重组恶性疟原虫裂殖子表面蛋白4和5及其用途的制作方法

专利名称：：重组恶性疟原虫裂殖子表面蛋白4和5及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组分离多肽、编码所述多肽的核酸、生产所述多肽重组形式的方法、抗所述多肽生成的抗体以及所述多肽和抗体在诊断方法、试剂盒、疫苗或抗寄生虫治疗中的用途。
背景技术：
：疟疾每年在全球引起大约200万人的死亡，其中大多数为5岁以下的非洲儿童，因此给世界上许多最贫穷国家带来了巨大的公共卫生负担。随着寄生虫及其蚊媒的抗药性扩展，这种负担正在以令人担忧的速度增长，加剧了对有效疫苗的迫切需要。迄今为止检测过的最有前景的红内期候选疫苗为裂殖子表面蛋白l(MSP-l)和顶端膜抗原(AMAl)。据发现，针对这些表面抗原的体液免疫应答与发病率下降有关，而且此类抗体在体外可以抑制寄生虫重新侵入红细胞(RBC)[l-3]。然而，与编码不易接近免疫效应物的蛋白质的基因相比，这些抗原基因一般表现出高得不成比例的非同义单核苷酸多态性(nsSNP)[4-6]，这些nsSNP中有一些编码根本性的氨基酸置换，这些氨基酸置换集中在该蛋白最易接近宿主免疫系统的区域。此类氨基酸多态性可以通过改变B细胞和T细胞表位在免疫逃避中发挥功能[4,8]。现在一般认为任何有功能的疟疾疫苗需含有每个耙抗原的数个等位基因型以期诱导多等位基因应答和/或需含有数个耙抗原的保守区域。更具体而言，本领域需要可用于疟疾特别是恶性疟和间曰疟诊断和治疗的抗原。具体而言，需要与赋予流行区域疾病保护的特异免疫应答相关联的保守抗原，还需要评价它们作为多价疟疾疫苗的组分的适宜性。发明概述本发明辅助实现本领域的这些需求。本发明提供了包含SEQIDNO:1,2，3，4,5，6，7或8的DNA序列的纯化或重组或合成核酸分子和编码SEQIDNO:9，10，11，12，13,14,15,16,17，18，19，20，21或22的氨基酸序列的纯化或重组或合成核酸分子。本发明还包括了与这些序列互补的纯化核酸分子。本发明还包括了由所述包含SEQIDNO:1-8的DNA序列的纯化或重组核酸分子编码的纯化多肽，正如所述DNA序列所预测。SEQIDNO:1-8的DNA序列或SEQIDNo.9-22的氨基酸序列是指这些序列中的任一序列和每个序列。本发明包括了包含SEQIDNO:1-8的DNA序列的纯化双链核酸分子和编码SEQIDNO:9-22的氨基酸序列的纯化双链核酸分子。单链和双链RNA和DNA核酸分子均包括在本发明内。这些分子可用于检测编码本发明所包括的多肽的单链和双链RNA和DNA变体。双链DNA探针允许检测相当于所述核酸分子两条链中任意一条的核酸分子。本发明包括与包含SEQIDNO:1-8的DNA序列以及编码SEQIDNO:9-22的氨基酸序列的变性双链DNA在42°C，50%甲醛和6XSSC的中度严格性条件和60°C,0.5XSSC,0.1%SDS的洗涤条件下杂交的纯化核酸分子。本发明还包括了源自SEQIDNO:1-8体外诱变的纯化核酸分子。体外诱变包括许多为本领域所知的技术，这些技术包括但不限于定点诱变、随机诱变和体外核酸合成。根据一个具体实施方式，来自所述引用序列体外诱变的此类核酸分子具有与原核酸分子相同的长度或具有比原核酸分子更短的序列。包括DNA和RNA的本发明的核酸分子在本文中被称为"重组MSP4和MSP5核酸"或"重组MSP4和MSP5DNA"，由这些分子编码的氨基酸在本文中被称为"重组MSP4和MSP5多肽"或"本发明的多肽"。本发明还包括由于遗传密码的简并性自SEQIDNO:l-8得到的纯化核酸分子，重组MSP4和MSP5核酸的等位基因变体的纯化核酸分子或重组MSP4和MSP5核酸的物种同系物。本发明还包括指导这些核酸分子表达的重组载体和以这些载体转化、转染或感染的宿主细胞。结合重组MSP4或MSP5多肽的纯化多克隆或单克隆抗体包括在本发明内，在本文中被称为"本发明的抗体"。本发明还包括生产重组MSP4和MSP5多肽的方法，其包括在促进表达的条件下培养宿主细胞和从培养基或细胞沉淀回收所述多肽。具体而言，重组MSP4和MSP5多肽在杆状病毒昆虫表达系统中的表达包括在本发明内。本发明还提供了标记的重组MSP4和MSP5多肽。优选情况下，所述标记多肽为纯化形式。还优选的是，所述未标记或标记多肽可为含有抗症疾抗体的人体液免疫识别。所述多肽可以用例如选自放射性标记、酶标记、荧光标记、化学发光标记和发色团的免疫测定标记进行标记。本发明还提供了本发明的重组MSP4或MSP5多肽和识别这些多肽的抗体之间的免疫复合物。所述免疫复合物可以用例如选自放射性标记、酶标记、荧光标记、化学发光标记和发色团组的免疫测定标记进行标记。此外，本发明提供了检测疟原虫MSP4和/或MSP5多肽的体外方法。所述方法包括提供包含疑为含有疟原虫MSP4和/或MSP5多肽的生物材料的组合物，以及检测疟原虫MSP4和/或MSP5多肽的存在。疟原虫的所述MSP4和MSP5多肽典型地由电泳测定或以本发明所述抗体进行免疫测定。该方法可用于生物样品中疟原虫的检测，在一个优选实施方式中该方法可用于恶性疟原虫和间日疟原虫(户/"柳o^^v/rax)的检测。本发明还提供了检测抗体存在与否的体外诊断方法，这些抗体结合包含本发明所述重组或纯化的MSP4或MSP5多肽或本发明所述重组或纯化的MSP4或MSP5多肽的混合物的抗原。所述方法包括将所述抗原与生物学液体在足够让所述抗原与所述生物学液体中抗体形成抗原-抗体复合物的条件下接触一段时间，然后检测所述复合物的形成。所述检测步骤还可以包括测量所述抗原-抗体复合物的形成。所述抗原-抗体复合物的形成优选地通过基于蛋白印迹技术、ELISA(酶联免疫吸附测定)、间接免疫荧光测定或免疫沉淀测定的免疫测定来测量。所述方法可用于检测对来自感染疟疾的动物或人患者的生物学液体中疟原虫的免疫应答。在一优选实施方式中，该方法可以用于检测对恶性疟原虫感染或间日疟原虫感染的免疫应答。用于检测结合本发明所述MSP4或MSP5多肽或本发明所述MSP4或MSP5多肽混合物的抗体存在与否的诊断试剂盒含有包含所述重组MSP4禾P/或MSP5多肽或所述重组MSP4和/或MSP5多肽的混合物的抗原，以及检测所述抗原和抗体之间免疫复合物形成的试剂。所述抗原和所述试剂的量足以进行所述检测。用于检测疟原虫MSP4和/或MSP5多肽存在与否的诊断试剂盒含有本发明的抗体和检测抗原和所述抗体之间免疫复合物形成的试剂(means)。所述抗体和所述试剂的量足以进行所述检测。本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含量足以诱发体内免疫原性或保护性应答的本发明的重组MSP4或MSP5多肽或本发明的重组MSP4或MSP5多肽的混合物，以及包含一种药学上可接受的免疫刺激剂。本发明的疫苗组合物包含足量的重组MSP4和/或MSP5多肽和药学上可接受的免疫剌激剂以诱发中和抗体。本发明所述MSP4和MSP5多肽因此可用作检测抗疟疾相关抗原蛋白的抗体存在的诊断组合物的一部分。此外，所述重组MSP4和MSP5多肽可以用于制备检测疟疾相关抗原蛋白存在的抗体。本发明的多肽还可以用于制备中和抗体，这些中和抗体或灭活寄生虫，减少寄生虫体内生存能力或抑制或防止寄生虫复制。当本发明所述多肽用于免疫或接种组合物时，诱发中和寄生虫抗体的能力尤为重要。下面是一种疫苗，它包括(A)天然信号序列(B)C端His标签以及(C)类似恶性疟原虫抗原酸性重复区域的酸性重复区域，该酸性重复区域与区域(MSP4p20)的保护性抗体应答关系最为密切。MKVAYFLSVLDLLIIFSLYFDGRRSAFAGIAACIRHGRILGEGGE/QNSTPGSGGQTGDHSAEAENGDYNEQGDDHGDDHGDDHGDDHGDEQDGEDYDDAEDDDLYELSEVDENANLCLDNNGGCGDDKICENLGKGIVKCLCKPGYKLVGTECVEHHHHHH[SEQIDNO:30]附图简述本发明将参考附图进行描述，其中图1描述了几种不同疟原虫物种的msp4和msp5基因位点的基因组结构。这些基因的种间保守性指示了基本功能。图2显示了SALSA序列与恶性疟原虫MSP-4(PfMSP4)有92%的相同性。己知SALSA序列具有B细胞和T细胞表位。PfMSP4序列以黑色显示，SALSA序列以灰色显示。图3显示了PfMSP4的全长合成基因序列。该图显示的所有序列以寡核苷酸表示。PfMSP4的基因序列由编号的重叠寡核苷酸序列(l-38)编码并交替以粗体和正常文本突出显示。限制性位点以小写文本显示。图4描绘了PCR法制备所述合成基因。"基因装配反应"(5或10pl，分别为泳道1和泳道2)和"基因扩增反应"(5或10pl，分别为泳道3和泳道4)的样品在1%琼脂糖凝胶上分离，DNA大小标准品位于样品侧面并将样品分开。图5显示了四个不同MSP4构建体的比对，这些构建体的生成是用于杆状病毒系统中的重组蛋白表达。推定信号序列(根据现有算法预测)以灰色突出显示，共有多态性位点以粗体字突出显示，最有可能处于平衡选择并因此参与免疫逃避的位点以"*"标出。图6显示了恶性疟原虫MSP5(PfMSP5)的全长合成基因序列。该图显示的所有序列以寡核苷酸表示。PfMSP5的基因序列由编号的重叠寡核苷酸序列(l-38)编码并交替以粗体字和正常文本突出显示。限制性位点以小写文本显示。图7描绘了所述合成基因的PCR制备。"基因扩增反应"(5iaL)的样品在1°/。琼脂糖凝胶上分离，其旁侧为DNA大小标准品。图8显示了PfMSP4在两种不同昆虫细胞系中随时间变化的表达。通过将细胞悬浮液与4%台盼蓝以1:1混合并计数盖玻片下一方格内的总细胞和蓝色细胞，计算出细胞死亡百分比。感染后24、30、36、42、48、54、60和72h时，从受感染的培养SN中纯化蛋白(分别为1-8泳道)，20uL的洗脱蛋白以4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen)分离并以SimplyBluesafestain(Iiwitrogen)染色。这些蛋白种类在未感染细胞培养物中未观察到(第9泳道)。图9为突出显示每个MSP4产物p40、p30和p20N端序列的序列比对。该研究中鉴定出的信号序列以灰色突出显示。每个产物的N端序列以蓝色粗体字显示。图10显示了三种己知疟疾抗原已报道的信号切割位点附近约80个氨基酸残基的疏水曲线。成熟蛋白的首个残基以黑色菱形显示。S-抗原信号序列切割的曲线类似于杆状病毒系统中MSP4信号序列切割的曲线。图11显示了PfMSP5在两种不同昆虫细胞系中随时间变化的表达。通过将细胞悬浮液与4%台盼蓝以1:1混合并计数盖玻片下一方格内的总细胞和蓝色细胞，计算出细胞死亡百分比。感染后24,30，36，42,48，54，60和72h时，从受感染的培养SN中纯化蛋白(分别为1-8泳道)，20uL的洗脱蛋白以4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen)分离并以SimplyBluesafestain(Invitrogen)染色。这些蛋白种类在未感染细胞培养物中未观察到(第9泳道)。图12涉及在兔中制备的多克隆抗血清。针对(A)全长MSP4p40(R6-7)和(B)MSP4降解产物p20(R8-9)而制备的血清的ELISA终点效价，采用天然(NR)或不可逆还原的(R)MSP4-p40作为包被抗原。当MSP4抗原被还原后，血清R8失去了50%以上的结合活性。免疫前血清标记为NEG。图(C)显示了抗MSP5血清(56-57)的效价，采用MSP5-p45和p35作为包被抗原进行分析。图13描述了采用针对杆状病毒表达的抗原而制备的多克隆血清和和来自Dielmo人血清库或来自抗MSP4兔血清库的MSP4p40亲和力纯化的血清对寄生虫材料进行探测而得到的结果。使用Wang等人(2003)[9]的方案，从iRBC提取并粗略分部不同步生长的寄生虫。各免疫印迹的每个泳道1加入非还原的TritonX100可溶寄生虫部分，泳道2加入非还原的膜部分，泳道3加入还原的TritonX100可溶寄生虫部分，泳道4加入还原的膜部分(图A，B和D)。图C显示了以风干后感染有恶性疟原虫的RBC而获得的IFA数据。图14显示了采集自1990年雨季肆虐期间Dielmo的9个免疫成年人(18-49岁)血清的ELISA分析。培养板以MSP4p40(A)或MSP5p45和p35(B)包被。图15是使用来自3号和9号个体的人免疫血清的重组MSP4p40,p30和p20(分别为1，2，3泳道)的免疫印迹(A)和使用来自8号个体的人免疫血清的重组MSP5的免疫印迹分析(B)。每份血清生成的ELISA曲线显示在图16A和16B的每块印迹上，图16A和16B描绘了两个特异识别PfMSP4，p40和p20表位的单克隆抗体mAbL11-16和mAbF12-7的蛋白印迹。图例说明nR=非还原，R-被invitrogen商用缓冲液还原，iR=被DTT和丙烯酰胺不可逆还原。图17A和17B描述了以稀释因子(x-轴)分别作为图16A和16B中的mAb的OD或吸光度(y-轴)的函数。图18A和18B描述了两个特异识别PfMSP5，p45和p35的表位的单克隆抗体mAbG21-2和mAbJ18-4的蛋白印迹。图例说明nR-非还原,R-被invitrogen商用缓冲液还原，iR-被DTT和丙烯酰胺不可逆还原。图19A和19B描述了以稀释因子(x-轴)分别作为图18A和18B中mAb的OD或吸光度(y-轴)的函数。图20A-B描述了用以优化所述蛋白包被浓度的ELISA分析。培养板以PBS中0.5或lng/ml蛋白质过夜包被，加入100nL/L。图(A)显示了以来自MSP4的三个不同抗原MSP4p40，MSP4p30(本文称MSP4p40/2)和MSP4p20获得的数据。图(B)显示了以MSP5获得的数据，根据来自图(A)的MSP4p20数据绘制以展示应答的不同强度。由于使用任一种浓度所观测到的光密度近乎相同，于是在后续所有分析中均使用了较低的包被浓度(0.5叫/ml)。图21A-D描绘了来自首次接受试验的个体(naiif)、超免疫成年人(shi)和来自2005年Dielmo队列的个体的对照血清的ELISA分析。培养板以0.5ng/mL的MSP5(A),MSP4p40(B),MSP4p20，MSP4p20(C)和MSP4p30(D)包被，并以不同稀释度的抗血清(3倍稀释系列)进行反应。所有抗原为免疫血清识别，但不为未感染疟疾的对照(malarianaivecontrol)识别。图22A-D描绘了来自2000年Ndiop队列个体的抗体应答，根据15岁以上和15岁以下的年龄分层。图(A)显示了抗原MSP4p20,MSP4p40,MSP4p30和MSP5(从左至右)光密度形式的ELISA数据。图(C)显示了OD比形式的相同数据。图(B)中个体对MSPlp19的抗体应答绘制为以OD比作为2000年Ndiop队列年龄的函数，而图(D)显示了以相同血清抗MSP5而获得的ELISAOD比。图23描绘了来自Ndiop2000队列的血清对MSP4及其衍生物的识别差异。左边的图显示了将平均应答作为MSP4p20，MSP4p40和MSP4p30(等同于MSP4md2)OD比的函数进行作图。右边的图显示了上四分位和下四分位以及将抗体对每个MSP4抗原的应答作为年龄函数的数据范围。图24描绘了抗体依赖性的单核细胞介导的细胞毒性，根据特异血清存在下诱发的氧化爆发所测量。根据OD比高于或低于队列中位反应将血清分组。图(A)显示了来自划分为MSP5反应性函数(高于或低于2.4的OD比)的血清的数据，图(B)显示了来自划分为MSP4p40反应性函数(高于或低于20的OD比)的血清的数据。采用化学发光法分析它们在PBMC(外周血单核细胞)和恶性疟原虫裂殖子存在下诱发氧化爆发的能力。在两组中，观察到表现出高OD比的个体发生氧化爆发的增加。