专利名称：一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备裸子植物花粉管全蛋白的方法，特别涉及一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法。
背景技术：
花粉管作为有花植物受精过程中雄性生殖单位的载体，具有典型的极性生长特征，因而是研究细胞形态建成、囊泡及细胞器运动以及信号转导途径的理想模式体系。蛋白质组分析是研究花粉管中蛋白质对细胞自身变化及环境刺激响应的重要技术手段，有利于深入了解高等植物有性生殖过程以及细胞极性生长机理。
选择合适的样品制备方法是决定蛋白质组研究成败的关键步骤。细胞必须进行有效的破碎，同时还要去除杂质并尽量避免蛋白样品的降解。裸子植物花粉管中富含多糖、脂类、核酸等干扰双向电泳过程的杂质。迄今为止还没有制备裸子植物花粉管全蛋白样品用于双向电泳的有效方法和技术，从而导致与裸子植物相关的蛋白质组研究相对被子植物而言比较滞后。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备较高质量的裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法。
本发明所提供的制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法，包括以下步骤1)将裸子植物花粉管粉末悬浮于0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液中，于-20--4℃下放置1-2小时；离心后收集沉淀，将该沉淀重悬于含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-20--4℃放置2-16小时，离心后收集沉淀，再用含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇和体积百分含量为70-80％的丙酮溶液洗涤，除去丙酮后得到裸子植物花粉管全蛋白粗提物；2)将步骤1)得到的裸子植物花粉管全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液后，离心取上清得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液；所述裂解缓冲液为含有5～7mol/L尿素(urea)，1-2mol/L硫脲(thiorea)，0.01-0.02g/mL CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid)，体积百分含量为1-2％、pH为3.5-10的两性电解质、质量百分含量为0.6-1％的二硫苏糖醇(DTT)、25-50μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。
所述裸子植物花粉管粉末可通过在液氮中研磨获得。
所述0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液用含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液配制。
所述三氯乙酸溶液中三氯乙酸的浓度优选为0.125g/mL。
所述步骤1)中花粉管粉末悬浮于三氯乙酸溶液中于-20℃下放置2小时。
所述步骤1)中含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液重悬沉淀后，于-20℃放置2-16小时。
为了获得更好的提取和分离效果，所述裂解缓冲液优选为含有7mol/L尿素(urea)、2mol/L硫脲(thiorea)、0.02g/ml CHAPS、体积百分含量为2％的两性电解质、质量百分含量为1％的二硫苏糖醇(DTT)、50μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。
所述步骤2)中，全蛋白粗提物与裂解缓冲液的质量体积比可为120mg/400μL-150mg/400μL裂解缓冲液，优选为150mg/400μL裂解缓冲液。
为了使尽可能多的蛋白溶解于裂解缓冲液中，可将加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液27-37℃下水浴15-30min，然后在室温下于60-150rpm(旋转半径为25mm)的摇床上振荡1小时，15000-17000g收集上清液，即为裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液。
所述加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液的水浴温度优选为27-29℃，水浴时间优选为30min。
上述方法中的离心条件均为在4℃15000rpm(19117g)离心10min。
所述裸子植物可为白皮松、红松、油松、云杉、冷杉等松杉纲、银杏等银杏纲以及苏铁纲的裸子植物；优选为松杉纲，尤其优选为松科裸子植物，特别优选为白杆或白皮松。
本发明的方法采用三氯乙酸和丙酮有效的去除裸子植物花粉管中的多糖、脂类和核酸等干扰双向电泳的杂质。本发明的方法裂解缓冲液中的尿素可以使蛋白质去折叠暴露疏水核心，而配合使用硫脲会增加蛋白质在固定pH梯度(IPGs)胶条中的溶解性，二硫苏糖醇还原二硫键从而使蛋白质达到完全溶解的状态，载体两性电解质能清除氰酸盐离子、离心时加速核酸沉淀，而PMSF则能够有效的防止样品制备过程中蛋白的降解。
本发明的制备裸子植物花粉管全蛋白样品的方法快速、简单易行，可获得较高质量的重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。
图1为白杆花粉管全蛋白样品双向电泳图谱图2为白皮松花粉管全蛋白样品双向电泳图谱具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的浓度，如无特别说明，均为体积百分比(V/V)。
