艾纳香总黄酮提取物的制备方法及艾纳香总黄酮提取物的制作方法

专利名称：艾纳香总黄酮提取物的制备方法及艾纳香总黄酮提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的制备艾纳香总黄酮提取物的方法，所述方法是对中国专利申请CN1403451中公开的制备方法的改进，该专利申请全文作为引用参考文献结合于本说明书。
背景技术：
艾纳香为菊科植物Blumea balsamifera(L.)DC干燥茎叶。艾纳香，中药又称大风艾。《广西中药材标准》(1990年版)记载，艾纳香性“辛、苦、温”，具“温中活血、调经、祛风除湿”之功能。用于治疗“外感风寒、泻痢、腹痛、肠鸣、肿胀、月经不调、筋骨疼痛”等病症。
艾纳香叶含挥发油，其中以L-龙脑(Borneol)为主，另含桉叶素(Cineole)、柠檬烯(Limonene)、倍半萜烯醇等(《中药大词典》，上海科学技术出版社，1977；562～563.)。中药艾纳香的主要用途是作为提取冰片的原料，也有少数传统中药复方以其挥发油或药材入药，例如咽立爽滴丸等。
近年来报道的化学成分有黄酮化合物、二氢黄酮化合物、以及倍半萜类化合物等(Nijsiri R.等，Journal of Nature Products.1981.44(5)541～545)。中国专利申请CN1403451首次公开了以艾纳香黄酮类化学成分为主要组分的总黄酮有效部位具有良好的抗心肌缺血及降血脂作用，可以用于冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的治疗和/或预防，该发明还建立了总黄酮有效部位的制备工艺。其采用吸附树脂或酸沉淀法作为艾纳香黄酮类成分的分离纯化方法，并进一步详述了其中吸附树脂法采用氯化钙沉淀作为层析前处理方法，然后经苯乙烯型大孔吸附树脂(D-101)柱层析，得总黄酮提取物。经HPLC检测，该提取物具有保留时间(Rt)为10.908、14.398、19.791、38.607、43.063的主要黄酮类组份；并经紫外分光光度法测定，总黄酮含量达25％～100％。由该发明方法制备的总黄酮提取物，经药效学试验证明，具有良好的抗心肌缺血及降血脂作用，作为艾纳香总黄酮有效部位，可以用于制备具有相应治疗作用的药物。
试验研究表明，大孔吸附树脂不仅可以吸附艾纳香提取物中的黄酮类成分，也可以吸附提取物中所含的甾体、萜类以及挥发性成分，对脂溶性成分有广谱吸附作用，即使采用乙醇-水梯度洗脱，也只能有限富集黄酮类化合物，使得大孔树脂纯化产物中黄酮类化合物含量难以进一步提高，例如使产物中的总黄酮含量达到60％以上。
已知聚酰胺树脂在特定条件下对黄酮类化合物具有良好的吸附能力(姚新生主编，《天然药物化学》，人民卫生出版社，1994)。由于聚酰胺树脂吸附属于氢键吸附，因此对带有多元酚羟基的黄酮类化合物具有更高的选择性。实际上，在中药有效部位的工业化制备技术中，聚酰胺树脂的应用仍极为有限，其中一个很重要的原因应当是聚酰胺树脂的吸附/洗脱等具体步骤中的工艺技术处理问题。采用聚酰胺树脂纯化艾纳香总黄酮提取物，首先需要解决的问题是粗提物吸附上样问题。
已知聚酰胺与酚类化合物形成氢键缔合的能力在水中最强，在含水乙醇中随醇浓度的增高而相应减弱，在高浓度醇或其它有机溶剂中几乎不缔合。聚酰胺柱层析时，通常用水装柱，样品也尽可能做成水溶液上柱以利聚酰胺对溶质的充分吸附(姚新生主编，《天然药物化学》，人民卫生出版社，1994)。根据文献以及本发明人研究结果，艾纳香所含黄酮类化合物主要为二氢黄酮类化合物以及黄酮类化合物，仅含少量的黄酮苷类化合物。这些化合物的水溶性都很差，显然，采用其水溶液上样存在着技术上的困难。本发明人发现，以较高浓度的醇溶液上样，则其中的黄酮类化合物很难被聚酰胺树脂所吸附。本领域中，采用干法上样可以不受上样溶剂的影响，但干法上样由于其处理步骤繁琐而一般仅限于实验研究，难以应用于规模化的工业生产。
现已发现，借助粗提物的“共溶”性可以实现艾纳香提取物的聚酰胺树脂的吸附上样。所谓“共溶”，是指通过粗提物中存在的水溶性非黄酮类化合物提高黄酮类化合物在水或低醇水溶液中的溶解性。
与CN1403451所述方法相比，除所得终产物中的总黄酮含量得以进一步提高之外，本发明方法的优势还包括工艺过程中的目标物损失率降低；相同吸附柱床体积下的活性成分的吸附量提高，即吸附效率显著提高；以总黄酮计，终产物收率显著提高。
本发明还进一步阐明了CN1403451没有阐明的所得艾纳香总黄酮产物中所含主要化学成分的化学结构。

发明内容
本发明的一个目的在于提供艾纳香总黄酮的制备方法，通过使用聚酰胺树脂将艾纳香的醇水提取物纯化分离可制备含量较高的艾纳香总黄酮。
本发明的另一个目的在于提供采用本发明方法制备的艾纳香总黄酮提取物。
本发明的又一目的在于提供本发明方法制备的艾纳香总黄酮提取物在制备药物组合物和制备艾纳香甲素、乙素、丙素、北美圣草酚、7-甲氧基圣草酚中的应用。
术语定义本发明中，“艾纳香”是指菊科植物Blumea balsamifera(L.)DC的地上部分，尤其是适合储存和运输需要的艾纳香干燥叶及嫩枝。
“艾纳香总黄酮提取物(或总黄酮提取物)”、“艾纳香总黄酮有效部位(或总黄酮有效部位)”是指按照本发明方法从艾纳香中获得的提取物，所述提取物中，黄酮类化学成分的总含量不低于50％。
本发明方法中所述有机溶剂水溶液的浓度均指体积百分含量(v/v)；例如，40％乙醇溶液，是指该溶液中含有40％体积的乙醇。
本发明中，所述艾纳香提取物中总黄酮或某一特定化学成分的“含量”均指质量百分含量。其中，对于特定化学成分，例如艾纳香甲素、乙素、丙素，其含量是指通过HPLC法测定的百分含量；对于总黄酮含量，则是指通过后文所述紫外分光光度法测得的百分含量。
本发明中，所述检测提取物中总黄酮含量采用紫外分光光度法测定，该方法检测步骤包括(1)制备对照品溶液取经五氧化二磷减压干燥至恒重的艾纳香甲素，加乙醇制成每1ml中含艾纳香甲素0.4mg的溶液，所得溶液即对照品溶液。
(2)制备标准曲线精密量取对照品溶液0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置25ml量瓶中，加10％硝酸铝溶液，混匀，加乙醇至刻度，摇匀。以0号管为空白，照分光光度法(中国药典2005年版一部附录V B)在380nm测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
(3)制备供试品溶液液体样品经稀释至适当浓度作为供试品溶液；固体样品则取样约40mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml置25ml量瓶中，作为供试品溶液。
