糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素的制作方法

专利名称：糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种糖基化免疫球蛋白以及一种含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素。更具体地说，本发明涉及一种免疫球蛋白或其片段，其通过修饰特定的氨基酸残基而额外地糖基化，以及一种糖基化融合蛋白，其通过将糖基化免疫球蛋白或其片段与至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成。
背景技术：
免疫粘附素(或免疫球蛋白融合蛋白)是类似抗体的分子，其通过将免疫球蛋白的片段(例如，Fc部分)与受体的配体结合区或粘附分子融合而形成。本领域已知的典型免疫粘附素具有抗体结构，其中，以受体的配体结合区取代参与抗原识别的可变区，同时保留Fc部分。长期以来，已有大量的专利说明了融合蛋白，其中，将生理活性蛋白的特定区域链接到抗体上(美国专利第5,521,288、5,844,095、6,046,310、6,090,914、6,100,383和6,225,448号)。
与不含免疫球蛋白的分子相比，免疫粘附素具有以下优点1)融合蛋白对配体的总亲合力增加，因为其具有二聚物形式的二价；2)由于分子稳定性增加，融合蛋白以未受破坏的形式更长时间地存在于血清中；3)通过免疫球蛋白重链的Fc(可结晶片段)部分来活化效应细胞；以及4)通过方便的方法来分离和纯化融合蛋白，例如，使用蛋白质A。
例如，如果以肿瘤坏死因子(以下简称“TNF”)作为细胞因子，为了抑制与TNF有关的炎症反应，可以使用肿瘤坏死因子受体(以下简称“TNFR”)，如PCT申请公开第WO92/16221和WO95/34326号中所述，或者可以使用TNFR-免疫球蛋白(Ig)融合蛋白，如美国专利第5,447,851号以及PCT申请公开第WO94/06476号中所述。根据许多报告，TNFR-Ig融合蛋白对TNF的亲合力比TNFR的天然单体形式或非Ig融合形式要高得多(Lesslauer W.等人，Eur.J.Immunol.，1991年，第21卷，第2883页；Ashkenazi A.等人，PNAS USA，1991年，第88卷，第10535页；Peppel K.等人，J.Exp.Med.，1991年，第174卷，第1483页；MohlerK.M.等人，J.Immunol，1993年，第151卷，第1548页)。
对于使用Ig融合蛋白来抑制TNF作用或控制免疫反应的情况，Ig融合结构中作为TNF受体、CD2和CTLA4的功能区的细胞外区的多价或多聚物形式预计可以提高融合结构的功效。当TNF受体细胞外区和Ig重链的一种单体融合蛋白(重链融合蛋白)与TNF受体细胞外区和Ig轻链的另一种单体融合蛋白(轻链融合蛋白)同时在一个细胞系中表达时，通过重链和轻链之间的相互作用来产生二聚融合蛋白。二聚融合蛋白具有像活体内形式那样平行排列的两个有效区，并且与单体融合结构相比，具有显著提高的功效(Scallon BJ.等人，Cytokine，1995年，第7卷，第759页)。
但是，由于以下问题，这种二聚物形式的Ig融合蛋白难以工业化应将单独融合至Ig重链和轻链的两个基因共同引入宿主细胞；当在单个细胞中同时表达两种不同的融合蛋白时，其产率极大地降低；而且，由于并非所有表达的重链融合蛋白和轻链融合蛋白都参与二聚物的形成，因此融合重链融合蛋白和轻链融合蛋白的二聚物在技术上难以从与单体重链融合蛋白或轻链融合蛋白的混合物中分离出来。
在这方面，本发明人构建了一种串联体蛋白，其中，使用重组DNA技术将生物活性蛋白的可溶区的C-末端链接到相同或不同生物活性蛋白的可溶区的N-末端。而且，本发明人制备了一种对二聚蛋白进行编码的DNA结构，其中，单体蛋白的两个分子(其中，将参与免疫反应的蛋白的串联体链接到免疫球蛋白Fc片段的铰链区)在铰链区二硫化键结，并根据DNA结构使用重组DNA技术产生串联体链接的二聚融合蛋白。
如上所述，已经尝试改进免疫球蛋白融合蛋白的功效和制备方法，但几乎所有努力都未能增加免疫球蛋白融合蛋白的稳定性。
在这方面，如韩国专利申请第2002-0045921号中所述，本发明人提出了一种通过将糖基化基序添加到蛋白的功能区与免疫球蛋白Fc区之间的连接区域来增加蛋白稳定性的方法。但是，当在功能区附近糖基化免疫粘附素时，蛋白无法正确折叠或者降低了功能。

发明内容
在这方面，本发明人通过将额外的糖基化基序引入免疫球蛋白融合蛋白的免疫球蛋白(特别是Fc部分)而构建了一种糖基化融合蛋白，并且发现，该糖基化融合蛋白在活体内的作用时间比不含糖基化基序的形式更长，从而得到了本发明。
因此，一方面，本发明提供了一种糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，将含有一种或多种氨基酸修饰的免疫球蛋白变异体额外地糖基化，所述氨基酸修饰选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组。
另一方面，本发明提供了一种对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA，其中，将含有一种或多种氨基酸修饰的免疫球蛋白变异体额外地糖基化，所述氨基酸修饰选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组。
又一方面，本发明提供了一种糖基化融合蛋白，其通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。
另一方面，本发明提供了一种对糖基化融合蛋白进行编码的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。
另一方面，本发明提供了一种重组表达载体，其含有对糖基化融合蛋白进行编码的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。
另一方面，本发明提供了一种使用重组表达载体转染或转化的宿主细胞，所述重组表达载体含有对糖基化融合蛋白进行编码的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。
另一方面，本发明提供了一种制备糖基化融合蛋白的方法，其包括培养一种宿主细胞，所述宿主细胞使用重组表达载体转染或转化，所述重组表达载体含有对糖基化融合蛋白进行编码的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化；以及将糖基化融合蛋白从培养物中分离出来。
另一方面，本发明提供了一种含有糖基化融合蛋白的医药组合物，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。


通过下面结合附图进行的详细描述，可以更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特点和其他优点。所附图形包括图1显示了根据本发明的免疫球蛋白的糖基化位点；图2是显示根据本发明的糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的表达水平的曲线图；图3是显示根据本发明的糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的蛋白质印迹分析的结果的曲线图；图4是显示在使用融合蛋白进行腹腔内注射的老鼠中，根据本发明的糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的血清水平随时间的变化的曲线图。
具体实施例方式
按照国际生物化学学会规定的标准缩写，本文中用于表示氨基酸的单个大写字母表示以下氨基酸A丙胺酸；B天冬酰胺酸或天门冬氨酸；C半胱氨酸；D天门冬氨酸；E谷氨酸；
F苯基丙氨酸；G甘氨酸；H组织氨基酸；I异亮氨酸；K赖氨酸；L亮氨酸；M蛋氨酸；N天冬酰胺酸；P脯氨酸；Q谷氨酸盐；R精氨酸；S丝氨酸；T苏氨酸；V缬氨酸；W色氨酸；Y酪氨酸；以及Z谷氨酸盐或谷氨酸。
本文所使用的符号“(表示一种氨基酸的大写字母)(氨基酸位置)(表示另一种氨基酸的大写字母)”表示，在给定蛋白质的指定氨基酸位置，以后一种氨基酸取代前一种氨基酸。例如，M179N表示以天冬酰胺酸取代给定蛋白质(例如，IgG)的第179个位置的蛋氨酸残基。氨基酸位置从成熟野生型蛋白的N-末端开始编号。
术语“糖基化”表示一种通过附加糖链来修饰由作为宿主细胞的真核细胞所产生的蛋白的方法。已知附加糖链会影响蛋白质的特性以及蛋白质的活体内稳定性和功能。有两种糖基化。O-链接糖基化将低聚糖链链接到丝氨酸和/或苏氨酸残基。N-链接糖基化将低聚糖链链接到天冬酰胺酸残基。具体地说，N-链接糖基化发生于特定氨基酸序列Asn-X-Ser/Thr(X是不包括脯氨酸的任何氨基酸)。
在本发明中，对免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列在一个或多个核苷处突变，以形成一个额外的糖基化位点，O-链接或N-链接糖基化发生于这个位点，并且在宿主细胞中表达已突变的DNA，以允许自发糖基化。一方面，根据本发明的糖基化免疫球蛋白或其片段通过突变对免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列以添加和/或增加发生N-链接糖基化的Asn-X-Ser/Tbr序列(糖基化基序)而构建。
