专利名称：获得植物内含子序列扩增多态性的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种获得植物内含子序列扩增多态性的方法及其专用引物。
背景技术：
在分子标记的开发和使用中，各种分子标记均存在一定的缺陷和不足。RFLP所需DNA量大，多态性频率低，需要放射性探针，且比较费时；RAPD试验结果可靠性和重复率低，分辨率也低；AFLP条带分析统计难度较大，对操作人员的实验技术水平要求较高；SSR标记开发费用高，多态性频率低；而且目前所使用的标记无法与表达序列联系起来，在其应用中存在一定的盲目性，尤其在QTL定位过程中，分子标记与QTL距离过远，使其利用价值较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种获得植物内含子序列扩增多态性的方法及其专用引物。
本发明所提供的获得植物内含子序列扩增多态性的专用引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物和反向引物均由18个核苷酸组成，正向引物的核苷酸序列为5′-NNNNNNNNNNNMAGGTAA-3′，反向引物的核苷酸序列为5′-CTGCAANNNNNNNNNNNN-3′，其中N为A、T、C和G中的任一种碱基，M为A或C。
优选的专用引物设计方法为筛选目标物种的BAC库，查找符合下述规律的内含子前端为GT且GT前为AAG或CAG，GT后为AA；后端为AG，AG前为TTGC且此4碱基前的7个碱基中至少包含4个嘧啶。选取符合此种规律且4种碱基在组成和排列上相对均匀，没有聚集在一起现象的内含子边界序列，按照本引物设计方案在A(C)AGGTAA前截取11个碱基连同A(C)AGGTAA一起以NNNNNNNNNNNA(C)AGGTAA的形式作为前端引物，在TTGCAG前截取12个碱基连同TTGCAG一起反向转录并将反向转录后的18个碱基以5′-CTGCAANNNNNNNNNNNN-3′的形式作为后端引物。所有作为引物的BAC库序列必须检验，剔除含有二级结构以及碱基排列不匀称不适合作为引物的序列。
其中，优选的专用引物的反向引物中自5′端第7位至13位碱基中至少有4个碱基是嘌呤。
所述专用引物具体可为以下几种
1)所述专用引物的的正向引物具有序列表中序列3的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列14的核苷酸序列，即引物组合F3R5。
2)所述专用引物的正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列11的核苷酸序列，即引物组合F1R2。
3)所述专用引物的正向引物具有序列表中序列4的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列10的核苷酸序列，即引物组合F4R1。
本发明所提供的获得植物内含子序列扩增多态性的方法，是以待测植物品种的基因组DNA为模板，利用上述的至少一种专用引物进行PCR，将得到的PCR产物进行电泳、显色和条带统计，得到待测植物品种间的内含子序列扩增多态性。
其中，所述电泳可为4％聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述电泳的电泳缓冲液可为1×TBE，电泳电压可为恒电压60W，电泳时间可为1.5-2小时。
所述显色方法为电泳后取下凝胶置于10％的乙酸中固定30min后水洗，然后置于0.1％的AgNO3和0.15％的甲醛下染色30min，水洗30s，置于4℃的含有3％Na2CO3、0.15％甲醛和0.0002％Na2S2O3的溶液中直到条带完全显出为止。
所述条带统计方法为所有条带均以显性标记记录。
在实际应用中，为保持Na2CO3溶液在显色过程中始终处于低温状态(4℃)，常常在显色时加少许液氮。
内含子序列扩增多态性(Intron Sequence Amplified Polymorphism，ISAP)是一种新型的基于PCR的标记系统，由本发明的发明人首次提出。ISAP分子标记是一种多态性好、开发合成费用低廉、使用简单方便而且紧密联系表达序列的分子标记。引物设计和引物组合是ISAP标记的核心。该分子标记引物设计的主要依据是真核生物的基因基本上都是由内含子和外显子构成，而在内含子与外显子的交界部位存在保守序列，且内含子序列在品种间差异很大。
实验证明，ISAP分子标记多态性好，本发明所提供的专用引物(引物组合)能产生多态性位点，部分专用引物(引物组合)能产生多个多态性位点；本发明所提供的专用引物(引物组合)开发合成费用低廉，按照本发明的分子标记的引物设计方案，设计程序非常简单，而且正向引物可以与反向引物相互组合，这大大增加了专用引物(引物组合)的数目，减少了合成正向引物或反向引物的数目，降低了合成费用；本发明的获得植物内含子序列扩增多态性的方法简单方便，采用PCR扩增产物电泳而无须繁琐步骤和放射性探针，简单方便且减轻了工作量；由于该分子标记本身来自于基因内部，使得这种分子标记与表达序列紧密联系，为该分子标记的应用如QTL定位提供了良好的条件。