(4)含量测定与计算照标准曲线制备项下的方法，自“加10％硝酸铝溶液”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液总黄酮的浓度(μg/ml)，计算，即得。
本发明中，所述检测提取物中总黄酮HPLC检测的色谱条件是色谱柱迪马钻石C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流速1.0ml/min；柱温30℃；进样量20μl；检测波长254nm和/或289nm。流动相梯度洗脱，洗脱程序见下表

发明详述本发明提供了一种改进的艾纳香黄酮类化学成分，特别是总黄酮有效部位的新制备方法。所述方法是根据艾纳香药材以及目标产物理化性质，采用聚酰胺层析技术分离其总黄酮有效部位。
本发明方法所包括的主要步骤有(1)提取艾纳香药材采用醇水溶液提取。
采用醇水溶液提取时，所述醇水溶液优选乙醇水溶液。作为提取溶剂的乙醇水溶液优选醇浓度为20％～80％(v/v)；更优选的醇浓度为30％～60％(v/v)；最优选的醇浓度为约40％～50％。
提取方法可以是加热提取、冷浸、或渗漉，其中优选分次、加热提取。一般来说，提取步骤中的总黄酮转移率应不低于60％；优选不低于75％；更优选不低于90％。容易理解，由于组成总黄酮之各种单体成分的理化性质存在一定差异，当各步骤之总黄酮转移率过低时，所得提取物中的总黄酮之各单体化合物组成比例可发生变化。
提取液合并后，经前处理回收乙醇并加水稀释至提取液基本不含乙醇，所谓基本不含乙醇，是指经回收、稀释后的提取液基本无醇味，或其中的乙醇含量不超过约15％，离心和/或过滤除去提取液中的不溶性物质，所得澄明溶液作为聚酰胺吸附纯化的上样溶液。
当采用较高浓度的乙醇溶液例如醇浓度为80％以上的溶剂提取时，所得提取液在回收乙醇的过程中可产生较大量的沉淀，离心检查其沉淀，可见沉淀中含有黄酮类化学成分；因此，以高浓度乙醇提取时，在制备聚酰胺吸附纯化的上样溶液时，黄酮类化合物有较大量的损失。
当采用较低浓度的乙醇提取例如醇浓度为30％～60％的溶剂提取时，所得提取液在回收乙醇的过程中仅产生少量沉淀，离心检查其沉淀，可见沉淀中基本不含黄酮类化学成分；因此，以较低浓度乙醇提取时，在制备聚酰胺吸附纯化的上样溶液时，黄酮类化合物基本没有损失。
提取液中总黄酮及其指标性成分的含量取决于药材、提取溶剂以及提取方法。典型地，所述上样溶液中含有艾纳香总黄酮从约0.2％～40％(总黄酮含量测定方法如后文所述)；以艾纳香甲素计，其上样溶液中的艾纳香甲素浓度从约0.02％～10％。
显然，甲醇等低级醇、以及丙酮等极性有机溶剂或其水溶液亦可用作提取溶剂。鉴于溶剂自身的安全性以及实用经济性，如无必要，这些溶剂一般不作为优选提取溶剂。
(2)聚酰胺树脂吸附步骤(1)所得上样溶液上样吸附于聚酰胺吸附树脂柱。聚酰胺柱的上样吸附量主要取决于上样溶液的性质。典型地，提取液上样吸附后，聚酰胺柱床所吸附的总黄酮的量约从5g/L～36g/L。
(3)聚酰胺树脂柱洗涤除杂采用水和/或低浓度醇溶液和/或低浓度碱性水溶液洗涤步骤(1)所述之聚酰胺吸附树脂柱，以除去未被聚酰胺树脂吸附或者仅被聚酰胺弱吸附的非黄酮类杂质成分。所述低浓度醇和/或低浓度碱性水溶液的实例有，例如1～5％的乙醇水溶液(v/v)，pH 7.5～8.5 Na2CO3或NaOH或KOH、氨水溶液等。
(4)有效部位洗脱采用高浓度乙醇水溶液和/或碱性水溶液从聚酰胺吸附树脂柱上洗脱有效部位。所述洗脱溶液的实例有，例如40～95％的乙醇水溶液(v/v)，pH 10～11 Na2CO3、NaOH或KOH水溶液、氨水溶液等。
CN1403451公开了一种采用大孔树脂吸附纯化方法制备艾纳香总黄酮。由于大孔树脂对脂溶性成分有广谱吸附作用，其不仅可以吸附艾纳香提取物中的黄酮类成分，也可以吸附提取物中所含的甾体、萜类以及挥发性成分等，因此，大孔树脂吸附法只能有限富集黄酮类化合物。其纯化产物中黄酮类化合物的含量很难达到60％以上。
已知聚酰胺树脂在特定条件下对黄酮类化合物具有良好的吸附能力。聚酰胺树脂吸附属于氢键吸附，对带有多元酚羟基的黄酮类化合物具有更高的选择性。但在中药有效部位的工业化制备技术中，聚酰胺树脂的应用极为有限，其中一个很重要的原因是聚酰胺树脂的吸附/洗脱等具体步骤中的工艺技术处理问题。
采用聚酰胺树脂纯化艾纳香总黄酮提取物，首先需要解决的问题是粗提物的吸附上样问题。在聚酰胺柱层析时，通常用水装柱，样品也需要尽可能做成水溶液上柱以利聚酰胺对溶质的充分吸附。
本发明研究结果表明，艾纳香所含黄酮类化合物主要为二氢黄酮类化合物以及黄酮类化合物，仅含少量的黄酮苷类化合物。这些化合物大多为水难溶性化合物。试验表明，艾纳香总黄酮在纯水中的最大溶解浓度低于0.1mg/ml。显然，采用其水溶液上样存在着技术上的困难。
艾纳香总黄酮水溶性差的问题，一方面影响到提取溶剂的选择，另一方面则影响到聚酰胺柱上样溶液的制备。
本发明人发现，以乙醇水溶液作为提取溶剂时，艾纳香总黄酮的提取效率随溶剂醇浓度降低而降低，即，采用较低浓度的醇溶液作为提取溶剂，提取物之总黄酮含量较低，总黄酮转移率也非常低。
当采用较高浓度的乙醇作为提取溶剂时，提取效率可得以提高，但所得提取液因含醇量较高而不能用于聚酰胺柱的吸附上样。本发明人研究发现，当艾纳香提取溶液之醇浓度相对较高时，以这些提取溶液上样聚酰胺柱，则聚酰胺柱床对提取液所含黄酮类化合物的吸附力很弱，或者基本不能吸附。
本发明人惊奇地发现，当采用适当浓度范围的乙醇水溶液作为提取液时，例如醇浓度为20％～80％，特别是30％～60％时，更特别的是当醇浓度为40％～50％时，提取液经回收乙醇并加水稀释后，离心所得澄清上样液可以使黄酮类化合物有效保留其中，随沉淀损失的总黄酮的量低于50％、20％，甚至10％。另一方面，根据计算，这时总黄酮溶解浓度达到了约0.5～2.0mg/ml，甚至＞3.0mg/ml。显然，这比艾纳香总黄酮的在纯水中的最大溶解浓度提高了数倍乃至数十倍。本发明人发现，采用适当的低浓度乙醇作为提取溶剂时，存在于提取液中的其它杂质成分对于艾纳香总黄酮的溶解起到了很好的助溶作用。换句话说，粗提物中存在的水溶性非黄酮类化合物可以提高黄酮类化合物在水或低醇水溶液中的溶解性，此即所谓的“共溶”作用。本发明人借助粗提物的“共溶”性成功地实现了艾纳香提取物的聚酰胺树脂的吸附上样。
当采用乙醇含量低于20％的醇水溶液提取时，艾纳香总黄酮的提取效率较低；而采用高浓度乙醇(例如90％的乙醇)提取时，提取液回收乙醇后，随离心沉淀损失的黄酮类化合物的量较大；因此均不适合作为本发明方法的提取溶剂。高浓度乙醇(例如90％的乙醇)提取时，提取液经回收乙醇和离心后所得上清液中的总黄酮浓度较低，也就是说，此时非黄酮类化合物对黄酮类化合物的助溶作用减弱，或者说“共溶”效应减弱。
