专利名称：一种透明颤菌血红蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种透明颤菌血红蛋白基因及其应用。
背景技术：
生物体内存在着一种O2结合蛋白即血红蛋白。血红蛋白现在已经在细菌、酵母、植物和动物中都有发现。诸多血红蛋白都有其共同的特点血红蛋白是一种结合蛋白，由珠蛋白和血红素构成。血红素由原卟啉与亚铁原子组成，每一个珠蛋白分子有4条肽链，每个肽链各结合一个辅基即血红素，O2即结合于Fe2+上，血红蛋白与氧疏松结合形成氧合血红蛋白(HbO2)，这种氧合作用于氧分压高时容易进行，于氧分压低时易于解离。红细胞结合和携带O2的过程并不影响二价铁离子，不会使其氧化为三价铁离子；Fe3+无带O2能力，只见于异常的高铁血红蛋白。Magnolo等人在天蓝链霉菌中表达了透明颤菌血红蛋白(VHb)，结果表明将VHb引入好氧的工业微生物中能够使其更有效的利用氧，降低能耗，促进生长，增加产品产量。王清路等人将VHb和腈水解酶基因在毕赤酵母中做了研究，其研究发现，VHb基因能够在酵母中高效表达，摇瓶发酵实验证明，血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和腈水解酶基因表达。
甲醇酵母是近几年逐渐发展起来的一类作为细胞工厂表达外源基因，特别是真核生物基因的理想宿主，其中多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)是当前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统。多形汉逊酵母的最适生长温度高，生长速率快，利于大规模发酵生产，可以高效表达许多在其它系统中难以高效表达的基因。由于多形汉逊酵母能够按一定的基因剂量比分步整合多个基因，重组菌可按最佳的比例表达所需的基因，这在其它甲醇酵母中未见报道。多形汉逊酵母具有遗传操作简单、外源基因拷贝数高、外源蛋白产量高、易于工业化生产等优点，是一个优于大肠杆菌和其它酵母的外源基因表达系统，已得到广泛关注。尤其是在分泌型表达中，外源蛋白通过分泌途径可完成蛋白水解成熟、糖基化修饰和二硫键形成等翻译后加工过程，使所表达的蛋白更接近具有生物学活性的天然蛋白形式。
多形汉逊酵母为高好氧微生物，在发酵过程中常常会出现因供氧不足而限制细胞生长和外源基因的表达等情况。透明颤菌血红蛋白是一种类似于人血红蛋白的胞内可溶物质，它能够从分子水平上提高工程菌对氧气的利用能力。基于此特性，到目前为止，透明颤菌血红蛋白已经在青霉素酰化酶及PHB等多种生化产品的发酵过程中成功应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种透明颤菌血红蛋白基因及其应用。
本发明所提供的透明颤菌血红蛋白基因，名称为Hb，可具有下述核苷酸序列之一×1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
其中，序列表中的序列1由466个脱氧核苷酸组成，自5′端第3-458位脱氧核苷酸为编码序列。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
含有本发明基因的表达载体具体可为pHMOXZR25S-Hb或pHFMDZR25S-Hb；所述pHMOXZR25S-Hb是将序列表中序列1的DNA序列插入到如图5所示的pHMOXZR25SA-M的多克隆位点得到的。所述pHFMDZR25S-Hb是将序列表中序列1的DNA序列插入到如图4所示的pHFMDZR25SA-M表达载体的多克隆位点得到的。
本发明的透明颤菌血红蛋白基因是根据汉逊酵母密码子偏爱性设计人工合成的基因。在实际应用中，可通过多形汉逊酵母表达载体pHFMDZR25S-Hb或pHMOXZR25S-Hb将本发明的重组透明颤菌血红蛋白基因，通过电穿孔的方法导入含有外源目的基因的多形汉逊酵母工程菌中，使多形汉逊酵母工程菌在贫氧情况下高效表达外源基因。
实验表明，含有本发明的透明颤菌血红蛋白基因的多形汉逊酵母工程菌，在贫氧情况下能够正常生长和表达目的基因，提高了氧的利用率，避免在发酵过程中用供纯氧来保持多形汉逊酵母对氧的需求，最终提高了表达量，并解决了在生产过程中易燃品甲醇和纯氧同时使用的安全性问题。