本发明中经过修饰以具有糖基化基序的“免疫球蛋白”是B细胞中产生的蛋白分子，并用作专门识别各种抗原的抗原受体。这些分子具有Y形结构，其由两个相同的轻链(L链)和两个相同的重链(H链)组成，其中，通过若干二硫化键将四个链组合在一起，在铰链区的H链之间包括二硫桥。L和H链包含可变和恒定的区域。根据H链的恒定区域的特点，将免疫球蛋白(Ig)分成五种同型A(IgA)、D(IgD)、E(IgE)、G(IgG)和M(IgM)。这五种子型具有独特的结构和生物特性。这些免疫球蛋白全都可以根据本发明进行修饰。
由于免疫粘附素一般包含免疫球蛋白的片段，即Fc部分，优选地，将本发明中的糖基化基序引入免疫球蛋白的Fc部分。本文所使用的术语“免疫球蛋白的Fc部分”指没有抗原键结活性并且容易结晶的片段，其包括铰链区和CH2及CH3区，以及负责键结抗体与效应材料和细胞的部分。
在本发明中，优选地，通过修饰免疫球蛋白的位置160、195、243、265、299、331和346的一种或多种氨基酸残基(所有这些氨基酸残基都在免疫球蛋白的Fc部分)而产生糖基化基序。因此，一方面，本发明提供了一种糖基化免疫球蛋白或其片段，其含有一种或多种氨基酸修饰，所述氨基酸修饰选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组，以及一种对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的基因。具体地说，提供了表1中所列的糖基化免疫球蛋白或其片段，其含有一种或多种上述氨基酸修饰的组合。
表1根据本发明的糖基化免疫球蛋白或其片段

另一方面，本发明提供了一种糖基化融合蛋白，其通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。在一优选方面，免疫球蛋白的片段包括Fc部分，而生物活性蛋白的该部分包括可溶性细胞外区。
一方面，糖基化融合蛋白具有单体结构，其中，通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接来形成单多肽，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。生物活性蛋白的该部分优选地包括该生物活性蛋白的可溶性细胞外区。可以通过铰链区的二硫化键来链接这种单体糖基化融合蛋白的两个分子，以形成二聚物结构。
另一方面，糖基化融合蛋白具有单体结构，其中，通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)第一生物活性蛋白或其一部分，以及(c)第二生物活性蛋白或其一部分以串联体的形式链接来形成单多肽，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。第一和第二生物活性蛋白可以相同，也可以不同。生物活性蛋白的该部分优选地包括该生物活性蛋白的可溶性细胞外区。可以通过铰链区的二硫化键来链接这种单体糖基化融合蛋白的两个分子，以形成二聚物结构。
在根据本发明的糖基化融合蛋白的一优选方面，免疫球蛋白变异体包括一种或多种氨基酸修饰并且被糖基化，所述氨基酸修饰选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组。在一更优选的方面，免疫球蛋白变异体包括SEQ ID NO16至SEQ ID NO23的氨基酸序列的任何一种，并且在最优选的方面，包括SEQ ID NO19的氨基酸序列。
本文所使用的术语“生物活性蛋白”指一般具有生理或医药活性的蛋白、肽或多肽，其在形成免疫粘附素之后保留其一部分天然活性。
本文所使用的术语“生物活性”的含义不限于生理或医药活性。举例来说，某些免疫粘附素(例如含有酶的免疫粘附素)可以在有机溶剂中催化反应。
蛋白、肽或多肽的非限制性例子包括血色素、血清蛋白(例如，血液因子，包括因子VII、VIII和因子TK)、免疫球蛋白、细胞因子(例如，白细胞介素)、α-、β-和γ-干扰素、集落刺激因子(例如，G-CSF和GM-CSF)、血小板衍生生长因子(PDGF)以及磷脂酶活化蛋白(PLAP)。其他典型的生物或治疗蛋白包括胰岛素、植物蛋白(例如，植物血凝素和篦麻毒素)、肿瘤坏死因子(TNF)及其突变等位基因、生长因子(例如，组织生长因子和内皮生长因子，如TGFα或TGFβ)、激素(例如，卵泡刺激激素、甲状腺刺激激素、抗利尿激素、色素聚集或分散激素以及甲状旁腺激素、黄体生成激素释放激素及其衍生物)、降血钙素、降血钙素基因相关肽(CGRP)、脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、丘脑下部释放因子、泌乳刺激素、绒毛膜促性腺激素、组织纤溶酶原活化剂、生长激素释放肽(GHRP)以及胸腺体液因子(THF)。某些蛋白(例如白细胞介素、干扰素或集落刺激因子)可以使用DNA重组技术以非糖基化的形式产生。本发明中，可以将非糖基化蛋白用作生物活性材料。
另外，可用于本发明的生物活性材料包括多肽的任何在活体内具有生物活性的部分。生物活性材料的例子包括肽或多肽、抗体的片段、单链键结蛋白(参见美国专利第4,946,778号)、键结分子(包括抗体的融合多肽或其片段)、多克隆抗体、单克隆抗体以及催化抗体。生物活性材料的其他例子包括过敏原蛋白，例如豚草属、抗原E、蜜蜂毒或螨的过敏原。
另外，可用于本发明的生物活性材料包括酶。酶的例子包括碳水化合物特异性酶、蛋白酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。具体地说，酶的非限制性例子包括天门冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷脱磷酸酶、酪氨酸酶和胆红素氧化酶。碳水化合物特异性酶的例子包括葡糖氧化酶、葡糖脑苷脂酶、牛乳糖、葡糖脑苷脂酶和葡萄糖苷酸酶。
本文所使用的术语“可溶性细胞外区”指暴露于嵌入膜蛋白(穿透含有磷脂的细胞膜)的细胞外区的部分，其中，嵌入膜蛋白含有一种或多种主要由疏术性氨基酸所组成的穿膜区。这种细胞外区主要包含亲水性氨基酸、其一般位于蛋白折叠结构的表面，因此可以溶解于水环境。在大多数细胞表面受体蛋白中，细胞外区用于键结特定配体，而细胞内区在信号转导方面起着重要作用。
一方面，根据本发明的糖基化融合蛋白可以通过制备对免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列来制备，其经修饰以包含糖基化位点并链接另一种对生物活性蛋白或其一部分进行编码的DNA序列。另一方面，糖基化融合蛋白可以如下制备首先制备对免疫球蛋白或其片段以及生物活性蛋白或其一部分进行编码的DNA序列(融合基因)，并使融合基因突变，以便可以糖基化免疫球蛋白或其片段。这两种方法的唯一不同之处是用作模板的DNA序列，并且基本上与本领域中用于编码蛋白变异体的DNA序列的制备方法相同。因此，在下文中，本发明打算将重点放在免疫球蛋白或其片段(实质上将糖基化基序引入其中)的修饰方法上。
根据本发明的对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列可以根据本领域熟知的各种方法来制备。这些方法包括但不限于低聚核苷酸介导诱变和盒式诱变。
具体地说，根据本发明的对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列优选地通过低聚核苷酸介导诱变来制备。这种技术是本领域中众所周知的，并且Zoller M.等人对此进行了说明(Zoller M.等人，Nuc.Ac.Res.USA，1982年，第10卷，第6487-6500页)。简要地说，对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列可以通过将模板DNA(例如，携带对非修饰或天然免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA的质粒)和针对所需的修饰编码的低聚核苷酸杂交而制备。杂交后，可以通过DNA聚合酶合成与DNA模板互补的第二完整链，并且第二链可以针对所需的修饰编码。
一般来说，上述方法中所使用的低聚核苷酸由大约25种核苷所组成。可以采用较短的低聚核苷酸，但最佳的低聚核苷酸在已修饰的密码子的左区和右区都包含12至15种与模板互补的核苷。这些低聚核苷酸可有效地与模板DNA杂交。这些低聚核苷酸可以通过本领域中熟知的技术来合成(Crea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978年，第75卷，第5765卷)。
一方面，本发明提供了一种对免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列，其携带一种氨基酸修饰(表1中的IgG)。该DNA序列可以通过使用对免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA作为模板并使用修饰编码合成低聚核苷酸作为引物来执行PCR而制备。引物与双链DNA模板在加热期间变性所产生的互补单链DNA杂交。DNA聚合酶以互补于模板的方式沿5′至3′方向逐一将核苷添加到修饰编码引物的3′-OH。新合成的链包含修饰编码引物，因而产生对所需修饰进行编码的基因。在PCR的扩充步骤中将新合成的链用作模板DNA，从而扩增对修饰进行编码的基因。
另一方面，本发明提供了一种对免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列，其具有两种或多种氨基酸修饰。将两种或多种需要修饰的氨基酸在多肽上相互紧密间隔时，所有所需的修饰都在一个低聚核苷酸中进行编码，因而得以同时实现。因此，具有两种或多种氨基酸修饰的突变免疫球蛋白或其片段可以通过用于制备携带一个核苷修饰的突变免疫球蛋白或其片段的相同方法来制备，但使用含有两个或多个氨基酸修饰的低聚核苷酸作为引物。
