专利名称：一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从猪小肠粘膜中分离生化药物的工艺，特别涉及一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺。背景技术：
肝素是一种广泛存在于哺乳动物组织中的黏多糖，主要存在于肥大细胞中，具有抗凝血作用，被广泛用于手术和脑血栓、心肌梗塞等的治疗。肝素的分子量大约3000— 37500。肝素钠是肝素的钠盐。肝素钠作为天然抗凝血物质受到世界各国的重视.也是我国主要的出口药物之一.随着研究的深入，人们发现肝素钠不但有抗凝、抗血栓形成和调节血脂的作用，还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等功能。猪小肠是肝素钠的重要来源之一，但是传统生产工艺在酶解时一次性加盐，如果加盐不超过3%，不能提升溶液中钠离子含量，肝素钠生 成结合率低；如果加盐超过3%，则细胞分解时发生盐析作用，肝素析出率低，且树脂在高盐浓度下吸附率低，肝素钠产率低，肝素钠产品质量不稳定。
发明内容
本发明为了弥补现有生产技术的不足，解决了酶解和吸附过程中对盐度要求不同的矛盾，提供了一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，本发明肝素解离完全，肝素与钠离子结合率高，吸附率高，并实现了吸附时分解液快速降温防止肝素酶快速裂解肝素钠，收率高，肝素钠活性损失小，质量稳定。本发明是通过如下技术方案实现的
一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，其特殊之处在于其包括以下步骤(I)酶解将猪小肠中粘膜取出，与水一起置于酶解罐中，粘膜与水的重量比为1:7-9，搅拌均匀后加入蛋白酶调节所得料液的PH值为8-9，加热至温度为55-58°C，然后加入肠衣专用盐至料液的盐度为2. 2%-2. 5%，保温l-3h，再加入肠衣专用盐至料液的盐度为4. 5%-5. 0%，保温O. 2-lh，继续加热使温度达到80-85 °C，保温20-50min后，过80目膜过滤，收集过滤液；
(2)吸附将上述所得过滤液加入吸附罐中，搅拌，然后加水至盐度为2.2%-2. 5%，温度为55-58°C，再加入树脂，搅拌8-10h，过滤，放出废液，收集过滤树脂；
(3)洗脱、沉淀脱盐、脱水将过滤后所得的树脂经洗脱、沉脱盐淀、脱水干燥制得肝素钠。
本发明的利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，步骤(I)中，添加碱性蛋白酶，该碱性蛋白酶与酶解中粘膜的重量比为I :500，用尼龙布过滤，收集过滤液，其中碱性蛋白酶属于一种丝氨酸脆外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。本发明的利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，步骤(2)中树脂的添加量按每根猪小肠加入20-30g树脂的比例添加。本发明的利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，步骤(3)中，
洗脱
(a):反复冲洗过滤后的树脂；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为5%_7%的盐水，温度保持在40-60°C，开启搅拌机转速为20-40r/min，搅拌10_60min ；
(b):随后将废液倒掉，加入质量分数为15%-30%的盐水，温度保持在40-60°C，开启搅拌机转速20-40r/min,搅拌2_4h后，收集洗脱液；
(c):重复步骤(b)，将两次收集的洗脱液合并待用；
Cd):步骤(c)收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为15%-30%的盐水，温度保持在40-600C，开启搅拌机转速20-40r/min，搅拌10_60min后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用。沉淀脱盐
将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80%-85%的乙醇，乙醇与洗脱 液的体积比为I. 8-2. 2:1，搅匀密封沉淀20-30h，收集沉淀物待用；
脱水将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在80-90°C下烘干6-8h即得肝素钠。本发明的利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，所述的盐水是由肠衣专用盐加水配制而成。本发明的有益效果是巧妙的化解了酶解和吸附过程中对盐度要求不同的矛盾，低盐浓度分解完毕，再加盐提升钠离子含量，使肝素生成率高。此后，加水稀释盐分至低盐，提高了树脂吸附率，且快速冷却分解液，避免高温降解肝素钠，肝素钠活性损失小，质量稳定，利用旧工艺生产I亿个单位的肝素钠，需要1800 2000根猪小肠，而利用本发明的制备方法生产I亿个单位的肝素钠，只需要1400 1500根猪小肠，且肝素钠效价和活性都有大幅度提高，从而使生产成本大大降低，利润可提高40%以上。
具体实施方式
实施例I:
本实施例中一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，采用如下步骤
(I)酶解
将520根猪小肠中的粘膜420kg从猪小肠中取出置于粘膜池中，通过粘膜泵，将该粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将3360kg水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为50r/min，搅拌均匀，再加入840g碱性蛋白酶到酶解罐中，调节pH值为8. O;打开蒸汽阀门使温度达到55°C，加入IOOkg肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2. 5%，保温I. 5h ;恒温结束后，加入IOOkg肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到4. 8%，保温O. 5h，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到80°C，停止加温，保温30min ;保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附。(2)吸附:
将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为50r/min，加入水，温度降到58°C，调节盐度至2. 5%，保持溶液的pH值为8. O ;按每根猪小肠加入25g树脂的比例需将IOkg树脂加入吸附罐中，搅拌8h ;自然冷却温度到45°C，放出废液，用80目尼龙丝袋收集过滤树脂。(3)洗脱
(a):将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为5%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在50°C，开启搅拌机转速为30r/min,揽拌 30min ；(b):随后将废液倒掉，加入质量分数为22%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在50°C，开启搅拌机转速30r/min，搅拌3h后，收集洗脱液；
(c):重复步骤(b)，将两次收集的洗脱液合并待用；
Cd):步骤(c)收集完洗脱液后 ，再接着加入质量分数为22%的盐水，温度保持在50°C，开启搅拌机转速30r/min,搅拌30min后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用；
盐水是由肠衣专用盐加水配制而成。(4)沉淀脱盐
将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80%的预冷过的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍，使乙醇浓度降到40%，搅匀密封沉淀24h ;虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用。(5)脱水干燥
将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在80°C下用蒸汽干燥6h，烘干即得肝素钠。肠衣专用盐为江苏井神盐化股份有限公司生产，该产品中氯化钠含量彡99. 10%，水份含量彡O. 30%，水不溶物含量(O. 03%，铁(Fe) mg/kg ( 5. 00，松散剂mg/kg < 5. 00。树脂为德国拜耳树脂。实施例2:
本实施例中一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，采用如下步骤
(I)酶解
将477根猪小肠中的310kg粘膜从猪小肠中取出置于粘膜池中，打开粘膜泵，将该粘膜从粘膜池打入酶解罐中，加入2790kg水至酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为50r/min，搅拌均匀，再加入620g碱性蛋白酶到酶解罐中，调节pH值为8. 5;打开蒸汽阀门使温度达到58°C，加入70kg肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2. 2%，保温Ih ;恒温结束后，力口入肠衣专用盐93kg，用盐度计测其盐度达到5. 0%，保温O. 2h，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到80°C，停止加温，保温20min ;保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附。(2)吸附
将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为50r/min，加入水，使吸附罐中的温度降到56°C，保持溶液的pH值为7. 5，测分解液盐度2. 2% ;按每根猪小肠加入20g树脂的比例，将9. 54kg树脂加入吸附罐中，搅拌IOh ;自然冷却温度到42°C，放出废液，用80目尼龙丝袋收集过滤树脂。(3)洗脱
(a):将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为6%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在40°C，开启搅拌机转速为20r/min,揽拌 60min ；
(b):随后将废液倒掉，加入质量分数为30%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在60°C，开启搅拌机转速20r/min，搅拌4h后，收集洗脱液；
(c):重复(b)的步骤一次，将两次收集的洗脱液合并待用；
Cd):步骤(c)收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为30%的盐水，温度保持在52°C，开启搅拌机转速30r/min,搅拌60min后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用；
盐水是由肠衣专用盐加水配制而成。(4)沉淀脱盐
将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80%的预冷过的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的I. 8倍，使乙醇浓度降到41%，搅匀密封沉淀30h ;虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
(5)脱水干燥
将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在80°C下用蒸汽干燥8h，烘干即得肝素钠。
肠衣专用盐为江苏井神盐化股份有限公司生产，该产品中氯化钠含量彡99. 10%，水份含量< O. 30%，水不溶物含量(O. 03%，铁(Fe) mg/kg ( 5. 00，松散剂mg/kg < 5. 00。树脂为德国拜耳树脂。实施例3:
本实施例中一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，采用如下步骤
(I)酶解
