专利名称：一种抗人基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗人基质金属蛋白酶的单克隆抗体，及其在检测基质金属蛋白酶 含量试剂盒中的应用背景技术研究表明，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，简称MMP)是一种肽链内 切酶，对肿瘤的侵袭和转移产生重要作用，特别是MMP-9与恶性肿瘤侵袭和转移的 关系更为密切，MMP-9不仅可以降解细胞外基质成分，还能够降解IV型胶原，从而 直接导致基底膜的破坏，使肿瘤细胞释放入血。许多恶性肿瘤患者和肝脏疾病患者的 外周血中MMP-9的含量均有明显升高。因而，MMP-9的检测对鉴别肿瘤具有重要意 义。检测血清中MMP9的最灵敏和准确的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA法)。该 方法的原理是将抗原或抗体吸阳于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后 用分光光度计判定结果。建立该方法的关键是制备特异性单克隆抗体，因为单克隆抗 体的质量决定ELISA法的灵敏度和准确度。美国Amershan Biosceinces和R&D Systems Inc公司研发了一种检测基质金属蛋白酶的试剂盒，包括 一抗包被96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，缓冲液，和显色剂。其中，抗体是以美国人的基质金属蛋白酶为抗原制备的。该试剂盒的灵敏度为0.6ng/ml，可对血清，血浆及细胞培养液等样本中的基质金属蛋白酶含量 进行定量检测。其检测原理采用了常规的酶联免疫双抗体夹心法(ELISA)。使用时，将 以美国人的基质金属蛋白酶为抗原制备的抗体加入固相载体——酶标板的凹孔上，加 入待测样品，孵育半小时，样品中的抗原可与载体上的抗体结合，用缓冲液洗去非特 异结合的杂蛋白后，再加入该抗原的酶标记抗体并孵育半小时，洗去未结合的酶标抗 体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。检测的结果 可以作为临床上肝癌患者术后复发和转移的一个重要的指标。但是，美国Amershan Biosceinces禾B R&D Systems Inc公司研发的这种试剂盒所 用的制备抗体的抗原是基于美国人的基因表达的，而中国汉族人的基因由于种族差别， 与美国人种存在着相当大的差异.因而使用这种试剂盒检测中国人的基质金属蛋白酶 时，准确性不高，有时甚至检测不到。发明内容本发明的目的在于克服现有技术检测基质金属蛋白酶时，使用的是基于美国人的 基因表达的抗原制备的抗体，其在检测中国人的基质金属蛋白酶时，准确性不高的缺 陷，从而提供一种适用于抗中国人种基质金属蛋白酶的、新的MMP-9表位的单克隆抗 体，该抗原与美国产的试剂盒中所用的抗原不同，在第13位的氨基酸由丝氨酸突变为 脯氨酸。本发明的另一目的在于提供一种采用所述的单克隆抗体检测血清样本中基质金属 蛋白酶含量的试剂盒。本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明选择中国汉族肝癌患者术后切除的肝癌组织，提取RNA后用逆转录酶合 成cDNA，再用高保真DNA聚合酶采用PCR方法扩增MMP-9基因片断，经基因测序 后构建表达载体并在大肠杆菌表达和纯化，制备出与目前试剂盒用的不同表位的抗原。 本发明用不同表位的抗原按照常规标准单克隆抗体制备技术制备出数株单克隆抗体。本发明提供一种适用于抗中国人种基质金属蛋白酶的单克隆抗体，该单克隆抗体 由保藏号为CGMCCNo. 1743，保藏日为2006年6月27闩的杂交瘤细胞制得。本发明提供的杂交瘤细胞系，已于2006年6月27日保藏在《中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心》(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生 物研究所)，其保藏号为CGMCCNo.1743，其分类命名为基质金属蛋白酶的单克隆抗 体细胞株。本发明提供一种包含了上述抗中国人种基质金属蛋白酶的单克隆抗体的试剂盒， 可以用于准确检测中国人血清中的基质金属蛋白酶，其包括 一抗中国人种基质金属 蛋白酶多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的本发明所述的单克隆抗 体，洗涤液和显色剂。所述的洗涤液优选为pH7.0， 0.01MPBS (磷酸盐缓冲液)，O.lMNaCl， 0.1%吐温20的混合液；所述的显色剂优选为4-氯-l-萘酚，简称TMB。
本发明提供的检测基质金属蛋白酶的试剂盒采用酵联免疫吸附法(ELISA)检测 血清和活体组织中基质金属蛋白酶含量，灵敏度高，特异性好，操作简单，价格低廉。 尤其适用于中国人种，对于判断中国人在肝癌手术后是否转移复发时有重大的意义。