将两个或多个需要修饰的氨基酸隔开(在两个需要修饰的氨基酸之间存在10个以上氨基酸的情况下)时，无法在一个低聚核苷酸中编码所有所需的修饰。因此，应采用不同的方法。一种方法是为每种氨基酸修饰制备单独的低聚核苷酸。将这些低聚核苷酸同时退火到单链模板DNA上时，新合成的二级单链DNA编码所有所需的氨基酸修饰。本发明中所使用的另一种方法包括两个诱变实验。在初步诱变中，使用天然DNA作为模板，将一种含有所需氨基酸修饰的低聚核苷酸退火到模板上，因而产生异源双链DNA。在二次诱变中，将异源双链DNA用作模板。该模板已携带至少一种修饰。将一种具有另一氨基酸修饰的低聚核苷酸退火到模板上时，所得的DNA对初步和二次修饰进行编码。
盒式诱变也是用于制备根据本发明的对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA的优选方法。这种方法基于Well J.等人所述的技术(Well J.等人，Biochem.，1990年，第29卷，第8509-8517页)。起始材料是一种含有对需要修饰的免疫球蛋白或其片段进行编码的基因的质粒(或另一载体)。当特定的限制酶位点只存在于需要修饰的位置时，优选地使用盒式诱变。但是，并非必须这样做。如果这种限制酶位点不存在，则可以通过低聚核苷酸介导诱变将其引入对免疫球蛋白或其片段进行编码的基因的适当位置。将限制酶位点引入质粒中之后，通过使用限制酶进行处理而将质粒线性化。可以使用同一方法来合成具有DNA序列的双链低聚核苷酸，所述DNA序列含有所需的突变并且位于限制酶位点之间。使用同一技术来个别地合成和杂交这两个链。这种双链低聚核苷酸一般称为“盒”。“盒”应采用具有与线性质粒的两端相容的3′-和5′-端的形式来制备，因而可以直接与质粒共轭。通过上述过程，质粒最终含有对所需的糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA。
另外，可以通过化学方法来制备根据本发明的对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列。具体地说，可以通过使用低聚核苷酸合成仪的化学方法来合成这种DNA序列。根据糖基化免疫球蛋白或其片段的氨基酸序列，并且优选地通过使用产生糖基化免疫球蛋白或其片段的宿主细胞选择优选的密码子，来制备低聚核苷酸。
对于根据本发明的对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA序列，遗传密码中的简并性(其表示一种氨基酸通过多个密码子来指定)在本领域中是众所周知的。因而，有多个具有简并性的DNA序列对根据本发明的糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码，并且其全都属于本发明的范围。
或者，可以按照以下方式来制备根据本发明的糖基化融合蛋白。制备对融合蛋白进行编码的DNA序列(下称“融合基因”)，并将其插入包括一个或多个表达调控序列的载体中，所述表达调控序列通过可操作地链接到融合基因而调节融合基因的表达。接着，通过所得到的重组表达载体来转化或转染宿主。在适合融合基因表达的条件下，在适当的培养基中，培养所得到的转化子或转染子。从所得到的培养物中回收通过融合基因编码的实质上纯净的糖基化融合蛋白。
本文中所使用的术语“载体”指用作媒剂的DNA分子，其能够将外源基因稳定地带入宿主细胞。为了可以投入应用，载体应该是可以复制的，具有将自身引入宿主细胞的系统，并具有可选择的标记。
另外，本文中所使用的术语“重组表达载体”指携带可操作链接的外源基因以在宿主细胞中表达的环状DNA分子。被引入宿主细胞时，重组表达载体能够以高复制数量复制，而不管宿主染色体DNA，并且能够产生异质DNA。如本领域中一般所知，为了增加宿主细胞中已转染基因的表达水平，应将基因可操作地链接到被选作表达系统的宿主细胞中起作用的转录和翻译调节序列。优选地，表达调节序列和外源基因可以在含有可选标记和复制原点的单个表达载体中携带。如果将真核细胞用作表达系统，则表达载体应进一步包括可用于真核宿主细胞的表达标记。
为了表达根据本发明的对糖基化融合蛋白进行编码的DNA序列(即融合基因)，可以采用各种表达载体。优选地，由于应将免疫球蛋白或其片段糖基化，所以应使用适合真核宿主细胞的表达载体。可用于真核宿主细胞的表达载体包含从SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和细胞巨化病毒等衍生的表达调控序列。具体地说，载体的例子包括pCDNA3.1(+)/Hyg(美国加利福尼亚州Carlsbad市Invitrogen公司)和pCI-neo(美国加利福尼亚州La Jolla市Stratagen公司)。可用于酵母的表达载体包括2μ质粒及其异构体、POT1载体(美国专利第4,931,373号)和pPICZA、B或C(Invitrogen)。可用于昆虫细胞的表达载体包括pVL 941、pBluebac 4.5和pMelbac(Invitrogen)。但是，本发明不限于这些例子。
本文中所使用的术语“表达调控序列”指对表达根据本发明的融合蛋白而言必需或有利的核苷序列。每个调控序列可以是融合蛋白本身的或外来的。表达调控序列的非限制性例子包括前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、增强子或上游活化序列、信号肽序列和转录终止子。
为了表达本发明的融合基因，可以将各种表达调控序列中的任何一种插入本发明所使用的表达载体中。适合在哺乳动物细胞中引导蛋白表达的表达调控序列的例子包括SV40以及腺病毒的早期和晚期启动子、MT-1(金属硫因基因)启动子、人类细胞巨化病毒即刻早期基因启动子(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和人泛素C(UbC)启动子。另外，为了改进哺乳动物细胞中的表达水平，可以将合成基因内区插入融合基因的5′-非翻译区。适合在昆虫细胞中引导蛋白表达的表达调控序列的例子包括多角体蛋白启动子、P10启动子、棒状病毒39K延迟早期基因启动子和SV40多腺苷酸化序列。适合在酵母中引导蛋白表达的表达调控序列的例子包括酵母α接合系统的启动子、酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子和ADH2-4c启动子。适合在真菌细胞中引导蛋白表达的表达调控序列的例子包括ADH3启动子和终止子。
术语“可操作地链接”指本发明的融合基因以功能关系与调控序列一起排列的状态。也就是说，将基因和调控序列链接起来，以便在适当的分子(例如，转录活化蛋白)与调控序列键结时，引起基因的表达。例如，当前置序列或分泌前导序列促进成熟蛋白的分泌时，就说是可操作地链接到蛋白的编码序列。在调节编码序列的转录时，启动子与编码序列可操作地链接。当存在于允许翻译编码序列的位置时，核糖体结合位点可操作地链接到编码序列。一般来说，术语“可操作地链接”指链接的核苷序列相互接触。如果是分泌前导序列，该术语指其接触编码序列并存在于编码序列的阅读框内。但是，增强子不一定与编码序列接触。核苷序列的链接可以通过在方便的限制酶识别位点的连接来实现。没有限制酶识别位点时，可以使用低聚核苷酸接头或连接子，其通过传统的方法来合成。
另一方面，可以使用具有外源DNA的高引入效率以及引入DNA的高表达水平的宿主细胞。具体地说，应使用能够糖基化本发明的融合蛋白的真核细胞作为宿主细胞。适当的酵母宿主细胞的例子包括酿酒酵母和汉森酵母的菌株。适当的真菌宿主细胞的例子包括木霉、镰刀霉和曲霉菌种属。适当昆虫宿主细胞的例子包括Sf9或Sf21等Lepidoptora细胞系。适当哺乳动物宿主细胞的例子包括CHO细胞系、COS1或COS7等COS细胞系、BHK细胞系或老鼠细胞等动物细胞系以及组织培养的植物细胞和人类细胞。
可以通过基本实验指导书中所述的方法将本发明的融合基因或含有该融合基因的重组表达载体引入宿主细胞(例如，Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。所述引入宿主细胞的优选方法包括磷酸钙转染法、DEAE-右旋糖苷介导转染、显微注射、阳离子脂质体介导转染、电致孔、病毒转导、划痕标记、弹道引入和感染。
在本发明的制备方法中，使用本领域熟知的方法，在适合产生多肽的培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵，在实验室或工业发酵桶中，采用适当的培养基，在允许表达和/或分离多肽的条件下，培养细胞。使用本领域中熟知的程序，在含有碳和氮源以及无机盐的适当培养基中进行培养。适当的培养基可以向商业供应商购买，并且可以根据公布的组合物(例如，美国典型微生物菌种保藏中心目录)来制备。如果将融合蛋白分泌到培养基中，则其可以从培养基直接回收。如果不分泌融合蛋白，则其可以从细胞溶解产物回收。
可使用本领域中熟知的几种用于分离多肽的方法的任何一种来回收本发明的糖基化融合蛋白。例如，可以通过传统方法(包括但不限于离心分离、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。而且，多肽可以通过本领域中熟知的多种方法来进行纯化，包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲合力、疏水性和尺寸排阻)、电泳、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取。
另一方面，本发明提供了一种含有根据本发明的糖基化融合蛋白的医药组合物。