采用本发明方法获得的艾纳香提取液经上样吸附于聚酰胺树脂后，以水以及低浓度醇洗除杂后，采用高浓度醇或其它有机溶剂如丙酮等洗脱可得所需总黄酮有效部位，也可以采用碱性水溶液如NaOH、KOH、尿素溶液等洗脱得到所需总黄酮有效部位。采用碱性水溶液洗脱时，所得洗脱液尚需脱盐处理。
本发明发现，以水以及不高于5％的乙醇水溶液洗涤除杂步骤中，黄酮类化合物基本不被洗脱，该步骤中，总黄酮的损失率一般可低于5％。
采用梯度浓度的乙醇水溶液洗脱时，开始时，相对低浓度乙醇洗脱物主要为黄酮类化合物，随着醇浓度的提高，二氢黄酮类化合物逐渐被洗脱下来。例如，10％～20％乙醇洗脱可以得到主要组分为黄酮类化合物的总黄酮提取物；25％～50％乙醇洗脱可以得到主要组分为二氢黄酮类化合物的总黄酮提取物。
进一步地，采用25％～50％浓度梯度的乙醇水溶液分段洗脱并分段收集相应流分时，则可以得到富集某些特定成分的流分。例如，20％洗脱后，25％乙醇洗脱，所得流分中，艾纳香甲素含量特别高；再采用30％～45％乙醇洗脱时，可以得到高含量北美高圣草酚和7-甲氧基-北美高圣草酚的流分。显然这些流分可以用于进一步精制纯化而得到特定的纯品化合物。
在制备用于直接制备药物制剂的总黄酮提取物时，本发明优选的洗脱方法是，继水洗和1％～5％乙醇水洗除杂后，以约50％～80％的乙醇水溶液洗脱总黄酮，优选采用约60％～80％的乙醇水溶液洗脱总黄酮，更优选约60％～70％的乙醇水溶液洗脱总黄酮。
收集的总黄酮洗脱液经浓缩和/干燥后，即可获得所需的总黄酮提取物。所述浓缩优选为减压浓缩，浓缩温度优选低于60℃，更优选室温减压浓缩。所述干燥优选喷雾干燥或真空干燥。
采用碱性水溶液洗脱时，所得洗脱液需经脱盐处理。所述脱盐方法可以采用pH沉淀法和/或萃取法、透析法、离子交换树脂吸附法等。
由此，本发明提供一种改进的艾纳香总黄酮提取物的制备方法，该方法中，艾纳香提取物通过聚酰胺吸附层析法富集黄酮类化合物成分；所得总黄酮提取物中，黄酮类化合物的总质量之和占提取物总质量的50％～95％；优选地，其黄酮类化合物的总质量之和占提取物总质量的60％～95％；更优选地，其黄酮类化合物的总质量之和占提取物总质量的75％～95％。
本发明之艾纳香总黄酮制备方法可包括下列步骤(1)艾纳香药材以20％～80％(v/v)乙醇水溶液提取；(2)步骤(1)之艾纳香提取液经前处理后，离心或过滤得澄清提取液；(3)步骤(2)之提取液上样于聚酰胺层析柱。
(4)步骤(3)所述上样结束后，聚酰胺层析柱首先以水和/或低浓度低级醇，和/或低级酮的水溶液，和/或低浓度碱性水溶液洗涤，然后以高浓度乙醇水溶液，和/或高浓度低级醇或低级酮的水溶液，和/或高浓度碱性溶液洗脱，收集含有所需成分的洗脱液。
(5)步骤(4)所述洗脱液经后处理获得艾纳香总黄酮提取物。
本发明方法中，步骤(1)所用乙醇水溶液的醇浓度优选为30％～60％(v/v)，更优选为40％～50％(v/v)。
本发明方法之步骤(2)中，前处理是指将提取液回收乙醇后加水稀释至溶液醇含量低于15％。
本发明方法之步骤(4)中，用于洗涤除杂的低浓度低级醇可以是醇浓度不高于5％的乙醇水溶液和/或1％～10％(v/v)甲醇水溶液；而低级酮可以是为1％～5％(v/v)丙酮水溶液；低浓度碱性水溶液为pH 7～9的Na2CO3、NaHCO3、NaOH、KOH水溶液，和/或0.1％～1％尿素水溶液。
本发明方法之步骤(4)中，用于洗脱所需总黄酮提取物的高浓度低级醇可以是10％～80％(v/v)乙醇水溶液和/或15％～90％(v/v)甲醇水溶液；而高浓度低级酮可以是10％～80％(v/v)丙酮水溶液。
高浓度碱性水溶液可以是pH10～14的Na2CO3、NaHCO3、NaOH、KOH、氨水溶液，和/或1.5％～10％尿素水溶液。
一般地，本发明方法中，其步骤(5)所述后处理包括浓缩和/或干燥。当采用碱性水溶液洗脱有效部位时，其后处理步骤可包括萃取、透析等脱盐步骤。
基于上述方法本发明，本发明还提供一种艾纳香总黄酮提取物，该提取物得自菊科植物Blumea balsamifera(L.)DC；所述提取物中黄酮类化合物的总质量之和占提取物总质量的50％～95％；所述提取物中含艾纳香甲素、艾纳香乙素以及艾纳香丙素。
进一步地，本发明之艾纳香总黄酮提取物中可含有约1％～30％的艾纳香甲素；可含有约0.5％～20％的艾纳香乙素；可含有艾纳香丙素约0.01％～10％。
本发明还进一步阐明CN1403451没有阐明的所得艾纳香总黄酮提取物中所含主要化学成分的化学结构。经系统化学研究，自新工艺产物中已分离并经结构确证的化合物有3，3’，5，7-四羟基-4’-甲氧基-二氢黄酮(艾纳香甲素，Blumeatin A)，3，3’，5-三羟基-4’，7-二甲氧基-二氢黄酮(艾纳香乙素，Blumeatin B)；3，3’，4’，5-四羟基-7-甲氧基-二氢黄酮(艾纳香丙素，BlumeatinC)；3’，4’，5，7-四羟基二氢黄酮(北美圣草素，eriodictyol)；3’，4’，5-三羟基-7-甲氧基-二氢黄酮(7-甲氧基-北美圣草酚，7-methyl-eriodictyol)；3，3’，7，5-四羟基-4’-甲氧基-黄酮(柽柳素，tamarixetin)；3’，4’，5，7-四羟基黄酮(木犀草素(Luteolin)；3，3’，5-三羟基-4’，7-二甲氧基-黄酮(商陆素(ombuine)；双木犀草素-3-O-葡萄糖-3″-O-半乳糖甙(艾纳香黄素，Blumeaflavone)。显然，本发明之总黄酮提取物的另一项用途就是可以用于制备这些纯品化合物的原料，例如，用于分离纯化艾纳香甲素、艾纳香乙素、艾纳香丙素、北美圣草素、7-甲氧基北美圣草酚、柽柳素、木犀草素、商陆素、艾纳香黄素等。
在本发明之HPLC条件下，本发明可以对艾纳香总黄酮提取物HPLC图谱中的主要化合物的色谱峰进行指认。根据本发明方法所得艾纳香总黄酮提取物中，艾纳香甲素、乙素、丙素的含量可以分别在约1％～30％；0.5％～20％；0.01％～10％的重量百分比范围内。
试验证明，本发明之总黄酮提取物具有抗心肌缺血以及降血脂的功效，因此，本发明之艾纳香总黄酮提取物的又一项用途是可以用于治疗药物的制备。
与CN1403451工艺相比，本发明方法可显著降低层析前处理过程中目标成分的损失率，提高层析上样量，使产物收率相应提高。此外，通过新方法还可提高目标产物的总黄酮实际含量，使该含量能更准确的反映黄酮类成分的真实含量。经检测，通过新方法制备的总黄酮有效部位，其总黄酮含量可达60％以上。采用不同洗脱梯度，还可以得到总黄酮含量为75％以上的艾纳香总黄酮提取物。采用本发明方法制备的各主要黄酮类组分的含量比例与原工艺产物基本一致。由此，在保证CN1403451所述艾纳香总黄酮提取物药效的基础上，采用本发明之总黄酮提取物可以减少患者服用量；此外，采用本发明方法制备总黄酮提取物，可以提高制备效率、降低制备成本，有利于制剂制备以及规模化的工业生产。