图25描绘了采用IgG特异二抗试剂分析每个抗原的抗体同种型曲线。显示了MSP4p40(图A)和MSP5(图B)的同种型曲线。数据作图为年龄的函数(高于和低于15岁)。图26为PfMSP4和PvMSP4氨基酸序列的比对。突出显示了Pf序列的几个特点(i)分泌和GPI锚定信号以绿色显示，(ii)已知为SALSA的序列加以下划线，(iii)所有带负电的残基(D和E)以红色显示，以及(iv)PfMSP4p20N端序列和重要半胱氨酸残基以蓝色突出显示。图27描绘了杆状病毒PfMSP5。(A)纯化的重组PfMSP5在SDS-PAGE凝胶上迁移，转移到纤维素膜并以人免疫血清探测。(B)在存在氖化豆蔻酸的情况下表达PfMSP5。纯化蛋白在SDS-PAGE凝胶上迁移，蓝染和进行7周的放射自显影。图28描绘了PflVISP4在RBC各期随时间变化的表达。(A沐用单克隆抗体G17.12探测丙酮固定的环状体期寄生虫和风干的后期和游离裂殖子，该单克隆抗体特异于PfMSPlp19或以重组PfMSP4p20(Rp20)亲和纯化的多克隆兔血清。抗体染色以AlexaFluor488羊抗鼠或抗兔的缀合抗体显示，寄生虫DNA以Hoechst33342染色。(B)采用亲和纯化的兔(Rp20)和人血清(Ndiop和Dielmo库Hp20为1:1)对来自成熟裂殖体(S)、游离裂殖子(M)和环状体(R)的寄生虫提取物进行蛋白印迹分析。图29描绘了由用于重组PfMSP4表达的构建体所编码的蛋白序列。显示了设计用于促进PfMSP4p20直接表达的所述构建体。构建体的名称列在序列文本的左侧，每个分泌蛋白的N端序列在文本内以粗体突出显示，所述重组蛋白名称列在右侧。图30描绘了PfMSP4p20随时间变化的直接表达。感染PfMSP4p40，PfMSP4p21,PfMSP4p21ssl或PfMSP4p21ss2杆状病毒的昆虫细胞培养上清的样品在感染后24h到66h之间每隔6h进行收集，透析并以TALON树脂分批纯化。纯化蛋白样品在NuPAGE4-12。/。梯度凝胶上分离，蓝染，并在右边标注蛋白的大小。采用感染后66h时剩下的最后130ml培养上清计算大致蛋白产量。以IMAC和HPLC纯化蛋白，并采用BCA蛋白定量试剂盒(P正RCE)计算该蛋白产量。图31描绘了PMSP4p40和PvMSP4/His的蛋白序列比对。杆状病毒间日症原虫MSP4和恶性疟原虫MSP4表达构建体的氨基酸(单字母符号)序列以clustalx进行比对。氨基酸相同性表示为(*)，保守置换表示为(:)，半保守置换表示为(.)和根本性改变表示为空格。鉴定的N端序列以下划线和粗体显示。不同蛋白质产物的N端序列以下划线和粗体显示。图32描绘了PvMSP4/His随时间变化的表达。简而言之，感染后24到66h之间每隔6h收集8ml旋动培养SN样品，透析，然后在TALON树脂上分批纯化。纯化蛋白样品在NuPAGE4-12%梯度凝胶上分离，以SimplyBlueSafeStain染色，并在左边和右边标注蛋白的大小。图33描绘了人免疫血清对PvMSP4/His的反应性。(A)ELISA培养板以杆状病毒表达系统中表达的PvMSP4/His包被。检测了3倍稀释系列或全部24份血清。(B)与此同时，以不可逆还原的PvMSP4检测每个稀释系列。该图在每个血清的下方图中显示了稀释为1/2700时的OD，得到高于阴性对照抗天然抗原的OD。上方图显示了血清以1/2700血清稀释时抗原还原所观察到的OD下降。图34和35描绘了血清(去补体、除去IgG或纯化IgG)处理在基于PMN对裂殖子(APDm)抗体依赖性吞噬的功能检测中的结果。实施例19描述了所述测定。发明详述两个近来鉴定的裂殖子表面抗原恶性疟原虫裂殖子表面蛋白4和5(PfMSP4和PMSP5)有望成为潜在多组分抗疟疾疫苗的蛋白组分。msp4和msp5基因均编码272个残基的蛋白，每个蛋白具有单个C端EGF样结构域和GPI锚定基序[10，11]并相邻位于2号染色体上，恰好处于msp2的上游。已表明两种蛋白都具有裂殖子表面处的膜连接，而且已表明人血清可与大肠杆菌表达的重组MSP4反应[12,13]。3种鼠类疟原虫即约氏疟原虫(尸.yoe///)、夏氏疟原虫(尸.ctotoz^/)和伯氏疟原虫(尸.Z^g/ze/)在MSP4和MSP5位点处(MSP4/5)仅有一个基因，相互之间表现出一定程度的同源性[14-16]。该基因被称为MSP4/5，并已被用于研究约氏疟原虫致死剂量攻击模型(lethalchallengemodd)的保护性免疫[17]。已经表明，MSP4/5使用多种免疫策略来提供保护，当与MSPlpl9一起输送时，效力达到最大[17-20]。此外，鼠MSP4/5蛋白诱发的免疫应答似乎没有菌株特异性[21]。在恶性疟原虫中，msp4和msp5均在同源位点处具有一个内含子[22]。恶性疟原虫裂殖子表面蛋白4(PfMSP4)的蛋白序列包括一个分泌信号序列，一个C端EGF样结构域和GPI锚定信号[10]。Pftnsp4基因序列长960bp，它包括一个144bp的内含子并编码272个氨基酸残基。Pfmsp5基因序列长955bp，它包括一个136bp的内含子并编码272个氨基酸残基。至于PfMSP4，PfMSP5的蛋白序列由一个分泌信号序列，一个C端EGF样结构域和一个GPI锚定信号组成[ll,22]。这簇MSP基因的下游是高度保守的腺苷酸琥珀酸裂解酶(ASL)基因，该基因已被证明为有利于鉴定其他物种中的该位点(图1)。当前许多数据支持这一概念，即PfMSP4和PfMSP5是良好的候选疫苗。尽管如此，几项发表的研究结果表明两种不同表达系统(大肠杆菌和酵母)产生的PfMSP4的重组类似物具有不同的抗原性，并诱发针对该蛋白质的EGF样结构域的不依赖构象的应答，使用人免疫血清时未观察到这一现象[13]。如果识别所述蛋白质的该区域的构象表位对于保护是重要的，正如MSP1-19—样，则有必要产生一种忠实复制所有表位的产物。因此，本发明提供了构建体，其中编码恶性疟原虫MSP4和MSP5的所述核酸和由此形成的多肽已被修饰以在昆虫细胞中实现最佳表达。更具体地，本发明提供了编码重组MSP4多肽的构建体，这些多肽在杆状病毒昆虫细胞表达体系中以可溶分泌多肽表达。所述重组多肽在C端含有一个似已适宜折叠的EGF样结构域。这一点表现在当该蛋白在ELISA培养板上被不可逆还原时多克隆兔血清对MSP4的识别发生了明显下降(50-60%)(参见图12)。一种本发明的重组MSP4多肽是MSP4菌表抗原(不含C端GPI锚定位点的疏水残基，因此可实现蛋白分泌)，其N端附近多态性区域有30个氨基酸的缺失。本发明的多肽被称为MSP4p30。另一种本发明的重组MSP4多肽是MSP4菌表抗原(不含C端GPI锚定位点的疏水残基，因此可实现蛋白分泌)，其N端附近多态性区域没有30个氨基酸的缺失。本发明的该多肽被称为MSP4p40，它是全长的基因产物。再一种本发明的重组MSP4多肽是大致对应于MSP4C端一半的20kDa多肽，开始于KSPKE基序附近并包括EGF结构域。该多肽可以包括上游补充(supplementary廣基酸残基，尤其是位于KSPKE基序上游的MSP4p40序列的残基。本发明的该重组多肽被称为MSP4p20。此外，本发明提供了包括同时产生的p35和p45形式的重组MSP5多肽。二者均含有翻译后修饰，可能参与了脂肪酸残基的共价锚定(豆蔻酰化)，该共价锚定可以促进免疫原性。本发明的这些重组多肽被称为MSP5p45和MSP5p35。尽管如此，本发明的重组MSP4和MSP5多肽还可以表达为C端GPI锚定实体，或使用其天然GPI信号序列或使用标志GPI修饰的来自其他GPI锚定的蛋白质序列。此类GPI修饰实体在没有任何免疫佐剂下预计可显著增加重组MSP4和MSP5多肽的免疫原性。本发明的重组多肽参照其对应如下SEQIDNO进行更详细地描述MSP4p20SEQIDNO:1MSP4p30SEQIDNO:2MSP4p40SEQIDNO:3MSP5SEQIDNO:4MSP5pl0SEQIDNO:5MSP4p21SEQIDNO:6MSP4p21sslSEQIDNO:7和SEQIDNO:28MSP4p21ss2SEQIDNO:8和SEQIDNO:29多肽MSP4p20(降解产物)SEQIDNO:9MSP4p30(构建体中有ORF-该构建体编码的多肽)SEQIDNO:10MSP4p30(表达终产物=昆虫细胞产生的多肽)SEQIDNO:11MSP4p40(构建体中有ORF)MSP4p40(表达终产物)MSP5(构建体中有ORF)MSP5pl0PvMSP顿isMSP4p21(构建体中有ORF)MSP4p21(表达终产物)MSP4p21ssl(构建体中有ORF)MSP4p21ssl(表达终产物)MSP4p21ss2(构建体中有ORF)MSP4p21ss2(表达终产物)SEQIDNO:12SEQIDNO:13SEQIDNO:14SEQIDNO:15SEQIDNO:16SEQIDNO:17SEQIDNO:18SEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21SEQIDNO:22PvMSP4p20(基于"PfMSP4和PvMSP4氨基酸序列的比对"中所给出的间日疱原虫MSP4序列的推荐疫苗构建体序列)SEQIDNO:30这些多肽在本文分别称为和合称为本发明的"重组MSP4和MSP5多肽"。与之类似，编码这些多肽的核酸被称为本发明的"重组MSP4和MSP5核酸"。本发明应用广泛。所述重组MSP4和MSP5多肽的发现能够构建包含编码本发明的重组MSP4和MSP5多肽的核酸的表达载体;用所述表达载体转染或转化的宿主细胞;有生物活性的重组MSP4和MSP5多肽和作为分离或纯化蛋白的重组MSP4和MSP5多肽；与重组MSP4和MSP5多肽发生免疫反应的抗体；所述重组MSP4和MSP5多肽和抗所述重组MSP4和MSP5多肽的抗体在检测疟原虫和疟疾感染中的诊断用途以及所述重组MSP4和MSP5多肽保护免受疟原虫感染的疫苗用途。如本文所使用，术语"重组MSP4和MSP5多肽"也系指一类还包括具有SEQIDNO:9-22氨基酸序列的多肽，以及具有与此类氨基酸序列高度相似性(至少90%的同源性)的蛋白质和多肽以及具有免疫反应性的蛋白质和多肽。此外，重组MSP4和MSP5多肽系指SEQIDNO:1-8的核苷酸的基因产物。本文使用的术语"纯化"意为所述重组MSP4和MSP5多肽基本不与例如作为重组宿主细胞培养物的纯化产物或作为来自非重组来源的纯化产物的其他蛋白质或多肽关联。本文使用的术语"基本纯化"系指含有重组MSP4和MSP5多肽，且除了存在使用特异抗体可以除去的已知蛋白，基本不与其他蛋白质或多肽关联的混合物，而且基本纯化的重组MSP4和MSP5多肽可以用作抗原。本文所称的重组MSP4禾BMSP5多肽"变体"意为与重组MSP4和MSP5多肽基本同源但因一个或多个缺失、插入或置换而具有与重组MSP4和MSP5多肽不同的氨基酸序列的多肽。所述变体氨基酸序列与重组MSP4和MSP5多肽的氨基酸序列优选具有至少80%的相同性，最优选具有至少90%的相同性。百分比相同性可以例如根据Devereux等人提出的6.0版GAP计算程序比较序列信息进行确定(Nucl.AcidsRes.12:387:1984)，该程序可从威斯康辛大学遗传计算组(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup,UWGCG)获得。所述GAP程序使用Needleman和Wunsch的比对方法(J.MoLBiol.48:443,1970)，该方法由Smith和Waterman修订(Adv.Appl.Math2:482，1981)。GAP程序的优选默认参数包括(l)核苷酸的一元比较矩阵(其中，值为l表示相同和值为O表示相同)和Gribskov和Burgess加权比较矩阵(Nucl.AcidsRes.14:6745,1986)，由著者Schwartz禾口Dayhoff描述(AtlasofProteinSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358,1979);(2)每一缺口罚分为3.0，每一缺口中的每一符号加罚0.10以及(3沐缺口没有罚分。变体可以包含保守置换的序列，这意味着某个氨基酸残基为具有类似生理化学特点的残基置换。保守置换的实例包括脂肪酸残基之间的置换，例如lie，Val,Leu或Ala之间的置换，或极性残基之间的置换，例如Lys和Arg之间、Glu和Asp之间或Gln和Asn之间的置换。其他此类保守置换，例如具有类似疏水特性的整个区域的置换，是众所周知的。本发明的MSP4和MSP5多肽变体的实例为产生自交替mRNA剪切事件的蛋白质或产生自所述重组MSP4和MSP5多肽的蛋白酶切割的蛋白质。归因于蛋白酶解的变异包括例如在不同类型宿主细胞中表达后末端的差异，这是由于一个或多个末端氨基酸残基从重组MSP4和MSP5多肽上蛋白水解除去。归因于移码的变异包括例如在不同类型宿主细胞中表达后末端的差异。正如上文指出，本发明提供了分离和纯化或同种的重组MSP4和MSP5多肽。可以用作抗原的重组MSP4和MSP5多肽的变体和衍生物可以通过编码重组MSP4和MSP5多肽的核苷酸序列的突变而获得。所述氨基酸序列的变化可通过许多常规方法中的任意一种而完成。通过合成含有突变序列的寡核苷酸可以在特定位点引入突变，该突变序列两旁为限制性位点，可使该突变序列连接到天然序列的片段上。连接后，所形成的重建序列编码具有所需氨基酸插入、置换或缺失的类似物。或者，可以使用寡核苷酸引导的定点特异性诱变方法来提供改变的基因，其中预先确定的密码子可通过置换、缺失或插入而改变。产生上述变化的示例性方法由Walder等人(Gene42:133，1986);Bauer等人(Gene37:73,1985);Craik(BioTechniques，January1985,12-19);Sm他等人(GeneticEngineering:PrinciplesandMethods,PlenumPress,1981);Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488,1985);Kunkel等人(MethodsinEnzymol.154:367,1987)和美国专利4，518，584和4,737,462号披露，它们全部通过引用的方法并入。在本发明的一个方面，重组MSP4和MSP5多肽可以被用于制备特异结合重组MSP4和MSP5多肽的抗体。术语"抗体"用于包括多克隆抗体、单克隆抗体和它们的片段，例如F(ab')2和Fab片段以及任何重组产生的结合配偶体。如果它们以大于或等于约107M-l的Ka结合重组MSP4和MSP5多肽，抗体则被定义为特异结合的。结合配偶体或抗体的亲和力可使用常规技术容易地测定，例如Scatchard等人AnnN.YAcad.Sci.,51:660(1949)描述的技术。使用本领域公知的方法可从许多来源例如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠或大鼠容易地生成多克隆抗体。本发明还包括源自SEQIDNOS:1,2，3,4，5,6,7禾B8的核苷酸序列的分离片段和寡核苷酸。本发明还包括了由这些片段和寡核苷酸编码的多肽。本发明范围内的核酸序列包括分离的DNA和RNA序列，它们在中度或高度严格性条件下可以杂交到本文公开的所述天然重组MSP4和MSP5核酸上，而且这些DNA和RNA序列编码重组MSP4和MSP5多肽。如本文所使用，为本领域普通技术人员知晓和为Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ed.Vol.1，pp.1.101-104,ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)确定的中度严格性条件包括使用5XSSC，0.5%SDS,1.0mMEDTA(pH8.0)的预洗涤溶液用于硝酸纤维素滤膜，42°C，50°/。