强化的植物。作为通过使用本发明的DNA制备转基因植物的生物种类没有特别的限定，优选是高等植物。这种转基因植物的制备可以通过以下方式有效地进行通过在保证其在植物细胞中表达的载体插入该DNA，使该转化植物细胞再生以获得转基因植物。
作为可以在转基因植物制备时使用的载体，可以最佳使用例如由东洋纺市售的pBI101或pIG121Hm(Plant J，Vol 6，p271-282(1994))。导入载体的植物细胞的种类没有特别的限制，但是可以考虑例如稻，小麦，玉米，大豆，烟草，人参等。作为植物细胞的形态，有例如原生质体，愈伤组织，植物体的部分(叶盘，胚轴等)。作为在宿主植物细胞中导入载体的方法，农杆菌法是最佳的，除此之外，还可以使用例如聚乙二醇法，电穿孔法，基因枪法等(模型植物的实验步骤，秀润社(1996))。
使导入了载体的植物细胞再生成植物体的方法，根据植物种类而不同。例如，在稻的情况下，可以按照以下方式进行。从完熟种子中进行愈伤组织诱导，使导入了cDNA的农杆菌感染该愈伤组织。经过共培养，转移到选择培养基中进行培养。约3周后将愈伤组织转移到在分化培养基中，培养至再分化。使之4，5天驯化后，移至罐中，使转化体再生(模型植物的实验步骤，秀润社(1996))。此外，作为人参，烟草等再生方法，可以分别最佳例示有加藤，庄野博士等的方法(植物组织培养的技术朝仓书店(1983))。
如果由此获得转基因植物体，进而从该植物体中获得繁殖材料(例如，根据植物的种类，种子，块根，切穗，分生组织克隆等的培养增殖)，由此可以大量生产本发明的转基因的植物。
以下，通过实施例对本发明具体地说明，但是本发明的技术范围不限于这些例示。
实施例1[欧洲海蓬子cDNA文库的制备]欧洲海蓬子是被子植物，双子叶类，藜属科的一年生草，显示出高等植物中最高水平的耐盐性(即使在1MNaCl以上也可以生长)。欧洲海蓬子的cDNA文库的制备使用叶，按照如下所示步骤进行。首先，按照Ostrem等人的方法(Plant Physiol Vol.84 p1270-1275(1987))提取总mRNA，使用Oligotex-dT30<super>(第一化学社)从中纯化poly(A)+RNA。基于纯化的poly(A)+RNA合成cDNA，导入到λZap II(Stratagene公司)λ噬菌体载体，从而构建出cDNA文库。使用λZap II的cDNA文库的构建方法是公知的方法，实际的步骤按照Stratagene公司的手册进行。其结果是，成功构建了含有独立5×105个独立克隆的欧洲海蓬子cDNA文库。
实施例2[从欧洲海蓬子cDNA文库中寻找环境压力抗性基因]从欧洲海蓬子cDNA文库中寻找环境压力抗性基因使用采用由山田等人开发的大肠杆菌的功能筛选法(Plant Cell Physiol Vol.43p903-910(2002))进行。其结果是，在导入了图1所示的全长1765bp构成的cDNA的大肠杆菌中确认了抗盐性的提高。用基因信息处理软件(软件开发株式会社)分析碱基序列的结果表明编码由427个氨基酸构成的蛋白质。用BLAST同源性检索程序，进行这些DNA编码的氨基酸序列的同源性检索。其结果，确认了图2所示的氨基酸序列与拟南芥的类成束蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白(FLA1)(At5g55730)具有部分同源性(图2的氨基酸序列的第1-427位的区域中有58％的同源性)。使用SignalP(HYPERLINK″http://www.cbs.dtu.dk/services/Signalp/″www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析的结果是，一般认为该蛋白质(以下SeFLA)的第1-25位的氨基酸序列是分泌性信号肽。此外，使用DGPI(http://129.194.186.123/GPI-anchor/DGPI_demo_en.html)和big-PI plant predictor(http://mendel.imp.univie.ac.at/gpi/plant_server.html)分析的结果是，一般认为前者中SeFLA的C末端第412-427位的氨基酸序列，后者中第401，402位的氨基酸序列是疏水性聚糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号序列。