本文所使用的术语“治疗”指疾病或障碍的完全治愈、抑制或缓解。因此，本文所使用的术语“治疗有效剂量”指足以达到以上药物效果的剂量。在本发明中，治疗有效剂量可以根据配制方法、给药方式、病人的年龄、体重和性别、疾病的严重性、膳食、给药持续时间、给药途径、排泄率和反应敏感度而变化。本领域的技术人员容易确定并开出能够达到所需治疗效果的剂量。
另外，本领域的技术人员应明白，要用本发明的医药组合物治疗的疾病可以通过改变蛋白的类型而改变。作为本发明的一个实施例的糖基化CTLA4-Ig融合蛋白适用其通过抑制T-细胞的作用而显示治疗效果的疾病，例如，关节炎或牛皮癣等自身免疫性疾病、各种骨头移植(包括骨髓移植)以及静脉曲张。而且，可以在癌症的治疗中使用具有用于各种与癌症相关的细胞生长因子的受体的融合蛋白，因为其具有改进的治疗功效，原因是其增加了受体的血清水平并阻挡了血管发生因子。
本发明的医药组合物中所使用的载体包括医药领域常用的载体、佐剂和媒剂，其统称为“医药可接受载体”。可用于本发明的医药组合物中的非限制性医药可接受载体包括离子交换树脂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如，人类血清白蛋白)、缓冲剂(例如，磷酸钠、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物)、水、盐或电解液(例如，鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠和锌盐)、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、以纤维素为主的基质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、多芳基化合物、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。
本发明的医药组合物可以经由任何常用的途径给药，但条件是其能够到达所需的组织。因此，本发明的医药组合物可以局部、肠胃外、眼内、经皮、直肠内和腔内的途径给药，并且可以配制成溶液、悬浮液等。本文所使用的术语“肠胃外”包括皮下、鼻内、静脉内、腹膜内、肌内、关节腔内、滑膜内、胸骨内、心脏内、鞘内、病灶内和头颅内注射或滴注技术。
一方面，本发明的医药组合物可以配制为水溶液用于肠胃外给药。优选地，可以采用适当的缓冲溶液，例如Hank溶液、Ringer溶液或生理缓冲盐水。可以用能够增加悬浮液粘性的物质来补充水注射悬浮液，例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和右旋糖苷。另外，活性成分的悬浮液(例如，油注射悬浮液)包括亲油溶剂或载体，例如，脂肪油(例如，芝麻油)和合成脂肪酸酯(例如，油酸乙酯、甘油三酸酯或脂质体)。也可以将多价阳离子非脂氨基聚合物用作媒剂。视情况，悬浮液可以含有适当的稳定剂或药物，以增加成分的溶解度，并获得高浓度的成分。
本发明的医药组合物优选地采用无菌可注射制剂的形式，例如，无菌可注射水性或油性悬浮液。可以根据本领域熟知的方法，使用适当的分散或湿润剂(例如，Tween 80)以及悬浮剂来配制这种悬浮液。无菌可注射制剂也可以是无毒肠胃外可接受稀释液或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液。可接受的媒剂和溶剂包括甘露醇、水、Ringer溶液和等张氯化钠溶液。另外，传统上，可以将无菌的不挥发性油用作溶剂或悬浮媒剂。基于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。另外，可以在可注射制剂的制备中使用脂肪酸，例如，油酸及其甘油酯衍生物，例如，医药上可接受的自然油(例如，橄榄油或蓖麻油)，特别是其聚氧乙烯化衍生物。
主要使用过滤器过滤除去细菌，并与消毒剂混合或结合辐射，来对上述水溶性组合物进行消毒。可以将消毒后的组合物硬化，例如通过冷冻干燥，以获得硬化的产物，并且基于实用性的考虑，将硬化后的组合物溶解于已消毒的水中或已消毒的稀释溶液中。
为了增加室温下的稳定性，减少低温下高成本贮藏的需要，并延长有效期，可以将本发明的医药组合物冻干。冷冻干燥方法可以包括冷冻、第一次干燥和第二次干燥的步骤。冷冻之后，在压力下加热组合物，以蒸发掉水分。在第二次干燥步骤，从干燥的产物中除去残留的水。
根据本发明的医药组合物的每日有效剂量一般为每千克体重约10μg至约500μg，优选地每千克体重约20μg至约300μg，并且最佳地每千克体重约50μg至约200μg。本领域的技术人员应明白，需要向病人给药的医药组合物的具体数量可以根据多个因素变化，包括但不限于所需的生物活性、病人的症状和药物抗性。
通过以下例子，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员应明白，以下例子只是为了说明本发明而提供的，本发明的范围不限于这些例子。
示例表2与CTLA4-Ig的制备中所使用的引物有关的信息


示例1A.对CTLA4的可溶性细胞外区进行编码的DNA片段的制备通过PCR来制备对CTLA4的可溶性细胞外区进行编码的DNA片段，其中使用具有限制酶的识别序列、EcoRI和用于CTLA4的前导序列的编码序列的一种引物(SEQ ID NO1)，以及具有PstI识别序列和针对CTLA4的可溶性细胞外区的3′端编码的反义序列的另一种引物(SEQ ID NO2)。PCR中的cDNA模板通过反向转录聚合酶链反应(RT-PCR)、使用从健康成人的单核细胞(T淋巴细胞)提取的mRNA来制备。使用Tri-Reagent mRNA分离试剂盒(美国MRC)来分离mRNA。首先，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.2)将2×107人类T淋巴细胞清洗三次，并使用1ml Tri-Reagent通过重复吸液进行细胞溶解。通过用力摇动将细胞溶解产物与0.2ml氯仿混合，在室温下保持15分钟，并以15,000rpm的转速在4℃下离心分离15分钟。将上层清液转移到1.5-ml试管中，与0.5ml异丙醇混合，并以15,000rpm的转速在4℃下离心分离15分钟。除去上层清液后，使用1ml以75％乙醇-25％DEPC处理的三重蒸馏水(TDW)清洗颗粒。将试管颠倒两到三次，并以15,000rpm的转速在4℃下离心分离15分钟。完全除去上层清液之后，将RNA颗粒风干，以除去剩余的乙醇，并溶解于50μl经DEPC处理的TDW。
B.对IgG1的Fc区域进行编码的DNA片段的制备对IgG1的Fc区域进行编码的DNA片段通过PCR来制备，其中使用了具有PstI识别序列和针对IgG1Fc的5′端编码的序列的一种引物(SEQ ID NO3)，以及具有XbaI识别序列和针对IgG1Fc的3′端编码的反义序列的另一种引物(SEQ ID NO4)。PCR中的cDNA模板通过RT-PCR、使用从病人的末稍血细胞(B淋巴细胞)提取的mRNA来制备，所述病人患有未知病因的发烧症状，并且正在恢复中。在与A部分的示例1相同的条件下，使用相同的试剂来执行RT-PCR。
C.对非糖基化CTLA4-IgG进行编码的基因的制备对CTLA4的可溶性细胞外区进行编码的DNA片段以及对IgG1的Fc区进行编码的DNA片段使用PstI消化并使用T4 DNA连接酶连接。连接后的DNA含有前导序列，以在表达后促进蛋白分泌。如此产生的融合基因片段使用EcoRI和XbaI消化，并插入pBluescript KS II(+)(美国Stratagene)的EcoRl/Xbal位点，其中，pBluescript KS II(+)是一种市售的克隆载体。通过DNA序列来标识整个编码区(SEQ ID NO7)。从融合基因表达的融合蛋白称为“CTLA4-IgG”，其预测氨基酸序列用SEQ ID NO8表示。
示例2糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的制备为了将糖基化基序引入IgG1的Fc区，按照以下方式制备了具有核苷序列的七种引物，所述核苷序列包含引起氨基酸取代的突变在SEQ ID NO5的核苷序列中，以AAC(Asn，N)取代478-480密码子(ATG，Met)、以AAC(Asn，N)取代583-585密码子(GCC，Ala)、以AAC(Asn，N)取代727-729密码子(ACC，Thr)、以AAC(Asn，N)取代793-795密码子(GAG，Glu)、以ACC(Thr，T)取代895-897密码子(TAC，Tyr)、以ACC(Thr，T)取代991-993密码子(TTQ，Phe)并以AAC(Asn，N)取代1036-1038密码子(CAG，Gln)。下表3中给出了与这些引物有关的信息。
表3与糖基化CTLA4-Ig的制备中所使用的引物有关的信息


本发明的糖基化融合蛋白通过PCR来制备，其中使用了示例1中制备的携带CTLA4-hIgG-编码DNA的克隆载体作为模板，并使用表3中所列的低聚核苷酸作为引物。
具体地说，按照以下方式制备每种糖基化融合蛋白。
(1)CTLA4-hIgG-G1(G1变异体)使用引物(SEQ ID NO9)产生一种糖基化基序，该引物设计成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)取代位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc区的478-480核苷(ATG，Met)。