甲酰胺，6XSSC的杂交条件(或其他类似杂交溶液，例如以50°/。甲酰胺配制的42°CStark's溶液)和约60°C，0.5XSSC，0.1%SDS的洗涤条件。高度严格性条件定义为上面的杂交条件，以及68°C,0.2XSSC,0.1%SDS的洗涤条件。本领域技术人员会认识到根据探针长度等因素需要时可以调节温度和洗涤溶液的盐浓度。由于已知的遗传密码简并性，其中一个以上密码子可以编码同一个氨基酸，因此一个DNA序列可以不同于SEQIDNO:1-8显示的序列但仍可编码具有SEQIDNO:9-22的氨基酸序列的重组MSP4和MSP5多肽。此类变体DNA序列可以来自沉默突变(例如发生在PCR扩增中)，或可以为天然序列故意诱变(delibemtemutagenesis)的产物。本发明因此提供了编码重组MSP4和MSP5多肽的等效分离DNA序列，这些DNA序列选自于(a);(a)包含SEQIDNO:1-8的核苷酸序列的DNA;(b)可与(a)中的DNA在中度严格性条件下杂交并编码重组MSP4和MSP5多肽的DNA;以及(c)因遗传密码与(a)或(b)定义的DNA简并且编码重组MSP4和MSP5多肽的DNA。由此类DNA等效序列编码的所述多肽包括在本发明内。等效于SEQIDNO:1-8的DNA序列的DNA将在中度严格性条件下与编码包含SEQIDNO:9-22的氨基酸序列的多肽的DNA序列杂交。由此类DNA编码的重组MSP4和MSP5多肽的实例包括但不限于重组MSP4和MSP5多肽片段以及包含失活N-糖基化位点、失活蛋白酶处理位点或上文所述的保守氨基酸置换的重组MSP4和MSP5多肽。源自其他疟原虫物种的DNA编码的所述多肽也包含在内，其中所述DNA将与SEQIDNO:1-8的DNA的互补序列杂交。含有编码重组MSP4和MSP5多肽的核酸序列的重组表达载体可以使用公知的方法制备。所述表达载体包括可操作地连接到适宜转录或翻译调节核苷酸序列的重组MSP4和MSP5DNA序列，这些调节核苷酸序列例如来自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的核苷酸序列。调节序列的实例包括转录启动子、操纵基因或增强子、mRNA核糖体结合位点和调控转录和翻译起始和终止的适宜序列。当所述调节序列的功能与所述重组MSP4和MSP5DNA序列有关时，核苷酸序列被"可操作地连接"。因此，如果所述启动子核苷酸序列调控重组MSP4和MSP5DNA序列的转录，启动子核苷酸序列被可操作地连接到重组MSP4和MSP5DNA序列。此外，在所需宿主细胞内通常由复制起点赋予的复制能力和可鉴定转化体的选择基因可整合到所述表达载体。此外，编码适宜信号肽的序列可以整合进表达载体，这些信号肽在自然情况下不与重组MSP4和MSP5多肽关联。例如，用于信号肽(分泌前导)的DNA序列可以通过符合读框的方式融合到所述重组MSP4和MSP5核苷酸序列，使得所述重组MSP4和MSP5多肽开始翻译为包含该信号肽的融合蛋白。在所需宿主细胞中有功能的信号肽增强重组MSP4和MSP5多肽的细胞外分泌。所述信号肽在重组MSP4和MSP5多肽从所述细胞分泌出后可以从所述重组MSP4和MSP5多肽上切割下来。用于原核宿主细胞的表达载体一般包含一个或更多表型可选择标记基因。表型可选择标记基因是例如编码赋予抗生素抗性或提供自养需求的蛋白质的基因。用于原核宿主细胞的有用表达载体的实例包括源自市售质粒的表达载体。市售载体包括为蛋白质的表达专门设计的载体。这些载体包括pMAL-p2和pMAL-c2载体，它们用于融合到麦芽糖结合蛋白的蛋白质的表达(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)。通常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括(3-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖启动子系统(Chang等人，Nature275:615,1978;和Goeddel等人，Nature281:544，1979)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，Nucl.AcidsRes.8:4057,1980;和EP-A-36776)禾ntac启动子(Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,p.412,1982)。用于重组MSP4和MSP5多肽表达的适宜宿主细胞包括原核细胞、酵母或更高等的真核细胞。优选为昆虫细胞。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适宜克隆和表达载体被例如Pouwels等人CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,NewYork,(1985)描述。也可以使用无细胞翻译系统利用源自本文公开的DNA构建体的RNA来产生重组MSP4和MSP5多肽。应理解的是，本发明旨在包括之前描述的分离或纯化形式的蛋白质或多肽，不论是使用本文描述的技术还是其他方法而获得。在本发明的一个优选实施方式中，所述重组MSP4和MSP5多肽基本不含人组织和人组织组分，核酸，外来蛋白和脂类，和外来微生物例如细菌和病毒。还应理解的是，本发明包括了具有基本相同的生物学和免疫原性的等效蛋白。取决于本发明所述重组MSP4和MSP5多肽的用途，理想情况下可对它们进行标记。适宜标记的实例为放射性标记、酶标记、荧光标记、化学发光标记和发色团。标记本发明的蛋白质的方法与广泛用于标记免疫球蛋白的方法没有本质差异。通过使用抗本发明的抗原的标记抗体或使用抗所述抗原的抗体的免疫球蛋白作为间接标记可避免标记的需要。—旦得到本发明所述重组MSP4和MSP5多肽，它们用于产生与之反应的多克隆和单克隆抗体。因此，可以使用本发明的蛋白质或多肽按照本领域已知技术来免疫动物宿主。此类技术通常涉及接种，但它们也可涉及其他给药方式。施用足量的所述多肽以在动物宿主中引起免疫原性应答。可以使用产生抗本发明的抗原的抗体的任何宿主。一旦动物被免疫并经过开始产生抗该抗原的抗体的足够时间，可以回收多克隆抗体。一般方法包括从所述动物取出血液并从取出的血液分离血清。可以使用含有抗该抗原的抗体的血清作为抗该抗原的抗血清。或者，可从所述血清中回收所述抗体。亲和纯化是从血清中回收抗该抗原的纯化多克隆抗体的优选技术。也可以制备抗本发明的抗原的单克隆抗体。生产与所述抗原反应的单克隆抗体的方法包括下列步骤以所述抗原免疫宿主；从宿主脾脏回收产生抗体的细胞；将所述产生抗体的细胞与缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤；通过在包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基上培养来选择至少一个杂交瘤;鉴定产生抗所述抗原的抗体的至少一个杂交瘤;培养所述鉴定的杂交瘤以产生可回收量的抗体；以及回收由所述培养的杂交瘤产生的所述抗体。这些多克隆或单克隆抗体可以用于许多场合。其中有相应蛋白的中和。它们还可用于检测生物制品中的疟原虫抗原，或用于纯化相应蛋白、糖蛋白或它们的混合物，例如用于亲和层析柱时。所述重组MSP4和MSP5多肽可以用作抗原来检测生物样品中疟原虫特异性抗体的存在和评价此类抗体在这些生物样品中的水平，这些抗体水平组成当前或之前感染的信号。此类生物样品自然包括人组织和人细胞，以及生物学液体例如包括人血清的人体液。当在免疫测定中用作试剂测定抗疟疾抗体的存在或浓度时，本发明的所述抗原提供了一种方便、快速、敏感和特异的检测。更具体而言，可以使用本发明的抗原通过熟知用于检测或定量液体中体液组分的免疫测定法来检测疟疾。因此，通过二级反应例如沉淀或凝集可以直接观察或测定抗原-抗体相互作用。此外，还可以使用免疫电泳技术。例如，可以使用琼脂电泳和随后抗血清反应的经典组合，以及双向电泳、火箭电泳、和聚丙烯酰胺凝胶谱的免疫标记(蛋白印迹或免疫印迹)。可使用本发明所述抗原的其他免疫测定法包括但不限于放射免疫测定法、竞争性免疫沉淀测定法、酶免疫测定法和免疫荧光测定法。应理解的是还可以使用比浊法(turbidimetric)、比色法和比浊法(nephelometric)技术。基于蛋白印迹技术的免疫测定法是优选的。通过将所述免疫试剂中的一种，或本发明的抗原或抗该抗原的本发明所述抗体，固定在载体表面但保留所述试剂的免疫反应性可进行免疫测定。所述相互免疫试剂可以不标记或标记，使得免疫反应性也得到保留。这些技术特别适合用于酶免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和竞争性抑制酶免疫测定(C正IA)。当本发明所述抗原或抗所述抗原的抗体吸附到固相支持物上时，所述支持物通常为玻璃或塑性材料。塑造成板、管、珠或盘形的塑性材料是优选的。适宜塑性材料的实例为聚苯乙烯和聚氯乙烯。如果所述免疫试剂不容易结合到所述固相支持物上，可在所述试剂和所述支持物之间插入载体材料。适宜载体材料的实例为蛋白质(例如牛血清白蛋白咸化学试剂(例如戊二醛或尿素)。所述固相的包被可使用常规技术进行。本发明提供了免疫原性的重组MSP4和MSP5多肽，更具体而言，提^^了用于制备抗疟疾的疫苗组合物的保护性多肽。通过给易受疟疾感染的哺乳动物施用所述多肽，这些多肽因此可以用作疫苗。可以使用常规的给药方式。例如，可通过口服、舌下、呼吸道或肠胃外途径给药。当所述疫苗经肠胃外给药时，皮内、皮下、肌内和静脉内给药途径是优选的。感染疟疾哺乳动物的免疫应答的主要目的是灭活疟原虫和便于杀灭疟原虫以及清除感染寄生虫的红细胞。免疫应答中B细胞应答主要负责灭活红内期的疟原虫。实现该目标的主要方式是通过中和感染性(抑制红细胞侵入)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。耙抗原必须是保守的，以有效防御其他寄生虫菌株的再感染，还必须可诱导T助细胞活性(CD4+)以产生长期记忆应答。破坏感染寄生虫细胞的T细胞介导机制是通过细胞毒性(CD8+)T淋巴细胞(CTL)提供的。该淋巴细胞可以在感染的红前期识别肝细胞表面与I类组织相容性抗原结合表达的重组MSP4和MSP5抗原。下面是一种疫苗，它包括(A)天然信号序列(B)C端His标签以及(C)类似恶性症原虫抗原酸性重复区域的酸性重复区域，其与区域(MSP4p20)的保护性抗体应答关系最为密切。DHSAEAENGDYNEQGDDHGDDHGDDHGDDHGDEQDGEDYDDAEDDDLYELSEVDENANLCLD丽GGCGDDKICENLGKGIVKCLCKPGYKLVGTECVEHHHHHH[SEQIDNO:30]本发明所述重组MSP4和MSP5多肽和疫苗在宿主体内诱发中和抗体的保护性水平(即体液应答期间针对所述抗原所引发的抗体，体液应答直接阻断了病原体感染红细胞的能力)的能力可以通过佐剂(免疫刺激剂)乳化、整合入脂质体、偶联适宜载体或这些技术的组合得到增强。例如，本发明所述重组MSP4和MSP5多肽可以与常规佐剂施用，例如磷酸铝和氢氧化铝凝胶，其量足以加强宿主体内的体液或细胞介导的免疫应答。所述免疫程序将取决于几个因素，例如宿主的感染易感性和宿主的年龄。可以给宿主施用本发明的单一剂量疫苗或可以进行间隔施用几种剂量的初次免疫过程。需要时，在初次过程后可以施用用作加强剂量的随后剂本发明的MSP4和MSP5蛋白、多肽和疫苗可以足够的量给宿主施用以诱发阻止或抑制寄生虫在体内感染和复制的免疫应答，以便降低宿主体内的寄生虫负荷并减轻临床症状。通过将本发明的多肽以每剂量为10到500毫克、优选每剂量为约50到100毫克的量给宿主施用可以获得免疫原性应答。本发明的蛋白质和疫苗可与生理学上可接受的载体一同施用。例如可以使用稀释剂如水或盐溶液。本发明的另一方面提供了DNA接种的方法。所述方法还包括在带或不带载体分子情况下给个体施用编码重组MSP4和MSP5多肽的核酸、所述蛋白质和多肽本身的任意组合。在实施方式中，所述个体为动物，优选地为哺乳动物。更优选地，所述哺乳动物选自人、狗、猫、牛、猪和马。在一特别优选的实施方式中，所述哺乳动物为人。本领域技术人员知晓核酸疫苗(例如DNA疫苗)和核酸疫苗技术以及基于蛋白质和多肽技术的概念、应用和效果。基于核酸的技术允许将编码重组MSP4和MSP5多肽的核酸(裸露或封装)直接施用于组织和细胞，而无需在施用前生产被编码的蛋白质。该技术基于这些核酸被受体生物细胞摄取和表达以产生受体免疫系统对之应答的免疫原决定簇的能力。一般情况下，所述表达抗原呈现在业已摄取和表达该核酸的细胞表面，但所编码抗原的表达和输出到受体个体的循环系统也在本发明的范围内。此类核酸疫苗技术包括但不限于裸露DNA和RNA的输送和编码MSP4和MSP5多肽的表达载体的输送。尽管该技术名为"疫苗"，但它同样适用于不会引起保护性应答的免疫原性组合物。此类不诱导保护作用的组合物和方法包括在本发明内。尽管将编码重组MSP4和MSP5多肽的核酸和载体分子以裸露核酸输送在本发明以内，但本发明还包括作为更大或更复杂组合物一部分的核酸的输送。包括在这些输送体系内的有病毒、病毒样颗粒或含有编码重组MSP4和MSP5多肽的核酸的细菌。此外，本发明的核酸和载体分子与可透过细胞的化合物(例如脂质体)的复合物包括在本发明的范围内。其他化合物，例如分子载体(EP696,191，Samain等人)和核酸疫苗输送系统为技术人员知晓，并例示在例如WO9306223和WO9011092，U.S.5,580,859和U.S.5,589,466(Vical公司专利)，它们通过引用的方式并入本文，并且这些化合物可以制备和使用而无需不适当或过多的实验。本发明将在下列具体实施方式中得到更为详细的描述。长期以来人们已知道使用杆状病毒表达系统产生的抗原忠实地含有参与半胱氨酸键形成的复合物结构，且适合于结晶研究。这些抗原通常被认为是检测其他系统产生的抗原的"金标准"[24,25]。由于PfMSP4和PfMSP5均含有由二硫键形成的EGF样结构域，它们可能利于在杆状病毒系统内生成。但是，正如通常使用的所有表达系统一样，蛋白质产量受到了恶性疟原虫异常密码子使用的有害影响[26,27]。此外，这些高度富含A+T的序列经常在大肠杆菌内发生突变[28]，且很少含有独特的限制性酶切位点。出于这些原因，采用Withers-Martinez(1999)[29]描述的方法设计并构建了合成基因。设计合成基因基于当时得自GenBank的序列资料和预期将来用途包括人攻击模型(challengemodel),选择常见的氨基酸序列PfMSP4NF54序列(保藏号AF295318)和PfMSP53D7序列(保藏号AF106476)用于修饰。与此同时，为了丰富序列数据集和进行种群间和种群内分析以及物种间分析，使用取自如下具有不同地方性的位点的样本进行了多态性研究。msp4和msp5基因多态性概况研发抗恶性疟原虫的疫苗时，抗原多态性是一项重要的考虑因素。迄今为止检测过的最有前景的红内期候选疫苗是裂殖子表面蛋白l(MSPl)和顶端膜蛋白(AMA1[1-3]。但是，与编码不易被免疫效应物机制接近的抗原的基因相比，这些和其他表面抗原基因表现出高得不成比例的非同步单核苷酸多态性(nsSNP)的频率[4-6]。作为一个混杂因素(compoundingfactor),这些nsSNP经常导致根本性的氨基酸置换，这些氨基酸置换主要聚集在多肽最易被宿主免疫系统接近的区域。据信，所形成的氨基酸置换可通过改变重要B细胞和T细胞表位在免疫侵入中发挥作用[34,38]。因此，以此类抗原完整重组形式进行接种可能会引起菌株特异性的保护[4,8]。