实施例3[SeFLA部分长度cDNA的制备]使用F1引物(5′-CCCACCACAACATAA ATGCACAACATCACC-3′；序列号3)和T7引物(5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；序列号4)，以由上述少选获得的SeFLAcDNA(克隆至pBluescript SK)作为模板，通过PCR扩增了除去了被推定为SeFLA的分泌性信号肽的第1-25位的氨基酸序列的部分长度序列(SeFLAΔN)(图3)。用T4 DNA聚合酶和klenow使所得DNA片段末端平滑。另一方面，用EcoRV切断大肠杆菌表达载体pBluscript SK，碱性磷酸酶处理后，克隆上述PCR片段。确认了克隆的片段没有引入变异，用于以后的实验。此外，使用F2引物(5′-GTCTAGTGTCTACTAA CCCAACCAACCATG-3′；序列号5)和R1引物(5′-CTCTCCTCCGTCTCACTAATCGTCCGCCGT-3′；序列号6)，以与上述相同的方式通过PCR扩增了除去了被推定为SeFLA的GPI锚定信号序列的第401-427位的氨基酸序列的部分长度序列(SeFLAΔC)(图3)。用T4 DNA聚合酶和klenow使所得DNA片段末端平滑。另一方面，用EcoRV切断大肠杆菌表达载体pBluscript SK，碱性磷酸酶处理后，克隆上述PCR片段。确认了克隆的片段没有引入变异，用于以后的实验。
并且，引物上的起始密码子用全角文字表示，终止密码子用下划线表示。
实施例4[向酵母表达载体的克隆]分别用Kpn I切断克隆到pBluscript SK中的SeFLA全长或部分长度的cDNA(SeFLAΔN，SeFLAΔC)cDNA，用T4 DNA聚合酶和klenow末端平滑化后，用Sac I切断。将所得片段克隆到具有ADH1启动子的酵母表达载体(pAURl23Takara)的Sac I/Hpa I位点。用SamI切断获得的质粒，通过SelfLigation进行来除去克隆时非编码区域产生的多余的限制酶位点。
实施例5[向植物表达载体的克隆]分别用Kpn I切断克隆到pBluscript SK中的SeFLA全长cDNA，用T4 DNA聚合酶和klenow末端平滑化后，用Xba I切断。将所得片段克隆到具有35S菜花花叶病毒启动子的植物表达载体(pBI121)的启动子下游。
实施例6[转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的制备]为了制备导入了SeFLA(全长)cDNA的烟草转化体，通过电穿孔(GTE-10岛津制作所)在A.tumefaciens(EHA株)中导入上述质粒。在含有50μg/ml的潮霉素的YEP固体培养基中选择，将所得的转化体接种于含有潮霉素的YEP培养基中，28℃下振荡培养。
实施例7[通过农杆菌法将基因导入烟草]导入了SeFLA(全长)cDNA的转化根癌农杆菌用乙酰丁香酮溶液(10μg/ml)稀释至OD600＝0.25。制作无菌状态下生长的烟草的叶的叶盘(直径7mm)，进入该菌体悬浮液中1分钟。置于含有10μg/ml乙酰丁香酮的Murashige-Skoog(MS)固体培养基中，26℃，暗条件下温育两天。然后，将叶盘置于MS再分化培养基(含有苄胺基嘌呤0.05mg/ml，萘基醋酸0.05mg/ml，CLAFORAN250mg/ml，卡那霉素100mg/ml)中，在26℃，明/暗条件下培养，每两周接种一次继续培养。约1个月后，切取由叶盘再分化的枝条，接种于MS发根培养基(含有CLAFORAN250mg/ml，卡那霉素100mg/ml)。生长约2个月的各转化烟草植入土中，约4个月后，获得了次世代(T1)的种子。
实施例8[SeFLA对大肠杆菌的盐压力抗性强化功能]对通过将克隆到pBluscript SK中的SeFLA全长或部分长度的(SeFLAΔN，SeFLAΔC)cDNA导入大肠杆菌(SOLAStratagene)获得的转化体的生长发育进行了评价。将各转化体分别接种于初期浓度达到OD600＝0.05的2YT液体培养基中，用小型振荡培养装置TVS062CA(ADVANTEC)监视菌体浓度。与无压力(NaCl86mM，山梨糖醇0mM，37℃)的状态下任意一个转化体显示出同样的生长(图4A)相对，37℃下，在含有650mM NaCl的2YT液体培养基(山梨糖醇0mM)中，与导入了对照载体的转化体相比，导入了SeFLA全长或部分长度(SeFLAΔN，SeFLAΔC)的转化体中确认了显著的耐盐性的提高(图4B)。
实施例9[SeFLA对大肠杆菌的水分压力抗性强化功能]对SeFLA全长或部分长度的(SeFLAΔN，SeFLAΔC)cDNA，作为对照的导入载体(pBluscript SK)的转化体的水分压力抗性进行了评价。在37℃下使用含有1.2M山梨糖醇的2YT培养基(NaCl86mM)进行与实施例8相同的操作。由此确认了SeFLA对大肠杆菌具有水分压力抗性强化功能。此外，相同条件下，在导入了SeFLA部分长度(SeFLAΔN，SeFLAΔC)的转化体中表明了与导入SeFLA全长的转化体相比，增殖速度降低(图4C)。