实施例1、制备白杆花粉管全蛋白双向电泳样品液并进行双向电泳分析1)过滤收集用液体培养基(0.0001g/mL硼酸，0.0003g/mL硝酸钙，0.12g/mL蔗糖)培养白杆花粉粒22小时得到的花粉管，液氮快速研磨成粉末；2)将步骤1)得到的粉末悬浮于含有0.125g/ml三氯乙酸和0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，于-20℃下放置2小时；3)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于三倍体积的-20℃预冷过的含0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-20℃放置16小时；4)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于含0.07％的巯基乙醇和80％丙酮的溶液中，-20℃放置1h；5)离心弃除上清液，得到沉淀，再重复步骤4)1-2次。待丙酮挥发完后，得到全蛋白粗提物干粉，用裂解缓冲液按照400μL/150mg干粉的量溶解全蛋白粗提物干粉，29℃水浴半小时后，室温于60-150rpm(旋转半径为25mm)的摇床上振荡1小时，使全蛋白粗提物干粉充分溶解，之后17000g室温离心取上清，即为白杆花粉管全蛋白双向电泳样品液；裂解缓冲液是含有7mol/L尿素(urea)、2mol/L硫脲(thiorea)、0.02g/ml CHAPS、2％两性电解质(ampholine pH3.5-10)、质量百分比为1％的二硫苏糖醇(DTT)和50μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。
6)通过上述过程提取的蛋白质，用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度，结果表明上述得到的白杆花粉管全蛋白双向电泳样品液中蛋白浓度为4-6μg/μL。按照如下方法进行双向电泳利用EttanTMIPGphor IITMIsoelectric FocusingSystem(通用电气医疗集团，USA)在20℃进行第一向等电聚焦电泳。电泳条件为500V电泳1h，随后1000V电泳1h，最后8000V电泳8.3h，总伏时数达到64000V×h。然后将聚焦后的固定pH梯度胶条在10mL平衡缓冲液1(50mmol/LTris-Cl缓冲液，pH8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.01g/mL二硫苏糖醇)中平衡15min，然后在10mL平衡缓冲液2(50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.25g/mL碘乙酰胺)中平衡30min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上。第二向电泳利用Ettan DALTsixsystem(通用电气医疗集团，USA)在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行(平均每块凝胶25mA恒流电泳，溴芬兰指示剂跑出凝胶时电泳结束)。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色后，乙醇/醋酸系统脱色。结果如图1所示，结果表明该裸子植物花粉管蛋白样品分离效果较好，没有发生明显的蛋白降解。图1中MW为蛋白质分子量标准，单位是kD。
实施例2、分离制备裸子植物白皮松花粉管全蛋白样品并进行双向电泳分析1)过滤收集用液体培养基(0.0001/mL硼酸，0.0003g/mL硝酸钙，0.12g/mL蔗糖)培养白皮松花粉粒22小时得到的花粉管，液氮快速研磨成粉末；2)将步骤1)得到的粉末悬浮于含有0.1g/ml三氯乙酸和0.05％的巯基乙醇的丙酮溶液中，于-10℃下放置1小时；3)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于三倍体积的-20℃预冷过的含0.05％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-10℃放置12小时；4)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于含0.07％的巯基乙醇和75％丙酮的溶液中，-20℃放置1h；5)离心弃除上清液，得到沉淀，再重复步骤4)1-2次。待丙酮挥发完后，得到全蛋白粗提物干粉，用裂解缓冲液按照400μL/150mg干粉的量溶解全蛋白粗提物干粉，29℃水浴半小时后，室温于60-150rpm(旋转半径为25mm)的摇床上振荡1小时，使全蛋白粗提物干粉充分溶解，之后17000g室温离心取上清，即为白皮松花粉管全蛋白双向电泳样品液；裂解缓冲液是含有5mol/L尿素(urea)、1mol/L硫脲(thiorea)、0.01g/ml CHAPS、1％两性电解质(ampholine pH3.5-10)、质量百分比为0.6％的二硫苏糖醇(DTT)和25μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。
6)通过上述过程提取的蛋白质，用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度，结果表明上述得到的白皮松花粉管全蛋白双向电泳样品液中蛋白浓度为4-6μg/μL。按照如下方法进行双向电泳利用EttanTMIPGphor IITMIsoelectricFocusing System(通用电气医疗集团，USA)在20℃进行第一向等电聚焦电泳。电泳条件为500V电泳1h，随后1000V电泳1h，最后8000V电泳8.3h，总伏时数达到64000V×h。然后将聚焦后的固定pH梯度胶条在10mL平衡缓冲液1(50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.01g/mL二硫苏糖醇)中平衡15min，然后在10mL平衡缓冲液2(50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH 8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.25g/mL碘乙酰胺)中平衡30min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上。