图1为部分ISAP引物组合在中棉所36和海7124两个棉花品种中的ISAP电泳图谱图2A和图2B为以中棉所36和海7124构建的F2群体为作图群体，将138个ISAP标记和138个SRAP标记定位在32个连锁群上图3A为引物组合F1R2对8种植物进行PCR的电泳图谱图3B为引物组合F4R1对8种植物进行PCR的电泳图谱图3C为引物组合F3R5对8种植物进行PCR的电泳图谱具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、获得棉花内含子序列扩增多态性1、ISAP分子标记的引物设计筛选棉花的BAC库，查找符合下述规律的内含子前端为GT且GT前为AAG或CAG，GT后为AA；后端为AG，AG前为TTGC且此4碱基前的7个碱基中至少包含4个吡啶。如CGAACAAGTCTCAGGTAATG………AGATTCATTGATTTGCAG(加下划线为内含子)，在CAGGTAA前截取11个碱基CGAACAAGTCT连同CAGGTAA一起作为前端引物，在TTGCAG前截取12个碱基AGATTCATTGAT连同TTGCAG一起反向转录为CTGCAAATCAATGAATCT并将反向转录后的18个碱基CTGCAAATCAATGAATCT作为后端引物。
按照该设计方案，共设计了9个ISAP正向引物F1至F9和8个反向引物R1至R8F15′-CGATATAAGCAAAGGTAA-3′(序列1)，R15′-CTGCAATTAAGCAAGAAC-3′(序列10)F25′-GCATGAATGCAAAGGTAA-3′(序列2)，R25′-CTGCAATGTAGACCCATT-3′(序列11)，F35′-ATGGAACTCGCAAGGTAA-3′(序列3)，R35′-CTGCAACAAGATCTCAGA-3′(序列12)，F45′-ACGAAGATGGAAAGGTAA-3′(序列4)，R45′-CTGCAAGTGAGAACACCC-3′(序列13)，F55′-TAGCCGGTATCAAGGTAA-3′(序列5)，R55′-CTGCAAAATTCAATAGTT-3′(序列14)，F65′-CGTCCGATGAAAAGGTAA-3′(序列6)，
R65′-CTGCAAATGTTAAACCCA-3′(序列15)，F75′-ATCAGCTGCTGCAGGTAA-3′(序列7)，R75′-CTGCAAGGGTTAACCAGT-3′(序列16)，F85′-AGCCGTTTATACAGGTAA-3′(序列8)，R85′-CTGCAATAACGCAACATG-3′(序列17)，F95′-CATCTCACTTTCAGGTAA-3′(序列9)，2、利用步骤1的ISAP引物获得中棉所36和海7124的内含子序列扩增多态性分别以棉花品种中棉所36和海7124的基因组DNA为模板，利用F1至F9中的任一个正向引物与R1至R8中的任一个反向引物配对得到的72种引物组合分别进行PCR扩增。PCR反应体系中含有0.2mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl2，0.3μmol/L正向引物，0.3μmol/L反向引物，5×104U/L Taq DNA聚合酶，2×103μg/L基因组DNA。扩增程序为94℃预变性5min，1个循环；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸2min，5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
将得到的PCR产物分别进行4％聚丙烯酰胺凝胶电泳。具体方法如下量取60ml4％聚丙烯酰胺凝胶，加400μL 10％的过硫酸铵和80μL TEMED，摇匀后注入电泳板中，凝固1个小时，置于恒电压60W在50×38cm的BIO-RAD电泳仪上电泳1.5-2小时，取下玻璃板放入1L 10％的乙酸中固定30min，用纯水水洗2次，每次5min，放入1L加有1.5ml甲醛的0.1％AgNO3中染色30min，再用纯水水洗30s，放入1L在4℃冰箱中预冷12小时以上的3％Na2CO3(30g/L)中显色，该1L 3％Na2CO3在显色前提前加入1.5ml甲醛和200μL 1％Na2S2O3并混匀，至条带完全显出时捞出玻璃板快速在纯水中洗一下，然后放入1L 10％的乙酸中终止10min，捞出用纯水洗一下，置于空气中晾干。以显性标记的方式记录所有差异条带。
其中，10×TBE配制方法为Tris base 108g，硼酸55g，EDTA7.44g，加水至1升溶解后稀释使用；4％聚丙烯酰胺凝胶配制方法为38g丙烯酰胺+2g N，N甲叉双丙烯酰胺+420g尿素+100ml 10×TBE，加水至1升溶解后使用；10％的过硫酸铵配制方法为称1g过硫酸铵加水至10ml溶解后使用；10％的乙酸配制方法为100ml乙酸溶于900ml水混匀后使用；0.1％的AgNO3配制方法为1g AgNO3溶于1L水，彻底溶解后使用；1％ Na2S2O3配制方法为10g Na2S2O3溶于1L水，彻底溶解后使用。
电泳结果表明，该72种引物组合在中棉所36和海7124中得到了212个ISAP标记(ISAP条带)，如图1所示，其中引物组合F1R2在中棉所36和海7124中得到了6个特异性条带，这6个特异性条带分别命名为F1R2a、F1R2b、F1R2c、F1R2d、F1R2e、F1R2f；引物组合F3R5在中棉所36和海7124中得到了7个特异性条带，这7个特异性条带分别命名为F3R5a、F3R5b、F3R5c、F3R5d、F3R5e、F3R5f、F3R5g；引物组合F4R1在中棉所36和海7124中得到了7个特异性条带，这7个条带分别命名为F4R1a、F4R1b、F4R1c、F4R1d、F4R1e、F4R1f、F4R1g；引物组合F7R4在中棉所36和海7124中得到了6个特异性条带，这6个条带分别命名为F7R4a、F7R4b、F7R4c、F7R4d、F7R4e、F7R4f。图1中每个引物组合下面有3个泳道，第一个泳道为中棉所36，第二个泳道为海7124，第三个泳道为两亲本的杂交种F1。