下文实施例用于说明本发明之特定实施方案，但不对本发明之范围构成限制。本领域内技术人员可以对具体实施方案的特定步骤以及特定参数进行修改而不超出本发明所要求的技术范围。
附图的简要说明

图1为艾纳香提取物聚酰胺树脂柱洗脱流分HPLC检测色谱图；其中图1A为10％洗脱流分HPLC色谱图(λ＝254nm)；图1B为45％洗脱流分HPLC色谱图(λ＝289nm)；图1C为20％洗脱流分HPLC色谱图(λ＝254nm)；图1D为60％洗脱流分HPLC色谱图(λ＝289nm)；图1E为30％洗脱流分HPLC色谱图(λ＝289nm)；图1F为75％洗脱流分HPLC色谱图(λ＝254nm)；图2为艾纳香总黄酮提取物HPLC检测色谱图。
具体实施例方式
实施例1艾纳香提取艾纳香药材贵州省罗甸县种植基地药材(批号021015)，经鉴定为菊科植物艾纳香Blumea balsamifera(L.)DC的干燥茎叶。
药材总黄酮含量测定艾纳香药材100g切碎，1L 75％乙醇浸泡24小时后，装渗漉柱(φ8cm，l100cm)，75％乙醇渗漉，渗漉流速20ml/min，间隔取样行HPLC-DAD检测，直至渗漉液中基本不含黄酮类化合物。
提取艾纳香药材100g 10份，切碎，分别以95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％乙醇作为提取溶剂提取，即各份药材分别以上述不同浓度的乙醇1.2L回流提取3次，每次2小时。分别合并提取液得提取液(I)，紫外分光光度法检测提取液(I)中总黄酮含量，计算总黄酮转移率(A)总黄酮转移率(A)＝提取液(I)总黄酮含量/药材总黄酮含量×100％。
分别自每份提取液中取出600ml，浓缩、干燥，计算提取液中总固形物含量。分别向剩余的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％乙醇提取液中加水2.55L、2.4L、2.4L、2.1L、1.8L、1.5L、0.9L、0.6L、0.3L后，各提取液分别减压(0.1～0.08Mpa，60℃)回收乙醇并加水定容至3.0L，提取液含醇量低于约15％，离心(4500rpm×15min)，得上清液(II)和沉淀(III)。紫外分光光度法检测上清液(II)中总黄酮含量。计算总黄酮转移率(B)总黄酮转移率(B)＝上清液(II)总黄酮含量/提取液(I)总黄酮含量×1.2×100％。沉淀(III)以75％乙醇洗涤(100ml×3)，离心，紫外分光光度法检测洗涤液中的总黄酮含量。计算提取步骤总转移率(C)总黄酮转移率(C)＝上清液(II)总黄酮含量/药材总黄酮含量×1.2×100％。
结果经测定，试验用艾纳香药材中总黄酮百分含量为4.68％。提取试验结果如表1所示。
表1不同浓度乙醇水溶液提取试验结果


显然，采用乙醇水溶液作为提取溶剂时，其提取效率随醇浓度提高而提高；但是，在保持回收乙醇后的剩余溶液体积一致的前提下，回收乙醇步骤中，总黄酮转移率(B)随所采用提取液醇浓度升高而降低。从提取液固形物含量看，提取液所含固形物的量随提取溶剂醇浓度的提高而减少，结合上清液(II)之总黄酮浓度判断，艾纳香总黄酮的水溶性可受提取液中存在的其它成分的影响。后述实施方案中将进一步证明上述上清液(II)之艾纳香总黄酮浓度均高于试验检测的艾纳香总黄酮在水中的溶解度；艾纳香提取物中存在的极性较高的杂质成分可以增加艾纳香总黄酮的水溶性。低浓度乙醇作为提取溶剂时，其提取效率较低，但由于提取液中极性较高的杂质成分随提取溶剂的醇浓度降低而增加，因此，回收乙醇后，剩余液中总黄酮的溶解稳定性也随提取溶剂的醇浓度降低而增加。
由表1结果判断，当采用醇浓度不低于90％或不高于20％的乙醇作为提取溶剂时，以上清液(II)所含总黄酮量计算，提取步骤中的总黄酮的总转移率均低于50％。
实施例2艾纳香提取物的聚酰胺柱床吸附材料(1)聚酰胺常州市长丰化工有限公司生产，柱层析用，颗粒度60～100目。按产品说明书进行预处理。
(2)其它同实施例1。
提取(1)艾纳香药材100g 10份，切碎，分别以95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％乙醇作为提取溶剂提取，即各份药材分别以上述不同浓度的乙醇1.2L回流提取3遍，每遍2小时。分别合并提取液得提取液(I)。
(2)艾纳香药材100g 4份，切碎，分别以60％、50％、40％、30％乙醇作为提取溶剂提取，即各份药材分别以上述不同浓度的乙醇1.2L回流提取3遍，每遍2小时。分别合并提取液，于60％、50％、40％乙醇提取液中分别加水0.9L、0.6L、0.3L后，各提取液分别减压(0.1～0.08Mpa，60℃)回收乙醇并加水至3.6L，提取液含醇量约低于10％，离心(4000rpm×30min)，得上清液(II)。
聚酰胺树脂吸附(1)聚酰胺静态吸附考察10份提取液(I)和4份上清液(II)各取1L，加入经预处理的聚酰胺吸附剂100mL，室温搅拌30min，继而室温放置6小时。过滤，树脂经水洗(300ml×2)以去除残留提取液；然后用80％乙醇洗脱(300ml×2)被树脂吸附的总黄酮。紫外法检测洗脱液中的总黄酮含量。
(2)聚酰胺柱床吸附考察10份提取液(I)和4份上清液(II)之剩余溶液约2.6L，分别以50ml/min的流速上样于聚酰胺吸附树脂柱床(φ6cm，100ml)。流出液中的黄酮类化合物存在以盐酸镁粉法监测、HPLC-DAD确认。当流出液中出现黄酮类化合物时即停止上样。5倍柱床体积的水洗以去除未吸附的上样溶液，随后以5倍柱床体积的80％乙醇洗脱被吸附的总黄酮。紫外法检测洗脱液中的总黄酮含量。
结果聚酰胺树脂吸附试验结果见表2。
表2聚酰胺树脂对提取液(I)和上清液(II)所含艾纳香总黄酮的吸附作用


*--总黄酮含量低于1mg显然，提取液(I)的聚酰胺树脂静态吸附量随提取液浓度升高而降低，当提取液浓度高于或等于70％时，聚酰胺树脂几乎不能吸附其中的黄酮类化合物；对于醇浓度在30％至60％的提取液(I)，聚酰胺树脂可少量吸附其中的黄酮类化合物；对于10％和20％醇浓度的提取液(I)，其吸附量还与提取液中所含总黄酮量较少有关。提取液(I)的聚酰胺树脂柱床吸附量呈现出类似的规律。
上清液(II)的聚酰胺树脂静态吸附量和聚酰胺树脂柱床吸附量均大幅度提高。其50ml树脂静态吸附的艾纳香总黄酮量在约776mg至约912mg之间；100ml聚酰胺树脂柱床吸附的艾纳香总黄酮量在2550mg至2946mg之间。此外，上清液(II)的聚酰胺树脂柱床吸附过程中，2.6L上样溶液均完全上样，上样流出液监测中未见黄酮类化合物泄漏，说明，聚酰胺树脂柱床对艾纳香总黄酮的吸附容量尚未饱和。