图1为中国汉族病人肝癌基质金属蛋白酶的核苷酸序列； 图2为中国汉族病人肝癌基质金属蛋白酶的氨基酸序列； 图3为美国人的基质金属蛋白酶的氨基酸序列；图4为单克隆阳性克隆株的western blot的检测，泳道1为重组的基质金属蛋白 酶与单抗结合，泳道2和3分别是血清上样量为15 ^和10 ^的样品与单抗的结合。
具体实施方式
实施例l、中国汉族人基质金属蛋白酶的获得本发明提供的作为抗原的基质金属蛋白酶，为采用基因工程技术从中国汉族病人 肝癌患者的肝癌组织中提取的RNA，经反转录和RT-PCR获得基质金属蛋白酶基因， 然后克隆到质粒中，转化大肠杆菌表达后得到的，其具体的克隆和纯化过程如下l)首先采用常规技术从中国汉族人群的肝癌患者的肝癌组织克隆基质金属蛋白酶 基因并测序。反转录和RT-PCR的具体条件以及相应的引物序列为上游引物ggA TCC ggC CgC TCC TAC TCT gC，下划线标注为BamH I位点下游引物gTC gAC TA T gTC gCT gTC A A A gTT Cg，下划线标注为Sal I位点反转录的条件为cDNA的合成取5 pi总RNA加入1 ^ 01igo(dT)i8、 2 ^ dNTP， 用DEPC水补至12 pi混匀，65'C赙育10min，置冰上3 5 min;加入4 pi 5X缓冲液， ljilDTT， lpl逆转录酶AMV. lplRNA酶抑制剂，DEPC水补足至20 pi,混匀后， 50。C孵育lh， 85。C孵育5min,终止反应，-20 。C保存。RT-PCR反应条件step 1: 94°C 5 min, step 2: 94°C 1 min, step 3: 60°C 30 sec, step 4: 72 。C 1 min, step 5: return to step 2 for 35 cycles, step 6: 72。C 10 min, step 7: end. 0.8%i^' 脂糖电泳鉴定。PCR所用酶为高保真的pfuDNA聚合酶。克隆的基质金属蛋白酶基因其具有图1所示的核苷酸序列，图2为图1序列所对 应的氨基酸序列，与美国人的基质金属蛋白酶的氨基酸序列(如图3所示)相比，在 第13个位置上的氨基酸不同；2)将步骤l)获得的基质金属蛋白酶的图l所示的基因克隆到pQE-30(Qiagen公司) 表达质粒，将pQE-30载体和RT-PCR产物分别用BamH I和Sal I双酶切后用T4连接酶 连接，将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE)，涂布含氨苄青霉素的琼脂平板，37°C 生长，待菌落长出后，挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的液体培养基中，37'C， 200rpm生长过夜；第二天，以l : IOO接种于新鲜含氨卞青霉素的LB培养基中，37t:生 长到OD600二0.6 0.9之间；按终浓度0.5mM加入lM的IPTG (异丙基-p-D-硫代吡喃半 乳糖苷)，37°C， 200rpm，诱导3小时；5000rpm， 4。C离心10分钟，菌体反复冻融三 次，超声波破碎；1000rpm， 4'C离心10分钟，弃上清，沉淀为包涵体，包涵体用含l X的Triton—X100洗涤一次，1000rpm， 4。C离心10分钟；用pH 8.0、 0.02MPBS (磷酸 盐缓冲液)、6M盐酸胍缓冲液溶解包涵体，1000rpm， 4'C离心10分钟；用pH 8.0、 0.02MPBS、 8M尿素缓冲液平衡Ni —金属亲和柱，己溶解的包涵体过柱，基质金属蛋 白酶蛋白被吸附，用含0.1MNaCl、 pH8.0、 0.02 PBS、 8M尿素的缓冲液洗涤除去杂蛋 白，用含0.5MNaCl、 pH8.0、 0.02MPBS、 8M尿素缓冲液洗脱，获得中国人种的基质 金属蛋白酶，用适量pH8.0、 0.02MPBS、 8M尿素缓冲液稀释至0.5mg/ml， .2(TC冻存。实施例2、多克隆抗基质金属蛋白酶抗体的制备本发明所述的多克隆抗基质金属蛋白酶抗体的制备包括如下步骤1) 免疫用抗原的制备将实施例1步骤2)中获得的中国人种的基质金属蛋白酶作 为抗原，首次免疫用抗原为200 pg/只和等量福氏完全佐剂的混合物； 加强免疫用抗原为200 pg/只和5ml福氏不完全佐剂的混合物；2) 免疫程序:选雌性2.5公斤的新西兰大白兔(购于中国医学科学院动物实验中心) 词养数周后，在背部脊柱两侧脱毛区取5 10个接种点接种；然后每隔10天加强接种 一次；共加强免疫4次；3) 采血首次免疫前取耳缘静脉采血，第3次以后各次加强免疫前各采血1次，第5次加强免疫后一周，颈动脉取血；4) 分离血清分别以饱和硫酸铵分级沉淀血清(从大白兔处死后获得的抗血清)分离抗体，离心后去上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，得到含有抗基质金属蛋白酶 多克隆抗体的溶液。