将867根猪小肠中的粘膜520kg从猪小肠中取出置于粘膜池中，打开粘膜泵，将该粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将3640kg水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，转速为50r/min，搅拌均匀，再加入1040g碱性蛋白酶到酶解罐中，调节pH值为9 ;打开蒸汽阀门使温度达到56°C，加入105kg肠衣专用盐，用盐度计测其盐度达到2. 4%，保温I. 5h ;恒温结束后，加入肠衣专用盐91kg，测其盐度为4. 5%，保温lh，再打开蒸汽阀门继续加温，使温度达到85°C，停止加温，保温50min ;保温后，即刻用80目尼龙布过滤，收集过滤液用于吸附。(2)吸附
将酶解过滤液打入吸附罐中，打开搅拌机，转速为50r/min，加入水至吸附罐中，吸附罐中的温度降到55°C，保持溶液的pH值为8. 0，调节盐度2. 3% ;按每根猪小肠加入30g树脂的比例，将26kg树脂加入吸附罐中，搅拌9h ；自然冷却温度到45°C，放出废液，用80目尼龙丝袋收集过滤树脂。(3)洗脱
(a):将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为7%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在60°C，开启搅拌机转速为40r/min,揽拌 IOmin ；
(b):随后将废液倒掉，加入质量分数为15%的盐水，加入盐水的量刚好没过树脂，温度保持在40°C，开启搅拌机转速40r/min，搅拌2h后，收集洗脱液；
(c):重复步骤(b)，将两次收集的洗脱液合并待用；
Cd):步骤(c)收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为15%的盐水，温度保持在40°C，开启搅拌机转速40r/min,搅拌IOmin后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用；
盐水是由肠衣专用盐加水配制而成。(4)沉淀脱盐
将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为85%的预冷过的乙醇，加入乙醇的体积量为洗脱液的2. 2倍，使乙醇浓度降到45%，调pH值至8. 0，搅匀密封沉淀20h ；虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
(5)脱水干燥
将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在90°C下用蒸汽干燥6h，烘干即得肝素钠。 上述肠衣专用盐为江苏井神盐化股份有限公司生产，该肠衣专用盐中氯化钠含量彡99. 10%，水份含量< O. 30%，水不溶物含量<0. 03%，铁(Fe)mg/kg<5. 00，松散剂mg/kg < 5. 00。树脂为德国拜耳树脂。
权利要求
1.一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，其特征在于其包括以下步骤 (1)酶解将猪小肠中粘膜取出，与水一起置于酶解罐中，粘膜与水的重量比为1:7-9，搅拌均匀后加入蛋白酶调节所得料液的PH值为8-9，加热至温度为55-58°C，然后加入肠衣专用盐至料液的盐度为2. 2%-2. 5%，保温l-3h，再加入肠衣专用盐至料液的盐度为4.5%-5. 0%，保温O. 2-lh，继续加热使温度达到80-85°C，保温20_50min后，过80目膜过滤，收集过滤液； (2)吸附将上述所得过滤液加入吸附罐中，搅拌，然后加水至盐度为2.2%-2. 5%，温度为55-58°C，再加入树脂，搅拌8-10h，过滤，放出废液，收集过滤树脂； (3)洗脱、沉淀脱盐、脱水将过滤后所得的树脂经洗脱、沉脱盐淀、脱水干燥制得肝素钠。
2.根据权利要求I所述的利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，其特征在于步骤(I)中，添加碱性蛋白酶，该碱性蛋白酶与酶解中粘膜的重量比为I :500，用尼龙布过滤。
3.根据权利要求I所述的利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，其特征在于步骤(2)中树脂的添加量按每根猪小肠加入20-30g树脂的比例添加。
4.根据权利要求3所述的利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，其特征在于步骤(3)中， 洗脱 (a):反复冲洗过滤后的树脂；将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中，加入质量分数为5%-7%的盐水，温度保持在40-60°C，开启搅拌机转速为20-40r/min，搅拌10_60min ； (b):随后将废液倒掉，加入质量分数为15%-30%的盐水，温度保持在40-60°C，开启搅拌机转速20-40r/min,搅拌2_4h后，收集洗脱液； (c):重复步骤(b)，将两次收集的洗脱液合并待用； Cd):步骤(c)收集完洗脱液后，再接着加入质量分数为15%-30%的盐水，温度保持在40-60 0C，开启搅拌机转速20-40r/min，搅拌10_60min后，收集洗脱液做高浓度盐水循环使用； 沉淀脱盐 将洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80%-85%的乙醇，乙醇与洗脱液的体积比为I. 8-2. 2:1，搅匀密封沉淀20-30h，收集沉淀物待用； 脱水将收集的沉淀物滤干脱水；将脱水后的沉淀物移入烘箱在80-90°C下烘干6-8h即得肝素钠。
5.根据权利要求4所述的利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，其特征在于所述的盐水是由肠衣专用盐加水配制而成。
全文摘要
本发明涉及一种从猪小肠粘膜中分离生化药物的工艺，特别涉及一种利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺。该利用猪小肠高效提取肝素钠的工艺，其特殊之处在于其包括以下步骤(1)酶解；(2)吸附；(3)洗脱、沉淀脱盐、脱水将过滤后所得的树脂经洗脱、沉脱盐淀、脱水干燥制得肝素钠。本发明的有益效果是巧妙的化解了酶解和吸附过程中对盐度要求不同的矛盾，避免高温降解肝素钠，肝素钠活性损失小，质量稳定，使生产成本大大降低，利润可提高40％以上。
文档编号C08B37/10GK102875697SQ20121039917
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者谢成君, 李鑫 申请人:山东绅联生物科技有限公司