普遍认为通用有效的疫苗会包括源自多阶段靶点(multi-stagetarget)的几种表面蛋白的保守区域[30]。到目前为止，仅有有限量的关于PfMSP4和PfMSP5多态性的资料[11,31,32]。为了充分探究来自疾病高度流行地区的PfMSP4和PfMSP5二者的多态性，开展了序列分析研究，其结果在Poison等人2005[33]推出。总之，发现尸>^5基因序列高度保守，并潜在地处于纯化选择中。据发现，户/m^^基因序列对一种恶性疟原虫表面抗原而言相对保守[5]并含有多态性位点的N端聚簇，该N端聚簇包括两个潜在地处于平衡选择中的位点(N52和G74)。该发现可解释所观察到的旁侧序列内部显而易见的中性(或搭载)多态性的聚集，它可以与B细胞或T细胞表位的变异联系在一起。典型情况下平衡选择起于携带影响分子免疫识别的"差异"的两个等位基因序列的存在。当等位基因A在群体中最为常见时，成为等位基因B是有利的，这是因为该等位基因不会被免疫系统以及显性等位基因所识别。因此，等位基因B变得更加普遍，直至其成为最常见类型，免疫系统也将识别等位基因B，此时成为等位基因A是有利的。首先，平衡选择的存在表明所述MSP4蛋白是有效免疫机制的靶点。其次，这表明为了保护疫区的人们，你需要用这两个等位基因来接种，或排除该蛋白质的此区域，迫使免疫系统攻击保守区域。至于近来鉴定的可特异结合肝细胞的两个源自PfMSP4的肽[34]，第一个肽(代表MSP4p4076-92位的残基)携带一个半保守的多态性位点(A81)，而第二个肽(代表MSP4p40113-135位的残基)含有一个缺失(115-119位)和/或一个半保守的多态性位点(G119)。在现有的PfMSP4数据集内，这些序列内部差异出现的频率相对低，从而支持了这一观点，即它们是重要的功能位点(注意这些序列也由SALSA所代表，图2)。最后，还有一个潜在地处于平衡选择的位点V190,它位于EGF样结构域首个半胱氨酸上游17个残基处，该位点可能也参与了B细胞或T细胞表位的修饰。合成基因的构建；PfMSP4首先，为了便于蛋白质分泌，除去从EGF结构域下游的3个残基起的全部序列。这包括了GPI锚定信号，因为己知杆状病毒系统可以使用此序列来整合昆虫细胞GPI部分并导致该蛋白在细胞表面定位(Bonnet等人2006)。此外，保留了天然信号MSP4序列，这是因为已知杆状病毒表达系统会正确切割重组类似物中的天然MSP1信号序列，尽管MSP4的天然切割N端尚未被确定。为了防止N-糖基化(尚不知疟原虫会发生N-糖基化，但该反应确实会发生在杆状病毒PfMSP4序列的两个潜在位点上)，用丙氨酸取代丝氨酸残基Sm和S73。两个残基均具有小的侧链(Ser=HO-CHr，Ala=CHr)，尽管没有报道表明这些位点在自然状态下是多态性的，但据信这些变化会对该蛋白的局部或宏观结构产生微小影响。一旦加入余下包括C端六个组氨酸标签和终止密码子的特点，则使用CODOP程序设为粉纹夜蛾(7Hc/zo/7/附/am')(HighFive)细胞的密码子用法对该序列进行回译(表1)。NF54和合成基因的MSP4密码子用法<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>CODOP是执行密码子优化的Unixperl脚本，该程序由Hale和Thompson提出[35]并在其他文献中详细描述[29]。随后采用手动干预来优化重新编码密码子的核苷酸序列以生成具有60-65°CTm的38x40寡聚核苷酸(mer)并含有数个独特的限制性位点以便于亚克隆(图3)。该基因的总GC含量增加了15%，显著增加了亚克隆的易操作性和效率并降低大肠杆菌在构建体操作中犯下的复制错误的频率。所述38个重叠寡核苷酸得自Eurogentec(仅有标准纯化)，它们每个长40个碱基。根据前述方法实现基因装配和扩增[29]。简而言之，混合等摩尔量(各25pM)的基因寡核苷酸，并被稀释10倍到含1pl的pfoDNA聚合酶(Stratagene)，5pi10x反应缓冲液，200pMdNTP和2p125mMMgS04的50plPCR反应液中。PCR程序由94°C，lmin的变性步骤和随后的25个循环(94。C，30s，52。C，30s和72°C，2min)组成。为了扩增全长基因产物，将5nl基因装配反应液稀释10倍达到50(iLPCR反应液，其含有1pfoDNA聚合酶(Stratagene)，5pl10x反应缓冲液，200^MdNTP,2jil25mMMgS04和各为500nM的第1禾B20号外基因装配寡核苷酸。PCR程序由94°C，lmin的1个循环，25个循环(94。C，45s，68。C，45s和72。C，2min)和72。C，10min的最终延伸步骤组成。凝胶提取图4所示的主要和大小正确的片段，并将其克隆进pMOSBlue进行测序，最后将其转移到载体pVL1393以整合进杆状病毒基因组(Baculogold，PharMingen)。该表达构建体被称为MSP4p40/His。修饰的PfMSP4构建体还组装了另外两个MSP4构建体，分别名为MSP4-EGF/His和MSP4p30/His(图5)。所述构建体MSP4-EFG/His设计用于仅表达MSP4EGF样结构域，主要用于结晶研究。通过高保真PCR生成含有PlasmoDB所述的预测信号序列(1-20残基)和2个下游残基的PCR片段。反应含有基因装配寡核苷酸1和反向引物MSP4modl(5'-TAT-AGC-AGA-TCT-TTG-TCG-AAG-TTG-ATG-GTG-CA-3')[SEQIDNO:23]，该反向引物含有一个万g/II限制性位点。所述合成基因克隆pMosMSP4被用作模板。所形成的86bpPCR产物以限制性内切酶5，HI和Bg/II切割并凝胶提取。然后将该产物连接(T4DNA连接酶；NEB)到之前制备好的pMosMSP4载体，同样以BmHI和Bg/II消化以去除EGF样结构域上游的全部序列，只余下D205到H252之间残基。所述MSP4p30/His构建体设计用于去除MSP4C端的30个残基(45到74位残基)，其中报道的多态性大部分位于此处(在图5中突出显示)。使用基因装配寡核苷酸l，反向引物MSP4mod11(5'-ATATGGCTGCAGCCAAGATCCTCATGTTAAGCAT-3')[SEQIDNO:24]和pMosMSP4载体作为模板来产生编码1到44位残基的PCR片段。该片段大小为154bp，分别在3'和5'最末端具有ffl和户WI的限制性位点。使用限制性内切酶尸WI和I从pMosMSP4载体切下编码A75残基下游全部序列的DNA片段(它位于pMOSS说z/e载体序列内的MSP4ORF下游)。这两个DNA片段在T4DNA连接酶(NEB)反应中以等摩尔的量结合并于4°C下温育3天以上。将2连接酶反应液在溴化乙啶染色的1%琼脂糖凝胶上分离，结果揭示了几种产物的存在，包括长724bp的所需产物。使用基因装配寡核苷酸1和20和连接反应物作为模板通过高保真PCR扩增该产物，凝胶提取该产物并将其克隆回pMOSSS/we。与合成基因一样，在被克隆到表达载体pVL1393前对MSP4-EGF/His和MSP4p30/His基因序列进行证实。从前述合成MSP4基因还设计和构建了另一个表达构建体。该表达盒设计允许该蛋白质的非多态性、抗蛋白酶和结构完整的C端区域(称为p20，并在下面部分描述)的表达。该构建体包括MSP4p40/His的jc6al克隆位点下游的全部核苷酸序列，因此它编码Leuno(不包括在内)下游的所有残基。为了便于蛋白分泌，使用基因装配寡核苷酸1和反向引物MSP4p21rev(ATTAATCTAGAGGCTTTTCTTCACCCAAGATCCTCATG)SEQIDNO:25生成编码MSP4信号序列以及下游9个残基(Met广Pro49)的PCR片段并将其连接到Bamffl/XbaI双消化的pMosMSP4p40/His。该构建体被称为MSP4p21/His，其序列在连接到pVL1319以整合入杆状病毒基因组前进行证实。从上述合成MSP4基因还设计和构建了另外两个补充类似表达构建体。这些构建体命名为MSP4p21ssl和MSP4p21ss2,二者均编码Leul30下游的所有残基。为了便于蛋白分泌，加入与MSP4p21/His相同的编码MSP4信号序列的序列(Met广Pro49)。此外还加入了MSP4p40/His构建体的一些密码子，它们编码MSP4p21ssl构建体中的序列(Asn5Q-Ser57和Leu!3Q)和编码MSP4p21ss2中的氨基酸残基Leu13o。PfMSP5合成基因的构建橫用与尸/m/^相同的方法来设计合成基因。从3D7菌株的GenBank蛋白序列开始，除去GPI锚定信号上游3个残基起的全部序列并替换为六组氨酸标签，3个糖基化位点被丝氨酸到丙氨酸的突变所破坏(S83，S102和S126)，N端信号序列保持完整。CODOP所执行的密码子修饰记录在表2中，图6显示了整条合成基因序列。3D7和合成基因的MSP5密码子用法<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>按照前述方法进行PfMSP5合成基因的PCR装配，由于该序列内缺乏重复基序，因而生成了高纯的终产物(图7)。凝胶提取该PCR产物并将其克隆进pMOSBIue并在转移到pVL1393载体以整合入杆状病毒基因(Baculo-gold，Stratagene)组前进行测序。评价根据此方法制备的构建体，其结果记录在下列实施例中。实施例1PfMSP4在昆虫细胞中的表达使用标准方法[36]生成病毒后，在150cn^培养瓶(Corning沖进行试感染。病毒以感染复数为10进行1小时的感染。3天后收集上清并分批在talon树脂上纯化。使用MSP4p40/His(40kDa)和MSP4p30/His(30kDa)构建体观察到预测大小的蛋白产物，但使用MSP4-EGF/His构建体没有观察到蛋白质(将在下文进一步讨论)。MSP4p21/His的表达仍处于初步分析阶段。MSP4p40和MSP4p30的生产被放大并从箱转移到旋转瓶培养。为了优化蛋白产量和限制产物降解(常见于更为剧烈的旋转瓶条件下)，进行了时间过程实验。在草地夜蛾(5^^^/m;h/g^mfo)(SF9)昆虫细胞和HighFive昆虫细胞中建立起感染MSP4p40/His或MSP4p30/His的旋动培养(210mL)。在24h，30h，36h,42h,48h,54h,60h和72h时收集样品(8ml)，显微镜下分析样品进行细胞死亡统计，然后以20mMTrisHC1(pH8);500mMNaCl对样品进行透析。使用试管方案在takm树脂上纯化蛋白，并将蛋白洗脱到100pL100mM咪唑；20mMTrisHC1(pH8);500mMNaCl。绘制每次感染随时间变化的细胞死亡百分比并平行分析每次洗脱20pL样品的构建体和细胞类型(图8)。正如预计一样，Highfive细胞的蛋白产量远高于SF9细胞。但是，观察到在长表达期確过48h)后，此时蛋白开始降解，MSP4蛋白没有完全降解，而是降解成约为20kDa的更小稳定产物(MSP4p20)。在MSP4p30感染的后期也观察到该产物。由于所有蛋白都是通过C端his标签纯化的，该产物必须包括EGF样结构域和一些上游序列，以形成抵抗蛋白酶的紧密结构。这与Wang等人(2001)[13]的发现吻合，即EGF样结构域的上游区域携带有还原敏感性的B细胞表位。实施例2N端测序和质谱使用得自时程实验的信息，通过在不同时间点收集培养SN生成三种不同的纯MSP4蛋白制品。首先，全长MSP4即MSP4p40，其次，全长修饰产物即MSP4p30，第三，降解产物MSP4p20。标准HighFive旋动培养中每个产物的平均蛋白产量分别为8mg/L,6mg/L和15mg/L，这些平均蛋白产量反映了收集时间，即产物收集越早蛋白产量越低。根据近来市售杆状病毒(Henogen)性能的进展，据信这些产量是最保守估算。每个产物的N端测序生成了一个强而清晰的信号(p40:从残基41开始-MRILG,p30:从残基41开始-MRILA，p20:从残基132开始-KSPKE)，并揭示体内恶性疟原虫的信号序列可能实际上是PlasmoDB预测长度的两倍(40个残基比20个残基)0lttp:〃plasmodb.org/pIasmodb/servlet/svpage=gene&sourceid=PFB0310c)。MSP4p40和MSP4p20的特性也已为质谱证实，这些蛋白分别具有23.554kDa和13.714kDa的实际分子量。杆状病毒表达的MSP4的N端序列可能识别寄生虫使用的信号序列。首先，MSP4-EGF/His构建体含有PlasmoDB预测的信号序列和3个下游残基，并且从未在培养SN中检测到。其次，在尸/mw4基因内部鉴定的多态性位点的N端聚簇从第45个密码子开始。正如Poison等人2005[33]报道的分析表明，密码子45下游的基因区域是有效免疫应答的耙点，该基因区域似已通过群体内平衡等位基因型(涉及残基52和74，参见图5)进化出对免疫应答的逃避机制。因此有可能加工后的PfMSP4N端由4个构成信号序列切割位点(MRIL)的保守残基和随后紧接的多态性位点的聚簇组成。这些多态性位点能够降低优先针对该蛋白更易接近区域的免疫应答的有效性。实施例3信号序列疏水性为了进一步证实杆状病毒系统对MSP4构建体使用的信号切割位点复制了天然切割，进行了一项针对之前报道的天然恶性疟原虫信号序列的生物信息学研究。2001年发表的一项研究对已知恶性疟原虫信号序列切割位点进行了比较[37]。由于获得此类数据存在技术上难题，仅有10个此类序列存在。出于本研究目的，选择和提交了(通过Pasteur服务器)蛋白序列的80个残基以计算局部疏水性的数值，这些残基主要集中在每个蛋白报道的信号序列切割位点周围。图10显示了Nacer于2001年报道的三个蛋白切割位点的疏水性曲线和杆状病毒系统的MSP4p40的疏水性曲线。在上方图中，KAHRP和MSP1信号序列表现出经典的疏水性曲线，其切割刚好出现在疏水性数值跨过代表中性的直线后(正对负)。已知PfMSPI信号的切割是由杆状病毒系统忠实地进行的(Bonnet等人2005)。局部疏水性的相同显著变化没有出现在MSP4p40蛋白序列N端预测的切割位点，切割实际上发生在疏水性最大的局部变化后的下游(负对正)。该曲线符合使用S-抗原所观察到的结果，因此并非独特的，这为MSP4p40信号序列长40个残基这一发现增加了分量。实施例4Pfls4SP5在昆虫细胞中的表达使用前述方法生成MSP5/His病毒原液并根据用于MSP4p40/His的方法进行试感染和时间过程研究。如图ll所示，检测到SDS-PAGE凝胶电泳上分别以45、35和10kDa迁移的源自PfMSP5的三个不同产物。有趣的是，观察到两个较大的产物同时出现在时间过程实验的早期，而不是生成较大产物并随后降解形成较小产物。使用PfMSP4观察到的另一明显差异是研究的两个细胞系相反的蛋白质生产能力，即SF9细胞产生蛋白质的能力远超过生长更快和更脆弱的HighFive细胞。这一发现本身是表明PfMSP5具有显著不同于PfMSP4性质的首个证据。第二个证据来自N端测序数据。实施例5N端测序和质谱目前尚不能获得MSP5表达的两个最大产物的N端信号，这表明它们均携带有阻断多肽骨架降解的N端修饰，而这正是N端测序中必不可少的事件。较小的lOkDa产物的测序取得成功，该测序确定该产物的N端起自残基189:YNKVE[SEQIDNO:26]。该产物的身份已为质谱所证实，它具有7.746kDa的实际分子量。此外，MSP5病毒基因组的序列已被证实，YNKVE[SEQIDNO:27]残基只位于正确的ORF内，因此这些尚未被确定的产物一定是PfMSP5。MALDI-MS获得的两个最大MSP5产物的质量数值分别为24.679和20.551kDa，不匹配于任何只源自MSP5蛋白序列的多肽，因而支持这一观点即这些蛋白携带转录后修饰。