实施例3、生产中国人的基质金属蛋白酶的单克隆抗体杂交瘤细胞株及单克隆抗基质金 属蛋白酶抗体的制备1) 免疫用抗原实施例1步骤2)中获得的中国人种的基质金属蛋白酶；2) 免疫程序采用BALB/c小白鼠(购于中国医学科学院动物实验中心)作为免 疫动物，首次免疫抗原剂量为50昭/只，经腹腔注射，在间隔10 14天，加强免疫4次， 取脾细胞；3) 细胞融合取对数生长期的骨髓瘤细胞SP 2/0与脾细胞在聚乙二醇(分子量4000) 的溶剂中进行细胞融合，在含HAT(H是次黄嘌呤hypoxanthine的简称，A是氨甲喋呤 Aminopterin的简称，T是胸腺嘧啶核苷Thymidine的简称)培养液中作选择培养；4) 杂交瘤细胞克隆化采用常规的有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直至得到完全同 质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；所述的杂交瘤细胞系己于2006年6月27日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心》(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究 所)，其保藏号为CGMCCNo.1743，其分类命名为基质金属蛋白酶的单克隆抗体细胞 株；5) 杂交瘤细胞的保存在液氮中保存；6) 单克隆抗体大量生长及提纯在小鼠腹腔内注射一定量的杂交瘤细胞，采集腹 水，经常规方法提纯后分装待用；所述的单克隆抗体纯化方法按伯乐公司提供的蛋白A亲和层析柱(Affi-gel Protein-A Agarose (BioRad #153-6153))法纯化，具体如下用结合缓冲液按l : 5稀 释腹水或抗血清，用2个柱体积的结合缓冲液平衡蛋白A亲和层析柱，上样，用5 6个 柱体积的结合缓冲液洗柱，用5个柱体积的洗脱缓冲液洗柱用50微升1M Tris接l毫升 洗脱液，用2X4LPBS透析，2 8°C，过夜，抗体保存在一2(TC。实施例4、辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体的制备将实施例3得到的单克隆抗基质金属蛋白酶抗体用pH 9.5、50mM的碳酸缓冲液(CB) 透析过夜；按抗原HRP的重量比为1: l的比例，取适量HRP，用高碘酸钠法将HRP活化后， 加入lmM pH4.0醋酸缓冲液透析过夜；第二天，按单克隆抗体HRP的重量比为1 : l的比例，将单克隆抗基质金属蛋白 酶抗体和活化后的HRP混和，用适量pH9.5、 0.2MCB调整混合物pH9.2，用pH9.5、0.01 MCB调整混合液的体积至单克隆抗基质金属蛋白酶抗体的浓度为1.0mg/ml， 25°C 暗处反应2小时，然后将反应液降温至4'C，按lmgHRP加入51ul的量加入0.1MNaBH4， 4"C反应2小时，终止连接反应；将反应液装入透析袋，加入pH7.0、 0.02M PBS、 0.2M NaCl，透析48小时，中间 每6小时换液一次；透析完成后，加入等体积的甘油，混合均匀，-2(TC存放，即获得辣根过氧化物酶 标记的单克隆抗基质金属蛋白酶抗体。实施例5、用于中国人种基质金属蛋白酶检测的试剂盒本发明提供的用于中国人种基质金属蛋白酶检测的试剂盒包括 一多克隆抗体包 被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，洗涤液(pH7.0， O.OIMPBS (磷酸盐缓冲液)，O.lMNaCl， 0.1%吐温20的混合液)和显色剂(4-氯-l-萘酚，简 称TMB)。本发明提供的试剂盒，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清或活体组织中的 基质金属蛋白酶含量，包括如下的-步骤1) 使用多克隆抗体包被的96孔酶标板将0.5mg/ml实施例2制备的抗基质金属蛋 白酶多克隆抗体的溶液按l : IOOO的(v/v)用pH9.50、 0.05MCB稀释；将此稀释液按 100ul/孔加到酶标板的凹孔中，于4"过夜；使用洗涤液(pH7. 0、 0.01M PB、 O.lMNaCl、 0.10/。tween'20)洗板一次，按115 pl/孔加入含5X小牛血清的pH7.0、 O.OIMPBS封板，4 'C封闭过夜；然后吸净封板液，37t:干燥2小时，加干燥剂封装于铝箔袋中，得到多克 隆抗体包被的96孔酶标板；2) 检测时，在包被反应孔中先加入50 plpH7.0、 O.OIMPBS、 0.1 M NaCl的PBS， 然后加入50ul待检血清、阴性对照为正常人血清(来自献血员)、阳性对照为重组MMP9 蛋白，37'C温育20分钟，样品中的抗原可与酶标板上的多克隆抗体结合，用洗涤液(pH 7.0， O.OIMPBS， O.lMNaCl， 0.1%吐温20)洗板五次，洗去非特异结合的杂蛋白；再加入按l: 3000(v/v)用含20X小牛血清PBS稀释的前述的辣根过氧化物酶(HRP) 标记的单克隆抗体，37t:温育20分钟，洗去未结合的酶标抗体；加入显色剂A、 B液各l滴，37。C显色10分钟，所述的显色剂A液为H202，显色剂B 液为TMB (4-氯-l-萘酚)，显色完成后，每孔加入50 ^ 2M H2S04终止反应，用酶免 疫检测仪在450 nm波长读取结果。对研制的试剂盒检测方法进行质量研究，结果显示采用该试剂盒检测病人血清
