专利名称：一种同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法。
背景技术：
上世纪末以来，对抗菌肽的研究、开发利用已引起了国际生物医学界的极大兴趣。
由于当今微生物对传统抗生素广泛耐药这一事实，而内源性抗生素肽经过了几百万年的进化历程仍保留了强大的抗菌效力，因此，发展新的高科技抗微生物战略势在必行。而在发展抗感染新战略上，天然抗生素肽格外引人注目。抗菌肽具有广谱、高效的抗微生物活性，来自机体自身，起源古老，经几百万年进化仍保留强大的抗微生物活性，故可能是解决微生物耐药问题的最佳选择。并可能由此带来一场抗微生物战略的新革命。
肝素钠是肝素的钠盐，本质上是分子量不同的粘多糖相混合在一起的硫酸氨基多糖的钠盐，广泛存在于哺乳动物欧立(Ehrlich)氏肥大细胞中，具有高效抗凝血、防止血检形成和降血功效，并可用于治疗某些免疫复合体(ImmunoComplex)疾病，有广泛使用和开发价值。肝素是一种水溶性物质，其分子量约为3000-50000道尔顿。肝素系天然酸性黏多糖，为线性阴离子聚电解质，是由结构不一、带有很强负电荷链所组成的一族化合物，肝素在体内和体外均具有延长血凝时间的作用，其抗凝作用非常迅速、强大。肝素对热稳定，对一般微生物及酶不敏感，为白色或类白色无定形粉末。静脉注射肝素时还可使脂蛋白质酶释放和稳定，因而降低血浆甘油三脂。药用肝素一般可自猪或牛的肠黏膜中提取。
在《中国免疫学》1993年第9卷第2期上吴琦等发表了一篇名为“人中性粒细胞防御素的分离纯化”的文章，其中提出了一种对人中性粒细胞抗菌肽进行分离纯化的方法，将获得人中性粒细胞胞浆颗粒，以5％乙酸浸提，然后进行Sephadex G-100和Bio-gel P10过滤，获得纯化的抗菌肽。由于肠道组织结构复杂，杂蛋白种类繁多，因而采用吴琦等的分离纯化方法需要进行多次才能达到较为满意的纯化效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法本发明所提供的同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法，包括如下步骤
1)取猪肠粘膜加入蛋白酶制剂，加热到85-95℃，调节pH值到9.0-9.5，保温20-40分钟；冷却后，加入吸附树脂进行吸附，保留分离液，并回收树脂；2)步骤1)回收的树脂以质量百分浓度为19-40％的NaCl水溶液洗脱，洗脱液以乙醇沉淀，得到肝素钠；3)步骤1)得到的分离液按体积比1∶1-2加入体积浓度为5-10％的乙酸进行搅拌浸提；浸提后的混合液离心，取上清液，并保存沉淀；4)调步骤3)所得上清液pH值到5～6.0，离心，保留上清液，冻干得到猪肠粘膜抗菌肽。
如果需要将猪肠粘膜抗菌肽用于医药用途，要进一步纯化将步骤5)所得猪肠粘膜抗菌肽溶于双蒸水后，利用Sephadex G-100层析除大分子，利用Sephadex G-25层析脱盐；层析得到的洗脱液先以截留分子量为10kD的超滤膜超滤，然后过截留分子量为3kD的超滤膜超滤，收集得到分子量为3-8kD的纯化猪肠粘膜抗菌肽。
Sephadex G-100层析除大分子的洗脱液为0.2mol/L乙酸钠溶液；Sephadex G-25层析脱盐的洗脱液为双蒸水。
为了能够更彻底地收获原料中的有效物质，还可以将步骤3)中的沉淀中的有效物质再进行提取，其方法是，按体积比为1∶1-2的比例向所述步骤3)所得离心沉淀中加入体积浓度为5-10％的乙酸，搅拌浸提；浸提后混合液离心，取上清液，并且与步骤3)所得的上清液合并，再进行以后的工序。
在上述提取过程中，步骤1)所述蛋白酶可以为胰蛋白酶，其用量为20g酶/公斤猪肠粘膜；吸附树脂可以为吸附树脂D254，其吸附用量为猪肠粘膜重量的5-10％。所述提取过程中的离心均可以采用在4℃，10000rpm条件下进行。