实施例10[SeFLA对大肠杆菌的热压力抗性强化功能]对SeFLA全长或部分长度的(SeFLAΔN，SeFLAΔC)cDNA，作为对照的导入载体(pBluscript SK)的转化体的热压力抗性进行了评价。进行与实施例8相同的操作，使用通常的2YT液体培养基(NaCl86mM，山梨糖醇0mM)，绘制45℃下的增殖曲线。其结果是，导入了SeFLA全长的转化体中确认了显著的增殖。此外，在导入了SeFLAΔN的转化大肠杆菌中确认了与导入全长的转化体相比，增殖速度降低，与对照相比增殖显著(图4D)。根据这些结果，确认了SeFLA对大肠杆菌起盐，水分，热压力抗性强化因子的作用。此外，为了该蛋白质充分行使功能，需要推定为分泌型信号肽的区域和推定为GPI锚定信号序列的区域这两者。
实施例11[SeFLA对酵母的盐压力抗性强化功能]对通过将克隆到酵母表达载体pAUR123中的SeFLA全长或部分(SeFLAΔN，SeFLAΔC)cDNA导入啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(YM4271Clontech公司)中获得的转化体的耐盐性进行了评价。将各转化体分别继续接种于初期浓度达到OD600＝0.1的YPD液体培养基中，用小型振荡培养装置TVS062CA(ADVANTEC)监视细胞浓度的变化。与无压力(NaCl0mM，山梨糖醇0mM，30℃)的状态下任意一个转化体显示出同样的生长(图5A)。与之相对，在含有1.5M NaCl的YPD液体培养基中，与只导入载体的转化体相比，在导入了SeFLA全长或部分(SeFLAΔN，SeFLAΔC)的转化体中确认了显著的耐盐性的提高(图5B)。
实施例12[SeFLA对酵母的水分压力抗性强化功能]对SeFLA全长或部分(SeFLAΔN，SeFLAΔC)，作为对照的导入载体(pAUR123)的转化体的水分压力抗性进行了评价。在30℃条件下使用含有2.2M山梨糖醇的YPD培养基(NaCl0mM)进行与实施例11相同的操作。其结果是，确认了导入了SeFLA全长或SeFLAΔN的转化体，与对照相比有显著的增殖(图5C)。此外，在相同条件下导入了SeFLAΔC的转化体中没有发现与对照相比有显著的差异(图5C)。根据这些结果，确认了，SeFLA在酵母中起水分压力抗性强化因子的作用，尤其是推定为GPI锚定信号序列的区域不可欠缺。
实施例13[SeFLA对酵母的热压力抗性强化功能]对SeFLA全长或部分(SeFLAΔN，SeFLAΔC)，作为对照的导入载体(pAUR123)的转化体的热压力抗性进行了评价。进行与实施例11相同的操作，使用YPD液体培养基(NaCl0mM，山梨糖醇0mM)，对38℃的生长进行评价。其结果是，与对照相比，在导入了SeFLA全长的转化体中发现了显著的增殖。此外，在导入了SeFLAΔN的转化体中确认了，与导入全长的相比，增殖速度下降，与对照相比，有显著的增殖。在导入了SeFLAΔC的转化体中，增殖速度急剧下降至与对照相同水平(图5D)。根据这些结果，确认了，SeFLA在酵母中也起热压力抗性强化因子的作用，尤其是推定为GPI锚定信号序列的区域不可欠缺。
根据以上结果，确认了SeFLA对酵母起盐，水分，热压力抗性强化因子的作用。
实施例14[SeFLA对烟草的盐压力抗性强化功能]制作按照实施例7制成的转化体烟草共计14条系，各转化体中用Northern blot法确认了SeFLAmRNA的表达。使用全长SeFLAcDNA作为探针的结果是，在第3，14系上确认了SeFLAmRNA强表达(图6A)。于是，使这两系自花传粉，获得了次世代的种子(T1)。将获得的种子播种于土壤中，然后每隔4添加含有250mM NaCl的盐水，评价10天后的发芽率。其结果是，发现了，与作为对照的野生株相比，导入了SeFLA全长的转化体在NaCl存在下的发芽率显著提高(图6B)。此时发现，发芽的幼植物体与对照相比，有显著的生长差异(图6C)。即使在湿重量中也发现了显著的差异(图6D)。
根据以上的结果，确认了，SeFLA具有使从细菌至酵母的大范围的生物种类的盐，水分，热压力抗性提高的效果。尤其是，根据上述压力给各种细胞造成细胞内的水分含量的降低，一般认为SeFLA蛋白质具有防止细胞内的水分含量降低的效果。实际上，还确认了导入了SeFLA的转化烟草系的第14，3系，在含有400mM的甘露糖醇的琼脂培养基中的发芽率(10天时评价)也均有提高(图6E)。