为了研究可能的N端封闭修饰，将MSP5序列通过ExPASY主页提交到prosite。这表明了两个N-豆蔻酰化4立点的存在，它们可以指导C14脂肪酸的共翻译加入(残基42:GGFTSK处和残基66:GSLPTK处)[38]。然而，尽管这些修饰只位于N端并可阻止N端测序，它们不会产生适宜的质量数值(分别为24，015和21,301)。但是，基序引导的N端甘氨酸残基修饰不是真核细胞进行的豆蔻酰化的唯一形式。它们还可转录后修饰任何具有豆蔻酰基的N端甘氨酸和任何赖氨酸(下文评述)。带着这些可能性，假设每个MSP5产物(p45和p35)携带两个脂肪酸修饰，得到了24.673kDa和20.553kDa的近似匹配，但目前尚不确定假设位点。实施例6脂肪酸修饰和疟原虫真核细胞使用了几种不同类型的额外翻译修饰，包括糖基化、棕榈酰化、N-豆蔻酰化和豆蔻酰化。其中此处表达的MSP5蛋白不具有第一种翻译修饰。在合成基因的构建过程中从该蛋白序列除去所有的糖基化位点，因为已知恶性疟原虫不会进行该类修饰。真核生物的第二类修饰尚未得到很好阐明，据信棕榈酰化可通过依赖酶和不依赖酶的途径发生。迄今为止尚无任何棕榈酰化的恶性疟原虫蛋白的报道。但是，已经表明蛋白质的N-豆蔻酰化在恶性疟原虫中的重要性。己鉴定出一个PfN-豆蔻酰转移酶基因的同系物(PlasmoDBPF14一10127)，并发现其与人类和酵母基因直向同源物高度同源[40，41]。如果该酶在疟原虫的作用与其在其他寄生原生动物例如布氏锥虫(7>_y;awosoma6race/)禾B硕大利什曼原虫(Le^/zmam'am咖r)一样重要，则多个蛋白质的N-豆蔻酰化预计对寄生虫生长起着必不可少的作用[41]。事实上，已表明PfADF(核糖体因子)的N-端豆蔻酰化对介导GTP结合和发挥酶活性起着重要作用[42]。已表明该脂肪酸修饰(N-端甘氨酸和内部赖氨酸上)在较高等的真核生物中起着许多作用，其中涉及蛋白膜定位和蛋白-蛋白相互作用的稳定[39,43-45]。实施例7杆状病毒系统中由于昆虫细胞的杆状病毒感染是更高等的真核生物系统，它可以执行许多更为进化类型的蛋白修饰。事实上，该系统已被专门用来生产几种N-豆蔻酰化的蛋白，其中了解最多的蛋白是NAP-22[46]。实施例8制备抗体通过EUROGENTEC使用标准免疫方法生成重组MSP4p40、MSP4p20和MSP5(p45和p35)的兔多克隆抗血清。免疫前所有兔对MSP4和MSP5呈阴性(每种抗原两只兔子)，3至4次免疫后经ELISA测定产生了高效价的特异血清抗体。图12显示了抗还原和非还原重组蛋白的终点效价。如图B所示，当所述抗原被还原时，来自8号兔的抗体对MSP4p20的识别减少了50%以上，这表明MSP4p20蛋白的许多表位是构象型的。由于还原主要影响具备二硫键的结构，该数据表明MSP4p20的EGF样结构域保持完整并参与了形成至少一个B细胞表位。实施例9源自寄生虫的MSP4使用前述的多克隆免疫血清生成免疫印迹的初步数据，图13显示了该数据。MSP4的数据与R.Coppel小组[9拨表的结果一致，即只在后期寄生虫制品的溶于TritonX100的部分中检测到一个40kDa的蛋白质(图13A)。为了研究MSP4C端区域MSP4p20的性质，亲和纯化了抗固定的MSP4p20(Amersham:NHS-活化Sepharose4快速流动)的兔血清库(R6-9)和2002年采集自塞内加尔Dielmo的人血清库。当用这些血清探测非同步寄生虫材料时(以SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上)，除之前在40kDa处观察到的条带，还观察到一条约为18kDa的条带(图13B)，这表明自然感染中MSP4抗原可能经历了类似于MSPlp42的蛋白酶解加工或可能被蛋白酶以自限方式降解，如杆状病毒感染后期所获得的。为了进一步证实恶性疟原虫裂殖子上MSP4p20表位的自然存在，对风干的非同步生长的寄生虫培养物迸行了间接免疫荧光测定(IFA)。使用人抗MSP4p20可见裂殖子特异性染色，而单用二抗或使用未感染症疾的血清未观察到有染色(图13C)。实施例10源自寄生虫的MSP5使用抗杆状病毒表达的MSP5制备的多克隆血清得到了免疫印迹数据，该数据表明其曲线与其他研究组发表的结果迥异，这些研究组显然面临检测MSP5的难题并暗示它是低水平表达的。本发明的免疫印迹数据显示了抗MSP5特异性血清的强烈信号(图13D)。与MSP4不同的是，源自寄生虫的MSP5也存在于粗制备的寄生虫提取物的膜部分，这表明它没有采用与仅携带一个GPI锚点的蛋白质相同的方法来分部(fractionate)。事实上，当考虑到还原的寄生虫材料时，有可能得出结论，即针对假设N-豆蔻酰化的MSP5而制备的多克隆血清可以与其他N-豆蔻酰化的蛋白质发生交叉反应，进一步支持这一观点，即这是恶性疟原虫中一种重要且经常使用的翻译后修饰。实施例11人免疫血清的分析为了证实本发明的蛋白产物为受疟疾感染个体的抗体所识别，采用ELISA分析9名随机选择的半免疫成人的血清，他们生活在塞内加尔一个疾病流行村庄(Didmo)(图14)。所有个体对所有蛋白产物均呈阳性(具有大于对照血清的OD值以及3倍的标准差)。个体间和产物间的相对效价各异，但MSP4和MSP5的总终点效价分别为lxl()S和lx104。使用来自2例MSP4呈高度阳性的个体(个体3和9)和1例MSP5呈高度阳性的个体(个体8)的血清进行蛋白印迹分析(图15)。正如前面使用抗MSP1p19观察到的结果一样，抗含有EGF的裂殖子表面蛋白的人抗体对聚集材料具有特别的亲和力(图15)。实施例12塞内加尔的抗MSP4抗体；保护作用为了进一步研究自然感染中抗MSP4抗体的假设作用，进行了一项流行病学研究。一项大规模前瞻性研究评价了三种不同纯化形式的MSP4即p40，p30和p20，该研究已发表(参见参考文献[47])并在下面的实施例16中得到详细描述。总之，每种形式的重组MSP4蛋白均被强烈识别，其血清阳性率>90%，但表现出显著不同的平均IgGOD比(p40=20±10,p30=12.3±7.3和p2017.3±10)。与观察的所有疟疾抗原一样，抗体效价随年龄增长，必须使用年龄校正渐进模型对抗体效价与保护之间的关联性进行研究。使用这种形式的分析，除了抗MSP4p40的抗体，抗MSP4-p30和抗MSP4-p20的抗体与临床疟疾发作的发生率减少呈正相关(P为别为0.036，0.018+0.067)。这些发现支持MSP4蛋白N端区域内潜在平衡多态性的鉴定[33]，具体而言支持在基于MSP4的疫苗构建体中删除所述蛋白质的该区域这一思想。实施例13塞内加尔的抗MSP5抗体；保护作用为了进一步研究自然感染中抗MSP5抗体的作用，进行了一项流行病学研究。根据别处描述方法(参见参考文献[47])对含有所述两个高分子量形式的MSP5的制品进行分析。尽管MSP5的血清阳性率低于MSP4(59%)，使用年龄校正渐进模型观察到其与减少的临床疟疾发作具有极为显著的统计学相关性(P=0.0028)。正如上文讨论，该抗原可能携带脂肪酸修饰，该修饰可能参与脂类诱导的免疫原性和抗感染免疫的免疫应答，正如GPI修饰所观察到[48];Bonnet等人2005，待发表)。氺氺承总之，PflVISP4具有一个C端EGF样结构域并通过GPI锚定子连接到裂殖子表面。尽管尚不知晓其功能，但它似乎对于寄生虫生存是必不可少的，这是因为尚未观察到存活的PfMSP4"敲除"突变体。三个重组PfMSP4构建体在杆状病毒昆虫细胞表达系统中以可溶、分泌蛋白表达，以优化天然抗原的复制，包括EGF样结构域的适宜折叠。两个构建体分别对应于具有或不具有来自N端(MSP4p30)和MSP4p40附近多态性区域的30个氨基酸缺失的MSP4菌表抗原(不含C端疏水残基以允许分泌)。第三个20kDa的蛋白大致对应于含EGF结构域的MSP4的C端部分(MSP4p20)。使用前述构建体MSP4p21/His正在对该抗原更为直接的表达进行评价。一项纳入205名个体并针对暴露于疟疾的人的自然获得性免疫的横断面研究对抗MSP4抗体对3种不同抗原的应答进行比较。这些个体居住在疟疾中度流行的村庄，其疟疾传播为季节性的。传播季节前，所述3个构建体被强烈识别，其血清阳性率超过90%，但却具有显著不同(PO.01)的平均IgGOD比，MSP4p40，MSP4p30和MSP4p20分别为20±10，12.3±7.3和17.3±10(效价约为5xl(T3)。抗体对MSP4构建体的应答与15岁以下个体的年龄相关，其IgG水平显著低于成年人(PO.OOl,Rho0.25-0.33)。在随后包括传播季节的6个月内，年龄校正模型的临床发作分析表明IgG的存在对缺乏多态性区域的MSP4p30和MSP4p20作出应答而不对具有多态性区域的MSP4p40作出应答，这一特点与疟疾临床发作发生率下降呈显著相关(P0.05，mte#0.75)。总之，这些结果表明(i)使用杆状病毒重组抗原监测到IgG对PfMSP4存在强烈的自然获得性应答；(ii)抗MSP4的IgG与抗临床疟疾的保护有关，以及;(iii)IgG对可变区域的应答可能会干扰本来与保护相关的抗MSP4IgG。实施例14PfMSP4单克隆抗体四个PfMSP4特异性单克隆抗体(mAb)识别3个不同的表位。单克隆抗体L11-16代表了其他2个由p40(完整PfMSP4多态性胞外结构域)诱导的单克隆抗体。其还原非敏感表位(17B)位于PfMSP4的N端部分(non-p20;16A)。它与PfMSP4的异质聚集物反应尤为强烈，该聚集物的形成是还原敏感的(图16A)并可表明非还原(nR)和部分还原(R)SDS-PAGE中的高分子量物质的确是PfMSP4(正如之前的杆状病毒PfMSPlp19)。单克隆抗体F12-7由PfMSP4p30(缺少多态性区域)诱导并识别PfMSP4的p20C端部分的一个还原非敏感的表位(图16B和17B)。与Lll-16相比，它与聚集物反应性明显降低可能是因为它小得多的亲和力克隆同种型KD/MSP5表位L11-16IgGlF12隱7IgGl3.21(TMA1.010-7MC实施例15PfMSP5单克隆抗体7个PfMSP5特异性单克隆抗体(mAb)识别5个不同的表位。单克隆抗体G21-2识别p45和p35PfMSP5产物(图18A)，其表位不是还原敏感的(图18A和19A)。它与不相关联的较高分子量的聚集物反应(图18A，nR)，这些聚集物的形成是还原敏感的(图18A，R)。单克隆抗体J18-14仅识别p45，其表位是还原敏感的(图19B)。它也与聚集物反应。由于这些抗原是通过C端的六组氨酸标签而纯化的，p45和p35被认为具有不同的N端。这些特点表明J18-14表位可能对应于涉及C端EGF结构域和N端的构象结构。两个mAb具有类似的亲和力克隆同种型KD/PfMSP5表位G21-2IgGl2.8l(T8MBJ18-14IgGl4.210'8MD这两个mAb的反应性可以用于确定PfMSP5产物。实施例16暴露个体的免疫血清和队列下列结果是使用(A)取自生活在疟疾流行区域且未表现出疾病症状个体的超免疫血清的对照库，(B)2005年6月收集自Dielmo村(全地方病传播)的个体血清和(C)2000年7月到8月于传播季节幵始前收集自Ndiop村(局部地方病传播)的205份血清的队列而获得的。该队列包括108名男性和97名女性，年龄介于3岁到75岁之间。积极记录随后5个月内的临床发作，共治疗278例临床发作(Perraut等人,JID2005191264-271)。分析方案(1)抗原包被的优化(2)待测试标准血清稀释度的选择(3)队列血清的系统分析(4)中位OD比值的计算(5膽年龄对结果分层(6)入选血清用于侵入和生长抑制的功能分析(7)选定组血清的同种型分析(8)中位OD比作为临床发作数据的函数，以此函数对结果分层并进行统计分析。(1)校正使用l昭/m和0.5吗/ml的2个抗原包被浓度测试来自Dielmo村(2005)的"血清超免疫"(Sffl)和入选个体的稀释系列。结果发现以0.5吗/ml包被是最佳的，因为其结果与对来自村庄和SHI个体使用lpg/ml抗原的结果一样。Dielmo入选个体的应答强于Ndiop，且MSP5对Ab的应答比MSP4更低。参见图20A和20B。(2)校正来自Dielmo的Sffl和阳性血清的滴定结果参看图21A,21B,21C和21D，当使用来自Dielmo(60605)的血清时，抗MSP4的反应为高度阳性OSHI)。但是，与之后2000年Ndiop对列得到的OD相比，该OD相对低。尽管如此，SHI的效价是可比较的。初一看检测的Ab具有相对较低的亲和力，正如曲线的锐角所示(与抗之前研究的MSP1的曲线相比)Sffl抗MSP5的效价=1/1600SHI抗MSP4-40-MSP4-30-MSP4-20的效价=1/3200(3)2000年Ndiop队列分析主要结果SHI在每一检测中进行系统滴定。根据每块培养板上Sffl对照系列计算OD比。对该队列而言，以1/200稀释的OD比都是高的，尽管其实际效价为平均的(4-6之间的OD比值给出了约1/2000的终点效价)(结果如下)效价/OD比的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>(4)应答者的发病率下列表格显示了来自Ndiop2000的个体队列的Ab应答特点阳性应答者被认为具有大于2的OD比。如下所示，MSP4几乎被所有的个体O90M)所识别，MSP5的识别则显著较低(约为60%)。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>(5)与年龄和其他抗MSP应答的相关性参看图22A,22B，22C和22D，与其他抗MSP应答有显著相关性。誦MSPl显著Rho#0.27-0.36-各种MSP4抗原之间Rho>0.9-MSP4和MSP5之间Rho#0.44-0.47与Ndiop队列个体年龄显著相关(P〈0.001,Rho为0.33至0.22)，但是略不如MSP1显著。抗MSP5的Ab应答与年龄相关性最低，但小于15岁的个体具有显著更低的Ab水平。聚焦MSP4:MSP4抗原的差异参看图23，MSP4不同片段的识别水平有极为显著的差异(PO.OOl)。矛盾的是，最小和最大的抗原(p20和p40)比抗原MSP4-30(或MSP4md2)被更好的识别，后者本身仅比全长MSP4(MSP4-40)少30个残基。这一结果很有趣，因为它似乎对应于免疫逃避策略的存在，其中抗体应答集中针对可变结构域。这可以解释IgG应答和侵入抑制之间相关性的缺乏(见下文)。(6)与功能测试的关系参看图24A禾卩24B，根据MSP4p40,MSP4p20，MSP4—mod(p30)(<20>)或MSP5(<2.4>)的中位OD比值的二分法比较，生长或侵入抑制没有显著差异。(这一性质似乎只对本队列的抗MSPlp19Ab表现出显著差异)。但是裂殖子的吞噬作用存在显著差异。这种与裂殖子吞噬作用的功能相关性是预期的，因为该现象与特异Ab效价(因此OD比)的总体上升有关，已知特异Ab效价会以疾病流行地区的年龄函数而增长。参见下列附图(7)同种型分析限制于用于MSP4-40和MSP5的有限数目的血清。结果显示在图25A和25B。对于MSP4-p40，其同种型曲线为IgGl+,lgG3+和不可忽视量的IgG4:-效价和近来流行的寄生虫血症没有相关性。-15岁以上个体的lgG3水平更高(P-0.006)，并与近来疟疾发作的个体相同(P-0.03),这是预计的结果，因为发作在疾病流行地区是与年龄相关的事件。-IgGl和lgG3是IgG应答的重要组分，分别代表了40%和30%的IgG。-对于更强的应答者，IgG应答和侵入抑制之间存在着显著关系(独立IgG亚类)。对于MSP-5，其同种型曲线主要为IgGl-与近来流行寄生虫血症(接近显著性差异P^.06)或年龄的关系没有差异。