(2)CTLA4-hIgG-G2(G2变异体)使用引物(SEQ ID NO12和13)产生两种糖基化基序，所述引物设计成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)和ACC(Thr，T)取代分别位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc区的793-795核苷(GAG，Glu)和895-897核苷(TAC，Tyr)。
(3)CTLA4-hIgG-G3(G3变异体)使用引物(SEQ ID NO13和14)产生两种糖基化基序，所述引物设计成具有核苷序列，其以ACC(Thr，T)和ACC(Thr，T)取代分别位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc区的895-897核苷(TAC，Tyr)和991-993核苷(TTC，Phe)。
(4)CTLA4-hIgG-G4(G4变异体)使用引物(SEQ ID NO9、12和13)产生三种糖基化基序，所述引物设计成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)和ACC(Thr，T)取代分别位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc区的478-480核苷(ATG，Met)、793-795核苷(GAG，Glu)和895-897核苷(TAC，Tyr)。
(5)CTLA4-hIgG-G5(G5变异体)使用引物(SEQ ID NO9、12、13和14)产生四种糖基化基序，所述引物设计成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、ACC(Thr，T)和ACC(Thr，T)取代分别位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc区的478-480核苷(ATG，Met)、793-795核苷(GAG，Glu)、895-897核苷(TAC，Tyr)和991-993核苷(TTC，Phe)。
(6)CTLA4-hIgG-G6(G6变异体)使用引物(SEQ ID NO9、10、12、13和14)产生五种糖基化基序，所述引物设计成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、ACC(Thr，T)和ACC(Thr，T)取代分别位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc区的478-480核苷(ATG，Met)、583-585核苷(GCC，Ala)、793-795核苷(GAG，Glu)、895-897核苷(TAC，Tyr)和991-993核苷(TTC，Phe)。
(7)CTLA4-hIgG-G7(G7变异体)使用引物(SEQ ID NO9、10、11、12、13和14)产生六种糖基化基序，所述引物设计成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、ACC(Thr，T)和ACC(Thr，T)取代分别位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc区的478-480核苷(ATG，Met)、583-585核苷(GCC，Ala)、727-729核苷(ACC，Thr)、793-795核苷(GAG，Glu)、895-897核苷(TAC，Tyr)和991-993核苷(TTC，Phe)。
(8)CTLA4-hIgG-G8(G8变异体)使用引物(SEQ ID NO9、10、11、12、13、14和15)产生七种糖基化基序，所述引物设计成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、ACC(Thr，T)、ACC(Thr，T)和AAC(Asn，N)取代分别位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc区的478-480核苷(ATG，Met)、583-585核苷(GCC，Ala)、727-729核苷(ACC，Thr)、793-795核苷(GAG，Glu)、895-897核苷(TAC，Tyr)、991-993核苷(TTC，Phe)和1036-1038核苷(CAG，Gln)。
如下执行PCR。将1μl CTLA4-hIgG DNA(2.2ng)、1.25 U Pfu DNA聚合酶(美国Stratagene)、4U Pfu DNA连接酶(美国Stratagene)、1μl用于Pfu DNA连接酶的10x反应缓冲液、1μl每种引物(10pM)和2μl dNTP(每种10mM)添加到PCR试管中，并将三重蒸馏水添加到最终的20μl体积中。PCR条件包括94℃下3分钟、61℃下1分钟以及65℃下1分钟的两个周期，然后是94℃下1分钟、61℃下1分钟以及65℃下7分钟的29个周期，接下来是在65℃下执行15分钟的最后伸长。对如此获得的PCR产物进行序列分析，以确定是否成功地插入糖基化基序。
示例3A.糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的表达和纯化为了在中国仓鼠卵巢K-I细胞(CHO-K1，ATCC CCL-61，卵巢，中国仓鼠Cricetulus giseus)中表达糖基化CTLA4-IgG融合蛋白，将含有CTLA4-hIgG融合基因(将糖基化基序插入其中)的pBluescript KS II(+)质粒DNA从已转化的大肠杆菌中分离出来，并以EcoRI和XbaI消化。将如此获得的CTLA4-hIgG融合基因插入动物表达载体pCRTM3(美国Tnvitrogen)的EcoRI/XbaI位点。所得到的表达载体称为pCT4Ig-G2至G8质粒。其中，2004年5月17日，根据布达佩斯条约的规定，将pCT4Ig-G2重组表达载体存放于韩国微生物菌种保藏中心(KCCM)，登记号为KCCM10572。
B.融合蛋白表达的转染和评估将中国仓鼠卵巢K-I细胞(CHO-K1)种植于六孔组织培养板(美国Nunc)上，密度为每孔1-3×105个细胞，并在含有10％FBS的DMEM培养基中生长至50-80％汇合。在无血清的DMEM中，将pCT4Ig-G2至G8质粒的任一者的1-2μg DNA与2-25μl Lipofectamine(美国Gibco BRL)混合，并在室温下孵化15-45分钟，以形成DNA-脂质体复合物。然后，将所得到的复合物添加到六孔板中。在五个小时的孵化期之后，将细胞重新放入含有20％FBS的DMEM培养基中，并进一步培养18-24小时。然后，在补充了3mg/ml Geneticin(美国Gibco BRL公司的G418)的含10％FBS的DMEM中，将细胞培养三周。选择并分离所形成的集落，然后繁殖分离出的集落。
通过ELISA，使用过氧化物酶标记羊抗人IgG(美国KPL)来评估是否表达了融合基因。如下执行ELISA。首先，用0.1M碳酸氢钠将1mg/ml的羊抗人IgG稀释为1∶2000，并将100μl的稀释液均等分配到96孔柔性板(美国Falcon)。用保鲜膜密封之后，在4℃下将板孵化16小时以上，以使板的底部涂上抗体。然后，用漂洗液(1x含有0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS))将板清洗三次，并将100μl稀释缓冲液(48.5ml 1×PBS、1.5ml FBS、50μl Tween-20)添加到每个孔中。将20μd培养上层清液添加到第一个孔中，并使用微量吸液管连续稀释。而且，像试样一样稀释作为阳性对照物的0.01μg/μl人类IgG(美国Sigma)以及作为阴性对照物的非转染CHO-K1细胞的培养液。完成稀释之后，用箔将96孔柔性板(美国Falcon)包起来，在37℃下孵化1小时30分钟，并用漂洗液清洗三次。用稀释缓冲液将过氧化物酶标记羊抗人IgG(美国KPL)稀释为1∶5000，并将100μl稀释液添加到每个孔中，用箔包起来，并在37℃下孵化一个小时。完成反应之后，使用TMB微孔过氧化物酶底物系统(美国KPL)对板进行显色。在630nm下，使用酶标仪(日本Bio-RAD，Model 550)测量吸光率，以确定是否表达了融合基因以及融合基因的表达水平(图2)。如图2所示，G1变异体以最高水平表达，接下来是G2、G4、G0和G3变异体。发现G5、G6、G7和G8变异体很少表达。
示例4蛋白质印迹分析用免疫沉淀反应纯化所表达的蛋白，并进行蛋白质印迹分析。首先，将50μl蛋白质A琼脂糖微球放入1.5-ml试管，与100μl缓冲液A(0.05M硼酸、4MNaCl、pH9.0)混合，并以13,000rpm的转速离心分离大约10秒钟。除去表面清液后，重复该步骤三次。将每个蛋白质样本与平衡的蛋白质A琼脂糖微球混合，并在4℃下孵化3小时，同时旋转，以产生键结。然后，以13,000rpm的转速离心分离反应混合物，并使用缓冲液A将微球清洗三次。将微球与20μl缓冲液B(0.05M磷酸钠、0.05M柠檬酸、0.3M NaCl、pH3.0)混合，并以13,000rpm的转速离心分离，以洗提键结的蛋白质。将洗提后的蛋白质样本与5x含有5％β-巯基乙醇的缓冲液混合，沸腾5分钟，并进行还原SDS-PAGE。将3.5％丙烯酰胺凝胶(0.5M Tris-HCl(pH6.8)、0.4％SDS)用作积层凝胶，并将10％丙烯酰胺凝胶(1.5M Tris-HCl(pH8.8)、0.4％SDS)用作电泳胶。电泳后，在350mA下，将蛋白质电转移到0.4-μm Westran(PVDF转移膜，S&S)，持续2小时。使用5％脱脂乳封闭印迹，持续1小时。用漂洗液(0.1％Tween-20、1x磷酸盐缓冲盐水)清洗三次后，在过氧化物酶标记羊抗人IgG(美国KPL)的1∶2000稀释液中将印迹孵化1小时。使用漂洗液将印迹清洗三次，并且在室温下用15ml着色剂显色10分钟，该着色剂根据推荐的使用方法，使用DAB底物试剂盒(美国VECTORLABORATORIES)制备。使用三重蒸馏水终止反应。图3中给出了结果。
