癌性疾病调节抗体的制作方法

专利名称：癌性疾病调节抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)的分离和制备，以及单独的 或者与一种或多种CDMAB/化学治疗试剂结合的这些CDMAB在治疗和 诊断方法中的应用。本发明还涉及利用本发明的CDMAB的结合分析。
背景技术：
用于癌症治疗的单克隆抗体每个患有癌症的个体都是独特的，并且 由于个体的差异，其患有的癌症也不同于其他癌症。尽管如此，目前的 治疗以相同的方式治疗患有同期同类型肿瘤的所有患者。至少30%的这 些患者的一线治疗是失败的，因而导致了更多轮次的治疗并且增加了治 疗失败、肿瘤转移及最终死亡的可能性。优良的治疗方式应该是针对特 定个体的个体化治疗。目前唯一釆用个体化的疗法是外科手术。化疗和 放疗不能针对患者量身定做，而在大多数情况下，手术本身并不足以治 愈癌症。
随着单克隆抗体的问世，开发个体化治疗的方法的可能性变得更为 现实，因为每种抗体可以针对单一的抗原决定簇。而且，制备针对多个 抗原决定簇的集群(constellation)的抗体组合成为可能，所述抗原决定簇集 群唯一确定了某一特定个体的肺瘤。
认识到癌细胞和正常细胞的显著差异在于癌细胞含有转化细胞特异 的抗原，科学界长期认为可以通过与这些癌抗原特异结合设计出特异靶 向转化细胞的单克隆抗体；这样就产生了单克隆抗体可以作为"魔术子 弹(Magic Bullets)"消除癌细胞的观点。然而，现在已经广泛地认识到单 一的单克隆抗体不能用于癌症的所有情形，并且单克隆抗体可以按类来 开发，用来治疗目标癌症。依照本发明公开的方法分离出的单克隆抗体 已经显示出以有利于患者的方式调节癌性疾病进程，如通过降低肺瘤负 荷，并且在本文中这些单克隆抗体将分别被称为癌性疾病调节抗体
10(CDMAB)或"抗癌"抗体。
目前，癌症患者通常可选4,的治疗方式纟艮少。目前的癌症治疗方法 已经改善了总体存活率和发病率。然而，对特定的个体来说，这些改善 的统计数据与他们个人情况的改善并无必然关系。
因此，如果提出一种方法学，使医生能够在同组患者中，独立于其 他患者治疗每例肿瘤，这就会使根据个体进行量身定做的独特治疗成为 可能。理论上，这样一种治疗过程可以增加治愈率，产生更好的效果， 从而满足长期的需要。
从历史上来看，多克隆抗体的应用在治疗人类癌症的方面取得的成 功有限。 一直用人类的血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但极少有长期的好 转或反应。而且，这种治疗方法缺乏重复性，与化疗相比，没有更多的 益处。诸如乳癌、黑色素瘤和肾细胞癌的实体肿瘤也用人类血液、黑猩 猩的血清、人类血浆和马血清来治疗过，但相应的结果是不可预测和无 效的。
有4艮多用单克隆抗体治疗实体肿瘤的临床试验。在20世纪80年代， 就有至少四项针对人类乳腺癌的临床试验，所述试验在使用了针对特定 抗原或基于组织特异性的抗体的至少47名患者中，只产生了 一名应答者。 直到1998年，才有了成功的临床试验，该试验联合使用人源化的抗 Her2/neu抗体(Herceptir^)与顺铂(CISPLATIN)。在这项试验中，对37名 患者的反应进行了评估，其中大约有四分之一的患者有部分反应率，另 外四分之一有轻微的或稳定的病情发展。在反应者中，中位进展时间 (median time to progression)是8.4个月，其中中位反应持续时间(median response duration)是5.3个月。
Herceptir^在1998年被批准作为与Taxo产联合使用的一线用药。临 床试验结果表明，与单独接受Taxo严治疗的人群的中位疾病进展时间(3.0 月)相比，接受抗体治疗与Taxof联合应用的患者的中位疾病进展时间(6.9 月)增加。HerceptiZ与Taxof联合治疗组的中位存活时间也轻微增加，与 Taxo^单独治疗组相比是22个月18个月。除此之外，所述抗体和Taxol 联合应用组与单独使用TaxoP组相比，在完全应答者(8%:2%)和部分应答 者(34%:15%)的数量方面都有增加。然而Herceptin⑧和Taxo严联合治疗相比Taxo产单独治疗，导致了较高的心血管毒性发病率(分别是13%和1%)。 