图1为透明颤菌血红蛋白基因Hb的合成方案示意2为多形汉逊酵母表达载体pHFMDZRA-M结构3为多形汉逊酵母表达载体pHMOXZRA-M结构4为多形汉逊酵母表达载体pHFMDZR25SA-M结构5为多形汉逊酵母表达载体pHMOXZR25SA-M结构图具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所述百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因Hb的获得根据GenBank号为AY278200的透明颤菌血红蛋白基因序列和汉逊酵母密码子偏爱性，对透明颤菌血红蛋白基因进行优化，设计具有多形汉逊酵母偏爱密码子的重组透明颤菌血红蛋白基因，然后利用PCR的方法进行人工合成多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因。引物序列如表1所示。
表1.PCR合成多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因的引物序列
多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因Hb的合成方案如图1所示。首先将该条序列分为两个部分。将所有引物制成50pmol/L的溶液。取HF2，HF3，HF4和HR1，HR2，HR3各2μl，混匀后，加198μl灭菌双蒸水稀释到100倍，取1μl HF1和HR4作为PCR反应的上下游引物，取稀释100倍的HF2，HF3，HF4和HR1，HR2，HR3各1μl作为反应的模板加入下述PCR反应体系中(50μl，冰上操作)HF1(50pmol/L)1μl，HR4(50pmol/L)1μl，100×稀释的引物(HF2，HF3，HF4和HR1，HR2，HR3)各1μl，10mmol/L dNTP 1μl，10×PCR反应buffer 5μl，Pfu DNA PCRsystem聚合酶2U，加灭菌dd H2O至50μl。
PCR反应程序为先94℃预变性3min；然后94℃变性30S，55℃退火45sec，72℃延伸30S，30循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增后的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段，得到纯化的F1片段(Hb-fragment1)，回收好的片段溶于30μl elution baffer中。
取HF6，HF7和HR5，HR6各2μl，混匀后，加198μl灭菌双蒸水稀释到100倍，取1μl HF5和HR7作为PCR反应得上下游引物，取稀释100倍的HF6，HF7和HR5，HR6各1μl作为反应的模板加入下述PCR反应体系中(50μl，冰上操作)HF5(50pmol/L)1μl，HR7(50pmol/L)1μl，100倍稀释的引物(HF6，HF7和HR5，HR6)各1μl，dNTP(10mmol/L)1μl，10×PCR反应buffer 5μl，Pfu DNAPCR system聚合酶2U，加灭菌dd H2O至50μl。
PCR反应程序为先94℃预变性3min；然后94℃变性30S，55℃退火45sec，72℃延伸30S，30循环；最后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段，得到纯化的F2片段(Hb-fragment2)，回收好的片段溶于30μl elutionbaffer中。
再设计如下反应扩增F1+F2片段取回收的F1和F2各1μl，混匀后，再稀释10×，然后从10×稀释中取1μl作为模板加入下述PCR反应体系中(50μl，冰上操作)HF1(50pmol/L)1μl，HR7(50pmol/L)1μl，10倍稀释的F1和F2各1μl，dNTP(10mmlo/L)1μl，ExTaqDNA PCR system聚合酶，2μl，10×PCR buffer 5μl，定容至50μl。混匀后，进行PCR反应(先94℃预变性3min；再94℃变性30s，55℃退火，72℃延伸60s，30cycles；最后72℃延伸10min)，扩增得到的产物1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段，将其溶于50μl灭菌dd H2O中。得到的产物即为多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因，将其命名为Hb，回收后与pMD18-T载体连接，测序，表明多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因Hb具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列1的5′端第3-458为核苷酸为编码序列，将含有Hb的pMD18-T载体命名为pMD18T-Hb，该Hb基因编码透明颤菌血红蛋白(GenBank号AY278200)。
