专利名称：碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝素钠生产技术领域，特别涉及一种碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺。
背景技术：
肝素钠又称肝素，是一种含有硫酸基的酸性粘多糖类天然抗凝血物质。肝素钠为白色或类白色粉末，无臭无味，有引湿性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂。肝素钠广泛存在于哺乳动物肝、肺、肠黏膜中，多与蛋白质结合成复合体存在。酶解蛋白可分离肝素钠，肝素钠是含硫酸、氨基、醛糖酸的粘多糖。在PH8-9时，带负电荷，可与阴离子交换剂进行离子交换，进行粗分离，多糖液在高浓度乙醇中沉淀进行精纯。肝素钠是血液化学成分测定中最好的抗凝剂。肝素钠是一种含硫酸基团的黏多糖，分子量为1.5万，其抗凝机制是与抗凝酶II一起，在低浓度能抑制因子IX a、VDI和PF3之间的作用，并能加强抗凝血酶III灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成；还有抑制凝血酶的自我催化及抑制因子X的作用。
传统的肝素钠的酶解生产方法的缺陷是:生产周期长，能耗大，收率低，生产一亿国际单位肝素钠粗品需2800-3000根猪小肠，产品纯度低，肝素钠的效价至多为80U/mg，并产生大量的肠渣和废水，污染环境。CN1308088A的发明公开了一种利用生物发酵工艺生产肝素钠的方法。该方法采用2709蛋白酶作为催化剂，D204强碱性阴离子交换树脂作为离子交换树脂，并采用150-180目多层布筛进行过滤。该方法存在的缺陷是:产品收率、纯度也较低，并产生大量的肠渣和废水，污染环境。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，生产周期短，产品收率、纯度高，减少了肠渣和废水的排放，利于环保。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，所述的工艺步骤如下:
(O酶解:将猪小肠粘膜浆液加入酶解罐，猪小肠粘膜浆液为猪小肠粘膜:水=1:
2.5-4的重量比的混合物，向酶解罐中加入盐度21° -24°的氯化钠溶液调节酶解罐中料液的盐度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5±0.5 ;接着按每1000L料液加1.2±0.4kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在53 ±3°C，盐度4.2 ±0.2 °，pH
7.0±0.5保持3±0.5小时；最后升温至85-88 °C，保持20_25min得酶解液，过滤去残渣。本步骤最后酶解液过滤去残渣时，往往采用布袋过滤去残渣，这样效率往往较低，发明人通过实践探索，发明了采用振动筛过滤去残渣的方式，大大提高了过滤速度，提高了生产效率，是代替布袋过滤的好方法。
(2)吸附:将酶解液输入吸附罐，降温至57±3°C，加水调节盐度至3.0±0.5°，控制pH 7.0-7.5，按每1000L酶解液加3_8kg的树脂量，向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂，搅拌吸附6-8小时后，收集树脂。(3)洗涤:将收集的树脂用水洗涤至pH为中性，再将树脂放入盐度4±1°、温度55-60°C的氯化钠溶液，搅拌至少I小时进行洗涤，其中，树脂:氯化钠溶液=1:1.3-1.7 (w/
V);控制氯化钠溶液温度在55-60 V，便于将树脂表面油脂类的附着物清洗干净，便于洗脱。(4)洗脱:将步骤(3)洗涤后的树脂倒入洗脱罐中进行两次洗脱，其中，第一次洗脱为:将树脂加入到盐度为21 ±1°、温度55-60°C的氯化钠溶液中搅拌至少3小时，树月旨:氯化钠溶液=1:1_1.4 (w/v);第二次洗脱为:将第一次洗脱后的树脂加入到盐度为21 ±1°、温度55-60°C的氯化钠溶液中搅拌至少3小时，树脂:氯化钠溶液=1:0.8-1.2 (w/v);合并两次收集的洗脱液；控制两次洗脱洗脱时的氯化钠溶液温度在55-60°C，便于将油脂状的肝素钠从树脂上洗脱下来，增加得率。(5)沉淀:将步骤(4)收集到的洗脱液倒入沉淀罐中，搅拌条件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精，酒精用量以 实测沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°为准，静置沉淀15小时以上，收集沉淀物。