序列表<110>国立大学法人东京农工大学(Tokyo University of Agriculture and Technology)<120>具有对热或水分压力的抗性提高的活性的阿拉伯半乳聚糖蛋白质<130>040036WO<150>JP2004-231603<151>2004-08-06<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1765<212>DNA<213>欧洲海蓬子<400>1tcgctactta gctcccactc tttctactaa atattatttc cacttctcat tcccactcat 60tttttcctct aacttccact cttaacacaa ctgtctagtg tctactaacc caaccaacca 120tgcaaaaagc tatagtatta ggagcattgc tcctcttgct cacactcacc ctcaccccca 180ccacaacaca tgcccacaac atcaccaaaa ttctagccaa gttccctgat ttctcctcct 240tcaaccacta cctcaccacc acccacctcg cccctgagat caacacccgc caaaccatca 300ccgtcctcgc catcgacaat gccgccatgg cttccctcac ctccaagcac ctccccattt 360ccaccctcaa aaacatcctc tccctccacg tcctcctcga ttacttcggc gctaaaaaac 420tccaccaaat caccgacggc tctgcccttg ctgccaccat gtaccaagcc accggctccg 480
cccccggcac tgccggtttt gtcaacatca ccgacctcaa aggcggcaaa gtcggcttcg 540ccgccaccaa ccccgcctct gatgaaggcg attccgacag cacaccctct ctcaactcaa 600ccttcatcaa atccctaaag gaaatccctt acaacatctc agtcatccaa atcagccaca 660ttctatcctc acctaccgcc gaggcgcctt ctccggcgcc cgaagccacc aacatcaccg 720gcattatgtc cgctcacggc tgcaaggaat tcgccgacac gctgacgtca tttcccgacg 780cactcgaggt tttcaccacc aacacagaag gcggattaac cgtcttttgt ccttcagacg 840acgccttcaa aggcttcctc cctaatttca aaaacctaac aaaagaagaa aaaaactctc 900tgctactctt ccatggaatt cctgtctaca actccatggc attgctcaaa accagcaatg 960gagtgatgaa cactctcgct accgacggta agaacaaatt cgacttcact gttcaaaacg 1020caggtcagaa agtgacattg aagacgaagg ctgtcaccgc gaccatcacc gctactctgt 1080tggacgaaga tccagttgcg atctacacca ttgataaggt cttgaagcca tcggagatct 1140ttaagaagcc ggagatttca cctgcaccag cacctgctcc ggaagctgag gcgccttcga 1200agggtaaaag acaccataaa tcgccaccag cgccaccgag tgaagatgat tcggcggatt 1260ctccggcgga ctcaccggca gatggaccga atgcggatga ctcgacggcg gacgattcga 1320gcgacggagg agagagagtg aagaaagggt tttggatggt tggagttgtg tcggtggtag 1380gggtttggag tatgtggata tagaattaca caaaaaaaaa aaaaagggta atgaaatatg 1440aaaagggaat aatttaattt aatttggggg gtaagaaaat ggaagtgtaa tttatattta 1500tggtgtgccc aaattattat tgtcctgtaa ttttattttt tctttttaat ttttttagtt 1560