本实施例表明，上清液(II)的制备，可以有效地解决艾纳香总黄酮提取物在聚酰胺树脂柱上的上样吸附问题。
实施例3艾纳香提取物在聚酰胺树脂柱上的洗脱材料(1)聚酰胺常州市长丰化工有限公司生产，柱层析用，颗粒度100～200目。按产品说明书进行预处理。
(2)其它同实施例1。
提取艾纳香药材200g，切碎，以50％乙醇作为提取溶剂提取3遍(2.4L×3)，每遍2小时。合并提取液(I)，减压(0.09MPa，50℃)回收乙醇并加水3.6L，离心(4000rpm×30min)，得上清液(II)。
聚酰胺树脂柱吸附上清液(II)以60ml/min的流速上样于聚酰胺吸附树脂柱床(φ8cm，200ml)。上样完毕后，顺次用水以及5％、10％、20％、30％、45％、60％、75％、95％乙醇溶液各1L洗脱层析柱，收集各洗脱流分；各洗脱流分少量取样，紫外法检测总黄酮含量，HPLC法检查总黄酮类化合物分布；分别浓缩干燥，计算各洗脱流分的洗脱物总量以及洗脱物中的总黄酮百分含量。
结果聚酰胺树脂吸附洗脱结果见表3。
表3艾纳香提取物在聚酰胺树脂柱上的洗脱

*--总黄酮含量低于1mg**流分总黄酮百分含量各洗脱流分总黄酮含量/各洗脱流分洗脱物总量×100％***流分总黄酮比例各洗脱流分总黄酮含量/各洗脱流分总黄酮含量之和×100％洗脱结果表明，艾纳香提取物上柱吸附后，上样流出液和水洗流出液中基本不含黄酮类化合物。5％乙醇洗脱物中含有约16.3％的黄酮类化合物，因洗脱总量较少，因此其所含总黄酮实际仅占全部流分总黄酮总量的1.85％。
10％乙醇至60％乙醇的5个洗脱流分的洗脱物中，所含总黄酮量均占全部流分总黄酮总量的10％以上，5个流分洗脱的总黄酮总量约占全部流分总黄酮总量的91％。
75％乙醇洗脱流分中仍含少量黄酮类化合物(约27％)，至95％乙醇洗脱流分，则其中所含黄酮类化合物更少(约6％)。
显然合并5％至95％的乙醇洗脱流分，则所得洗脱物总量可达14.7g，其中含总黄酮8.09g，即总黄酮百分含量约为55.0％；以药材所含总黄酮计算，则此合并组分之总黄酮转移率为约86.4％。
合并10％至75％的乙醇洗脱流分，则所得洗脱物总量可达11.9g，其中含总黄酮7.83g，即总黄酮百分含量约为65.7％；以药材所含总黄酮计算，则此合并组分之总黄酮转移率为约83.7％。
合并10％至60％的乙醇洗脱流分，则所得洗脱物总量可达10.2g，其中含总黄酮7.37g，即总黄酮百分含量约为72.3％；以药材所含总黄酮计算，则此合并组分之总黄酮转移率为约78.7％。
从附图1可见10％乙醇洗脱流分中所含黄酮类化合物主要是HPLC保留时间(Rt)在约6.6min至约11.3min之间的黄酮类化合物以及少量的其它(二氢)黄酮类化合物；20％乙醇洗脱流分所含黄酮类化合物主要是RT11.30min的黄酮类化合物，此外含有RT7.44min、RT7.97min、RT29.11min的三个二氢黄酮化合物以及少量的其它(二氢)黄酮类化合物；30％乙醇洗脱流分主要含RT11.01min的黄酮类化合物和RT12.56min的二氢黄酮化合物，此外含有RT20.06min、RT28.78min两个二氢黄酮化合物以及少量的其它(二氢)黄酮类化合物；45％乙醇洗脱流分主要含RT12.59min、RT16.08min、RT31.19min三个二氢黄酮类化合物，以及少量的其它(二氢)黄酮类化合物；60％乙醇洗脱流分主要含RT16.11min的二氢黄酮类化合物和RT25.54min、RT26.64min两个黄酮类化合物，以及少量的其它(二氢)黄酮类化合物；75％乙醇洗脱流分主要含保留时间(Rt)在约18min至约26min之间的黄酮类化合物以及少量的其它(二氢)黄酮类化合物。
实施例4聚酰胺树脂吸附与大孔吸附树脂吸附纯化艾纳香总黄酮产物比较材料(1)聚酰胺台州市路桥四甲生化塑料厂生产，柱层析用，颗粒度80～120目。按产品说明书进行预处理。
(2)D101大孔树脂，天津农药树脂分公司产品，按说明书进行前处理(3)其它同实施例1。
提取艾纳香药材200g，切碎，以50％乙醇作为提取溶剂提取3遍(2.4L×3)，每遍2小时。合并提取液(I)，减压(0.1～0.08MPa，55℃)回收乙醇，加水约3.6L，至提取液基本无醇味，离心(4500rpm×10min)，得上清液(II)。
聚酰胺树脂柱吸附纯化上清液(II)1.8L以60ml/min的流速上样于聚酰胺吸附树脂柱床(φ6cm，100ml)。上样完毕后，顺次用水、5％乙醇各500ml洗涤树脂柱，然后用750ml 75％乙醇洗脱；收集75％乙醇脱洗液，减压浓缩后真空干燥。紫外法检测所得样品的总黄酮含量。
D101大孔树脂柱吸附纯化上清液(II)1.8L以60ml/min的流速上样于D101大孔树脂柱床(φ6cm，300ml)。上样完毕后，顺次用水、20％乙醇各1500ml洗涤树脂柱，然后用1500ml 75％乙醇洗脱；收集75％乙醇脱洗液，减压浓缩后真空干燥。紫外法检测所得样品的总黄酮含量。
结果聚酰胺树脂、D101大孔吸附树脂纯化所得艾纳香总黄酮产物检测结果见表4。
表4聚酰胺树脂、D101大孔吸附树脂纯化所得艾纳香总黄酮提取物比较

*总黄酮产物得率提取物总量(g)/原药材量(g)×100％**总黄酮转移率提取物中总黄酮量(g)/原药材中总黄酮量(g)×100％本实施例结果表明，与D101大孔吸附树脂相比，采用聚酰胺吸附树脂纯化可以使吸附树脂用量减少，洗涤和洗脱溶剂用量减少；总黄酮提取物的得率增加1.5倍；提取物中黄酮类化合物的含量提高17个百分点；总黄酮转移率提高2.03倍。
实施例5艾纳香总黄酮的水溶性及杂质成分与总黄酮的“共溶”效应材料实施例4所述“聚酰胺树脂柱吸附纯化”步骤所述之水、5％乙醇洗涤流分、75％乙醇洗脱所得总黄酮提取物。
总黄酮提取物溶解性检测取实施例4所得艾纳香总黄酮提取物1g，加水100ml，60℃超声促溶60min，4000rpm×15min离心，取上清液检测总黄酮浓度(I)。
艾纳香提取物杂质成分与总黄酮的“共溶”效应合并实施例4所述“聚酰胺树脂柱吸附纯化”步骤所述之水、5％乙醇洗涤流分，减压浓缩至300ml，顺次以石油醚(100ml×2)、氯仿(100ml×2)、乙酸乙酯(100ml×2)萃取，合并有机相。水相减压挥去残留有机溶剂，补加水至约500ml；有机相回收溶剂得有机相残留物。
取水相100ml，加实施例4所得艾纳香总黄酮提取物1g，60℃超声促溶60min，4000rpm×15min离心，取上清液检测总黄酮浓度(II)。