第二向电泳利用Ettan DALTsixsystem(通用电气医疗集团，USA)在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行(平均每块凝胶25mA恒流电泳，溴芬兰指示剂跑出凝胶时电泳结束)。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色后，乙醇/醋酸系统脱色。结果如图2所示，结果表明该白皮松花粉管蛋白样品的双向电泳样品分离效果较好，没有发生明显的蛋白降解。图2中MW为蛋白质分子量标准，单位是kD。
权利要求
1.一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法，包括以下步骤1)将裸子植物花粉管粉末悬浮于0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液中，于-20--4℃下放置1-2小时；离心后收集沉淀，将该沉淀重悬于含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-20--4℃放置2-16小时，离心后收集沉淀，再用含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇和体积百分含量为70-80％的丙酮的溶液洗涤，除去丙酮后得到裸子植物花粉管全蛋白粗提物；2)将步骤1)得到的裸子植物花粉管全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液后，离心取上清得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液；所述裂解缓冲液为含有5-7mol/L尿素，1-2mol/L硫脲，0.01-0.02g/mL CHAPS，体积百分含量为1-2％、pH为3.5-10的两性电解质、质量百分含量为0.6-1％的二硫苏糖醇、25-50μg/mL苯甲基磺酰氟的溶液。
2.根据权利要求1所述的制备裸子植物花粉管全蛋白样品的方法，其特征在于所述0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液用含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液配制。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述三氯乙酸溶液中三氯乙酸的浓度为0.125g/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述裂解缓冲液为含有7mol/L尿素、2mol/L硫脲、0.02g/mL CHAPS、体积百分含量为2％的两性电解质、质量百分含量为1％的二硫苏糖醇、50μg/mL苯甲基磺酰氟的溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中花粉管粉末悬浮于三氯乙酸溶液中于-20℃下放置2小时；所述步骤1)中含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液重悬沉淀后，于-20℃放置2-16小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，全蛋白粗提物与裂解缓冲液的质量体积比为100mg/400μl-150mg/400μl裂解缓冲液，优选为150mg/400μl裂解缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液的步骤是将加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液27-37℃下水浴15-30min，然后在室温下于旋转半径为25mm、60-150rpm的摇床上振荡1小时，15000-17000g收集上清液，即得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液的水浴温度为27-29℃，水浴时间为30min。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述裸子植物为松杉纲、银杏纲或苏铁纲的裸子植物；所述松杉纲裸子植物为白杆、青杆、白皮松或油松；所述银杏纲裸子植物为银杏；所述苏铁纲裸子植物为苏铁。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述裸子植物为白杆或白皮松。
全文摘要
本发明公开了一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法。该方法包括以下步骤1)将裸子植物花粉管粉末悬浮于三氯乙酸溶液中，于－20～－4℃下放置；离心后收集沉淀，将该沉淀重悬于丙酮中，－20℃放置2－16小时，离心后收集沉淀，再用80％丙酮溶液洗涤，除去丙酮后得到裸子植物花粉管全蛋白粗提物；2)将步骤1)得到的裸子植物花粉管全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液后，离心取上清得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液。本发明的分离制备裸子植物花粉管全蛋白用于双向电泳的方法快速、简单易行，可获得较高质量而且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。
文档编号C07K2/00GK1872871SQ200610089309
公开日2006年12月6日 申请日期2006年6月16日 优先权日2006年6月16日
发明者林金星, 陈彤, 吴小琴, 陈艳梅, 汪小雄 申请人:中国科学院植物研究所