中MMP9的含量时，批内检测结果变异系数(CV)为26.7%:批间检测结果变异系 数CV)为24.07%:标准曲线线性范围为15.6ng/ml—500ng/ml:标准曲线线性相关 系数复相关系数112为0.992:检测样品中MMP9的含量的灵敏度为153.2 ng/ml。说明本发明的试剂盒能与中国人基质金属蛋白酶特异性结合。实施例6、 Western Blot免疫印迹实验检测单抗与中国人基质金属相关蛋白酶结合反应 用大肠杆菌体外翻译系统合成重组中国人基质金属蛋白酶(Yanan Liu, Dalong Ma.Expression of Recombinant Chemokine-Like Factor 1 with a Cell-Free Protein Biosynthesis system. Cell-Free Protein Expression. Editor: Dr. James R. Swartz, 2nd ed， 2003, ISBN 3-540-05041-8, Springer, Chapter 20, ppl65-177)。将合成的重组中国人基 质金属蛋白酶5 10 ug/毫升和正常人血清15微升和IO微升进行15% SDS-PAGE电 泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到硝酸纤维素膜上。用实 施例3制得的单克隆抗体为一抗，用酶标记兔抗鼠的lgG为二抗做Western Blot免疫 印迹实验，结果如图4所示，显示均为特异的一条带，其中泳道1为重组的基质金属 蛋白酶与单抗结合，泳道2和3分别是血清上样量为15 ^和10 ^的样品与单抗的结 合。该实验说明本发明制得的单抗与中国人基质金属蛋白酶具有较强的特异性反应。ELISA和Western Blot的结果都证明本发明制得的单抗能与基质金属蛋白酶发生 强烈的结合反应，因此本发明的单抗可以应用到基础研究和临床应用研究。例如该单 抗可用于定量检测肝癌患者外周血中MMP-9浓度，作为协助诊断肝癌的参考指标， 并且在治疗前检测周围血中MMP-9的水平能够作为预测肝癌复发转移的较好的指标; 治疗前外周血MMP-9高水平的肝癌患者可考虑在介入或手术等局部治疗前后给与系 统化治疗，预防其转移的发生，以期提高治愈率。 sequence list.txtSEQUENCE LISTING <110〉中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 <120〉 一种抗人基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其应用 <130> FPI06211 <160> 3<170> Patentln version 3.3<210> 1<211〉 435<212〉 DNA<213> Homo sapiens<400> 1ggccgctcctactctgcctgC￡lCC3CCg￡lCggtcgcccc,gacggcttgccctggtgcagt60accacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctac120acccgggacggcaagctgatgggaaaccctgccagtt"t:cattcatcttccsaggccaa180tcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggcuaccgctggtgcgccaccacc240gccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccg,icccgagctgactcgacggtg300atggggggcaactxggcgggggagctgtgcgtcttccccgatcactttcct360tactcgacctgtaccagcgaggccgcggagatgggcgcc二ctggtgcgctaccacctcga420sctttgacagCg￡lC3435<210> 2<211> 145<212> PRT〈213> Homo sapiens<400> 2Gly Arg Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gl/ Arg Pro Asp Gly Leu1 5 1015Pro Trp Cys Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly20 