有机相残留物加水100ml，加实施例4所得艾纳香总黄酮提取物1g，60℃超声促溶60min，6000rpm×15min离心，取上清液检测总黄酮浓度(III)。
结果检测结果表明，艾纳香总黄酮提取物在纯水中的溶解度很低，其饱和水溶液中的总黄酮浓度(I)为约0.05mg/ml；与水溶性杂质共存时，其饱和水溶液的总黄酮浓度(II)为约0.86mg/ml；与非水溶性杂质共存时，其饱和水溶液的总黄酮浓度(III)与其纯水中的饱和浓度近似，为约0.07mg/ml。该结果表明，艾纳香提取物中所含水溶性杂质成分可以促进艾纳香黄酮类化学成分的水溶性，这可以部分解释实施例1所得上清液(II)中所含黄酮类化合物可以保持溶解稳定性的原因，并由此实现聚酰胺吸附纯化的上样溶液的可制备性。
实施例6艾纳香总黄酮提取物所含黄酮类化合物鉴定艾纳香总黄酮提取物制备采用1kg药材，同实施例4所述步骤制备聚酰胺树脂之10％、20％、30％、45％、60％、75％、95％乙醇洗脱物。
纯化30％乙醇洗脱物，经硅胶柱层析纯化得化合物I(3，3’，5，7-四羟基-4’-甲氧基-二氢黄酮，艾纳香甲素，Blumeatin A)，化合物II(3，3’，5-三羟基-4’，7-二甲氧基-二氢黄酮，艾纳香乙素(Blumeatin B)；45％乙醇洗脱物，经硅胶柱层析纯化得化合物I，化合物III(3，3’，4’，5-四羟基-7-甲氧基-二氢黄酮，艾纳香丙素(Blumeatin C，Blu C)；化合物IV(3’，4’，5，7-四羟基-二氢黄酮，即北美圣草素(eriodictyol))；20％乙醇洗脱物，经硅胶柱层析纯化得化合物I，化合物V(3’，4’，5-三羟基-7-甲氧基-二氢黄酮，即7-甲醚-北美圣草素(7-methyl-eriodictyol))；60％乙醇洗脱物，经硅胶柱层析纯化得化合物VI(3，3’，7，5-四羟基-4’-甲氧基-黄酮，即柽柳素(tamarixetin))，化合物VII(3’，4’，5，7-四羟基黄酮，即木犀草素(Luteolin))化合物VIII(3，3’，5-三羟基-4’，7-二甲氧基-黄酮，即商陆素(ombuine))10％乙醇洗脱物，经硅胶柱层析纯化得化合物IX(双木犀草素-3-O-葡萄糖半乳糖二糖甙，艾纳香黄素(Blumeaflavone))。
鉴定化合物I3，3’，5，7-四羟基-4’-甲氧基-二氢黄酮，本发明称之为艾纳香甲素(Blumeatin A，Blu A)。类白色针晶，m.p.175～177℃；UV(EtOH)291，205；MS(FAB)318[M]+；IR(KBr，cm-1)3394，2962，2845，1640，1598，1518，1466，1444，1414，1385，1276，1248，1155，1130，1081，1028，998，976，949，801，764，737；1H-NMR(DMSO-d6)11.90(1H，s)，10.84(1H，s)，9.06(1H，s)，6.94～6.87(3H，m)，5.91(1H，d)，5.86(1H，d)，5.79(1H，d)，5.03(1H，d)，4.50-4.54(1H，dd)，3.78(3H，s)；13C-NMR198，167，163，163，148，146，120，119，115，111，100，96，95，83，72。
化合物II3，3’，5-三羟基-4’，7-二甲氧基-二氢黄酮，本发明称之为艾纳香乙素(Blumeatin B，Blu B)。白色针状晶体，m.p.170～171℃；MS(FAB)333[M+1]+；IR(KBr，cm-1)3474，1633，1517，1277，1150，1134；UV(CH3OH)335，287，205；1H NMR(DMSO，δ)11.82(1H，s)；8.91(1H，s)；6.93～6.86(3H，bm)；6.09(1H，d)；6.06(1H，d)；5.74(1H，d)；5.06(1H，dd)；4.52(1H，d)，3.78(6H，s)；13C NMR(DMSO)198，167，163，162，148，146，129，119，115，111，101，94，94，83，72，56，55。
化合物III3，3’，4’，5-四羟基-7-甲氧基-二氢黄酮，本发明称之为艾纳香丙素(Blumeatin C，Blu C)。白色针状晶体；m.p.263～265℃。MS(FAB)319[M+1]+；UV(CH3OH)326，292；IR(KBr，cm-1)3427，2955，2924，2853，1639，1574，1453，1384，1282，1185，1156，1127，1085，1004；1H NMR(DMSO)11.86(1H，s)；8.97(2H，br)；6.88～6.75(3H，m)；6.11(1H，d)；6.07(1H，d)，5.79(1H，br)，5.03(1H，d)，4.55(1H，d)；3.87(3H)；13C NMR(DMSO，δ)197，163，163，165，147，146，129，118，115，114，104，96，95，83，72。
化合物IV3’4’，5，7-四羟基二氢黄酮，即北美圣草素(eriodictyol)。淡黄色粉末，m.p.270℃。MS(FAB)289[M+1]+；UV(CH3OH)287.2；IR(KBr，cm-1)3370，1637，1606，1452，1309，1162，1085，823，734；1H NMR(DMSO)12.10(1H，s)；10.33(1H，s)；9.03(1H，s)；9.01(1H，s)；6.85(1H，s)；6.72(2H，d)；5.86(1H，d)；5.85(1H，d)，5.34(1H，dd)，3.15(1H，dd)，2.7(1H，dd)；13C NMR(DMSO)198，168，165，165，147，146，132，119，116，114，104，97，96，80，44。
化合物V3’，4’，5-三羟基-7-甲氧基-二氢黄酮，即7-甲醚-北美圣草素(7-methyl-eriodictyol)。白色针状晶体；m.p.218℃MS(FAB)303[M+1]+；UV(CH3OH)335，285；IR(KBr)3374，3189，2853，1637，1605，1576，1500，1451，1302，1204，1154，828，733，504；1H NMR(DMSO)12.08(1H，s)；8.97(1H，s)；8.91(1H，s)；6.88～6.74(3H，m)；6.08(1H，d)；6.06(1H，d)；5.43(1H，dd)；3.78(3H，s)；3.20(1H，dd)；2.71(1H，dd)；13C NMR(DMSO，δ)197，167，163，163，146，145，129，118，115，114，103，95，94，79，56，42。