(6)干燥:步骤(5)收集的沉淀物加入酒精度85°以上的酒精进行脱水1-3小时，滤干后做烘干处理即得肝素钠产品。本发明中的w/v为质量体积比具体为:kg:L。本发明以猪小肠粘膜为原料，通过优化工艺，来制备肝素钠，收率高，生产一亿国际单位肝素钠粗品只需1600根左右猪小肠，产品纯度高，肝素钠的效价> 110U/mg。作为优选，步骤(I)处理得到的酶解液在6000-8000转/分的转速下，离心处理20-40min后，再进入下一步的吸附。酶解后得到乳浊状液体，滤去残渣后进入离心机，启动离心机，酶解液在离心力作用下，使乳浊状酶解液进入离心机转鼓后，固体颗粒或密度较大的液体(含蛋白)向转鼓壁沉降，形成沉洛，密度较小的肝素钠分解液向转鼓中心方向聚集，流至溢流口排出，成为分离液。沉渣通过蜗杆传动把沉渣从排渣口挤压出来，分离液通过离心机从出料口排出，输送到吸附罐内进行下一步树脂吸附工序。增加本步骤后在分解工段中直接清除了部分杂质，使吸附工序中的树脂能充分吸附肝素钠，提高树脂吸附有效性。在分解工序中直接进行杂质的分离，提高最终产品的纯度。控制离心速度和时间，保证离心分离的效果。作为优选，将步骤(2)收集树脂后剩余的料液重新输送至吸附罐，控制温度在57±3°C，pH 7.0-7.5，按每1000L料液加2_3kg的树脂量向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂再次吸附6-8小时后，收集树脂，然后与步骤(2)收集的树脂合并后，进入下一步的洗涤步骤。本步骤将树脂吸附后的料液重新进行吸附，可以提高肝素钠的收率，减少浪费，同时能减少废液中蛋白的含量，利于废水处理。作为优选，所述罗门哈斯FPA98CL型树脂活化处理后再使用，活化处理为:树脂用50-60°C温水浸泡20小时以上后用清水冲洗干净并浙干,再加入质量浓度为10%的氢氧化钠溶液搅拌I个小时以上，最后用清水冲洗至洗液PH为中性，所述氢氧化钠溶液的加入量为每千克树脂加入IL氢氧化钠溶液的量计；活化后的树脂在4000-5000转/分的转速下，离心处理10-30min,再用于吸附。将活化处理后待使用的树脂通过离心机进料口进入离心机。启动离心机，树脂在4000-5000转/分钟的转速作用下，树脂进入离心机转鼓后，固体颗粒树脂向转鼓壁沉降，粘附在鼓壁内。离心作用甩出的液体或密度较小的物质向转鼓中心方向聚集，流至溢流口排出，成为废物。收集留在鼓壁的树脂，准备用于吸附工序。本步骤树脂孔内水分得到充分甩干，以增加树脂的吸附空间，提高树脂的吸附能力。作为优选，步骤(4)收集的洗脱液进入超滤机超滤后再进入步骤(5)沉淀，超滤机的超滤膜孔径在0.45 μ m-0.6 μ m。经过超滤，可将洗脱液中的废水和杂质排除，有效提高产品的纯度，并能减少下一步酒沉工艺中的酒精使用量，节约成本。作为优选，步骤(4)收集的洗脱液在8000-10000转/分的转速下，离心处理10-20min后，再进入步骤(5)沉淀。把洗脱液通过离心机进料口进入离心机，启动离心机，洗脱液在分解液在离心力(8000-10000转/分)作用下，使乳浊状洗脱液进入离心机转鼓后，固体颗粒或密度较大的液体(含蛋白)向转鼓壁沉降，形成沉渣，密度较小的肝素钠洗脱液向转鼓中心方向聚集，流至溢流口排出，成为分离液。沉渣通过蜗杆传动把沉渣从排渣口挤压出来，分离液通过离心机从出料口排出，输送到沉淀罐内进行下一步酒精沉淀工序。本步骤增加对洗脱液离心的工序，从而在洗脱工序中直接去除部分杂质和蛋白，从而提高最终产品的纯度，并能减少下一步酒沉工艺中的酒精使用量，节约成本。作为优选，步骤(5)收集沉淀物后剩余的上清液输入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入饱和氯化钠溶 液搅拌均匀，并调节pH为9-10，上清液与饱和氯化钠溶液的体积比为1:0.5-0.7，静置沉淀8-12小时后，收集沉淀，然后与步骤(5)收集的沉淀物合并后进入下一步的干燥。本步骤对第一次酒沉后的上清液再次进行酒沉，可有效提高肝素钠的收率，减少浪费，利于废水处理。作为优选，步骤(6)烘干处理的温度为60_80°C。作为优选，收集步骤(I)酶解液过滤获得的残渣，向酶解罐中加入盐度5±0.5°的氯化钠溶液，然后将残渣重新加入酶解罐中，残渣与盐度5±0.5°的氯化钠溶液的重量比为1:5-6，控制料液的pH在8.5±0.5，接着按每1000L料液加1.0-1.2kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在55 ± I °C，保温6-7小时；最后升温至88-90°C，保持20-25min，再静置20_30min后得酶解液，酶解液在6000-8000转/分的转速下，离心处理20-40min后,进入下一步的吸附。现有工艺中，酶解剩余的残渣即肠渣往往弃之不用，这样较浪费且增加了环境的负担。而本发明的发明人经过多年实践探索，发明了一条有效再利用残渣的工艺步骤，通过对残渣的再次酶解处理，能更进一步分解残渣，提取肝素钠，增加了肝素钠的收率，减少了废物排放，利于环保。本发明的有益效果是:
1、通过优化工艺制备肝素钠，收率高，生产一亿国际单位肝素钠粗品只需1600根左右猪小肠。2、产品纯度高，肝素钠的效价> 110U/mg。3、残渣的再次酶解提取，能更进一步分解残渣，提取肝素钠，增加了肝素钠的收率，减少了废物排放，利于环保。
具体实施例方式下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。树脂活化处理:
将新的罗门哈斯FPA98CL型树脂(市售进口树脂，经销商北京博赛斯生物技术有限公司)用50°C温水浸泡20小时后用清水冲洗干净并浙干，再加入质量浓度为10%的氢氧化钠溶液搅拌I个小时以上，最后用清水冲洗至洗液PH为中性，所述氢氧化钠溶液的加入量为每千克树脂加入IL氢氧化钠溶液的量计。研究表明，树脂活化处理中采用的温水温度在50-60°C之间，浸泡时间在16-24小时之间，对树脂的活化处理效果是等同的，在此不做——赘述。活化后的树脂在4000-5000转/分的转速下，离心处理10-30min，再用于吸附。实施例1:
(O酶解:将2000L猪小肠粘膜浆液(由猪小肠经刮肠机处理而得)加入酶解罐，猪小肠粘膜浆液为猪小肠粘膜:水=1: 2.5的重量比的混合物，向酶解罐中加入盐度21°的氯化钠溶液调节酶解罐中料液的盐度至5±0.5°，控制料液的pH在8左右；接着按每1000L料液加0.8k g的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在56°C，盐度
4.2±0.2°，pH 6.5保持2.5小时；最后升温至85°C，保持25min得酶解液，过滤去残渣；然后酶解液在6000转/分的转速下，离心处理40min后，再进入下一步的吸附。收集酶解液过滤获得的残渣，向酶解罐中加入盐度5±0.5°的氯化钠溶液，然后将残渣重新加入酶解罐中，残渣与盐度5±0.5°的氯化钠溶液的重量比为1:5，控制料液的pH在8左右，接着按每1000L料液加1.0kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在56°C，保温6小时；最后升温至88°C，保持25min，再静置30min后得酶解液，酶解液在6000转/分的转速下，离心处理40min后，进入下一步的吸附。(2)吸附:将酶解液输入吸附罐，降温至54°C，加水调节盐度至3.0±0.5°，控制PH 7.0，按每1000L酶解液加3kg的树脂量，向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂，搅拌吸附8小时后，收集树脂；将收集树脂后剩余的料液重新输送至吸附罐，控制温度在54°C, pH 7.0，按每1000L料液加2kg的树脂量向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂再次吸附8小时后，收集树脂，然后与吸附酶解液收集的树脂合并后，进入下一步的洗涤步骤。(3)洗涤:将收集的树脂用水洗涤至pH为中性，再将树脂放入盐度4±1°、温度55°C的氯化钠溶液，搅拌3小时进行洗涤，其中，树脂:氯化钠溶液=1:1.3 (w/v)；
(4)洗脱:将步骤(3)洗涤后的树脂倒入洗脱罐中进行两次洗脱，其中，第一次洗脱为:将树脂加入到盐度为21 ±1°、温度55°C的氯化钠溶液中搅拌5小时，树脂:氯化钠溶液=1:1 (w/v);第二次洗脱为:将第一次洗脱后的树脂加入到盐度为21 ±1°、温度55°C的氯化钠溶液中搅拌5小时，树脂:氯化钠溶液=1:0.8 (w/v);合并两次收集的洗脱液；
收集的洗脱液进入超滤机超滤后再进入下一步沉淀，超滤机的超滤膜孔径在0.45 μ m-0.6 μ m。(5)沉淀:将洗脱液倒入沉淀罐中，搅拌条件下向沉淀罐中加入酒精度80°的酒精，酒精用量以实测沉淀罐中混合液的酒精度到45°为准，静置沉淀20小时，收集沉淀物；收集沉淀物后剩余的上清液输入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入饱和氯化钠溶液搅拌均匀，并调节PH为9，上清液与饱和氯化钠溶液的体积比为1:0.5，静置沉淀12小时后，收集沉淀，然后与洗脱液沉淀得到的沉淀物合并后进入下一步的干燥。(6)干燥:向沉淀物加入酒精度85°的酒精进行脱水3小时，滤干后60°C烘干即得肝素钠产品。经检测，生产一亿国际单位肝素钠粗品只需1600根左右猪小肠，肝素钠的效价>110U/mg。