实施例2、含有重组透明颤菌血红蛋白基因表达载体的构建和工程菌的获得1、FMD启动子载体和MOX启动子载体的构建对pHFMDZA和pHMOXZA(pHFMDZA和pHMOXZA的构建过程件见文献Houhui Song，Yong Li，Weihuan Fang，Yunfeng Geng，Xu Wang，Min Wang，BingshengQiu，Development of a set of expression vectors in Hansenula polymorpha，Biotechnology Letters，Volume 25，Issue 23，Dec 2003，Pages 1999-2006)进行改造得到新的FMD启动子载体pHFMDZR25SA-M和MOX启动子载体pHMOXZR25SA-M，该两个载体含有自主复制序列，HARS(序列2)25SrDNA(序列3)，这两个原件可以提高目的基因的拷贝数。将pHFMDZA和pHMOXZA的终止序列AOX-TT分别替换成为FMD-TT序列(序列4)和MOX-TT序列(序列5)。
pHFMDZR25SA-M和pHMOXZR25SA-M在电穿孔转化酵母的过程中不用线性化，可以用质粒直接进行电穿孔转化。构建的方法如下1)设计引物(表2)从汉逊酵母基因组扩增HARS、25SrDNA、FMD-TT和MOX-TT序列表2.扩增HARS、25SrDNA、FMD-TT和MOX-TT序列的引物序列
以表1中HARS上下游引物(HARS-up和HARS-down)、25S上下游引物(25S-up和25S-down)、FMD-TT上下游引物(FMD-TT-up和FMD-TT-down)和MOX-TT上下游引物(MOX-TT-up和MOX-TT-down)，用汉逊酵母基因组作为模板，分别扩增HARS、25SrDNA、FMD-TT和MOX-TT序列。扩增的程序为先94℃ 5min加热变性后，然后94℃ 1min，56℃ 45sec，72℃，1min，30个循环后再72℃延伸10min。反应体系为50ul。扩增得到的目的片段进行电泳后割胶回收后再根据设计的双酶切位点(表2中所示)进行双酶切，酶切之后再割胶回收备用，得到了目的片段分别为512bp的HARS、2807bp的25SrDNA、556bp的FMD-TT和382bp的MOX-TT。将pHFMDZA(HouhuiSong，Yong Li，Weihuan Fang，Yunfeng Geng，Xu Wang，Min Wang，Bingsheng Qiu，Development of a set of expression vectors in Hansenulapolymorpha，Biotechnology Letters，Volume 25，Issue 23，Dec 2003，Pages 1999-2006)用XbalI和BamHI双酶切后电泳后割胶回收3035bp的大片段，回收的产物与用XbalI和BamHI双酶切后的FMD-TT PCR产物进行连接，再将连接产物转化大肠杆菌，利用抗性(zeocin)培养基进行筛选，用FMD-TT上下游引物进行PCR鉴定阳性克隆，把经PCR鉴定表明含有FMD-TT的pHFMDZA载体命名为pHFMDZA-M，将pHFMDZA-M用BglII单酶切，电泳后回收线性化的酶切产物，将其与HARS PCR产物用BglII和BamHI双酶切后的产物进行同尾酶连接，这样连接后原来HARS引物上的BamHI位点被破坏掉，只剩下BglII位点，再将连接产物转化大肠杆菌，在抗性培养基上培养，利用HARS引物鉴定阳性克隆，把鉴定表明含有HARS的pHFMDZA-M载体命名为pHFMDZRA-M(图2)，得到的阳性克隆再进行BglII单酶切，电泳后回收线化的酶切产物，将其与用BglII和BamHI双酶切25SrDNA的PCR产物进行连接，将连接后的产物同样转化大肠杆菌，在抗性培养基上培养，利用25SrDNA上下游引物鉴定阳性克隆，把鉴定表明含有25SrDNA的pHFMDZRA-M载体命名为pHFMDZR25SA-M(图4)。