专利名称：：用于体外蛋白质折叠的方法和系统的制作方法
技术领域：
：本发明处于蛋白质化学的一般领域中。更具体地，本发明涉及用于再折叠(refolding)通过重组技术产生的蛋白质的方法和系统。2.相关技术重组蛋白质的典型的商业生产方案涉及转化细胞，通常细菌细胞，如大肠杆菌(￡.co/z),以产生通常为哺乳动物来源的外源产物。将编码所述蛋白质的基因插入到宿主细胞中并通过正常的细胞介导的产生翻译成对应的蛋白质。然而，细菌宿主细胞可能不能正确折叠这种重组蛋白质，因为它缺乏哺乳动物细胞中存在的环境和细胞器来进行这种折叠。结果，细胞可能产生未折叠或者不正确折叠蛋白质的团聚体。当以高浓度产生时，未折叠和部分折叠的蛋白质可能开始形成不溶性团聚体或者称作包含体的团聚的、不溶性实体。这些团聚体聚集在周质空间中并且有时候可以占细菌细胞总蛋白质50%以上。包含体的大部分由目的蛋白质组成(有时产生超过90%的纯化蛋白质)，使得它已经是高度纯化的，小分子、宿主细月包蛋白质和核酸组成包含体的剩余部分。尽管有通常发生的错折叠，在大肠杆菌细胞而不是哺乳动物细胞中产生重组蛋白的优点是细菌细胞容易得到，生长更快并且可以过量产生目的蛋白质。它们也不能藏匿可以在哺乳动物细胞中发现的某些病毒。于是，已经尝试从大肠杆菌纯化和再折叠蛋白质，从而使得产品更经济和对于人体注射更安全。例如，从团聚体或者包含体分离蛋白质后，纯化蛋白质的第一步是将其用强盐浓度，例如，6M盐酸胍(GuHCL)或8M尿素溶解。两种盐都是离液剂，它们通过破坏将包含体维持在一起的氲键和疏水相互作用而4吏蛋白溶解和解3斤叠。参见，例长口，Ladisch,MichaelR,BioseparationsEngineering:Principles,PracticeandEconomics(2001)JohnWileyandSons,Inc.,118-123。此外，可能需要还原试剂如二石危苏糖醇、半胱氨酸或者卩-巯基乙醇破坏在蛋白质的产生中错误连接的二硫键。随后用再折叠緩冲液(可能含有环氧改组试剂以帮助二硫键形成)稀释或者透析解折叠的蛋白质溶液以减小变性剂浓度，使得蛋白质能用它的固有化学结构再折叠。在再折叠步骤中产物损失的主要途径是团聚。当分离的蛋白质之间的吸引力比蛋白质和溶质之间的吸引力更有利时，发生团聚。随后有利的分子内残基-残基吸引(其帮助再折叠蛋白质成它的天然状态)与不利的分子间吸引力竟争，导致可溶的团聚体。这些可溶的团聚体然后积累并导致不溶性团聚体的沉淀。尽管团聚有时是可逆反应，但是试图再折叠团聚体是不希望的，因为这增加生产时间和成本。所以，一旦之前团聚或者聚集的蛋白质被溶解，通常避免进一步团聚。迄今为止，蛋白质再折叠和团聚的详细机理是复杂的并且仍有待讨论。已知再折叠不在一个步骤中发生；相反，随着变性剂被除去，蛋白质发生不连续的构象改变。在这些未折叠和折叠状态之间的中间构象下，再折叠、团聚或者错折叠(产物损失的另一途径)途径发生竟争。蛋白质的环境条件和固有的化学结构帮助指示哪个竟争途径将在再折叠期间占优势。通过改变蛋白质-溶质混合物的环境条件，包括蛋白质浓度、变性剂浓度和局部温度，已经进行了在再折叠期间避免团聚的尝试。例如，已经发现团聚反应的动力学在蛋白质浓度方面处于比折叠反应更高的级另'J(Kiefhaber,T.,Rudolph,R.,Kohler,H,H.,Buchner,J."ProteinAggregationinvivo:AQuantitativeModeloftheKineticCompetitionBetweenFoldingandAggregation."Sz'o/Tec/zwo/ogy,1991,9,825-829)。对于该反应，通常在相对于溶解度极限的稀释条件下进行再折叠。在此类条件下，分子相互作用的机会和吸引的可能性被减小。在实验上，蛋白质也显示出在中间变性剂浓度下，在再折叠期间倾向于团聚。当处于中间构象时，蛋白质可以具有暴露的区域，其具有在它的疏水残基处团聚的可能性，如上所述。如果变性剂除去或者减少太慢，那么再折叠可能失败。