实施例2:
(O酶解:将1000L猪小肠粘膜浆液(由猪小肠经刮肠机处理而得)加入酶解罐，猪小肠粘膜浆液为猪小肠粘膜:水=1: 4的重量比的混合物，向酶解罐中加入盐度24°的氯化钠溶液调节酶解罐中料液的盐度至5±0.5°，控制料液的pH在9左右；接着按每1000L料液加1.6kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在50°C，盐度
4.2±0.2。,pH 7.5保持3.5小时；最后升温至88°C，保持20min得酶解液，过滤去残渣；然后酶解液在8000转/分的转速下，离心处理20min后，再进入下一步的吸附。收集酶解液过滤获得的残渣，向酶解罐中加入盐度5±0.5°的氯化钠溶液，然后将残渣重新加入酶解罐中，残渣与盐度5±0.5°的氯化钠溶液的重量比为1:6，控制料液的pH在9左右，接着按每1000L料液加1.2kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在54°C，保温7小时；最后升温至90°C，保持20min，再静置20min后得酶解液，酶解液在8000转/分的转速下，离心处理20min后，进入下一步的吸附。(2)吸附:将酶解液输入吸附罐，降温至60°C，加水调节盐度至3.0±0.5°，控制PH7.5，按每1000L酶解液加8kg的树脂量，向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂，搅拌吸附6小时后，收集树脂；将收集树脂后剩余的料液重新输送至吸附罐，控制温度在60°C，pH 7.5,按每1000L料液加3kg的树脂量向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂再次吸附6小时后，收集树脂，然后与吸附酶解液收集的树脂合并后，进入下一步的洗涤步骤。(3)洗涤:将收集的树脂用水洗涤至pH为中性，再将树脂放入盐度4±1°、温度60°C的氯化钠溶液,搅拌I小时进行洗漆，其中，树脂:氯化钠溶液=1: 1.7 (w/v)；
(4)洗脱:将步骤(3)洗涤后的树脂倒入洗脱罐中进行两次洗脱，其中，第一次洗脱为:将树脂加入到盐度为21 ±1°、温度60°C的氯化钠溶液中搅拌3小时，树脂:氯化钠溶液=1: 1.4 (w/v);第二次洗脱为:将第一次洗脱后的树脂加入到盐度为21 ±1°、温度60°C的氯化钠溶液中搅拌3小时，树脂:氯化钠溶液=1: 1.2 (w/v);合并两次收集的洗脱液；
收集的洗脱液在8000转/分的转速下， 离心处理20min后，再进入下一步沉淀。(5)沉淀:将洗脱液倒入沉淀罐中，搅拌条件下向沉淀罐中加入酒精度90°的酒精，酒精用量以实测沉淀罐中混合液的酒精度到60°为准，静置沉淀15小时，收集沉淀物；收集沉淀物后剩余的上清液输入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入饱和氯化钠溶液搅拌均匀，并调节PH为10，上清液与饱和氯化钠溶液的体积比为1:0.7，静置沉淀8小时后，收集沉淀，然后与洗脱液沉淀得到的沉淀物合并后进入下一步的干燥。(6)干燥:向沉淀物加入酒精度90°的酒精进行脱水I小时，滤干后80°C烘干即得肝素钠产品。经检测，生产一亿国际单位肝素钠粗品只需1600根左右猪小肠，肝素钠的效价>110U/mg。
实施例3:
(O酶解:将1500L猪小肠粘膜浆液(由猪小肠经刮肠机处理而得)加入酶解罐，猪小肠粘膜浆液为猪小肠粘膜:水=1:3的重量比的混合物，向酶解罐中加入盐度22°的氯化钠溶液调节酶解罐中料液的盐度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5左右；接着按每1000L料液加1.2kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在53°C，盐度4.2±0.2° ,pH 7.0左右保持3小时；最后升温至86°C，保持22min得酶解液，过滤去残渣；然后酶解液在7000转/分的转速下，离心处理30min后，再进入下一步的吸附。收集酶解液过滤获得的残渣，向酶解罐中加入盐度5±0.5°的氯化钠溶液，然后将残渣重新加入酶解罐中，残渣与盐度5±0.5°的氯化钠溶液的重量比为1:5.5，控制料液的pH在8.5，接着按每1000L料液加1.1kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在55°C，保温6.5小时；最后升温至89°C，保持22min，再静置25min后得酶解液，酶解液在7000转/分的转 速下，离心处理30min后，进入下一步的吸附。