对分离纯化所得猪肠粘膜抗菌肽的生物学活性进行研究的结果表明，所得猪肠粘膜抗菌肽对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等常见的致病菌有明显的抑制作用；猪肠粘膜抗菌肽还对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)均有显著的灭活作用。更有意义的是，猪肠粘膜抗菌肽还可提高机体非特异性免疫功能、鸡特异性免疫血清抗体水平和肠道黏膜免疫功能，并且能提高雏鸡日增重、降低料重比，促进鸡胚和雏鸡的生长发育。
本发明从猪肉屠宰加工的废弃物肠黏膜中同时提取肝素钠和抗菌肽两种物质，极大的提高屠宰加工废弃物的利用价值；所提取得到的肝素钠和抗菌肽，在功能上具有广谱抗菌、抗病毒，不产生耐药性，并具有免疫调节作用。本发明方法分离纯化方法简便，分离、提取率高，所用原料可使用生猪屠宰厂、肠衣加工厂等企业的废弃物，来源丰富、成本低，实现废弃物高值化利用，可最大限度地减少或消除生猪屠宰厂、肠衣加工厂等企业的废弃物对环境的污染，具有良好的经济效益和社会效益。
具体实施例方式
实施例1、同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽第一阶段肝素钠的提取步骤一，取肠衣加工的副产品猪肠粘膜，加入胰蛋白酶制剂搅拌，其用量为20克酶/公斤猪肠粘膜，加热到90℃，用氢氧化钠调节pH值9.0-9.5，恒温20-40分钟。
步骤二，冷却后，加入清洗干净的吸附树脂D254进行吸附，树脂用量为肠粘膜重量的5％。
步骤三，吸附后的液体与树脂分离，液体用于提取抗菌肽，回收树脂，用19-30％(重量)NaCl水溶液洗脱；步骤四，洗脱液用纯乙醇沉淀，收集沉淀出的肝素钠粗品，干燥保存。经鉴定，该产品中肝素钠的含量可以达到65％以上。
第二阶段抗菌肽的提取步骤五，取上述步骤三分离出液体，按1∶1(v/v)加入5％乙酸，搅拌浸提24h；步骤六，将混合物于4℃，10000rpm离心30min，取上清。
步骤七，将离心后的沉淀按步骤五再次浸提，再按照步骤六进行离心，保留上清液后，继续下一步；步骤八，合并两次上清液，调其pH值至5～6.0，离心，去掉沉淀，保留上清液，得到猪肠粘膜抗菌肽粗产品(可冻干保存)。
如果需要将猪肠粘膜抗菌肽用于医药用途，进一步纯化将冻干物溶于双蒸水，利用Sephadex G-100层析除大分子(用0.2mol/L乙酸钠洗脱)和利用Sephadex G-25层析脱盐(用双蒸水洗脱)，层析得到的洗脱液先以截留分子量为10kD的超滤膜超滤，然后过截留分子量为3kD的超滤膜超滤，收集得到分子量为3-8kD的抗菌肽纯品。
将所得产品紫外检测，测量OD260纳米处的吸收值，如果在260nm处有吸收值，证明有蛋白，可进行抑菌实验。
实施例2、猪肠粘膜抗菌肽的功能实验1、抑菌试验采用微量琼脂糖弥散试验法检测猪肠粘膜抗菌肽对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌自然分离株、凡隆嗜水气单胞菌等细菌的作用，结果表明猪肠粘膜抗菌肽对这些细菌均有不同程度的抑制和杀灭作用，杀菌率由59.5％～98.5％不等，揭示了猪肠粘膜抗菌肽具有很强的抗菌作用和较广的抗菌谱。
2、抗病毒实验抗病毒实验结果表明，猪肠粘膜抗菌肽可使鸡胚尿囊液中IBV的血凝效价由7.3log2(病毒组)降至1.0log2(猪肠粘膜抗菌肽处理病毒组)，抑制IBV所引起的鸡胚病变；还可以使NDV感染鸡群发病率由100％(NDV攻毒组)降至40％(ABPs处理NDV攻毒组)，相应的死亡率由60％降至13.3％。使IBDV感染鸡群发病率由100％(IBDV攻毒组)降至33.3％(ABPs处理IBDV攻毒组)，相应的死亡率由80％降至20％。揭示猪肠粘膜抗菌肽对IBV、NDV和IBDV有一定的抑制和杀灭作用。