此外，对蛋白质的热胁迫将增加再折叠期间.蛋白质团聚的可能性。似乎对于许多蛋白质在低温下团聚反应被抑制，而对于报道在较高温度下再折叠的其他蛋白质，团聚可能不是重要的途径。该再折叠/团聚行为的机理还没有被最终建立。它可以是由于涉及蛋白质之间非极性表面屏蔽的疏水力的温度依赖性(参见，例如，Baldwin,R丄.Temperaturedependanceofthehydrophobicinteractioninproteinfolding.尸toc.A/〃.爿c^/.1986，83,8069-8072)或者倾向于团聚的中间体的另一单独的途径。从有关再折叠期间团聚的知识，浓缩的物质需要与稀释剂緩沖液快速混合以避免任何局部的高蛋白质浓度、高变性剂浓度和高温区域。当前的实验步骤涉及在无挡板槽中使用斜叶搅拌器(pitchedbladeimpellor)来快速混合浓缩形式的溶解蛋白质与稀释剂緩冲液。该类型的动力混合器是工业中用于剧烈混合的最常用装置。最初将混合器设置在以湍流速度搅拌以在稀释剂緩冲液中诱导涡流。然后对准该涡流或者直接对准高速搅拌器的滴管緩慢递送浓缩的蛋白质溶液。然而，已经证明按比例放大该机械混合器是有困难的。研究已经表明在混合不是湍流的低搅拌速度下，形成分离的混合区(Makino,T.,Ohmura,H.,Kataoka,K.ObservationofIsolatedMixingRegionsinaStirredVessel,Jow/-""/CTzemz.ca/￡Vzg/"ee">g2001,34「5」，574-578)。在这些区域中，蛋白质被过度浓缩并且有团聚的危险，如上所述。然后将以高湍流速度搅拌该溶液以避免在再折叠期间分离的混合区。然而，考虑到亚声速脉冲引起的大量的来自搅拌器的剪切力和叶片后缘附近局部的空泡形成，蛋白质可能随着该方法^f皮放大而经历更高的机械变性胁迫。参见，例如，Fennema,OR.1996.FoodChemistry.第三版.MarcelDekker,Inc.,NewYork.第6章。此外，高搅拌速率向该系统中产生高功率输入，从而可能通过功率损耗对所述蛋白质产生热变性胁迫。用于大规模产生蛋白质，尤其是重组蛋白质的改进的蛋白质再折叠方法，包括改进的混合方案将是所希望的。发明概述本发明通过提供再折叠蛋白质的方法解决了这些需要，所述方法包括静态混合变性蛋白质的浓缩溶液与再折叠稀释剂以得到与所述再折叠蛋白质的混合物。该方法尤其适于大规模加工体积，如30L或者以上，例如高达200或者1000或甚至10,000L中的樣i生物产生的重组蛋白质。通过从微生物宿主分离蛋白质并将它们暴露于变性剂中，可以得到变性蛋白质溶液。将该溶液在与所述蛋白质的正确折叠相容的混合条件下与合适的再折叠稀释剂混合，从而快速并且以高产率得到具有生物活性的再折叠蛋白质。本发明可具体用于大规模生产蛋白质，尤其是重组蛋白质。本发明还提供了适于实施本发明的蛋白质再折叠方法的系统。该系统包括静态混合器、与该静态混合器相配并且处于该静态混合器上游的导管，所述静态混合器上游导管的入口，和所述静态混合器下游的低剪切力动态混合容器。操作时，将再折叠稀释剂源递送到该静态混合器上游的导管，并且通过所述静态混合器上游的入口将浓缩的变性蛋白质来源递送到导管。静态混合后，使溶液保持在低剪切力动态混合容器中一段时间以优化方法产率。静态混合器包括导管中的一系列混合元件。所述混合元件可以是固定的或者可移动的，但是是无动力的(即，静态的)并且仅仅通过液流在它们上方的移动提供混合作用。当结合附图阅读下面本发明的详细描述时，本发明的这些和其他方面和特征将变得更充分地显而易见。附图简述图l是简化的示意图，其图解了本发明使用的静态混合器的主要特征。图2是框图，其图解了本发明用于从变性蛋白质溶液回收再折叠蛋白质的系统的主要特征。图3是流程图，其图解了本发明用于从变性蛋白质溶液回收再折叠蛋白质的方法。图4A是变性剂浓度对溶液中未折叠的蛋白质分数的代表图。图4B是对于动态和静态混合来说时间对混合蛋白质分数(混合行为和速率)的代表图。