示例5测量老鼠中的糖基化CTLA4-hIgG融合蛋白的血清半衰期按照以下方式在老鼠中测量糖基化CTLA4-hIgG融合蛋白的血清半衰期。以0.2mg/kg的剂量将每种融合蛋白以腹膜内方式注射到老鼠中(韩国Samtako公司的ICR)。在给定的时点收集血液样本，最少50小时，并根据与示例3中相同的ELISA方法确定蛋白质浓度(图4)。
如图4所示，G2、G3和G4变异体具有增加的血清水平，而与野生型相比，G1变异体显示了缩短的血液循环时间。具体地说，G2变异体具有最高的循环时间。
工业适用性如上所述，根据本发明的糖基化融合蛋白能够减小临床应用中的剂量和给药频率，因为其具有很高的活体内稳定性。
序列表<110>魅德秀专有限公社(MEDEXGEN Inc.)<120>糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素<130>KRA1V070001317<150>KR-10-2004-0038833<151>2004-05-31<160>31<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，寡聚CTLA4-F-EcoRI<400>1ccggaattca tgaggacctg gccc 24<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，寡聚CTLA4-R-PstI
<400>2ctctgcagaa tctgggcacg gttcaggatc 30<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，寡聚IgG1-F-PstI<400>3atctgcagag cccaaatctt gtgac 25<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，寡聚IgG1-R-xbaI<400>4gctctagagc tcatttaccc ggagacaggg agag 34<210>5<211>1068<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1065)<223>IgG-wild
<400>5cag atc acc ttg aag gag tct ggt ccc acg ctg gtg aaa ccc aca cag48Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15acc ctc acg ctg acc tgc acg ttc tct gga ttc tca ctc agc aaa agt96Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser20 25 30gga gtg ggt gtg ggc tgg atc cgt cag ccc cca gga cag gcc ctg gag 144Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu35 40 45tgg ctt gca ctc att ttt tgg gat gat gat aag cgc tac agc cca tct 192Trp Leu Ala Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser50 55 60ctg agg acc aga ctc acc atc acc aag gac acc tcc aaa aac cag gtg 240Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val65 70 75 80gtc ctt aca atg acc aac gtg gac cct gcg gac aca gcc aca tat tat 288Val Leu Thr Met Thr Asn Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr85 90 95tgt gga tac agt gtt gaa gga tat ggc caa ggt tac cgc ttt cac tcc 336Cys Gly Tyr Ser Val Glu Gly Tyr Gly Gln Gly Tyr Arg Phe His Ser100 105 110tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tgc tca gag ccc aaa tct tgt 384Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Cys Ser Glu Pro Lys Ser Cys115 120 125gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 432Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly130 135 140gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 480Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 528Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His165 170 175gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 576Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val180 185 190cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 624His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr195 200 205cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 672Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly210 215 220aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 720Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile225 230 235 240gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 768Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val245 250 255tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc 816Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser260 265 270ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 864Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu275 280 285tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 912Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro290 295 300gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg 960Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 1008Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met325 330 335cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tcc 1056His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350ccg ggt aaa tga 1068Pro Gly Lys355<210>6<211>355<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser20 25 30Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu35 40 45Trp Leu Ala Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser50 55 60Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val65 70 75 80Val Leu Thr Met Thr Asn Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr85 90 95Cys Gly Tyr Ser Val Glu Gly Tyr Gly Gln Gly Tyr Arg Phe His Ser