分别以棉花品种中棉所36和海7124的基因组DNA为模板，以me1-me9中任一个正向引物和em1-em17中的任一个反向引物配对得到的153种引物组合按照上述方法进行PCR扩增和电泳，结果在中棉所36和海7124中得到了138个相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)标记(SRAP条带)。其中，正、反向引物序列如下me1TGAGTCCAAACCGGATAme2TGAGTCCAAACCGGAGCme3TGAGTCCAAACCGGAATme4TGAGTCCAAACCGGACCme5TGAGTCCAAACCGGAAGme6TGAGTCCAAACCGGTAGme7TGAGTCCAAACCGGTTGme8TGAGTCCAAACCGGTGTme9TGAGTCCAAACCGGTCAem1GACTGCGTACGAATTAATem2GACTGCGTACGAATTTGCem3GACTGCGTACGAATTGACem4GACTGCGTACGAATTTGAem5GACTGCGTACGAATTAACem6GACTGCGTACGAATTGCAem7GACTGCGTACGAATTATG
em8GACTGCGTACGAATTAGCem9GACTGCGTACGAATTACGem10GACTGCGTACGAATTTAGem11GACTGCGTACGAATTTCGem12GACTGCGTACGAATTGTCem13GACTGCGTACGAATTGGTem14GACTGCGTACGAATTCAGem15GACTGCGTACGAATTCTGem16GACTGCGTACGAATTCGGem17GACTGCGTACGAATTCCA。
采用中棉所36和海7124构建一个包含69个单株的F2群体，使用Mapmaker软件使上述138个ISAP标记和138个相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplified polymorphism，SRAP)标记一起构建了32个连锁群(LG1至LG32)，最短的5.2cM，最长的179.3cM，最多的含有32个标记，最少的含有2个标记，平均每个连锁群长度为6.81cM.图谱总长度为2179.4cM，占基因组总长的46.8％(图2A和图2B)。标记平均距离为8.9cM。ISAP标记和SRAP标记在32个群体上分布比较均匀，没有明显的差异。图2A和图2B中，ISAP分子标记(名称以字母“F”开头)是由ISAP正向引物(分子标记名称中的前两位为相应的正向引物名称)和反向引物(分子标记名称中的第三位和第四位为相应的正向引物名称)扩增得到的多态性条带，分子标记名称中最后一位的a、b、c、d、e、f、g、h分别表示由该引物组合得到的不同多态性条带；SRAP标记(名称以字母“M”开头)是由SRAP正向引物和反向引物扩增得到的多态性条带，分子标记名称中的前两位为相应的正向引物名称，其中的M表示me，分子标记名称中最后一位的a、b、c、d、e、f、g、h分别表示由该引物组合得到的不同多态性条带，其余位表示反向引物的名称，E表示em；如M6E16a表示由em6和me16组成的引物组合得到的一个SRAP标记。
实施例2、ISAP分子标记在各种植物中的应用采用引物组合F1R2、F4R1、F3R5扩增来自8种植物的DNA，包括小麦，玉米，辣椒，烟草，花生，高梁，吊兰，一串红。在每种植物中ISAP引物F1R2、F4R1、F3R5均能扩增出条带，且在不同品种中显示较好的多态性(图3A、图3B和图3C)。图3A和图3B和图3C中，1-8为小麦(1-8依次为科农199，良基99，邯7086，周98100，汶农6号，烟2070，衡4338，科麦1号)，9-12为玉米(依次为东农250，中单9409，农大108，京玉7号)，13-15为辣椒(羊角椒，天鹰椒，农蕾2号)，16为烟草，17为花生，18为高梁，19为吊兰，20为一串红。图3A和图3B和图3C中，所标的条带大小的单位是bp。
序列表<160>17<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1cgatataagc aaaggtaa<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gcatgaatgc aaaggtaa<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3atggaactcg caaggtaa<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4acgaagatgg aaaggtaa<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5tagccggtat caaggtaa<210>6<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>6cgtccgatga aaaggtaa<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7atcagctgct gcaggtaa<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8agccgtttat acaggtaa<210>9
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>9catctcactt tcaggtaa<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10ctgcaattaa gcaagaac<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11ctgcaatgta gacccatt