图5是时间对％活性的曲线图，图解了下面实施例2中描述的实验的结果。本发明具体实施方案描述现在将参考一些实施方案描述本发明的方法和系统。在正文结构中阐明了所述实施方案的重要性质和特征。尽管将结合这些实施方案描述本发明，但是应理解本发明无意被局限于这些实施方案。相反，它意在覆盖备选方案、修改和等同方案，这些可以被包括在如所述权利要求定义的本发明精神和范围内。在下面的描述中，给出了许多特定细节以便提供对本发明的完全理解。可以在缺乏这些具体细节的一些或者全部的情况下实施本发明。在其他实施方案中，为了不会不必要地使本发明晦涩难懂，没有详细描述公知的方法操作。引言本发明提供了回收再折叠蛋白质的方法，其通过静态混合变性蛋白质的浓缩溶液与再折叠稀释剂以得到与所述再折叠蛋白质的混合物。该方法尤其适于大的加工体积中通过微生物产生的重组蛋白质，如干扰素卩-lb,所述加工体积为诸如10L,30L或100L或者以上，如高达200L或1000L或甚至10,000L。通过从微生物宿主分离蛋白质并将它们暴露于变性剂，可以得到变性的蛋白质溶液。将该变性蛋白质溶液在与该蛋白质的正确折叠相容的静态混合条件下与合适的再折叠稀释剂混合，从而快速并且高产率地得到具有生物活性的再折叠蛋白质。本发明尤其可用于大规模生产再折叠蛋白质，尤其是重组蛋白质。本发明还提供了用于实施本发明的再折叠蛋白质回收方法的系统。该系统包括静态混合器，与该静态混合器连接并且位于其上游的导管，和所述静态混合器上游导管的入口。操作时，将再折叠稀释剂源递送到该静态混合器上游的导管，并且通过所述静态混合器上游的入口将浓缩的变性蛋白质源递送到导管。该静态混合器包括导管中的一系列混合元件。所述混合元件可以是固定的或者可移动的，但是是无动力的(即，静态的)并且仅仅通过液流在它们上方的移动提供混合作用。静态混合蛋白质混合是两种现象的偶联可能的易于团聚环境的局部面积的减小，和对该蛋白质的机械胁迫的增加。因而，当低度混合时，作用于蛋白质的剪切力低，但是蛋白质可能经历局部的高蛋白质浓度，允许它团聚。当高度混合时，来自环境的团聚可能性较低，但是作用于该蛋白质的机械胁迫高，可能破坏该蛋白质。存在机械混合的最佳水平，需要确定该水平以发现再折叠期间剪切力和易于团聚环境的局部面积之间的中点。本发明用静态混合为用于蛋白质折叠的有效混合的挑战提供了新方法。静态混合器是导管(例如，管)内的一系列几何元件，其被构造用来使用液体流动能量在流过混合器的两种或多种液体之间产生混合。那么，静态混合是仅使用液体流动能量来混合两种或多种流动液体的混合。几何混合元件可以是安装在静态混合器导管内材料的任何构造，其导致在所述元件上经过的液流的混合。所述元件通常是固定的，但是它们可以移动，只要所述元件的任何移动是由于在所述元件上待混合的液体的移动而不是外部动力源。优选的实例包括桨叶和螺旋。参考图1，典型的静态混合器100是管102和一组固定的螺旋元件104的组合，它分离液流然后通过温和涡旋混合所得到的液流。该系列事件在每个元件继续。通过主入口106和次入口108为混合器IOO提供待混合的液体，主入口106与混合器连接，通常用于较大体积液体，次入口108通过紧邻混合元件104上游的导管壁进入。混合温和但快速，避免了盐浓度、温度和蛋白质浓度的任何局部化。用于本发明系统的适合的静态混合器可以具有多种几何结构和构造，它们可以至少部分地取决于处理体积。对于30-200L范围内的体积，已经发现直径从小于％到高达2英寸的导管是可以接受的，例如，3/16英寸、3/4英寸、l英寸和2英寸。适合的静态混合器可以具有约2到20个混合元件，例如，6到12个混合元件，例如，6或12个元件。这些元件可以是固定的或者可移动的或者其组合。所述元件可以具有任何适合的形状和结构。在具体实施方案中，静态混合器具有6个或者12个固定的螺旋形元件。此类静态混合器可以从例如KofloCorporation,Cary，IL得到。如下文适当操作此类混合器用于蛋白质折叠应用最初的浓缩的蛋白质可以低至所希望的浓度，但是通常浓度为约10mg/ml变性剂并且可以更高，例如，高达约20mg/ml或者以上，只要保持可溶性。