MOX启动子载体的构建过程同上述载体的构建过程，将XbalI和BamHI双酶切MOX-TT终止子的PCR产物，将其连接到XbalI和BamHI双酶切过下的pHMOXZA(Houhui Song，Yong Li，Weihuan Fang，Yunfeng Geng，Xu Wang，MinWang，Bingsheng Qiu，Development of a set of expression vectors in Hansenulapolymorpha，Biotechnology Letters，Volume 25，Issue 23，Dec 2003，Pages 1999-2006)上，把含有MOX-TT的载体命名为pHMOXZA-M，将pHMOXZA-M用BglII单酶切，电泳后回收线性化的酶切产物，将其与HARS PCR产物用BglII和BamHI双酶切后的产物进行同尾酶连接，这样连接后原来HARS引物上的BamHI位点被破坏掉，只剩下BglII位点，再将连接产物转化大肠杆菌，在抗性培养基上培养，利用HARS引物鉴定阳性克隆，把鉴定表明含有HARS的pHMOXZA-M载体命名为pHMOXZRA-M(图3)，得到的阳性克隆再进行BglII单酶切，电泳后回收线化的酶切产物，将其与用BglII和BamHI双酶切25SrDNA的PCR产物进行连接，将连接后的产物同样转化大肠杆菌，在抗性培养基上培养，利用25SrDNA上下游引物鉴定阳性克隆，把鉴定表明含有25SrDNA的pHMOXZRA-M载体命名为pHMOXZR25SA-M(图5)。
为了连接方便，再通过PCR扩增，在重组透明颤菌血红蛋白基因的5′端加上了EcoRI酶切位点，3’端加上了NotI酶切位点，所用合成基因引物序列见表1，因为原来的合成基因的引物序列特别长，这样不方便鉴定重组子，所以设计了鉴定引物其序列为Hb-EcoRIgaattcatggaccaacaaactattaacattatt(EcoRI)，Hb-NotIgcggccgctcagtggtggtggtggtggtgctca(NotI)以pMD18T-Hb为模板，进行PCR扩增。其PCR扩增体系为50μl，扩增程序为先94℃ 5min；然后94℃ 1min，56℃ 45sec，72℃，1min，30个循环后再72℃延伸10min。PCR扩增得到5‘端加上了EcoRI酶切位点，3’端加上了NotI酶切位点的Hb。将该片段用EcoRI和NotI酶切后，分别插入到pHMOXZR25SA-M(图5)和pHFMDZR25SA-M表达载体(图4)的EcoRI和NotI酶识别位点之间。把经过测序表明含有Hb的pHMOXZR25SA-M命名为pHMOXZR25S-Hb；把经过测序表明含有Hb的pHFMDZR25SA-M命名为pHFMDZR25S-Hb。
2.pHFMDZR25S-Hb在多形汉逊酵母的表达将pHFMDZR25S-Hb用电穿孔转化法转化多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)AS2.2412(购自中国科学院微生物所菌种保藏室)，该电穿孔转化法是发明人对(Faber，Haima et al.，1994)的改进，即避免了电击过程中的短路现象又提高了转化效率(转化率高达106)。具体步骤如下挑多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)AS2.2412(购自中国科学院微生物所菌种保藏中心)单克隆于5ml YPD液体培养基中，37℃培养过夜，取2ml菌液加入200ml预温至37℃的YPD中，37℃培养至OD600＝1.2-1.5之间(约6h)。室温6000rpm离心5min，弃上清，用500mlTED(100mmol/L Tris-HCl；50mM EDTA；25mmol/L DTT，pH＝8.0)悬浮细胞。在37℃摇床，200rpm摇15min，4℃ 6000rpm，离心，5min，弃上清，用200ml预冷的270mmol/L的蔗糖轻轻悬浮细胞，4℃ 6000rpm，离心，5min，弃上清，用100ml预冷的270mmol/L的蔗糖轻轻悬浮细胞，4℃ 6000rpm，离心，5min，弃上清，用1ml预冷的270mmol/L的蔗糖轻轻悬浮细胞，分装成100μl/管，-80℃保存，在100μl的感受态细胞中加入10μl质粒DNA(pHFMDZR25S-Hb或pHMOXZR25S-Hb)，轻轻混匀后加入2mm孔径的电击杯中，电击参数50uF，100Ω，1.5KV，电击后立即加入940μl的YPDTM(1％酵母提取物；1％蛋白胨；2％葡萄糖；1mmol/L MgCL2)，吸取至2-5ml的小管中，37℃摇床，200rpm培养1h。取100μl涂于含有Zeocin抗生素(终浓度100ug/ml)的YPD平板，37℃培养2-3天，平板上出现大小不一的克隆，挑取单克隆利用引物Hb-EcoRI和Hb-NotI进行PCR鉴定重组子，将经鉴定表明含有pHFMDZR25S-Hb的转化子命名为ASpHFMDZR25S-Hb，含有pHMOXZR25S-Hb的转化子命名为ASpHMOXZR25S-Hb。