aggattttgt gtgagaattt gtttgtttgt tgtgtttgag tgttgtttaa tgtaattttt 1620tgaatgggat taggatttta tgtgggtgtt taaaagaaaa ataattggat tgaaatttgt 1680ttttggtatc acaaattgta gacacacata atttgacaat aatttatggt gatgtatcaa 1740ttaatctgaa aaaaaaaaaa aaaaa1765<210>2<211>427<212>PRT<213>欧洲海蓬子<400>2Met Gln Lys Ala Ile Val Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Thr Leu1510 15Thr Leu Thr Pro Thr Thr Thr His Ala His Asn Ile Thr Lys Ile Leu20 2530Ala Lys Phe Pro Asp Phe Ser Ser Phe Asn His Tyr Leu Thr Thr Thr35 40 45His Leu Ala Pro Glu Ile Asn Thr Arg Gln Thr Ile Thr Val Leu Ala50 5560Ile Asp Asn Ala Ala Met Ala Ser Leu Thr Ser Lys His Leu Pro Ile65 70 7580
Ser Thr Leu Lys Asn Ile Leu Ser Leu His Val Leu Leu Asp Tyr Phe85 90 95Gly Ala Lys Lys Leu His Gln Ile Thr Asp Gly Ser Ala Leu Ala Ala100 105110Thr Met Tyr Gln Ala Thr Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ala Gly Phe Val115 120 125Asn Ile Thr Asp Leu Lys Gly Gly Lys Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn130 135 140Pro Ala Ser Asp Glu Gly Asp Ser Asp Ser Thr Pro Ser Leu Asn Ser145 150 155 160Thr Phe Ile Lts Ser Leu Lys Glu Ile Pro Tyr Asn Ile Ser Val Ile165 170 175Gln Ile Ser His Ile Leu Ser Ser Pro Thr Ala Glu Ala Pro Ser Pro180 185 190Ala Pro Glu Ala Thr Asn Ile Thr Gly Ile Met Ser Ala His Gly Cys195 200205Lys Glu Phe Ala Asp Thr Leu Thr Ser Phe Pro Asp Ala Leu Glu Val210 215 220
Phe Thr Thr Asn Thr Glu Gly Gly Leu Thr Val Phe Cys Pro Ser Asp225 230 235 240Asp Ala Phe Lys Gly Phe Leu Pro Asn Phe Lys Asn Leu Thr Lys Glu245 250 255Glu Lys Asn Ser Leu Leu Leu Phe His Gly Ile Pro Val Tyr Asn Ser260 265 270Met Ala Leu Leu Lys Thr Ser Asn Gly Val Met Asn Thr Leu Ala Thr275 280 285Asp Gly Lys Asn Lys Phe Asp Phe Thr Val Gln Asn Ala Gly Gln Lys290 295 300Val Thr Leu Lys Thr Lys Ala Val Thr Ala Thr Ile Thr Ala Thr Leu305 310 315 320Leu Asp Glu Asp Pro Val Ala Ile Tyr Thr Ile Asp Lys Val Leu Lys325 330335Pro Ser Glu Ile Phe Lys Lys Pro Glu Ile Ser Pro Ala Pro Ala Pro340 345350Ala Pro Glu Ala Glu Ala Pro Ser Lys Gly Lys Arg His His Lys Ser355 360 365
Pro Pro Ala Pro Pro Ser Glu Asp Asp Ser Ala Asp Ser Pro Ala Asp370 375 380Ser Pro Ala Asp Gly Pro Asn Ala Asp Asp Ser Thr Ala Asp Asp Ser385 390 395 400Ser Asp Gly Gly Glu Arg Val Lys Lys Gly Phe Trp Met Val Gly Val405 410 415Val Ser Val Val Gly Val Trp Ser Met Trp Ile420 425<210>3<211>30<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>F1 primer<400>3cccaccacaa cataaatgca caacatcacc 30<210>4<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>T7 primer