变性剂可以为例如约3-10M,如5M或8M,Gu-HCL或者尿素。浓缩的变性蛋白质溶液在静态混合器中被稀释至再折叠发生点。例如，可以进行IO、20、30或者60倍稀释。通常，再折叠稀释剂是緩冲液，所述蛋白质在其中是可溶的并且其促进该蛋白质的正确折叠。这可以是蛋白质特异的，尽管对于许多蛋白质来说已知适合的再折叠緩冲液，但是对于给定的蛋白质来说，可能需要一定程度的实验来确定用作再折叠稀释剂的合适緩冲液，这处于本领域技术人员的专业知识范围内。适合作为本发明的再折叠稀释剂的緩冲液的一些实例包括约5mM甘氨酸(pH约3)、约5mM磷酸(pH约2-3)和约2mM天冬氨酸(pH约4)。该方法的合适的温度范围为约2到30°C,例如约2-8°C,如4°C。当不存在蛋白质稳定性问题时，优选室温，使得不需要冷藏设备。选择混合物的流速使得静态混合器具有约200到7000的雷诺数(ReynoldsNumber)。该方法能够在小于1天内、或者小于1小时，例如小于30分钟或者小于5分钟内实现大于75%单体(或者至少80、85、90、95、97、98或99%)的产率。尽管不限制本发明，但是认为单体百分比与所述蛋白质进行与医学病症减轻相关的生物功能的能力相关，所述生物功能在本文中称作生物活性或者生物学上有活性的。在蛋白质再折叠中使用静态混合器可以通过两种机制在蛋白质折叠中减少团聚静态混合器快速并有效地混合液流以将浓缩的变性蛋白质快速稀释到再折叠稀释剂中。例如，适合的静态混合器可以一般在小于30分钟，例如约20-30分钟内混合30-200L流体；相比，动态混合这些大体积需要约6小时或者更长时间。因此，使用静态混合器，极大地降低了支持高团聚倾向种类(例如，熔球)的变性剂的瞬时浓度。阈值团聚浓度将随蛋白质而变。例如，对于卩干扰素，应该避免高于约0.2mg/ml的浓度口袋(例如，0.1mg/ml是可接受的)。对于TFPI,应该避免高于约2mg/ml的浓度。通常，优选尽可能高并且没有团聚问题风险的浓度以减小处理体积。而且，静态混合器比动态混合产生更低的蛋白质胁迫环境。对于搅拌的槽，蛋白质经历高剪切力的时间与规^^莫成比例，因为在向稀释剂中加入蛋白质整个期间，整体再折叠溶液被连续涡旋。随着该方法在搅拌槽中放大，蛋白质可以经历延长几分钟到几小时的胁迫。然而，在静态混合器中，蛋白质与稀释剂快速混合(通常在数秒内)，然后排出到低剪切混合容器中，产生较短的高速混合停留时间从而产生较低的胁迫。静态混合器的另一重要的优点是它在驱动该方法所需的功率中的效率。如以前陈述的，功率增加引起的不利影响是由于功率损耗而向该系统中加入了更大量的热。对于200L方法，对搅拌槽和静态混合器的能量需求进行比较。搅拌槽的典型的能量需要将为约2-5HP/1000gal(Rushton，J.H.,Costich,E.W.andEverett,H.J.PowerCharacteristicsofMixingImpeller,Part1,C7zewz'ca/5V7gz力ee〃力g尸rogress,1950,46,467),而静态混合器的能量需求为约0.005HP。可以4吏用等式3计算温度的相应改变等式3其中m为质量，Cp是比热，T是温度，t是时间。考虑20分钟处理时间，-假设所有功率都一皮转化成热并且液体净皮分离，我们发现△T扰拌容器0.22DC禾口△T静态混合器0。C。尽管这些潜在热效应当在槽上平均时非常小，但是在高速混合器附近产生局部加热效应，产生高温，其是处理中需要重点考虑的。为了放大该静态混合器，确定混合的数值是有用的并且通常是必要的。液体的混合依赖于混合区的特征长度尺度和混合种类的特征速度。在管中的大分子规模下，可以将混合区定义为管的长度并将速度定义为进入液体的流速。从而，如果我们保持流速和管的直径成比例，那么我们在放大时保持混合恒定。将速度和直径关联起来的常用的缩放因子是雷诺值。对于静态混合器，这通过等式l给予Re=^Z^等式i其中Q是流速(gal/min),S是比重，p是粘度(cP),D是管的内径。