(2)吸附:将酶解液输入吸附罐，降温至57°C，加水调节盐度至3.0±0.5°，控制PH 7.0左右，按每1000L酶解液加5kg的树脂量，向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树月旨，搅拌吸附7小时后，收集树脂；将收集树脂后剩余的料液重新输送至吸附罐，控制温度在57°C，pH 7.0左右，按每1000L料液加2.5kg的树脂量向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂再次吸附7小时后，收集树脂，然后与吸附酶解液收集的树脂合并后，进入下一步的洗涤步骤。(3)洗涤:将收集的树脂用水洗涤至pH为中性，再将树脂放入盐度4±1°、温度58°C的氯化钠溶液，搅拌2小时进行洗涤，其中，树脂:氯化钠溶液=1:1.5 (w/v)；
(4)洗脱:将步骤(3)洗涤后的树脂倒入洗脱罐中进行两次洗脱，其中，第一次洗脱为:将树脂加入到盐度为21 ±1°、温度58°C的氯化钠溶液中搅拌4小时，树脂:氯化钠溶液=1:1.2 (w/v);第二次洗脱为:将第一次洗脱后的树脂加入到盐度为21 ±1°、温度58°C的氯化钠溶液中搅拌4小时，树脂:氯化钠溶液=1:1 (w/v);合并两次收集的洗脱液；
收集的洗脱液在10000转/分的转速下，离心处理IOmin后，再进入下一步沉淀。(5)沉淀:将洗脱液倒入沉淀罐中，搅拌条件下向沉淀罐中加入酒精度85°的酒精，酒精用量以实测沉淀罐中混合液的酒精度到50°为准，静置沉淀18小时，收集沉淀物；收集沉淀物后剩余的上清液输入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入饱和氯化钠溶液搅拌均匀，并调节PH为9，上清液与饱和氯化钠溶液的体积比为1:0.6，静置沉淀10小时后，收集沉淀，然后与洗脱液沉淀得到的沉淀物合并后进入下一步的干燥。(6)干燥:向沉淀物加入酒精度85°的酒精进行脱水2小时，滤干后70°C烘干即得肝素钠产品。经检测，生产一亿国际单位肝素钠粗品只需1600根左右猪小肠，肝素钠的效价>110U/mg。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所 记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
权利要求
1.一种碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，其特征在于:所述的工艺步骤如下: (1)酶解:将猪小肠粘膜浆液加入酶解罐，猪小肠粘膜浆液为猪小肠粘膜:水=1:2.5-4的重量比的混合物，向酶解罐中加入盐度21° -24°的氯化钠溶液调节酶解罐中料液的盐度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5±0.5 ;接着按每IOOOL料液加1.2±0.4kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在53 ±3°C，盐度4.2 ±0.2 °，pH7.0±0.5保持3±0.5小时；最后升温至85-88°C，保持20_25min得酶解液，过滤去残渣； (2)吸附:将酶解液输入吸附罐，降温至57±3°C，加水调节盐度至3.0±0.5°，控制pH7.0-7.5，按每1000L酶解液加3-8kg的树脂量，向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂，搅拌吸附6-8小时后，收集树脂； (3)洗涤:将收集的树脂用水洗涤至pH为中性，再将树脂放入盐度4±1°、温度55-60°C的氯化钠溶液，搅拌至少I小时进行洗涤，其中，树脂:氯化钠溶液=1:1.3-1.7 (w/V); (4)洗脱:将步骤(3)洗涤后的树脂倒入洗脱罐中进行两次洗脱，其中，第一次洗脱为:将树脂加入到盐度为21 ±1°、温度55-60°C的氯化钠溶液中搅拌至少3小时，树脂:氯化钠溶液=1:1-1.4 (w/v);第二次洗脱为:将第一次洗脱后的树脂加入到盐度为21 ±1°、温度55-60°C的氯化钠溶液中搅拌至少3小时，树脂:氯化钠溶液=1:0.8-1.2 (w/v);合并两次收集的洗脱液； (5)沉淀:将步骤(4)收集到的洗脱液倒入沉淀罐中，搅拌条件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精，酒精用量以实测沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°为准，静置沉淀15小时以上，收集沉淀物； (6)干燥:步骤(5)收集的沉淀物加入酒精度85°以上的酒精进行脱水1-3小时，滤干后做烘干处理即得肝素钠产品。