此外，Herceptii^治疗也只对那些过表达(通过免疫组化(IHC)分析来确定) 人类表皮生长因子受体2(Her2/neu)的患者有效。Her2/neu是一种目前还 不知其功能或生物学重要配体的受体；大约25%的转移性乳腺癌患者过 表达Her2/neu。因此远远不能满足患乳腺癌的患者的治疗需求。即便那 些从Hercepth^治疗中受益的患者仍然需要化疗，并且随后还必须至少在 一定程度上处理这类治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验涉及到同时针对糖蛋白和糖脂把标的抗 体。对腺癌有某些特异性的诸如17-lA的抗体，已经在超过60例的患者 中经过了2期临床实验，其中仅有1例患者有部分反应。在其他试验中， 17-1A的使用在采用额外使用环磷酰胺实验方案的52例患者中，只产生 了 l例完全反应，2例轻孩t反应。到目前为止，17-lA作为m期结肠癌 辅助治疗的m期临床试验还没有显示出改善的疗效。最初被批准用于显 像的人源化鼠单克隆抗体也没能使肿瘤消退。
只有到了最近，使用单克隆抗体进行的结肠直肠癌的临床试验才有 一些阳性结果。在2004年，ERBITUX⑧被批准作为表达EGFR的转移结 肠直肠癌患者的二线治疗用药，这些患者对于基于依立替康(irinotecan) 的化疗是耐受的。双臂II期临床研究和单臂研究的结果表明，ERBITUX 与依立替康联合应用分别有23%和15%的反应率，中位疾病进展时间分 别是4.1和6.5月。来自同一项双臂II期临床试验和另一项单臂研究的结 果表明，￡1^11!1乂@单独治疗分别产生了 11%和9%反应率，中位疾病进 展时间分别是1.5和4.2个月。
因而在瑞士和美国，ERBITUX⑧与依立替康的联合应用，以及在美国， ERBITUX 的单独治疗都已经被批准作为依立替康一线治疗失败的结肠 癌患者的二线治疗。因此，与Herceptii^—样，￡116111;乂@治疗在瑞士只 被批准作为单克隆抗体和化疗联合应用。此外，在瑞士和美国，ERBITUX 治疗只纟皮批准作为患者的二线治疗。同样，在2004年，八￥八3丁^@被批 准与基于静脉注射5-氟尿嘧啶的化疗联合应用，作为转移性结肠直肠癌 的一线治疗。ni期临床研究结果表明，使用AVASTD^力口 5-氟尿嘧啶治 疗的患者与单独使用5-氟尿嘧啶处理的患者相比，中位存活时间延长(分别是20个月和16个月)。然而，还是与Herceptii^和ERBITUX⑧一样， AVASTE^治疗只被批准作为单克隆抗体与化疗联合应用。
对于肺脏、脑、卵巢、胰腺、前列腺和胃癌的治疗，疗效仍然很差。 在II期临床试验中，得到了对于非小细胞肺癌最有希望的近期结果，其 治疗涉及与化疗试剂丁八乂0丁￡肌@联合应用的偶联细胞杀伤药物阿霉素 的单克隆抗体(SGN-15;dox-BR96,抗-唾液酸化的Lex)。 TAXOTERE⑧是唯 一经FDA批准的用于肺癌二线治疗的化疗药物。初始数据表明，与单独 使用丁^0丁￡11￡@相比，总体存活率提高。参与该研究的62个患者中， 三分之二接受了 SGN-15与TAXOTERE⑧的联合治疗，同时剩下的三分之 一接受了 TAXOTERE⑧的单独治疗。接受SGN-15与TAXOTERE⑧联合治 疗的患者的中位总体存活时间是7.3个月，相比之下，接受TAXOTERE⑧ 单独治疗的患者的中位存活时间是5.9个月。与接受丁^0丁￡肌@单独治 疗的患者的1年和18个月的总体存活率为分别24%和8%相比，接受 SGN-15与TAXOTERE⑧联合治疗的患者分别是29。/。和18%。进一步的临 床试验在计划中。
临床前试验中，使用单克隆抗体治疗黑色素瘤取得了有限的成功。 这些抗体中，极少有达到临床试验期的，且至今还没有一种得到批准， 或在III期临床试验中显示出良好效果。