2530Phe Cys Pro Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Arg As,'〕 Gly Asn Ala Asp Gly35 4045Lys Pro Cys Gin Phe Pro Phe lie Phe Gin Gl/ Gin Ser Tyr Ser Ala 50 55 60Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr65 70 7580Ala Asn Tyr Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Ph3 Cys Pro Thr Arg Ala85 9095Asp Ser Thr Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe100 105110Pro Phe Thr Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Ala115 120125Ala Glu Met Gly Ala Ser Gly Ala Leu Pro Pro Arg Thr Leu Thr Ala 130135sequence list, txt 140Thr 145<210> <211> <212> <213>3145 PRT Homos印iens<400〉 3Gly Arg 1Ser Tyr Ser Ala Cys Thr 5Thr Asp Gl/ Arg Ser Asp Glv Leu 10 15Pro Trp Cys Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly2025 30Phe Cys Pro Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Arg Aso Gly Asn Ala Asp Gly 35 4b 45Lys Pro Cys Gin Phe Pro Phe lie Phe Gin Glv Gin Ser Tyr Ser Ala 50 55 60Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr657075 80Ala Asn Tyr Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala8590 95Asp Ser Thr Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val.Phe100105 110Pro Phe Thr Phe Leu Glv Lvs Glu Tyr Ser Thr Cvs Thr Ser Glu Ala 115 120 125Ala Giu Met Gly Ala Ser Glv Ala Leu Pro Pro Arg Thr Leu Thr Ala 130 13^ 140Thr 14权利要求
1、一种杂交瘤细胞，于2006年6月27日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1743，其分类命名为基质金属蛋白酶的单克隆抗体细胞株。
2、 一种抗中国人种基质金属蛋白酶的单克隆抗体，该单克隆抗体由权利要求1 所述的杂交瘤细胞制得。
3、 一种权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测中国人种基质金属蛋白酶的 ELISA试剂盒中应用。
4、 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的EUSA试剂盒包括抗基质 金属蛋白酶多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的权利要求2所述的 抗中国人种基质金属蛋白酶单克隆抗体，洗漆液和显色剂。
全文摘要
本发明涉及一种抗中国人种基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其在检测MMP9的ELISA试剂盒中的应用。该单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.1743，保藏日为2006年6月27日的杂交瘤细胞制得。所述的该单抗在检测MMP9的ELISA试剂盒中的应用包括该单抗包被的96孔酶标板，采用辣根过氧化物酶标记的抗MMP9的多克隆抗体双抗夹心检测样品中的MMP9的含量。对于判断中国人在肝癌手术后是否转移复发时有重大的意义。
文档编号C07K16/40GK101126081SQ200610089290
公开日2008年2月20日 申请日期2006年8月15日 优先权日2006年8月15日
发明者杨建国, 胡敬群, 董小平, 平 赵, 俊 韩 申请人:中国医学科学院肿瘤医院