3、肌肉注射实验采用肌肉注射的方法，给鸡按照每周1次，每次10μg剂量注射猪肠道抗菌肽；对照组注射相同剂量的生理盐水。结果表明实验组雏鸡平均日增重(15.54±0.20g)显著高于对照组(11.10±0.19g)(p＜0.05)；实验组料重比(2.27±0.04)显著低于对照组(2.60±0.05)(p＜0.05)。由此可见猪肠粘膜抗菌肽可以提高雏鸡的生长速度和饲料转化率，改善鸡的生长指标，促进雏鸡生长发育。同时，在研究中还发现，猪肠粘膜抗菌肽可以促进鸡胚的生长发育，显著提高各段肠管的肠绒毛长度和V/C值。
权利要求
1.一种同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法，包括如下步骤1)取猪肠粘膜加入蛋白酶制剂，加热到85-95℃，调节pH值到9.0-9.5，保温20-40分钟；冷却后，加入吸附树脂进行吸附，保留分离液，并回收树脂；2)步骤1)回收的树脂以质量百分浓度为19-40％的NaGl水溶液洗脱，洗脱液以乙醇沉淀，得到肝素钠；3)步骤1)得到的分离液按体积比1∶1-2加入体积浓度为5-10％的乙酸进行搅拌浸提；浸提后的混合液离心，取上清液，并保存沉淀；4)调步骤3)所得上清液pH值到5～6.0，离心，保留上清液，冻干得到猪肠粘膜抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将步骤5)所得猪肠粘膜抗菌肽溶于双蒸水后，利用Sephadex G-100层析除大分子，利用Sephadex G-25层析脱盐；层析得到的洗脱液先以截留分子量为10kD的超滤膜超滤，然后过截留分子量为3kD的超滤膜超滤，收集得到分子量为3-8kD的纯化猪肠粘膜抗菌肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于Sephadex G-100层析除大分子的洗脱液为0.2mol/L乙酸钠溶液；Sephadex G-25层析脱盐的洗脱液为双蒸水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于按体积比为1∶1-2的比例向所述步骤3)所得离心沉淀中加入体积浓度为5-10％的乙酸，搅拌浸提；浸提后混合液离心，取上清液，并且与步骤3)所得的上清液合并。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于步骤1)所述蛋白酶为胰蛋白酶，其用量为20g酶/公斤猪肠粘膜；所述吸附树脂为吸附树脂D254，其吸附用量为猪肠粘膜重量的5-10％。
6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述提取过程中的离心均是在4℃，10000rpm条件下进行的。
全文摘要
本发明公开了一种同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法。本发明方法，包括1)取猪肠粘膜加入蛋白酶制剂，加热到85－95℃，调节pH值到9.0－9.5，保温20－40分钟；冷却后，加入吸附树脂进行吸附，保留分离液，并回收树脂；2)步骤1)回收的树脂以质量百分浓度为19－40％的NaCl水溶液洗脱，洗脱液以乙醇沉淀，得到肝素钠；3)步骤1)得到的分离液按体积比1∶1－2加入体积浓度为5－10％的乙酸进行搅拌浸提；浸提后的混合液离心，取上清液，并保存沉淀；4)调步骤3)所得上清液pH值到5～6.0，离心，保留上清液，冻干得到猪肠粘膜抗菌肽。本发明从猪肉屠宰加工的废弃物肠黏膜中同时提取肝素钠和抗菌肽两种物质，极大的提高屠宰加工废弃物的利用价值，具有良好的经济效益和社会效益。
文档编号C07K14/435GK1844166SQ20061007886
公开日2006年10月11日 申请日期2006年5月11日 优先权日2006年5月11日
发明者佘锐萍, 包汇慧, 马卫明, 胡艳欣, 刘天龙, 刘伟, 李冰玲, 杨玉荣, 张艳梅, 王德成, 彭芳珍, 靳红 申请人:中国农业大学