由于对能够促进疾病发生的30, 000种已知基因产物中的相关靶点 缺乏鉴定，使治疗疾病的新药的发现受阻。在肿瘤学研究中，潜在的药 物靶点仅因为其在肿瘤细胞中过表达这一事实而经常被选择。随后，这 样鉴定的靶点通过与大量化合物的相互作用被筛选。就潜在抗体的治疗 而言，这些候选化合物通常由依据Kohler和Milstein 4是出的基本原理 (1975, Nature, 256， 495-497, Kohler and Milstein)的制备单克隆抗体的传统 方法所产生。从用抗原免疫过的小鼠(例如全细胞、细胞成分、纯化的抗 原)收集脾细胞，并与永生的杂交瘤细胞伴侣融合。根据与靶抗原密切结 合的抗体的分泌来筛选所产生的杂交瘤。包括Herceptii^和RITUXIMAB 在内的许多针对癌细胞的治疗和诊断的抗体已经用这些方法制备并已基 于它们的亲和性被选择。这项策略的缺陷是双重的。首先，由于对组织 特异性的癌症过程认识的贫乏及由此产生的鉴定这些靶标的过分简单的
13方法(诸如通过过表达来筛选)，与用于治疗或诊断的抗体结合的合适靶标 的选择是有限的。其次，与受体有最大结合亲和性的药物分子通常具有 启动或抑制信号的最大可能性这一假说并不总是成立。
尽管乳癌和结肠癌的治疗取得了 一些进展，但是有效的抗体治疗的 鉴定与开发对所有类型癌症而言都是不够的，不管是作为单一试剂还是 联合治疗。
现有专利
美国第5,750,102号专利公开了一种方法，其中用从来自患者的组织 或细胞中克隆的MHC基因转染来自患者肿瘤的细胞。然后用这些转染的 细胞给患者接种。
美国第4,861,581号专利公开了一种方法，所述方法包括的步骤有 获取对哺乳动物肿瘤细胞和正常细胞的细胞内成分特异而对外部成分没 有特异性的单克隆抗体；标记所述的单克隆抗体；将该标记的抗体与已 接受杀灭肿瘤细胞的治疗的哺乳动物的组织接触；以及通过测量该标记 抗体与退化的肿瘤细胞的细胞内成分的结合来确定治疗的效果。在制备 针对人类细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认识到肿瘤细胞代表这类 抗原的方^f更来源。
美国第5,171,665号专利提供了一种新型抗体及其制备方法。具体地， 该专利叙述了单克隆抗体的制备，所述抗体具有与人类肿瘤(例如肠癌和 肺癌)相关的蛋白抗原牢固结合的特性，而与正常细胞的结合程度弱得多。
美国第5,484,596号专利提供了一种癌症治疗的方法，所述方法包括 手术去除来自人类癌症患者的肿瘤组织；处理所述肺瘤组织以获得肿瘤 细胞；照射所述肿瘤细胞，使其能成活但不致瘤；以及使用这些细胞来 制备能够抑制原发性肿瘤复发，同时抑制肿瘤转移的患者疫苗。该专利 讲述了与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发。如在第4栏，第 45行等处提到的，专利权所有人在开发单克隆抗体中应用了自体肿瘤细 胞，所述单克隆抗体对人类肿瘤表现出活性特异的免疫治疗。
美国第5,693,763号专利讲述了人类癌细胞的糖蛋白抗原特性，且所 述抗原不依赖于起源的上皮组织。
14美国第5,783,186号专利涉及在表达Her2的细胞中诱导凋亡的抗 -Her2抗体、产生该抗体的杂交瘤细胞系、使用所述抗体和包含所述抗体 在内的药物组合物治疗癌症的方法。
美国第5,849,876号专利描述了产生单克隆抗体的新的杂交瘤细胞 系，所述抗体针对从肿瘤和非胂瘤組织来源中纯化的粘液素抗原。
类淋巴细胞的方法，制备单克隆抗体的方法以及由所述方法制备的单克 隆抗体。该专利特别涉及用于癌症诊断和治疗的抗-HD人类单克隆抗体 的制备。
美国第5,869,045号专利涉及与人类癌细胞反应的抗体、抗体片段、 抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的作用机制是双重的，其中所述 分子可与人类癌细胞表面的细胞膜抗原反应，而且所述抗体能够进一步 内化入癌细胞内，随后结合，使它们对形成抗体-药物和抗体-毒素的偶联 物特别有用。所述抗体以它们未经修饰的形式在特定浓度下，也表现出 细胞毒特性。
美国第5,780,033号专利7>开了用于肺瘤治疗和预防的自身抗体的使 用。不过，这种抗体是来自老年哺乳动物的抗核自身抗体。在这种情况 下，所述自身抗体是指一种存在于免疫系统的天然抗体。因为所述自身 抗体来自"老年哺乳动物"，所以就不要求自身抗体真正来自受治患者。 此外，该专利公开了来自老年哺乳动物的天然单克隆抗核自身抗体以及 产生单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。
发明概述