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro225 230 235 240atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 768Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln245 250 255gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc 816Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val260 265 270agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 864Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val275 280 285gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 912Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro290 295 300ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 960Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr305 310 315 320gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1008Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val325 330 335atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 1056Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu340 345 350tcg ccg ggt aaa tg a 1071Ser Pro Gly Lys355<210>8<211>356<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
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245 250 255Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser260 265 270Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu275 280 285Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro290 295 300Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val305 310 315 320Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met325 330 335His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350Pro Gly Lys355<210>18<211>1068<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
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cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tcc 1056His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350ccg ggt aaa tga 1068Pro Gly Lys355<210>19<211>355<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>19Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser20 25 30Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu35 40 45Trp Leu Ala Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser50 55 60Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val65 70 75 80Val Leu Thr Met Thr Asn Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr85 90 95Cys Gly Tyr Ser Val Glu Gly Tyr Gly Gln Gly Tyr Arg Phe His Ser100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Cys Ser Glu Pro Lys Ser Cys115 120 125Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Cys Ser Glu Pro Lys Ser Cys115 120 125Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Asn145 150 155 160Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His165 170 175Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val180 185 190His Asn Asn Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr195 200 205Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly210 215 220Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile225 230 235 240Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val245 250 255Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Asn Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser260 265 270Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu275 280 285Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Thr Lys Thr Thr Pro Pro290 295 300Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val305 310 315 320Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Thr Ser Cys Ser Val Met
325 330 335His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350Pro Gly Lys355<210>28<211>1068<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