-IgGl是IgG应答的重要主要组分，总共占75%的应答。-IgG应答和侵入或生长抑制之间没有相关性(与特定的同种型没有关联)。(8)与疟疾发作的相关性使用年龄校正泊松回归模型分析随访期间抗Ag构建体的Ab应答和疟疾发作的发生率之间的关系。在纳入205例来自Ndiop村的个体队列的前瞻性研究中(2000)，这些抗原表现出与抗临床发作的保护之间的显著相关性。关于MSP4与之前指出的观察结果一致，其中IgG对MSP4-p40和MSP4-p30的效价存在显著差异，抗全长抗原(MSP4-p40)的Ab应答与保护没有关联。但是，抗缺乏所述抗原30个残基的可变结构域的构建体(MSP4-p30)和最小抗原(MSP4p20)的Ab应答与保护呈显著相关(P<0.05)。这些发现支持这一观点，即所述蛋白质N端的残基多态性参与免疫逃避，而且针对该蛋白质这一区域的抗体具有(A)有限亲和力(B)表现出菌株特异性，因此对大多数菌株具有有限的效应，或/和(C)由于APL的存在，从未实现亲和力成熟或缺少所需的T细胞辅助。无论涉及何种机制，该数据支持这一观点，即保守蛋白亚基诱导广泛特异性免疫的可能性比全长实体更高，全长实体经常含有认为在免疫逃避中发挥作用的多态性区域。MSP4-40系数标准误差P值速率比下限(C.I.)上限(C.I.)%GM-6.0490.1935<0細0.002360.0016150加3449AgeC131.2150.1021<0.0013.372.7594.116m440cl2-0.22790.12450.0670.79620.62381.016WISP4-30系数标准误差P值速率比下限(C.I.)上限(C.I.)%GM-6.0310,1931<0.0010.0024030細6460.003508AgeCI31.2180.1017<0.0013.382.7694.125M4mdcl2-0.25460.12160.0360.77520.61080.9839MSP4-20系数标准误差P值速率比下限(C.I)上限(C.I.)%GM-6.0170.1914<0.0010.0024380.0016760.003548AgeCI31.2160.1013<0.0013.3732.7664.114m4一20cl2-0.28880.12230.0180.74910.58950.9521发现有发作。鉴于预测可由所述抗原进行的脂肪酸修饰，这些结果对疾病严重程度和抗脂质反应可能具有有趣的提示。MSP5系数标准误差P值速率比下限(G.I.)上限(C.I.)%GM-5邻4O.雪<0.0010.002570.0017650.003741AgeCI31.2010.1016<0.0013.3242.7244.057mso5cl2-0.37060.12430.0028Q.6卯40.5410.8809从上述介绍数据可得出的主要结论是(l)杆状病毒表达的MSP4和MSP5可用作疫苗，其活性与MSPlpl9相当，(2)这些抗原被免疫个体强烈识别(3)高于MSP4(p30，而p20更是如此)保守结构域的IgG识别中位值和高度保守的MSP5抗原的IgG识别中位值与抗临床疟疾的自然保护呈相关性。实施例17MSP4p20表达构建体根据恶性疟原虫MSP4合成基因序列设计两个构建体用于MSP4p20的表达。一个构建体鉴定为MSP4p21ssl，别名PfMSP4p21ssl[SEQIDNO:28]。下面描述了由构建体MPS4p21ssl编码的or/[SEQIDNO:19]和预测的氨基酸序列[SEQIDNO:20]:MSP4p21ssl构建体的核苷酸序列>MSP4p21sslACCATCACTAA[SEQIDNO:28]构建体MSP4p21ssl编码的ORF>MSP4p21sslMWIVKFLIWHFFIICTINFDKLYISYSYNIVPENGRMLNMEILGEEKPNVDGVSTSJSEKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVEH朋HHH[SEQIDNO:19〗浅灰色加入的氨基酸直接跟在MSP4p40序列的残基MRIL之后深灰色加入的氨基酸直接位于MSP4p40序列中MSP4p20序列的起点之前预计蛋白产物MSP4p21sslEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVEHHHHHH[SEQIDNO:20]另外一个构建体鉴定为MSP4p21ss2，别名PWSP4p21ss2[SEQIDNO:29]。本文描述了由构建体MPS4p21ss2编码的or/[SEQIDNO:21]和预测的氨基酸序列[SEQIDNO:22]。构建体MSP4p21ss2的核苷酸序列>MSP4p21ss2AAGGAATTGAGTGCGTTGAACACCACCACCACCATCACTAA[SEQIDNO:29]构建体MSP4p21ss2编码的ORF>MSP4p21ss2MWIVKFLIVVHFFIICTINFDKLYISYSYNIVPENGRML画R1LGEEKP正KSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDHHHHH[SEQIDNO:21]浅灰色加入的氨基酸直接跟在MSP4p40序列的切割位点MRIL之后深灰色加入的氨基酸L直接位于MSP4p40序列中MSP4p20序列的起点之前预计蛋白产物MSP4p21ss2MRILGEEKPLEKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEG正CVEHHHHHH[SEQIDNO:22]实施例18MSP4特征的进化保守使用一个常用比对程序(ClustalX)对来自恶性疟原虫和间日疟原虫的MSP4氨基酸序列进行比对时，可观察到几个明显结果。参见图26。首先，恶性症原虫信号序列切割位点下游的残基(依本文确定)在物种间几乎100。/。保守(PfMRILGE和PvGRILGE)。这一发现再次强烈支持这一观点，即成熟PfMSP4蛋白起自41位残基，直接位于其前的残基是保守的切割位点的一部分。其次，间日疟原虫蛋白中没有被称为SALSA(下划线)的序列元件。这表明肝细胞结合(如果由PfMSP4体内介导)不是保守的，因此也不是该蛋白质的重要功能。相反，间日疟原虫蛋白的该区域与恶性症原虫蛋白的该区域完全不同，且含有极低复杂度的序列。虽然与恶性疟原虫的序列没有明显的可比性，我们可以想象其对免疫系统的效应是类4以的。恶性疟原虫中，该蛋白质N端最外侧具有N端高度可变区域。多态性频率的统计学分析表明该区域内的两个位点可能参与了免疫逃避。这可以通过B细胞或T细胞表位的修饰或去除实现，因此当暴露给变异序列时，可导致菌株特异性的应答和/或免疫耐受。这种类型的免疫调节也是重复序列的一种性质。(A)它们含有其自身改变的肽配体以及(B)它们可以诱导不依赖T细胞的B细胞活化，一般引起短期和低亲和力应答的生成。从比对序列可以得出的第三个观察结果是MSP4p20的主要序列元件存在于两个物种中。不令人震惊的是，核心EFG结构域和GPI锚定信号均得到了保留，更有趣的是所述酸性重复序列的排列方式似乎差不多。这增加了这一观点的分量，即自然感染中MSP4或是被降解或是被切割，使得结合膜的小结构实体位于裂殖子的表面。该实体是否会像MSPlpl9进入刚被侵入的RBC尚未被证实，但该模型似乎符合这一可能。基于这一比较，可推荐下列蛋白质序列作为抗间日疟原虫的疟疾候选疫苗。实施例19抗MSP4p20抗体在多形核嗜中性白细胞的裂殖子抗体依赖性吞噬中的作用嗜中性白细胞内化病原体并使用活性氧和颗粒水解蛋白将其破坏。活化的嗜中性白细胞通过一个由NADPH氧化酶催化的称为呼吸爆发的过程高效地生成ROS例如0"H202等。可以通过化学发光染料来检测ROS，ROS可用于测量抗体诱导的吞噬活性。所述化学发光染料是鲁米诺，它在存在ROS的情况下发光，借助连接到电脑上的光度计(Microlumat+)可对光进行定量。使用基于多形核嗜中性白细胞(PMN)的裂殖子抗体依赖性吞噬(ADPm)的新型功能性检测，可以测量由天然获得和接种诱发的抗体所诱发的恶性疟原虫裂殖子的吞噬作用。使用来自疟疾流行区域个体的免疫血清和冷冻裂殖子制品，显示该测试为高度特异性的，而且具有可忽略的非免疫本底信号和良好的批内测定重复性。使用标准阳性对照进行批间测定的比较。根据ELISA测量，来自生活在季节性传播区域的个体的数据表明ADPm活性与年龄和IgG抗体对裂殖子和MSP重组抗原的应答显著相关。特异针对来自塞内加尔Dielmo和Ndiop村居民的流行免疫血清的杆状病毒重组MSPlpl9和MSP4p20的抗体消耗表明抗这些抗原的抗体是ADPm活性的重要组分。具体而言，通过离心培养物上清液收集恶性疟原虫裂殖子并将其冷冻分装储存。取自新鲜捐血的多形核嗜中性白细胞以简单Ficoll-Hystopaque1077梯度分离并旋即用于ADPm测定。从Ndiop(局部人口地方病)和Dielmo(全人口地方病)的居民获得地方病免疫血清。在杆状病毒表达系统内生成具有c端六组氨酸标签的重组MSP1p19和MSP4p20抗原并通过固定化金属亲和层析纯化这些抗原。使用载有相应重组抗原的TALON金属亲和树脂去除血清中抗MSPlp19或/和抗MSP4p20的抗体。加入鲁米诺和PMN(每孔5.106细胞)启动该反应前将裂殖子与血清在96孔板上温育。使用BertholdMicroLumatPlus96孔板测量发光量(luminescenceoutput)1小时。使用阳性标准人免疫血清对照(HIS)来定量该反应在本测定中阳性读数需要裂殖子的抗原特异性IgG调理(结合)(具或不具补体)，这是因为去除补体的血清(56。C处理30分钟)或以蛋白G纯化的总IgG诱导了对初始血清类似的应答，而且去除总IgG的血清不再产生应答(图34)。但是，由特异IgG产生的化学发光效应的大小是可变的。图35显示了特异于杆状病毒MSP4p20和MSPlpl9的抗体在本检测中均有功能，但其程度不一样。耗竭MSP4p20抗体后所述化学发光信号减少了67%，相比之下MSPlpl9抗体耗竭使化学发光信号减少34n/。。特异于识别MSP4p20和MSPlpl9抗体的耗竭减少了78%的化学发光信号。这些结果表明识别杆状病毒MSP4p20和MSPlpl9重组蛋白的天然抗体是介导裂殖子吞噬作用和PMN免疫效应物的破坏的重要组分，这为使用这些抗原作为疫苗提供了强有力支持。实施例20PflVISP5修饰为了考量位于杆状病毒表达的PfMSP5N端封闭修饰的性质，进行了放射性标记实验。由于质谱表明该实体共价结合于豆蔻酰基，因此首先检査了豆蔻酰基的掺入。如之前实施例1所描述，使用SF9细胞在T25细胞培养瓶中进行昆虫细胞感染。感染后24h时，向培养上清加入200pCi[9,10(n/H]豆蔻酸(Amersham)和不含脂肪酸的BSA的复合物。感染后70h时，收集培养上清，以20mMTrispH8;500mMNaCl对其进行透析，并以Talon⑥树脂对其进行分批纯化。在蓝染的SDS-PAGE凝胶上，在存在放射性标记的情况下观察到未标记对照和培养物具有相同的蛋白质表达。当以放射自显影分析时，杆状病毒表达的两个PfMSP5蛋白(35和45kDa)均已掺入携带氚化的豆蔻酰基(图27)。未标记蛋白未观察到有本底活性，且空病毒感染未观察到这两个PfMSP5蛋白条带。这些结果表明杆状病毒表达的重组PfMSP5蛋白是豆蔻酰化的。这些数据证实先前实施例4到7有关PfMSP5在昆虫细胞中表达的数据。实施例21PfMSP4的去向为了跟踪PfMSP4的自然去向，产生了几种不同的纯化血清。首先，以NHS活化sepharose固定的杆状病毒表达的PfMSP4p20对收集自4只接种MSP4的兔的抗血清库进行亲和纯化。使用已知对来自Ndiop或Dielmo的PfMSP4呈阳性的5个人免疫血清的2个不同库来重复该步骤。使用这些抗体试剂，通过IFA和蛋白印迹跟踪源自菌株3D7培养物中PfMSP4的去向，并将其结果与使用特异于PfMSPlpl9(G17.12)的单克隆抗体获得的结果进行比较。如图28A所示，在后期寄生虫和游离裂殖子表面检测出PfMSP4，但在可鉴定出PfMSPlp19的丙酮固定的环状体期寄生虫没有检测出PfMSP4。此外，当通过蛋白印迹平行分析等量的寄生虫提取物时(图28B)，收集自寄生虫培养上清的游离裂殖子的PfMSP4水平似远少于成熟裂殖体，而且在环状体期寄生虫提取物中没有检测出该蛋白。该数据符合这一观点，即PfMSP4以类似于顶端膜抗原-1的方式从裂殖子表面排出，而不是像MSPlp19—样被蛋白酶解加工并携带进刚被侵入的RBC。有趣的是，两种亲和纯化血清(兔和人)均识别仅来自成熟裂殖体提取物的多个高分子量蛋白条带。与之前MSP3和MSP6—样，这可能是含有交叉反应表位的成熟裂殖体中存在的抗原，或者这有可能是天然PMSP4蛋白三聚物，因为该寄生虫提取物没有被还原。为了研究PfMSP4在肝前期寄生虫中的表达，使用抗PfMSP4p20亲和纯化的兔血清对恶性疟原虫子孢子进行IFA。尽管阳性对照抗CSP单克隆抗体给出了强而清晰的表面染色，使用抗PfMSP4p20抗体未见有染色。这些结果表明天然MSP4蛋白定位于裂殖子的表面，且寄生虫重新侵入红细胞后该蛋白不再存在(参见环状体期感染的红细胞的IFA，图28A)。图28B的蛋白印迹显示了使用抗天然MSP4(人血清)抗体和使用抗重组MSP4(兔血清)抗体同样的模式。因此可从这一结果推断得出，抗杆状病毒重组抗原的抗体能够识别天然形式的抗原。实施例22p20亚结构域独立于p40的表达为了便于p20亚结构域的直接表达，构建(图29和实施例17)和测试了一系列新的表达构建体。如图30所示，编码最小信号序列的构建体(PfMSP4p21)没有引起蛋白分泌，但检测到高水平的胞内蛋白(数据未显示)。使用PfMSP4p21ssl和PfMSP4p21ss2构建体实现了更高的表达水平，正如图30所示和N端测序所揭示(参看图29)，两种蛋白质均很快失去了余下的N端残基以产生与杆状病毒PfMSP4p40相同的稳定p20实体。但是，使用杆状病毒PfMSP4p40和PfMSP4p21ssl对平行感染后66h时的蛋白表达进行比较时，原有构建体产生高得多的蛋白产量(2倍)。这些结果补充了前述的实施例17。实施例23PvMSP4在杆状病毒表达系统中的表达为了获得PvMSP4开放阅读框(ORF)，对来自寄生虫菌株Bdem的基因组DNA进行巢式PCR。由于间日疟原虫的基因组DNA大约富含50%的GC含量，因此没有必要制备合成基因。将整个ORF克隆进pMosBLUE并进行测序。然后，以PCR扩增两个外显子，其中外显子2的3端的GPI锚定信号被六组氨酸标签取代。此外，将一个适宜限制性位点分别引入到外显子1和2的3'或5，端，继而将这些序列克隆到pMosBLUE载体以形成以组氨酸标签结尾的连续ORF(图31)。使用标准方案生成编码PvMSP4的杆状病毒，并根据前述方法使用HighFive昆虫细胞对随时间变化的蛋白质表达进行评测。如图32所示，感染后约30h时可检测到蛋白质表达。对该蛋白质条带进行的N端序列分析揭示了GIAAC的N端。感染后约54h时蛋白质表达达到最高，此时可见一些蛋白质降解。但是，PvMSP4降解的方式与PfMSP4不同。终产物的N端测序表明该蛋白质己降解为13或30-32个氨基酸，生成EGGEQ的N端序列和产生GDSSG、DSSGG和SSGGL的混合信号。检测到的最小蛋白质产物大小约为8kDa，它携带N端序列LDNNG。实施例24PvMSP4的人免疫血清识别时程分析结束时(如图32所示的66h)，以HPLC在Talon树脂上纯化130mL的培养上清。所述纯化产物由图32所示的30，25kDa和8kDa条带所组成。为了考量人血清识别，以0.5吗/mL杆状病毒表达的PvMSP4包被ELISA培养板。同时捡测了共24例血清样本。