<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12ctgcaacaag atctcaga<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>13ctgcaagtga gaacaccc<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14
ctgcaaaatt caatagtt<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>15ctgcaaatgt taaaccca<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16ctgcaagggt taaccagt<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>17ctgcaataac gcaacatg
权利要求
1.获得植物内含子序列扩增多态性的专用引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物和反向引物均由18个核苷酸组成，正向引物的核苷酸序列为5′-NNNNNNNNNNNMAGGTAA-3′，反向引物的核苷酸序列为5′-CTGCAANNNNNNNNNNNN-3′，其中N为A、T、C和G中的任一种碱基，M为A或C。
2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于所述反向引物中自5′端第7位至13位碱基中至少有4个碱基是嘌呤。
3.根据权利要求1或2所述的专用引物，其特征在于所述专用引物从目标物种的BAC库中筛选，查找符合下述规律的内含子前端为GT且GT前为AAG或CAG，GT后为AA；后端为AG，AG前为TTGC且此4碱基前的7个碱基中至少包含4个嘧啶；选取符合此种规律，在MAGGTAA前截取11个碱基连同MAGGTAA一起以5′-NNNNNNNNNNNMAGGTAA-3′作为正向引物，在TTGCAG前截取12个碱基连同TTGCAG一起反向转录并将反向转录后的18个碱基以5′-CTGCAANNNNNNNNNNNN-3′作为反向引物。
4.根据权利要求1或2或3所述的专用引物，其特征在于所述专用引物的正向引物具有序列表中序列3的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列14的核苷酸序列。
5.根据权利要求1或2或3所述的专用引物，其特征在于所述专用引物的正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列11的核苷酸序列1。
6.根据权利要求1或2或3所述的专用引物，其特征在于所述专用引物的正向引物具有序列表中序列4的核苷酸序列，反向引物具有序列表中序列10的核苷酸序列。
7.一种获得植物内含子序列扩增多态性的方法，是以待测植物品种的基因组DNA为模板，利用权利要求1至5中任一权利要求所述的至少一种专用引物进行PCR，将得到的PCR产物进行电泳、显色和条带统计，得到待测植物品种间的内含子序列扩增多态性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述电泳为4％聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述电泳的电泳缓冲液为1×TBE，电泳电压为恒电压60W，电泳时间为1.5-2小时。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述显色方法为电泳后取下凝胶置于10％的乙酸中固定30min后水洗，然后置于0.1％的AgNO3和0.15％的甲醛下染色30min，水洗30s，置于4℃的含有3％Na2CO3、0.15％甲醛和0.0002％Na2S2O3的溶液中直到条带完全显出为止。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述条带统计方法为所有条带均以显性标记记录。
全文摘要
本发明公开了一种获得植物内含子序列扩增多态性的方法及其专用引物。获得植物内含子序列扩增多态性的专用引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物和反向引物均由18个核苷酸组成，正向引物的核苷酸序列为5′－NNNNNNNNNNNMAGGTAA－3′，反向引物的核苷酸序列为5′－CTGCAANNNNNNNNNNNN－3′，其中N为A、T、C和G中的任一种碱基，M为A或C。本发明的专用引物能产生多态性位点，开发合成费用低廉，设计程序非常简单，而且正向引物可以与反向引物相互组合，这大大增加了专用引物的数目，减少了合成正向引物或反向引物的数目，降低了合成费用；本发明的获得植物内含子序列扩增多态性的方法简单方便，采用PCR扩增产物电泳而无须繁琐步骤和放射性探针，简单方便且减轻了工作量。
文档编号C07H21/04GK1884525SQ20061008966
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月10日 优先权日2006年7月10日
发明者喻树迅, 陆才瑞, 范术丽, 宋美珍, 马淑娟 申请人:中国农业科学院棉花研究所