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Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser20 25 30Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu35 40 45Trp Leu Ala Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser50 55 60Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val65 70 75 80Val Leu Thr Met Thr Asn Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr85 90 95Cys Gly Tyr Ser Val Glu Gly Tyr Gly Gln Gly Tyr Arg Phe His Ser100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Cys Ser Glu Pro Lys Ser Cys115 120 125Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Asn145 150 155 160Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His165 170 175Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val180 185 190His Asn Asn Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr195 200 205Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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<400>30cag atc acc ttg aag gag tct ggt ccc acg ctg gtg aaa ccc aca cag48Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15acc ctc acg ctg acc tgc acg ttc tct gga ttc tca ctc agc aaa agt96Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser20 25 30gga gtg ggt gtg ggc tgg atc cgt cag ccc cca gga cag gcc ctg gag 144Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu35 40 45tgg ctt gca ctc att ttt tgg gat gat gat aag cgc tac agc cca tct 192Trp Leu Ala Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser50 55 60ctg agg acc aga ctc acc atc acc aag gac acc tcc aaa aac cag gtg 240Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val65 70 75 80gtc ctt aca atg acc aac gtg gac cct gcg gac aca gcc aca tat tat 288Val Leu Thr Met Thr Asn Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr85 90 95tgt gga tac agt gtt gaa gga tat ggc caa ggt tac cgc ttt cac tcc 336Cys Gly Tyr Ser Val Glu Gly Tyr Gly Gln Gly Tyr Arg Phe His Ser100 105 110tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tgc tca gag ccc aaa tct tgt 384Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Cys Ser Glu Pro Lys Ser Cys115 120 125gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 432Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly130 135 140gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc aac 480Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Asn
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Thr Ser Cys Ser Val Met325 330 335His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Asn Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350Pro Gly Lys35权利要求
1.一种糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，将含有一种或多种氨基酸修饰的免疫球蛋白变异体额外地糖基化，所述氨基酸修饰选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组。
2.如权利要求1所述的糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，所述免疫球蛋白变异体含有SEQ ID NO19的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，所述片段是Fc部分。
4.一种对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA，其中，将含有一种或多种氨基酸修饰的免疫球蛋白变异体额外地糖基化，所述氨基酸修饰选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组。
5.如权利要求4所述的DNA，其中，所述免疫球蛋白变异体含有SEQ ID NO19的氨基酸序列。
6.如权利要求4或5所述的DNA，其中，所述片段是Fc部分。
7.一种糖基化融合蛋白，其通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列(X是不包括脯氨酸的任何氨基酸)的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。
8.如权利要求7所述的糖基化融合蛋白，其中，免疫球蛋白变异体含有一种或多种氨基酸修饰，其选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组。
9.如权利要求7所述的糖基化融合蛋白，其中，所述免疫球蛋白变异体含有SEQ ID NO19的氨基酸序列。
10.如权利要求7所述的糖基化融合蛋白，其中，所述片段是Fc部分。
11.如权利要求7所述的糖基化融合蛋白，其中，所述生物活性蛋白的所述部分是可溶性细胞外区。
12.如权利要求7或11所述的糖基化融合蛋白，其中，所述生物活性蛋白选自由血色素、血清蛋白、细胞因子、α-、β-和γ-干扰素、集落刺激因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、磷脂酶活化蛋白(PLAP)、胰岛素、植物蛋白、肿瘤坏死因子(TNF)及其突变等位基因、生长因子、激素、降血钙素、降血钙素基因相关肽(CGRP)、脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、丘脑下部释放因子、泌乳刺激素、绒毛膜促性腺激素、组织纤溶酶原活化剂、生长激素释放肽(GHRP)、胸腺体液因子(THF)、白细胞介素、干扰素和酶所组成的群组。
13.一种采用二聚物形式的糖基化融合蛋白，其中，通过铰链区的二硫化键将如权利要求7至12中任何一项所述的糖基化融合蛋白的两个分子链接起来。
14.一种对如权利要求7至12中任何一项所述的糖基化融合蛋白进行编码的DNA。
15.一种含有如权利要求14所述的对融合蛋白进行编码的DNA的重组表达载体。
16.如权利要求15所述的重组表达载体，其登记号为KCCM-10572。
17.一种使用如权利要求15或16所述的重组表达载体转化或转染的宿主细胞。
18.一种制备糖基化融合蛋白的方法，其包括培养如权利要求17所述的转化或转染的宿主细胞以及将所述糖基化融合蛋白从所得到的培养物中分离出来。
19.一种含有如权利要求7至13中任何一项所述的糖基化融合蛋白的医药组合物。
全文摘要
本发明涉及一种糖基化免疫球蛋白或其片段以及一种对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的基因，其中，将含有一种或多种氨基酸修饰的免疫球蛋白变异体额外地糖基化，所述氨基酸修饰选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组。而且，本发明涉及一种糖基化融合蛋白，其通过将(a)一种糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn－X－Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化；一种对糖基化融合蛋白进行编码的基因；一种含有该基因的重组表达载体；一种使用该重组表达载体转化或转染的宿主细胞；一种制备糖基化融合蛋白的方法，其包括培养转化子或转染子以及将该糖基化融合蛋白从培养物中分离出来；以及一种含有如此制备的糖基化融合蛋白的医药组合物。
文档编号C07K16/18GK101014626SQ200580025687
公开日2007年8月8日 申请日期2005年5月31日 优先权日2004年5月31日
发明者郑用勋, 李基完, 赵勋埴, 朴洪圭, 金光成 申请人:魅德秀专有限公社