3、转多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因工程菌抗贫氧活性检测
1)多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因对其工程菌的生物量的影响将ASpHFMDZR25S-Hb、ASpHMOXZR25S-Hb和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)AS2.2412(对照)分别用三只分别装有25ml、50ml、100ml YPD培养基的250ml三角瓶进行发酵，接种量均为5％(体积比)，每天分两次加入0.5％(体积比)的甲醇诱导，共诱导四天即96小时。取发酵液10ul稀释100倍后，用YPD培养基作为对照，测定对照组、ASpHMOXZR25S-Hb组和ASpHFMDZR25S-Hb组的OD600吸收值。结果如下表3.对照组、ASpHMOXZR25S-Hb组和ASpHFMDZR25S-Hb组培养生物量检测
从生物量参数检测可以看出，在25ml和50ml，100ml的三角瓶中对照组、ASpHMOXZR25S-Hb组和ASpHFMDZR25S-Hb组的生物量基本差距不大，所以在比较重组透明颤菌血红蛋白是否起到作用只需要看三者表达量的区别即可。这里可以看出重组透明颤菌血红蛋白对生物量影响不大。
2)多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因Hb对外源基因表达的影响将含有乙肝表面抗原基因的工程菌(按照专利申请号为200410047904.6的说明书中实施例2的方法获得的转入乙肝表面抗原分泌表达载体pHFMDHZ-R-HBsAgHan(200410047904.6)的多形汉逊酵母AS2.2497转化子)作为受体菌，将pHFMDZR25S-Hb或pHMOXZR25S-Hb转入受体菌，使重组透明颤菌血红蛋白和乙肝表面抗原在多形汉逊酵母AS2.2497中共表达，以转入乙肝表面抗原分泌表达载体pHFMDHZ-R-HBsAgHan(200410047904.6)的多形汉逊酵母AS2.2497转化子作为对照。按照如下方法检测多形汉逊酵母偏爱透明颤菌血红蛋白基因Hb对外源基因表达的影响用250ml装有YPD培养液(含1.5％(体积比)甘油，pH5.0)的三角瓶进行发酵，三角瓶的装液量分别为25ml，50ml，100ml，接种量均为5％，每天分两次加入0.5％(体积比)的甲醇诱导，共诱导四天即96小时。对照组也用相同的处理方法。因为所用的外源基因工程菌为分泌型乙肝表面抗原工程菌，表达产物在培养液中，直接用20μl上清液作检测，通过ELSA检测乙肝表面抗原基因的表达量来体现重组透明颤菌血红蛋白对酵母发酵的影响。ELISA检测中，用乙肝表面抗原检测试剂盒检测乙肝表面抗原的表达情况(乙肝表面抗原试剂盒购买于华美生物工程公司)用酶标仪测定450nm处的吸光值(OD450)。结果如表4所示，表明在装有25ml和50ml培养基的三角瓶中转pHFMDZR25S-Hb或pHMOXZR25S-Hb的受体菌和对照的乙肝表面抗原表达量没有很大的差异，该结果是由于25ml和50ml的装样量对于250ml的三角瓶来说，它的氧的含量足够多形汉逊酵母生长所用，所以没有影响到乙肝表面抗原的表达量。而100ml装样量对于250ml的三角瓶来说通气量不够，不能满足多形汉逊酵母在生长过程中氧的需要量，影响了乙肝表面抗原的表达；在装100ml培养基的250ml三角瓶中，转pHFMDZR25S-Hb的受体菌乙肝表面抗原ELISA检测结果为OD450＝1.592，转pHMOXZR25S-Hb的受体菌乙肝表面抗原ELISA检测结果为OD450＝1.621，对照组为OD450＝0.164，吸收值差10倍。说明本发明的Hb基因在贫氧情况下能够提高多形汉逊酵母工程菌对氧的利用率。