系统和方法图2是框图，图解了本发明用于从变性蛋白质溶液回收再折叠蛋白质的系统的主要特征。系统200包括静态混合器202。静态混合器202与导管(例如管)204连接，该导管通常具有与静态混合器相同的直径。导管204提供了该静态混合器的入口，用于两种液体中的较大体积在静态混合器中混合，在这种情况下较大体积液体为蛋白质稀释剂。静态混合器的第二个入口206为将要在静态混合器中混合的两种液体中的较小体积提供，在该情况中，较小体积液体为变性的蛋白质溶液。用于本发明系统的适合的静态混合.器可以具有多种几何结构和构造，它们可以至少部分地取决于处理体积。对于30-200L范围内的体积，已经发现具有从小于％到高达2英寸的导管是可以接受的，例如，3/16英寸、％英寸、l英寸和2英寸。适合的静态混合器可以具有约2到20个混合元件，例如，6到12个混合元件，例如，6或12个元件。这些元件可以是固定的或者可移动的或者其组合。所述元件可以具有任何合适的结构和形状。在具体实施方案中，静态混合器具有6个或者12个固定的螺旋形元件。静态混合器202输出至第二导管208,其通常是第一导管204的延长。第二导管208与动态混合容器210连接，从而通过静态混合器混合的蛋白质产物出口可以通过第二导管208输送到动态混合容器210以完成折叠过程。任选地，静态混合的蛋白质产物可以在传递到动态混合容器前，经由另一导管(管)通过静态混合器202再循环一次或多次。通常操作动态混合容器以避免剪切力诱导的蛋白损害。例如，动态混合可以是非湍流的。然后可以乂人动态混合容器210以大体积和高产率收集再折叠的蛋白质用于贮存或者包装为药物产品。以这种方法，动态混合实现了最佳的蛋白质混合，最终正确折叠快速发生，没有高浓度口袋、剪切或者生热，并且具有低功率消耗。图3是流程图，图解了本发明的从变性蛋白质溶液回收再折叠蛋白质的方法。该方法涉及提供变性蛋白质的浓缩溶液(301)并静态混合变性蛋白质与再折叠稀释剂以得到再折叠的蛋白质(303)。如上面参照本发明系统所指出的，在优选实施方案中，在静态混合操作后，蛋白质折叠低剪切混合容器中继续。图4A是变性剂的浓度对溶液中未折叠蛋白质分数的代表性曲线图。该图阐明变性蛋白质在相对狭窄的变性剂(例如，GuHCl)浓度范围内折叠。动态混合逐渐发生，从而溶液中被动态混合的蛋白质的折叠条件满足该曲线图中的曲线并且对该过程混合条件存在不精确的控制。而且，当蛋白质混合处于部分折叠状态时，最可能发生团聚问题，因此缩短蛋白质混合物在该状态中花的时间量将是有益的。静态混合更快地发生，静态混合的蛋白质溶液的折叠条件沿着该曲线以点到点(未折叠到折叠)的方式有效移动，在中间的部分混合状态中花费很少的时间。这为该过程提供了的更大程度的控制、一致性，以及由此而来的更大的可靠性，允许细微控制动力学以实现为天然蛋白质折叠优化的热力学。图4B是对于动态和静态混合来说时间对混合蛋白质分数(混合行为和速率)的代表图。该图进一步图解了上面参照图4A比较动态和静态混合实现的混合相对速率而指出的点。通过曲线410表示的动态混合仅仅逐渐发生，导致冗长状态的中间混合，而通过曲线420表示的静态混合快速发生。制剂本发明的方法和系统还可以用于将赋形剂掺入到蛋白质混合物中以产生活性蛋白质的治疗制剂。例如，根据本发明，可以向待混合的液体中加入海藻糖。本发明的一种尤其有利的应用是大规才莫生产无HA的重组蛋白，如干扰素卩lb。白蛋白被认为与IFN复合，从而阻止IFN-IFN团聚。除去白蛋白以产生无HA的IFN制剂恶化了混合期间的团聚问题。尽管本发明不受到该理论的限制，但是认为海藻糖可以减轻在无HA的蛋白质制剂中除去白蛋白引起的一些团聚问题。在一个实施方案中，待混合的蛋白质溶液包括2mM天冬氨酸緩冲液(pH约4)中的0.25mg/ml无HA的干扰素p-1b以及9%海藻糖。该方法的结果是完全的无HA蛋白质(例如，IFN-卩lb)制剂。实施例提供下面的实施例以阐明本发明的某些方面。这些实施例将进一步阐明本发明但是无意以任何方式限制本发明的范围。