这些样本收集自斯里兰卡至少经历一次间日疟原虫疟疾发作的个体。这些样本中有17例为PvMSP4血清阳性，其终点效价位于1/25,000和1/200,000之间(图33A)。这些17例阳性血清以1/2700稀释在ELISA培养板上检测，其中ELISA培养板以用DTT和碘乙酰胺处理而不可逆还原的杆状病毒PvMSP4包被。所述17例阳性血清中，有11例表现出介于12-80%之间的还原敏感性程度，不论是以固定的1/2700稀释度计算还是使用落在每条曲线中点的稀释度计算(图33B)。涉及间日疟原虫MSP4(PvMSP4)的实施例23和24补充了实施例18。如图33B所示，尽管2、3、4、6、7、8、9、10、11、14和17号血清对DTT还原的抗原比对非还原抗原具有更小的亲和力，但12和15号血清对还原抗原比对非还原抗原具有更高的亲和力。可以得出结论，抗原构象影响抗体-抗原结合，但由于尚未确定每份受检血清抗疟原虫感染的保护能力，抗体对还原或非还原抗原的亲和力不能与两种类型抗体的保护价值联系起来。下列PfMSP5/His、PflVISP4p30/His和PfMSP4p40/His杆状病毒于2005年11月10日保藏在巴斯德研究所的法国微生物保藏中心(C,N.C.M.)(28,rueduDocteurRoux,75724Paris，Cedex15，FRANCE)并分别分配给下列保藏号。材料保藏号.PfMSP5/His1-3512P麵P4p30/His1-3513PfMSP4p40/His1-3514下列F12-7、G21-2、J18-14和Lll-6杂交瘤于2005年11月16日保藏在巴斯德研究所的法国微生物保藏中心(C.N.C.M.)(28，rueduDocteurRoux,75724Paris,Cedex15，FRANCE)并分别分配给下列保藏号。材料保藏号F12-71-3517G21-21-3518J18-141-3519Lll-161-3520下列PMSP4p21ssl/His、PfMSP4p21ss2/His和PvMSP4/His于2006年11月21日存放在巴斯德研究所的法国微生物保藏中心(C.N.C.M.)(28，rueduDocteurRoux，75724Paris,Cedex15,FRANCE)并分别分配给下列保藏号。材料保藏号PfMSP4p21ssl/His1-3695PfMSP4p21ss2/His1-3696PvMSP4/His1-3694下列是上述肽和多核苷酸的氨基酸和核酸序列MSP5pl0(MSP5降解产物，186-253位残基)YNKVEKNVTDEMLLYNMMSDQNRKSCA躍GGCSDDQICIN雨IGVKCICKDGYLLGTKCI朋HH冊[SEQIDNO:16]编码MSP5plO的核酸序列>readseq-48009—tmp一l207bpIDNO:5]SEQIDNO:1=编码SEQIDNO:9的降解产物MSP4p20(132-251位残基)的核酸>readseq-41112—tmp—1363bpMSP5>readseq.input(l)，762个碱基，6761DE71校验和.TCACCACCACCACCACCACTGA[SEQIDNO:4]ORF编码的蛋白质>readseq.input(l)，253个碱基，7870B947校验和.NNENELKEEGSLPTKMNEKNSNSADKQPNDISHDESKSNS丽AQNIQKEPEEKENSNPNLDSSENSAESATRSVDISEHNSNNPETKEENGEEPLDLEINENAEIGQEPPNRLHININNIGVKCICKDGYLLGTKCIHHHHHH[SEQIDNO:14]MSP4p40〉reads叫.input(1),756碱基，733F5E48校验和.CACCACCACCACCATCACTAA[SEQIDNO:3]ORF编码的蛋白质>readseq.input(l),251个碱基，1EFAEF35校验和.TPGGNEASSASPNLADAAEKKDEKEASEQGEESHKKENSQESANGKDDVKEEKKTNEKKDDGKTDKVQEKVLEKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVEHHHHHH[SEQIDNO:12]最终产生的蛋白质〉reads叫input(1),211个碱基，67EAFE8C校验和.MRILGEEKPNVDGVSTSNTPGGNEASSASPNLADAAEKKDEKEASEQGEESHKKENSQESANGKDDVKEEKKTNEKKDDGKTDKVQEKVLEKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKWQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEG正CVEHHHHHH[SEQIDNO:13]与最终产生的蛋白质一起分泌的P20蛋白>readseq.input(l),120个碱基，9358BD28校验和.KSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVEHHHHHH[SEQIDNO:9]200680044019.XMSP4p30>readseq.input(l),666个碱基，A9B2DCBC校验和.GAATTGAGTGCGTTGAACACCACCACCACCATCACTAA[SEQIDNO:2]ORF编码的蛋白质>readseq.input(l),22l个碱基，F982D7F0校验和.MWIVKFLIVVHFFIICTINFDKLYISYSYNIVPENGRML薩RILAAEKKDEKEASEQGEESHKKENSQESANGKDDVKEEKKTNEKKDDGKTDKV卿VLEKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVEHHHHHH[SEQIDNO:10]最终产生的蛋白质>readseq.input(l)，181个碱基，FB2C49DD校验和.MRILAAEKKDEKEASEQGEESHKKENSQESANGKDDVKEEKKTNEKKDDGKTDKVQEKVLEKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVE朋HHHH[SEQIDNO:11]MSP4p21〉reads叫input(1)，498个碱基，C2453A47校验和.GAACACCACCACCACCATCACTAA[SEQIDNO:6]ORP编码的蛋白质>readseq.input(l),165个碱基，27BB4F2E校验和.MWIVKFLIVVHFFIICT，DKLYISYSYNIVPENG腹L雇RILEKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEG正CVEHHH朋H[SEQIDNO:17]最终产生的蛋白质readseq.input(i)，125个碱基，50D64DD2校验和.MRILEKSPKESQ雨DDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVEHHHH朋[SEQIDNO:18]MSP4p21ssl>readseq.input(l),540个碱基，96DADE5校验和.ACCATCACTAA[SEQIDNO:7]ORF编码的蛋白质〉reads叫input(1),179个碱基，F0D6C58校验和.EKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVEHHHHHH[SEQIDNO:19]最终产生的蛋白质〉reads叫input(1)，139个碱基，4D5C3E0F校验和.MRILGEEKPNVDGVSTSLEKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVE朋HHHH[SEQIDNO:20]MSP4P21ss2〉reads叫input(1)，516个碱基，1B3CABBA校验和.AAGGAATTGAGTGCGTTGAACACCACCACCACCATCACTAA[SEQIDNO:8]ORF编码的预测蛋白质>readseq.input(l),171个碱基，EB09D214校验和.MVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVEHHHHHH[SEQIDNO:21]最终产生的蛋白质>readseq.input(l),131个碱基，6B6B091D校验和.MRILGEEKPLEKSPKESQMVDDKKKTEAIPKKVVQPSSSNSGGHVGEEEDHNEGEGEHEEEEEHEEDDDDEDDDTYNKDDLEDEDLCKHNNGGCGDDKLCEYVGNRRVKCKCKEGYKLEGIECVEHHHHHH[SEQIDNO:22]PvMSP4/His蛋白MKVAYFLSVLDLLIIFSLYFDGRRSAFAGIAACIRHGRILGEGGEQSGGASGGSSGGSSGDSSGGLSGGSSGGPSPPAGSSGSGGSDPANSATGPQNSTPGSGGQTGDHSAEAENGDYNEQGDDHGDDHGDDHGDDHGDEQDGEDYDDAEDDDLYELSEVDENANLCLD丽GGCGDDKICENLGKGIVKCLCKPGYKLVGTECVESHH朋朋[SEQIDNO:16]本申请描述了、尤其是在实施例中描述了公开为PfMSP5/His、PfMSP4p30/His、PfMSP4p40/His、PfMSP4p21ssl/His、PfMSP4p21ss2/His和PvMSP4/His的生物材料。它满足以下要求-增殖病毒的要求细胞类型草地夜蛾(Sf9)土首养基添加L-谷氨酰胺(GIBCO,InvitrogenCorporation)CatN°10卯2-088的SF-900II培养基200mML-谷氨酰胺(GIBCO,InvitrogenCorporation):2mM终浓度CatN°25030-024庆大霉素(50mg/ml;GIBCO，InvitrogenCorporation):50|ig/ml终浓度CatN。15750-037血清胎牛血清5%pH6,2温度27-28°C气相环境(无C02富集)-用于获得病毒悬浮液的方法增殖的细节在一容器(T-25,T-75或T-150)中以新鲜完全培养基(添加5。/。FCS)培养单层Sf9细胞，该培养物接种小量病毒悬浮液(或噬斑或通过有限稀释取自克隆方法的一块微量滴定板的孔)。所述培养物于27-28i:温育，直至5-6天左右时所有细胞裂解。感染证据的标准细胞具延展细胞核，随后细胞核呈粒状外观，数天后细胞裂解。制备病毒悬浮液的细节细胞上清以4000g离心10分钟以除去细胞碎片。-用于滴定的方法有限稀释(从稀释起感染一个孔，导致96孔微量滴定板约1/10的阳性)。6天后读取结果，预计效价为107-108pfU/ml。-储存条件-S(TC冷冻长期保存。悬浮液为标准的培养基。小鼠骨髓瘤细胞(浆细胞瘤Ag8X636.5.3)和取自以指定抗原免疫动物脾脏的小鼠免疫细胞之间进行细胞融合获得上述杂交瘤F12-7、G21-2、J18-14和Lll隱16。-细胞的特点和产物骨髓瘤命名X63-Ag8-6.5.3抗原特异性MSP4II用于F12-7，MSP5用于G21-2和518-14，MSP4用于L11-16。抗体亚类IgGlk分泌的稳定性良好，不受限制-培养条件土首养基EagleMEM-Eurobio丙酮酸钠-GibcoBRL谷氨酰胺-GibcoBRL抗生素青链霉對p6ni-streptomycine)-GibcoBRL马血清10%血清碳酸氢根2,2g/1血清马10%pH7,4最佳温度37。C气相7%C02冻融注意事项37。C快速解冻，立即以培养基+血清洗涤。培养于24孔板上，每孔lml。-培养条件细胞悬浮群体倍增时间15h最佳分裂比3天预计细胞密度5.106无限生命期常规传代技术分裂-储存条件悬浮液95。/。马血清-5。/。DM50细胞收集技术取细胞悬浮液，离心和吸取冰冻培养基中的沉淀。冷冻技术:含5.106个细胞的1ml冰冻培养基于-2(TC放置2h，于-8(TC和液氮中放置3至4天。悬浮液为标准的培养基。参考文献基于下列每篇出版物的全部公开内容并通过引用的方式将其并入本文中。1Genton,B.,Al-Yaman,F.,Betuela，I.etal.Safetyandimmunogenicityofathree-componentblood-stagemalariavaccine(MSPl,MSP2,RESA)againstPlasmodiumfalciparuminPapuaNewGuineanchildren.Facc/we2003，22(1)，30-41.2Stowers，A.W,，Kennedy,M.C"Keegan,B.P.，Saul,A"Long,CA.&Miller,LH.VaccinationofmonkeyswithrecombinantPlasmodiumfalciparumapicalmembraneantigen1confersprotectionagainstblood-stagemalaria,/w/erf/mw柳2002,70(12),6961-6967.3O'Donnell，R,A.,deKoning-Ward,T.F.,Burt,R.A.etal.Antibodiesagainstmerozoitesurfaceprotein(MSP)-I(19)areamajorcomponentoftheinvasion-inhibitoryresponseinindividualsimmunetomalaria./ExpMed2001，193(12)，1403-1412.4Hughes，M.K.&Hughes,A丄.NaturalselectiononPlasmodiumsurfaceproteins.^Mb/5zoc/ze附尸araw'to/1995,71(1)，99-113.5Escalante,A.A.，Lai,A.A.&Ayala，FJ.GeneticpolymorphismandnaturalselectioninthemalariaparasitePlasmodiumfalciparum.Gewe"cs1998，149(1)，189-202.6Volkman，S.K.，Hartl，D.L,Wirth,D.F.etal.ExcesspolymorphismsingenesformembraneproteinsinPlasmodiumfalciparum.5Wewce2002，298(5591),216-218.7Rayner，J.C，Corredor,V.,Feldman，D.etal.ExtensivepolymorphisminthePlasmodiumvivaxmerozoitesurfacecoatproteinMSP-3alphaislimitedtospecificdomains.Parasitology2002,125(Pt5)，393-405.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>actingonamalariavaccinecandidate.Afo/尸anzs/to/2000,111(2),447-451.16Kedzierski,L.，Black,CG.&Coppel,R丄.Characterizationofthemerozoitesurfaceprotein4/5geneofPlasmodiumbergheiandPlasmodiumyoelii.Mo/历oc/ze附Para^to/2000,105(1)，137-147.17Kedzierski,L,Black,CG.,Goschnick,M.W.,Stowers,A.W.