化合物VI3，3’，7，5-四羟基-4’-甲氧基-黄酮，即柽柳素(tamarixetin)。黄色针状晶体；m.p.＞300.0°；MS(FAB)317[M+1]+；UV(CH3OH)368，255；IR(KBr)3310，2941，2847，1655，1617，1511，1439，877，808；1H NMR(DMSO)12.40(1H，s)；10.67(1H，s)；9.28(1H，s)；9.19(1H，s)；7.65(1H，dd)；7.63(1H，d)；7.05(1H，d)；6.39(1H，d)；6.17(1H，d)；3.85(3H，s)；13C NMR(DMSO)176，164，161，157，150，147，147，136，124，120，115，112，104，99，94，56。
化合物VII3’，4’，5，7-四羟基黄酮，即木犀草素(Luteolin)。浅黄色粉末。m.p.＞300℃；MS(FAB)287[M+1]+；UV(CH3OH)348，293sh，267，254；IR(KBr)3506，3421，1656，1611，1504；1H NMR(DMSO)12.98(1H，s)；7.43(1H，dd)；7.41(1H，d)；6.89(1H，d)；6.67(1H，d)；6.45(1H，d)；6.19(1H，d)；13C NMR(DMSO)184，166，166，163，159，151，147，124，120，117，114，105，104，100，95。
化合物VIII3，3’，5-三羟基-4’，7-二甲氧基-黄酮，即商陆素(ombuine)。黄色针状晶体。m.p.233～235℃；MS(FAB)331[M+1]+；UV(CH3OH)368，255；IR(KBr)3450，3278，3100，3001，2840，1657，1587，1507，1436，837，806，763；1H NMR(DMSO)12.42(1H，s)；9.46(1H，s)；9.23(1H，s)；7.72(1H，s)；7.69(1H，d)；7.01(1H，d)；6.69(1H，d)；6.34(1H，d)；3.87(3H，s)；3.86(3H，s)；13CNMR(DMSO)176，165，160，156，150，147，146，136，123，120，115(C2’)，112，104，98，92，56，56。
化合物IX双木犀草素-3-O-葡萄糖半乳糖二糖甙，本发明称之为艾纳香黄素(Blumea-flavone)。黄色粉末；m.p.233～235℃；MS(FAB)927[M+1]+；UV(CH3OH)368，255；1H NMR(DMSO)12.64(2H，d)；10.84(1H，br)；9.77(1H，br)；9.36(2H，br)；7.72(1H，s)；7.68(1H，d)；7.59～7.56(2H，m)；7.53(1H，d)；6.85(1H，d)；6.83(1H，d)；6.41(2H，d)；6.20(2H，d)；5.46(1H，d)；5.37(1H，d)；5.26～4.23(8H，m)，3.99～3.66(10H，m)；13C NMR(DMSO)177，177，164，164，151，156，156，156，156，148，144，144，133，133，116，116，115，104，104，102，101，99，93，78，76，76，74，73，71，70，68，61，60。
实施例7艾纳香总黄酮提取物所含部分黄酮类化合物指认与含量测定艾纳香总黄酮提取物所含部分黄酮类化合物指认按实施例4所述步骤制备聚酰胺树脂纯化的艾纳香总黄酮提取物，采用实施例6所得纯品化合物作为对照品，通过加样HPLC图谱指认艾纳香总黄酮提取物HPLC谱图中的部分黄酮类化合物。
艾纳香总黄酮提取物中艾纳香甲素、乙素、丙素含量测定对照品法HPLC检测不同批次总黄酮提取物中的艾纳香甲素(BluA)、乙素(BluB)、丙素(BluC)含量。
HPLC色谱条件固定相BDS柱(5.0mm×25cm×10μm)；流动相0.4％磷酸∶甲醇(55∶45)；流速1ml/min；柱温30℃；检测波长254nm和/或289nm；进样量10～20μl。
结果艾纳香总黄酮提取物的HPLC色谱图如附图2所示。其中，与实施例6所述化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX对应的色谱峰分别为保留时间(RT)为12.727、29.110、31.540、20.318、16.270、47.096、32.975、23.970min的色谱峰。
6个批次的艾纳香总黄酮提取物之艾纳香甲素、乙素、丙素含量检测结果见表5。检测结果表明，艾纳香甲素、乙素、丙素含量分别在9％～25％；1％～6％；0.5％～5％范围内。
表5艾纳香总黄酮提取物中艾纳香甲素、乙素、丙素含量检测结果

实施例8艾纳香总黄酮片制备材料艾纳香总黄酮提取物，按照实施例4方法制备，批号050716。
制法称取艾纳香总黄酮提取物10g，溶解于适量乙醇中，加入90g PVPK29/32，混合均匀，使充分溶解；旋转蒸发使乙醇挥发，冷却，干燥，固化，粉碎固化物，取10克与5克乳糖、3克预胶化淀粉、1克羧甲基淀粉钠混合，过80目筛2遍，混合均匀，以1％低取代羟丙基纤维素乙醇溶液(浓度50％)为粘合剂制软材，过40目筛制粒，60℃干燥，过30目筛整粒，加入0.15克滑石粉混合均匀，压片，可制备艾纳香总黄酮片100片。
实施例9艾纳香总黄酮的药理学活性受试物实施例4所述之聚酰胺吸附树脂柱纯化获得的艾纳香总黄酮提取物。
对照药丹参片，上海雷允上药业有限公司生产，生产批号050914。
试剂Nitrotetrazolium Blue chloride/N-BT染色剂，瑞士Fluka化学试剂公司生产。
动物及分组SD大鼠，由第二军医大学实验动物中心提供，动物合格证号SYXK-(沪)-2002-0026，体重220-250g，雄性，随机分为5组。

试验方法动物称重后乙醚浅麻醉。沿胸骨左缘第3肋间快速开胸，剪开心包。冠状动脉前降支结扎，造成急性心肌缺血模型，4小时后取心脏，用生理盐水洗净，滤纸吸干，称全心重量，剪去心耳和右心室后称重(左心重)。然后将左心切成0.2cm厚的心肌片，置37℃、0.1％氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)液染色。染色过程中不时摇动染色液使之与心肌充分接触。30分钟后立即用水冲去多余染料。梗死心肌不着色，非梗死心肌被染成着蓝黑色，剪去着色部分，将未着色的梗死区称重。试验药物和对照药物均在冠脉结扎前30分钟灌胃。给药容积为10ml/kg，给药次数为一次。