实施例l:具有一个二硫键的蛋白质的复性用于商业生产的一种目的蛋白质是干扰素卩(IFN-(3),尤其是干扰素卩lb(IFN-卩lb),其是18.5kD合成的IFN-卩重组蛋白质类似物。IFN-卩lb是再折叠的蛋白质，其17位的半胱氨酸残基被丝氨酸残基置换。作为微生物产生的蛋白质，IFN-(3lb是未糖基化的。它还具有N末端甲硫氨酸缺失。它的特征是天然状态下的非常疏水的表面和一个二硫键，该二石危键在整个处理中^f呆持完整。以Betaseron⑧上市的IFN-(3lb已经配置为成功的药物，其已经被批准用于治疗和控制多发性硬化(MS)。该蛋白质类似物、其生产所需的材料和技术、作为治疗剂的制剂和治疗MS的用途已经在许多美国专利和申请中描述和要求保护，所述美国专利和申请包括申请号435,154(1982年10月19日提交)；专利号4,588,585(1986年5月13日出版)；专利号4,737,462(1988年4月12日出版)；和专利号4,959,314U990年9月25日出版)，出于所有目的将它们每一个以其整体通过参考引入本文。此外，一些IFN-j3药物制剂，包括Betaseron⑧，含有常用的蛋白质稳定剂人血清白蛋白(HA或HSA)。HA是人血产物并且供应日益降低。因此，近来需要无HA的药物制剂。该实l佥研究了使用静态混合器再折叠无HA的IFN的可能性并对多种变量(包括不同的雷诺数；T形管(tee)距离和温度)测试了它们对单体百分数的影响，单体百分数即没有分子间键的正确折叠的蛋白质的百分数。通过体积排阻层析HPLC测定单体百分数。将测试的变量与用机械混合方法在相似条件下得到的单体百分数相比较。为了在O.lg规模再折叠IFN,将含有5M盐酸胍(GuHCl)的10mg/mL无HA的IFN-(3lb溶液用稀释剂在2-8°C冷室中稀释60倍。该实马全最初使用Koflo12-元件3/16"—次性管内(inline)混合器，其经改良而包括混合元件上游约lmm处的渐缩管倒钩适配器(T形管)。使用下面为lg规模描述的Koflo6-元件3/5"管内混合器进行以后的试验。测试的雷诺数在300到2000的值之间。用加入至472mL再折叠稀释剂的8mLIFN溶液在搅拌平板上剧烈混合进行对照。该阶段的结果在下面的表I中。表I.O.lg规模下IFN的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>倍。最初的实验使用Koflo6-元件3/5"—次性管内(静态)混合器，在入口之前2.5"到4"之间连接渐缩T形管。以后的试验在5g规模下使用下述3/4"不锈钢静态混合器。测试的雷i若数为2000-7000之间。地磅显示最终的希望体积后停止流速。在该阶段的结果在下面的表II中。表II.1g规模下IFN的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在5g规模下，将10mg/mL浓IFN用再折叠稀释剂稀释60倍。％"KoFlo6-元件不锈钢静态混合器在紧接混合元件的上游安装!/2"渐缩T形管。将混合器夹紧至50L有夹套的不锈钢罐的底部部分，罐壁叶轮在相反侧运行。使用平均的总流速，对于所有静态混合器运行，雷诺数为约4000。在/人浓缩的IFN并瓦清空全部内容物后停止浓缩的IFN泵，而在地磅显示最终希望的体积(其包括緩冲液罐和再折叠罐之间的维持体积)后停止緩冲液泵(用于再折叠稀释剂)。在2-10°C处理材料。处理后，让再折叠罐混合不少于10分钟。使用安装3/4"渐缩T形管的2"Koflo不锈钢6-元件静态混合器进行额外实验。雷诺数保持恒定在4000。结果在下面的表III中显示。表III.5g规模下IFN的结果处理时间混合器类型渐缩T形管距离温度%单体RE=400010min3/4，，不锈钢w/6-元件3"10oC97.81RE=400010min3/4"不锈钢w/6画元件3，，5。C98.36RE=40003min2"AL6XNw/12画元件3"~50C99.50动态混合30minN/AN/A40C98.02如表I和III中所示，对于每种规模，最终的单体百分数大于对照百分数。