&Coppel，R丄.ImmunizationwithaCombinationofMerozoiteSurfaceProteins4/5and1EnhancesProtectionagainstLethalChallengewithPlasmodiumyoelii./"/e"/附ww"2002，70(12),6606-6613.18Kedzierski,L,Black,CG.&Coppel,R丄.ImmunizationwithrecombinantPlasmodiumyoeliimerozoitesurfaceprotein4/5protectsmiceagainstlethalchallenge,/"/ec//m扁w2000,68(10)，6034-6037.19Kedzierski,L.,Black,CG.,Stowers，A.W.,Goschnick,M.W.,Kaslow,D.C&Coppel,R丄.Comparisonoftheprotectiveefficacyofyeast-derivedandEscherichiacoli-derivedrecombinantmerozoitesurfaceprotein4/5againstlethalchallengebyPlasmodiumyoelii.F"acc/we2001，19(32),4661-4668.20Wang，L.,Goschnick,M.W.&Coppel,R丄.OralImmunizationwithaCombinationofPlasmodiumyoeliiMerozoiteSurfaceProteins1and4/5EnhancesProtectionagainstLethalMalariaChallenge.Infectlmmun2004，72(10),6172-6175.21Goschnick,M.W.，Black,CG.,Kedzierski,L,,Holder,A.A.&Coppel，R丄.MerozoiteSurfaceProtein4/5ProvidesProtectionagainstLethalChallengewithaHeterologousMalariaParasiteStrain,/"々cf/附附ww2004，72(10)，5840-5849.22Marshall,V.M.，Tieqiao,W.&Coppel,R丄.Closelinkageofthreemerozoitesurfaceproteingenesonchromosome2ofPlasmodiumfalciparum.Mo/所oc/zew户aras"o/1998，94(1),13-25.23Nishimura,Y.,Chen,Y.Z.,Uemura,Y.etal.DegeneraterecognitionandresponseofhumanCD4+Thcellclones:implicationsforbasicandappliedimmunology.iWb//m附w打o/2004，40(14-15)，1089-1094.24Brady,C.P.,Shimp,R丄.，Miles,A.P.,Whitmore,M.&Stowers，A.W.High-levelproductionandpurificationofP30P2MSP1(19)，animportantvaccineantigenformalaria,expressedintheme勿lotropicyeastPichiapastoris.尸rafez,w￡xpr尸m/2001,23(3),468-475.25Epp,C,Kauth,C.W.,Bujard,H.&Lutz,R.ExpressionandpurificationofPlasmodiumfalciparumMSP-1(42):Amalariavaccinecandidate./CTzromflfogr5Tec/wo/5/o附ed5"c/2003，786(1-2),61-72.26Withers-Martinez,C,Saldanha，J.W.,Ely,B.etal.ExpressionofrecombinantPlasmodiumfalciparumsubtilisin-likeprotease-1ininsectcells.Characterization,comparisonwiththeparasiteprotease,andhomologymodelingPCR画basedgenesynthesisasanefficientapproachforexpressionoftheA+T-richmalariagenome./所o/Cta2002,277(33),29698-29709.Epub22002Jun29696.27Zhou,Z.，Schnake,P.,Xiao,L.&Lal，A.A.EnhancedexpressionofarecombinantmalariacandidatevaccineinEscherichiacolibycodonoptimization.尸rate/w尸Mn/2004，34(1)，87-94.28Weber，J.L.MolecularBiologyofMalariaParasites._Bc_p.户aros"o/.1988,66,143-170.29Withers-Martinez,C,Carpenter,E.P.,Hackett,F.etal.PCR-basedgenesynthesisasanefficientapproachforexpressionoftheA+T-richmalariagenome.1999,12(12)，1113-1120,30Ballou，W.R.，Arevalo-Herrera,M.,Carucci，D.etal.Updateontheclinicaldevelopmentofcandidatemalariavaccines.』w/7>o/办g2004:71(2Suppl)，239-247.31Wang,L.,Marshall,V.M.&Coppel，R丄.Limitedpolymorphismofthe肠c/^附尸a顧.to/2002,120(2),301-303.32Jongwutiwes,S.,Putaporntip,C,Friedman,R.&Hughes,A丄.TheExten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3、14、15、16、17、18、19、20、21、30或22的序列的氨基酸序列。3.—种纯化的核酸分子，其与包含权利要求1或2任一项所述核酸序列的变性、双链DNA的任一链在42。C、50。/。甲酰胺和6XSSC的中度严格性条件和60。C、0.5XSSC、0.1%SDS的洗涤条件下杂交。4.如权利要求3所述的纯化的核酸分子，其中所述分离的核酸分子源自SEQIDNO:l-8的体外诱变。5.—种纯化的核酸分子，其来自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8的遗传密码简并。6.—种纯化的核酸分子，其编码重组MSP4或MSP5多肽，重组MSP4或MSP5多肽DNA的等位基因变体或重组MSP4或MSP5多肽DNA的同系物。7.—种重组载体，其指导选自由权利要求l、2、5和6所述的纯化的核酸分子组成的组中的核酸分子的表达。8.—种重组载体，其指导权利要求3的核酸分子的表达。9.一种重组载体，其指导权利要求4的核酸分子的表达。10.—种纯化的多肽，其由选自由权利要求1、2、5和6所述的纯化的核酸分子组成的组中的核酸分子编码。11.如权利要求10所述的纯化的多肽，其为非糖基化形式。12.—种纯化的多肽，其由权利要求3的核酸分子编码。13.如权利要求12所述的纯化的多肽，其为非糖基化形式。14.一种纯化的多肽，其由权利要求4的核酸分子编码。15.如权利要求14所述的纯化的多肽，其为非糖基化形式。16.纯化抗体，其结合权利要求10的多肽。17.如权利要求16所述的纯化抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。18.纯化抗体，其结合权利要求12的多肽。19.如权利要求18所述的纯化抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。20.纯化抗体，其结合权利要求14的多肽。21.如权利要求20所述的纯化抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。22.—种宿主细胞，其以权利要求7的载体转染、转导或感染。23.用于生产重组MSP4或MSP5多肽的方法，其包括在促进表达的条件下培养权利要求22的宿主细胞，和从培养基回收所述多肽。24.如权利要求23所述的方法，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。25.—种宿主细胞，其以权利要求8所述载体转染、转导或感染。26.用于生产重组MSP4或MSP5多肽的方法，其包括在促进表达的条件下培养权利要求25的宿主细胞，和从培养基或细胞沉淀回收所述多肽。27.如权利要求26所述的方法，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。28.—种宿主细胞，其以权利要求9所述载体转染、转导或感染。29.用于生产重组MSP4或MSP5多肽的方法，其包括在促进表达的条件下培养权利要求28的宿主细胞，和从培养基或细胞聚集物回收所述多肽。30.如权利要求29所述的方法，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。31.—种重组载体，其选自1-3512、1-3513、1-3514、1-3694、1-3695和1-3696。32.—种免疫复合物，其包含重组MSP4和MSP5多肽和特异识别所述多肽的抗体。33.用于检测疟原虫感染的方法，其中所述方法包括提供包含疑为疱原虫感染的生物材料的组合物，和测定结合特异于重组MSP4和MSP5多肽的抗体的疟原虫天然MSP4和/或MSP5多肽的存在。34.如权利要求33所述的方法，其中它被用于检测恶性症原虫35.如权利要求33所述的方法，其中它被用于检测间日疟原虫36.如权利要求33所述的方法，其中通过电泳法或使用与所述重组MSP4和MSP5多肽发生免疫反应的抗体的免疫测定法来检测所述天然MSP4或MSP5多肽。37.用于检测结合包含重组MSP4或MSP5多肽的抗原的抗体存在与否的体外诊断方法，其中所述方法包括将所述抗原与生物学液体在足以使所述抗原和所述生物学液体中的抗体形成抗原-抗体复合物的条件下接触一段时间，和检测所述复合物的形成。38.如权利要求35所述的方法，其进一步包括测量所述抗原-抗体复合物的形成。39.如权利要求35所述的方法，其中通过基于蛋白印迹技术、ELISA、间接免疫荧光测定或免疫沉淀测定的免疫测定来检测抗原-抗体复合物的形成。40.用于检测结合重组MSP4或MSP5多肽或它们的混合物的抗体存在与否的诊断试剂盒，其中该试剂盒包括包含重组MSP4或MSP5多肽或重组MSP4和MSP5多肽混合物的抗原，和用于检测所述抗原和抗体之间免疫复合物形成的试剂，其中所述试剂的量足以进行所述检测。41.一种免疫原性组合物，其包含量足以诱发体内免疫原性或保护性反应的至少一种重组MSP4或MSP5多肽或它们的混合物，和一种药学上可接受的载体。42.如权利要求41所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含足量的至少一种重组MSP4或MSP5多肽以诱发体内中和抗体。43.如权利要求41所述的免疫原性组合物，其至少包含重组多肽MSP4p40。44.如权利要求41所述的免疫原性组合物，其至少包含重组多肽MSP4p30。45.如权利要求41所述的免疫原性组合物，其至少包含重组多肽MSP4p20。46.如权利要求41所述的免疫原性组合物，其至少包含重组多肽MSP5p45和MSP5p35。47.如权利要求39所述的免疫原性组合物，其至少包含重组多肽PvMSP4p20。48.—种多核苷酸，其选自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8。49.一种多核苷酸，其选自SEQIDNO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或30。50.如权利要求41所述的免疫原性组合物，其至少包含选自PfMSP4p21ssl和PfMSP4p21ss2的重组多肽。51.如权利要求39所述的免疫原性组合物，其至少包含重组多肽MSP4p40和MSP4p20。52.如权利要求39所述的免疫原性组合物，其还包含含有重组MSPlpl9多肽的抗原。53.—种疫苗组合物，其包含量足以诱发体内保护性反应的至少一种重组MSP4或MSP5多肽或它们的混合物，和一种药学上可接受的载体，其中所述至少一种重组MSP4或MSP5多肽选自MSP4p40、MSP4p30、MSP4p20、MSP4p21ssl、MSP4p21ss2、MSP5p45、MSP5p35和PvMSP4p20。54.用于体外诊断来自疑为疟原虫感染的人的生物材料样品的疟原虫感染的方法，其中所述方法包括下列步骤-将包含重组MSP4或MSP5多肽的抗原与所述样品在足以使所述抗原和所述样品中的抗体形成抗原-抗体复合物的条件下接触一段时间，以及-检测所述复合物的形成。55.如权利要求54所述的方法，其还包括测量所述抗原-抗体复合物的形成。56.如权利要求54所述的方法，其中通过基于蛋白印迹技术、ELISA、间接免疫荧光测定或免疫沉淀测定的免疫测定来检测所述抗原-抗体复合物的形成。57.如权利要求36所述的方法，其中以2005年11月16日以保藏号1-3517、1-3518、1-3519或1-3520保藏于C.N.C.M.的杂交瘤分泌的抗体经免疫测定来测定所述天然MSP4或MSP5多肽。58.如权利要求17所述的纯化抗体，其由在2005年11月16日以保藏号1-3517、1-3518、1-3519或1-3520保藏于C.N.C.M.的杂交瘤所产生。59.于2005年11月16日以保藏号1-3517、1-3518、1-3519或1-3520保藏于C.N.C.M.的杂交瘤。60.用于检测疟原虫的方法，其中所述方法包括提供包含疑为疟原虫感染的生物材料的组合物，和测定疟原虫天然MSP4和/或MSP5多肽的存在，所述天然MSP4禾口/或MSP5多肽结合特异于重组MSP4或MSP5多肽的抗体或至少一种特异于重组MSP4多肽的抗体和至少一种特异于重组MSP5多肽的抗体的混合物。61.如权利要求60所述的方法，其中所述重组MSP4或MSP5多肽选自权利要求IO所述的纯化的多肽。62.如权利要求60所述的方法，其中所述特异于重组MSP4或MSP5多肽的抗体选自权利要求58所述的纯化抗体。63.如权利要求60所述的方法，其用于检测恶性疟原虫或间日疟原虫。全文摘要因此，本发明提供了构建体，其中编码恶性疟原虫MSP4和MSP5的核酸和所形成的多肽已被修饰。更具体地，本发明提供了编码重组MSP4和MSP5多肽的构建体，这些多肽在杆状病毒-昆虫细胞表达体系中以可溶分泌多肽表达。意外地发现，所述重组多肽含有一C端EGF样结构域，其在所述多肽中适当地折叠。文档编号C07K14/445GK101415436SQ200680044019公开日2009年4月22日申请日期2006年11月23日优先权日2005年11月23日发明者F·纳托,H·波尔森,R·佩罗,S·朗埃克申请人:巴斯德研究院;国立科学研究中心