观察指标观察给药后心肌梗死范围及其梗死比率，进行组织学定量(N-BT染色)。检测梗死范围(g)，即N-BT染色未着色心肌；计算心肌梗死比率(梗死心肌重/左心重)。观察时间为给药后4小时。
试验结果以定量组织学N-BT染色法显示心肌梗塞范围，溶剂对照组梗塞区重量与左心室重量比值0.17±0.04。丹参片以及艾纳香总黄酮提取物之中、高剂量组有明显缩小心肌梗塞范围的作用，比值分别为0.14，0.14和0.12，与溶剂对照组比较相差显著(P＜0.05)。说明受试药物对大鼠急性冠状动脉结扎引起的心肌损伤有保护作用。
表5艾纳香总黄酮提取物对急性心梗大鼠心肌梗死的影响

VS溶剂对照组；*P＜0.05，**P＜0.0权利要求
1.艾纳香总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，以聚酰胺吸附层析从艾纳香的醇水粗提取物中纯化分离艾纳香总黄酮提取物，该提取物中占50％～95％质量百分比的为黄酮类化合物；所述艾纳香为菊科植物Blumea balsamifera(L.)DC。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括下述步骤1)以20％～80％(v/v)乙醇水溶液从艾纳香中制备艾纳香粗提取物；2)以聚酰胺吸附步骤1)中制备的艾纳香粗提取物；3)高浓度乙醇水溶液、和/或高浓度低级醇或低级酮的水溶液，和/或高浓度碱性溶液洗脱吸附了艾纳香粗提取物的聚酰胺，获得艾纳香总黄酮提取物。
3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1)艾纳香以20％～80％(v/v)乙醇水溶液提取；(2)步骤(1)之艾纳香提取液经前处理使溶液含醇量不高于15％，离心得澄清提取液；(3)步骤(2)之提取液上样于聚酰胺层析柱；(4)步骤(3)所述上样结束后，聚酰胺层析柱首先以水和/或低浓度低级醇，和/或低级酮的水溶液，和/或低浓度碱性水溶液洗涤，然后以高浓度乙醇水溶液，和/或高浓度低级醇或低级酮的水溶液，和/或高浓度碱性溶液洗脱，获得艾纳香总黄酮提取物。
4.权利要求3所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)～(4)之各步骤中的总黄酮转移率均不低于50％。
5.权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述乙醇水溶液的醇浓度为30％～60％(v/v)。
6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述乙醇水溶液的醇浓度为40％～50％(v/v)。
7.权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤3)所述高浓度低级醇为10％～80％(v/v)乙醇水溶液和/或15％～90％(v/v)甲醇水溶液；所述高浓度低级酮为10％～80％(v/v)丙酮水溶液；所述高浓度碱性水溶液为pH10～14的Na2CO3和/或NaHCO3和/或NaOH和/或KOH，和/或1.5％～10％尿素水溶液。
8.权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(4)所述低浓度低级醇为1％～5％(v/v)的乙醇水溶液和/或1％～10％(v/v)甲醇水溶液；所述低浓度低级酮为1％～5％(v/v)丙酮水溶液；所述低浓度碱性水溶液为pH 7～9的Na2CO3和/或NaHCO3和/或NaOH和/或KOH，和/或0.1％～1％尿素水溶液。
9.权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(4)所述高浓度低级醇为10％～80％(v/v)乙醇水溶液和/或15％～90％(v/v)甲醇水溶液；所述高浓度低级酮为10％～80％(v/v)丙酮水溶液；所述高浓度碱性水溶液为pH10～14的Na2CO3和/或NaHCO3和/或NaOH和/或KOH，和/或1.5％～10％尿素水溶液。
10.权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述前处理包括浓缩和/或加水稀释。
11.权利要求3所述的制备方法，其特征在于进一步包括将步骤(4)获得的提取物浓缩和/或干燥的步骤。
12.一种艾纳香总黄酮提取物，其特征在于所述艾纳香提取物得自菊科植物Blumea balsamifera(L.)DC；所述提取物中黄酮类化合物的总质量之和占提取物总质量的50％～95％；所述提取物中含艾纳香甲素、艾纳香乙素以及艾纳香丙素。
13.权利要求12所述的艾纳香总黄酮提取物，其特征在于所述艾纳香总黄酮提取物采用权利要求1所述方法制备。
14.权利要求13所述的艾纳香总黄酮提取物，其特征在于所述总黄酮提取物按照如下方法制备(1)艾纳香药材以20％～80％(v/v)乙醇水溶液提取；(2)步骤(1)之艾纳香提取液经前处理使溶液含醇量不高于15％，离心或过滤得澄清提取液；(3)步骤(2)之提取液上样于聚酰胺层析柱。(4)步骤(3)所述上样结束后，聚酰胺层析柱首先以水和/或低浓度低级醇，和/或低级酮的水溶液，和/或低浓度碱性水溶液洗涤，然后以高浓度乙醇水溶液，和/或高浓度低级醇或低级酮的水溶液，和/或高浓度碱性溶液洗脱，收集含有所需成分的洗脱液。(5)步骤(4)所述洗脱液经后处理获得艾纳香总黄酮提取物。
15.权利要求12-14所述的艾纳香总黄酮提取物，其特征在于所述总黄酮提取物中，艾纳香甲素含量为0.5％～30％；艾纳香乙素含量为0.1％～20％；艾纳香丙素含量为0.01％～20％。
16.权利要求12所述的艾纳香总黄酮提取物在制备抗心肌缺血和/或降血脂药物中的应用。
17.权利要求12所述的艾纳香总黄酮提取物在制备艾纳香甲素、乙素、丙素、北美圣草酚、7-甲氧基圣草酚中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种改进的艾纳香总黄酮提取物的制备方法，特别涉及从艾纳香原植物中制备其总黄酮有效部位。采用适当的前处理步骤，进而以聚酰胺为吸附剂进行层析分离。通过本发明方法可以显著提高艾纳香总黄酮提取物的制备效率、降低制备成本，实现了在保证原有药效基础上，减少患者服用量，同时更有利于制剂制备以及规模化工业生产的技术创新目的。
文档编号C07D311/30GK1899344SQ20061008958
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月4日 优先权日2006年7月4日
发明者赵金华, 康晖, 曾伟珍, 姚光辉, 殷米来, 张丽娟, 李靖, 冯汉林, 于琳 申请人:深圳海创医药科技发展有限公司