在lg规模没有进行对照；然而，对于O.lg规模和5g规模，每种试验产生比任一种对照百分数相似或更大的产率。从而，本发明的基于静态混合的方法和系统实现了与常规方法相比至少一样好和通常更好的产率。另一益处是在更大规模(即，用于生产的30g规模)下，静态混合时间保持恒定(3-15分钟)，而动态混合时间由于对局部化蛋白质或者变性剂浓度(其中可以发生IFN的团聚)的考虑而增加(从30分钟到几小时)。从而，静态混合可以很容易地放大到大规模生产。还提供了更一致的结果并且是更可靠的方法。实施例2:在天然状态具有三个或者更多二硫鍵的蛋白质的复性鸡蛋白溶菌酶是具有四个二硫键的14kD分子。它具有复杂的再折叠方案，但是已经被详细研究并且已经被详细地表征。该实验表明静态混合器将适用于比IFN更复杂的折叠方案。将在37。C下在8MGuHCl，50mMTns,lmMEDTA,32mMDTT緩沖液，pH8中变性1小时的0.3g溶菌酶用1.25MGuHC1,50mMTns,1mMEDTA緩冲液，pH8在5分钟内稀释16倍并在25。C孵育24小时以产生lmg/mL的终浓度。该实验使用具有12个螺旋元件的3/16"—次性静态混合器，所述螺旋元件在紧接混合元件的上游安装了渐缩管倒钩适配器。选择流速以得到约1000的雷诺数(即，对于稀释緩沖液为60mL/分钟，对于变性溶菌酶溶液为4mL/分钟)。采集样品用于通过活性测定法测定纯度百分数以评估再折叠动力学。图5是时间对％活性图，图解了三次单独再折叠的再折叠动力学。4吏用乂人Jolles,P.LysozymesfromRabbitSpleenandDogSpleen.M^/^Az"五^ymo/ogy1962,5,137改编的方法在24小时后进行溶菌酶动力学的最后分析。对于三次单独的试验，24小时后活性溶菌酶的最后回收为90%或者更高。这与公布的结果相当，其中动态混合产生约95%的溶菌酶活性(DeBernardez-Clark,E.,Hevehan,D.,Szela,S.，Maachupalli,J.OxidativeRenaturationofHenEgg-WhiteLysozyme.FoldingvsAggregation.万/她c/wo/ogy/Vogmw1998,14,47-54)。从而,该实验表明使用静态混合器，在再折叠具有多个二硫键的重组蛋白质中的效用。实验结果讨论再折叠来自包含体的蛋白质的主要问题是团聚。团聚可被描述为导致团聚的吸引力与导致再折叠的吸引力的竟争。为了控制再折叠期间的团聚，使用了剧烈搅拌。然而，使用机械搅拌器的常用混合方案可能破坏该蛋白质或者无效地混合该蛋白质而引起团聚。使用静态混合器是该问题的新解决方案，因为它快速混合液流而没有机械混合引起的极端剪切力，并且可以容易地用于生产车间，因为它可容易地改变规才莫。来自两种单独的蛋白质的结果表明宽范围的应用性。结论本发明的基于静态混合的方法和系统实现了与常规方法至少一样好的产率。此外，它可容易地放大到大规;漠生产、更快、提供更一致的结果并且是更可靠的方法。尽管为了清楚理解的目的而更详细地描述了前面的发明，但是显而易见的是在所附权利要求范围内可以实施某些改变和修改。应注意到有许多备选方案可以实现本发明的方法和组合物。因此，本发明的实施方案将被认为是阐明性的并且不是限制性的，并且本发明不限于本文给出的细节，而是可以在所附权利要求的范围和等同方案内被修改。将本文引用的所有文件完整地和为了所有目的引入本文作为参考。权利要求1.再折叠蛋白质的方法，其包括提供变性蛋白质的浓缩溶液；和使所述变性蛋白质与再折叠稀释剂静态混合以得到包含再折叠蛋白质的混合物。2.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是通过微生物产生的重组蛋白质。3.权利要求2的方法，其中所述变性蛋白质溶液是通过从微生物宿主分离蛋白质并将其暴露于变性剂而得到。4.权利要求1的方法，其中所述再折叠稀释剂是緩冲液，所述蛋白质在其中可溶。5.权利要求4的方法，其中静态混合于在导管中包含一系列混合元件的静态混合器中发生。