表4.Hb对外源基因表达的影响检测结果
序列表<160>5<210>1<211>466<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ccatggacca acaaactatt aacattatta aggctactgt tccagttttg aaggagcacg 60gtgttactat tactactact ttctacaaga acttgttcgc taagcaccca gaggttagac 120cattgttcga catgggtaga caagagtctt tggagcaacc aaaggctttg gctatgactg 180ttttggctgc tgctcaaaac attgagaact tgccagctat tttgccagct gttaagaaga 240ttgctgttaa gcactgtcaa gctggtgttg ctgctgctca ctacccaatt gttggtcaag 300agttgttggg tgctattaag gaggttttgg gtgacgctgc tactgacgac attttggacg 360cttggggtaa ggcttacggt gttattgctg acgttttcat tcaagttgag gctgacttgt 420acgctcaagc tgttgagcac caccaccacc accactgagc ggccgc 466<210>2<211>512<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gtcgacgaac ccgcgtttga gtacttgctc aagctttctg gtagacgttg tagtactcat 60gaaacaagcc ttagcactct gatctgtttc tcttgggtag cggtgagtgg tttattggag 120ttcactggtt tcagcaaatc tgtcatctag acaatattgt tactaaattt ttttgaacat 180
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<223>
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1.一种透明颤菌血红蛋白基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为pHMOXZR25S-Hb；所述pHMOXZR25S-Hb是将序列表中序列1的DNA序列插入到如图5所示的pHMOXZR25SA-M的多克隆位点得到的。
4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为pHFMDZR25S-Hb；所述pHFMDZR25S-Hb是将序列表中序列1的DNA序列插入到如图4所示的pHFMDZR25SA-M表达载体的多克隆位点得到的。
5.含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求1所述基因的宿主菌。
7.根据权利要求6所述的宿主菌，其特征在于所述宿主菌为多形汉逊酵母。
8.根据权利要求7所述的宿主菌，其特征在于所述多形汉逊酵母为多形汉逊酵母AS2.2412或AS2.2497。
9.权利要求1所述的基因在提高多形汉逊酵母工程菌在贫氧状况下表达目的基因的效率中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述目的基因为乙肝表面抗原基因。
全文摘要
本发明公开了一种透明颤菌血红蛋白基因及其应用。该基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。含有本发明的透明颤菌血红蛋白基因的多形汉逊酵母工程菌，在贫氧情况下能够正常生长和表达目的基因的，提高了氧的利用率，避免在发酵过程中用供纯氧来保持多形汉逊酵母对氧的需求，最终提高了表达量，并解决了在生产过程中易燃品甲醇和纯氧同时使用的安全性问题。
文档编号C07K14/805GK1884533SQ20061008930
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月16日 优先权日2006年6月16日
发明者邱并生, 牛振东 申请人:中国科学院微生物研究所