<400>4gtaatacgac tcactatagg gc 22<210>5<211>30<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>F2 primer<400>5gtctagtgtc tactaaccca accaaccatg 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>R1 primer<400>6ctctcctccg tctcactaat cgtccgccgt 30
权利要求
1.编码序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA。
2.编码由与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA。
3.编码由序列号2所述的氨基酸序列中缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA。
4.由序列号1所示的碱基序列或其互补的序列构成的DNA。
5.由序列号1所述的碱基序列中缺失，取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成并且编码具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA。
6.与权利要求4或5记载的DNA在严紧条件下杂交并且编码具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的DNA。
7.由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
8.由与序列号2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质。
9.由序列号2所述的氨基酸序列中缺失，取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质。
10.含有编码权利要求7-9任一项记载的蛋白质的DNA的重组载体。
11.含有编码权利要求1-6任一项记载的DNA的重组载体。
12.通过将权利要求10或11记载的重组载体导入宿主细胞获得的转化细胞。
13.根据权利要求12记载的转化细胞，所述宿主细胞为植物细胞。
14.根据权利要求12记载的转化细胞，所述宿主细胞为微生物细胞。
15.具有至少热或水分压力抗性提高活性的蛋白质的培养方法，特征在于培养权利要求12-14任一项记载的转化细胞，从该转化细胞或其培养液上清中回收重组蛋白质。
16.具有至少热或水分压力抗性提高活性的转基因植物，其是通过在植物细胞中导入编码权利要求7-9任一项记载的蛋白质的DNA，使该植物细胞进行分裂增殖和再分化而获得的。
17.具有至少热或水分压力抗性提高活性的转基因植物，其是通过在植物细胞中导入权利要求1-6任一项记载的DNA，使该植物细胞进行分裂增殖和再分化而获得的。
18.具有至少热或水分压力抗性提高活性的转基因植物，其是通过在植物细胞中导入权利要求12或13记载的载体，使该植物细胞进行分裂增殖和再分化而获得的。
全文摘要
提供了一种对盐，水分，热压力等环境压力，尤其是对水分压力的抗性提高的活性的蛋白质的基因，具有对环境压力的抗性提高的活性的蛋白质，以及对环境压力的抗性增强了的转基因植物等。使用具有对水分压力的抗性提高的强活性，即使在积累了盐类的干燥地区都可以生长的盐生植物，旨在分离与欧洲海蓬子的耐盐性机制相关的基因群(cDNA)，通过采用大肠杆菌的基因表达系的功能筛选法，寻找与欧洲海蓬子的耐盐性机制相关的基因，发现了与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的类成束蛋白(Fasciclin－like)阿拉伯半乳聚糖蛋白质具有部分同源性的由427个氨基酸构成的阿拉伯半乳聚糖蛋白质具有强化耐盐性，水分压力抗性(山梨糖醇抗性)，耐热性的功能。
文档编号C07K14/415GK101014706SQ20058002593
公开日2007年8月8日 申请日期2005年8月1日 优先权日2004年8月6日
发明者山田晃世, 小关良宏, 赤塚里子 申请人:国立大学法人东京农工大学