本发明采用了美国专利6,180,357中讲述的制备患者特异性抗癌抗体 的方法，用以分离编码癌性疾病调节单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些 抗体可以针对一种肿瘤被专门制备，从而使癌症治疗的个性化成为可能。 在本申请公开的内容中，具有细胞杀灭(细胞毒素的)或细胞生长抑制(细 胞生长抑制的)特性的抗癌抗体将在下文中被称为细胞毒的。这些抗体可 以用于帮助癌症的分期和诊断，也可以用于治疗肿瘤转移。这些抗体也 可以通过预防性治疗的方式用于癌症预防。与传统的药物发现模式下制备的抗体不同，用本方法制备的抗体可以靶向以前没有表明对恶性组织 生长和/或存活必需的分子和途径。此外，这些抗体的结合亲和性满足启 动细胞毒性作用事件的要求，所述事件可不顺从于更强的亲和性相互作 用。本发明的范围还包括将传统的化疗调节物质，比如放射核素，与本
发明中的CDMAB偶联，从而使所述的化疗作用集中。所述CDMAB也 可以与毒素、细胞毒性部分、例如生物素偶联酶的酶、细胞因子、干扰 素、靶标部分或报告分子部分或造血细胞偶联，从而形成抗体偶联物。 所述CDMAB可以单独使用或与一种或多种CDMAB/化疗治疗试剂联合 使用。
个体化抗癌治疗前景将会带来患者治疗方式的变化。 一个可能的临 床情境就是在肿瘤出现时，就获取肺瘤样本并入库。通过该样本，从预 存在的癌性疾病调节抗体组中对该肿瘤进行分型。对该患者进行常规分 期，而所提供的抗体可用于该患者的进一步分期。用现有的抗体可以直 接对该患者进行治疗，且所述肿瘤特异性的抗体组可以通过使用本文中 列出的方法来制备或通过噬菌体显示库与本文公开的筛选方法合用来制 备。既然其他肿瘤可能携带一些与被治疗肿瘤相同的抗原决定簇，制备 的所有抗体将被加入到抗癌抗体库中。按照本方法制备的抗体可以用于 治疗许多患有与这些抗体结合的肿瘤的患者的癌性疾病。
除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的治疗作为多模式治 疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对于非癌细胞相对无毒性这一 事实允许大剂量抗体组合的使用，要么单独使用，要么与传统的治疗联 合使用。高治疗指数也允许短期内的重复治疗，这种治疗会降低治疗抗 性细胞出现的可能性。
如果患者的初期治疗产生耐药性或发生了转移，可以重复肺瘤特异 性抗体的制备过程进4于再次治疗。此外，所述抗癌抗体可以与/人该患者 体内获得的红细胞偶联，重新输注到患者体内用于治疗转移肿瘤。目前 几乎没有有效的治疗转移癌的方法，而转移通常预示着导致死亡的不良 结果。然而，转移癌通常血管丰富，通过红细胞来递送抗癌抗体可以具 有将抗体富集在肿瘤部位的作用。即便在转移之前，大多数癌细胞也要 依赖于宿主的血供来存活，因而与红细胞偶if关的抗癌抗体对原位肺瘤同样有效。可选择地，所述抗体可以与例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细 胞、自然杀伤细胞等其他血细胞偶联。
抗体有五类，每类都与其重链所赋予的功能相关。通常认为通过抗 体依赖性细胞的细胞毒性作用或补体依赖性细胞毒性作用来介导棵抗体
的癌细胞杀伤功能。例如，鼠IgM和IgG2a抗体能够通过结合补体系统 的C-l组分来活化人类补体，从而活化导致胂瘤裂解的补体活化的经典 途径。对于人类抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgGl。鼠lgG2a 和IgG3同种型抗体可以有效地募集具有Fc受体的细胞毒细胞，所述Fc 受体会导致单核细胞、巨嗟细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作 用。人的IgGl和IgG3同种型抗体介导ADCC。
通过Fc区介导的细胞毒性作用需要例如NK细胞、T细胞和补体的 效应细胞、它们对应的受体或蛋白的存在。这些效应器机制缺乏的情况 下，抗体的Fc部分是无活性的。所述抗体的Fc部分在体内可以提供影 响抗体的药物动力学的特性，但在体外这是无效的。