2.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，其特征在于:步骤(I)处理得到的酶解液在6000-8000转/分的转速下，离心处理20-40min后，再进入下一步的吸附。
3.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，其特征在于:将步骤(2)收集树脂后剩余的料液重新输送至吸附罐，控制温度在57±3°C，pH 7.0-7.5，按每1000L料液加2-3kg的树脂量向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂再次吸附6_8小时后，收集树脂，然后与步骤(2)收集的树脂合并后，进入下一步的洗涤步骤。
4.根据权利要求1或3所述的碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，其特征在于:所述罗门哈斯FPA98CL型树脂活化处理后再使用，活化处理为:树脂用50-60°C温水浸泡20小时以上后用清水冲洗干净并浙干，再加入质量浓度为10%的氢氧化钠溶液搅拌I个小时以上，最后用清水冲洗至洗液PH为中性，所述氢氧化钠溶液的加入量为每千克树脂加入IL氢氧化钠溶液的量计；活化后的树脂在4000-5000转/分的转速下，离心处理10-30min，再用于吸附。
5.根据权利要求1或2或3所述的碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，其特征在于:步骤(4)收集的洗脱液进入超滤机超滤后再进入步骤(5)沉淀，超滤机的超滤膜孔径在 0.45 μ m-0.6 μ m。
6.根据权利要求1或2或3所述的碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，其特征在于:步骤(4)收集的洗脱液在8000-10000转/分的转速下，离心处理10-20min后，再进入步骤(5)沉淀。
7.根据权利要求1或2或3所述的碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，其特征在于:步骤(5)收集沉淀物后剩余的上清液输入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入饱和氯化钠溶液搅拌均匀，并调节PH为9-10，上清液与饱和氯化钠溶液的体积比为1:0.5-0.7，静置沉淀8-12小时后，收集沉淀，然后与步骤(5)收集的沉淀物合并后进入下一步的干燥。
8.根据权利要求1或2或3所述的碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，其特征在于:步骤(6)烘干处理的温度为60-80°C。
9.根据权利要求1或2或3所述的碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺，其特征在于:收集步骤(I)酶解液过滤获得的残渣，向酶解罐中加入盐度5±0.5°的氯化钠溶液，然后将残渣重新加入酶解罐中，残渣与盐度5±0.5°的氯化钠溶液的重量比为1:5-6，控制料液的PH在8.5±0.5，接着按每1000L料液加1.0-1.2kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在55土 1°C，保温6-7小时；最后升温至88-90°C，保持20_25min，再静置20-30min后得酶解液，酶解液在6000-8000转/分的转速下，离心处理20_40min后，进入下 一步的吸附。
全文摘要
本发明涉及肝素钠生产技术领域，提供了一种碱性蛋白酶法从肠粘膜提取肝素钠的工艺。本发明主要步骤为酶解、吸附、洗涤、洗脱、沉淀和干燥。本发明生产周期短，产品收率、纯度高，减少了肠渣和废水的排放，利于环保。生产一亿国际单位肝素钠粗品只需1600根左右猪小肠，肝素钠的效价＞110U/mg。
文档编号C08B37/10GK103183745SQ20121034734
公开日2013年7月3日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者花瑞华, 潘为群, 潘为中 申请人:杭州龙扬生物科技有限公司