6.权利要求5的方法，其中在导管中所述再折叠稀释剂流临近到达所述静态混合器的混合元件前，将所述蛋白质溶液递送到所述再折叠稀释剂流。7.权利要求1的方法，其中在所述静态混合后为所述混合物被提供至动态混合容器。8.权利要求7的方法，其中所述混合物在所述动态混合容器中动态混合。9.权利要求1的方法，其中所述再折叠蛋白质在小于1小时内以大于75%单体的产率被获得。10.权利要求9的方法，其中所述再折叠蛋白质以大于95%的产率被获得。11.权利要求10的方法，其中所述再折叠蛋白质在小于30分钟内被获得。12.权利要求ll的方法，其中所述再折叠蛋白质在小于5分钟内被获得。13.权利要求4的方法，其中所述蛋白质溶液中所述变性剂的浓度小于3M。14.权利要求1的方法，其中所述稀释为至少10倍。15.权利要求14的方法，其中所述稀释为至少60倍。16.权利要求l的方法，其中混合期间的温度为约2到3(TC。17.权利要求1的方法，其中混合期间的温度为约4。C。18.权利要求1的方法，其中混合期间的蛋白质浓度小于0.2mg/ml。19.权利要求18的方法，其中混合期间的蛋白质浓度为约0.1mg/ml。20.权利要求1的方法，其中选择混合物的流速使得所述静态混合器具有约200到7000之间的雷诺数。21.权利要求1的方法，其中所述混合物的体积大于IOL。22.权利要求l的方法，其中所述混合物的体积大于IOOL。23.权利要求l的方法，其中所述混合物的体积大于IOOOL。24.权利要求1的方法，其中蛋白质在其天然状态具有一个或多个分子内二硫键。25.权利要求24的方法，其中所述蛋白质在其天然状态具有一个分子内二硫键。26.权利要求25的方法，其中所述蛋白质是干扰素卩。27.权利要求26的方法，其中所述蛋白质是干扰素P-lb。28.权利要求27的方法，其中蛋白质溶液包含无HA的干扰素卩。29.权利要求1的方法，其中再折叠的蛋白质是生物学上有活性的。30.权利要求1的方法，其中所述混合物还包含一般被认为是所述活性蛋白质的治疗制剂的安全成分的赋形剂。31.4又利要求30的方法，其中所述赋形剂包含海藻糖。32.权利要求31的方法，其中所述蛋白质溶液包含pH约为4的2mM天冬氨酸中的0.1mg/ml无HA的干扰素卩-lb并且所述赋形剂包含9%海藻糖。33.用于从溶液回收再折叠蛋白质的系统，其包括静态混合器；与所述静态混合器相配并且处于其上游的导管；和所述静态混合器上游导管的入口。34.^又利要求33的系统，其还包括再折叠稀释剂源，其被配置为用于递送到所述静态混合器上游的导管；和浓缩的变性蛋白质源，其被配置为用于通过所述静态混合器上游的入口递送到所述导管。35.权利要求34的系统，其中所述静态混合器在导管中包含一系列固定的混合元件、可移动的混合元件，或者其组合。36.权利要求35的系统，其中所述静态混合器导管具有不超过2英寸的直径。37.权利要求36的系统，其中所述静态混合器导管具有约3/4英寸的直径。38.权利要求35的系统，其中所述静态混合器具有固定的元件。39.权利要求33的系统，其还包括所述静态混合器下游的动态混合容器。全文摘要回收再折叠蛋白质的方法，包括使变性蛋白质的浓缩溶液与再折叠稀释剂静态混合以得到再折叠蛋白质。本方法尤其适于大规模处理体积的微生物产生的重组蛋白质。通过从微生物宿主分离蛋白质并将它们暴露于变性剂，可以得到变性的蛋白质溶液。将该溶液与适合的再折叠稀释剂在与所述蛋白质的正确折叠相容的静态混合条件下混合，从而得到所述再折叠蛋白质，优选快速并且高产率地得到。用于实现再折叠蛋白质回收方法的系统包括静态混合器、与该静态混合器相配并且处于其上游的导管，和所述静态混合器上游导管的入口，以及任选地，所述静态混合器下游的动态的、优选非湍流的混合容器。本发明可尤其用于大规模生产蛋白质，尤其是重组蛋白质。文档编号C07K1/113GK101233152SQ200680027895公开日2008年7月30日申请日期2006年7月28日优先权日2005年7月29日发明者J·卢克,R·圣约翰,T·乐申请人:诺瓦蒂斯有限公司