我们测试抗体的细胞毒性作用分析没有任何效应器机制的存在，并 且在体外操作。这些分析没有效应细胞(NK细胞、巨噬细胞或T-细胞) 或补体的存在。既然这些分析完全由加在一起的成分确定，所以每一成 分都可以被表征。本文中使用的分析只包含靶细胞、介质和血清。因为 这些靶细胞是癌细胞或成纤维细胞，所以它们没有效应器功能。在没有 具有效应器功能特性的外源细胞情况下，就没有具有该功能的细胞组分。 所述介质不包含补体或任何细胞。用于支持所述耙细胞生长的血清没有 厂商公开的补体活性。此外，在我们自己的实验室中，我们已经验证了 在使用的血清中没有补体活性。因此，我们的工作证明了抗体的效应是 完全来自通过Fab介导的抗原结合的效应这一事实。有效地，既然所述 靶细胞没有对应Fc的受体，它们^皮观察到只与Fab相互作用。尽管杂交 瘤分泌被用靶细胞测试的完整免疫球蛋白，但所述免疫球蛋白与所述细 胞相互作用的唯一部分是作为抗原结合片段的Fab。
关于本发明要求保护的抗体和抗原结合片段，提交的本申请已经证 实了细胞的细胞毒性作用，如由

图1中的数据所证明的那样。如上述所指出以及如本文通过客观证据所证实的，该效应完全来自所述Fab对肺 瘤细胞的结合。
本领域存在大量关于抗体介导的细胞毒性作用来自抗体与靶抗原的 直接结合而不依赖于由Fc募集的效应器机制的i正据。对此最好的证据是
整的免疫球蛋白或用诸如F(ab)'2片段的抗原结合片段实施了这些类型的 实验。在这些类型的实验中，抗体或抗原结合片段能够直接诱导靶细胞 的凋亡，诸如抗-Her2和抗-EGFR抗体的情况，所述两种抗体已经;故美 国FDA杏匕准上市用于癌症治疗。
抗体介导的癌症杀伤功能的另 一可能机制可能是通过使用能够催化 细胞膜及其相关糖蛋白或糖脂中各种化学键水解的抗体，即所谓的催化 抗体。
抗体介导的癌细胞杀伤还有三种机制。第一种是用抗体作为疫苗以 诱导机体产生针对存在于癌细胞的推定抗原的免疫反应。第二种是用抗 体靶向生长受体，并干扰它们的功能或下调所述受体，以使受体功能有 效丧失。第三种是这类受体对细胞表面部分的直接连接(ligation)的作用， 这可导致直接的细胞死亡，比如诸如TRAIL Rl或TRAIL R2的死亡受体， 或是诸如o;Vi8 3及其类似物的整合素分子的连接。
癌症药物的临床应用是基于该药物在可接受的风险范围下对患者的 益处。在癌症治疗中，存活率通常是追求的最主要的益处。但是，除了 延长寿命之外，还有许多其他公认的益处。在治疗对存活率没有负面影 响的情况下，这些其他益处包括症状减轻、防止副作用、延长复发或无 疾病存活时间以及延长病情进展时间。这些标准是被普遍接受的，且诸 如美国食品药品管理局(F. D. A.)等管理机构批准产生这些益处的药物 (Hirschfeld " a/. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy (月中瘤学/血液学 的临床综述)42:137-143 2002)。除了这些标准之外，人们充分认识到还有 一些其他的指标可以预测这些类型的益处。在某种程度上，美国FDA准 许的快速审批程序肯定了可能预测患者受益的替代品的存在。到2003年 末，有16种药物在这种程序下得到批准，在这些药物中，有四种进入了 完全审批，即后续的研究已经显示了直接的患者受益，正如替代指标预测的那样。确定药物对实体肿瘤疗效的一个重要的指标是通过测定对治
疗的反应来评价月中瘤负荷(Therasse d a/. Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000)。这类评价的临床标准(RECIST criteria (RECIST标准))已经由实体肿瘤反应评价标准工作组(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group)^S布，该工作纟且由国际癌症专家组 成。正如依据RECIST标准的客观反应显示的，与适当的对照组相比， 对肺瘤负荷有确切作用的药物易于最终对患者产生直接的益处。在临床 前设置中，肿瘤负荷通常能更直接地被评价和记录。因为临床前研究可 以转化成临床设置，所以在临床前模型中延长存活率的药物有最好的预 期临床效用。与临床治疗产生的积极作用相似，在临床前设置中减轻肿 瘤负荷的药物也对疾病有明显的直接影响。尽管延长生存时间是癌症药 物治疗中追求的最主要的临床结果，但仍有其他有临床作用的益处，并 且显然，降低胂瘤负荷(其与疾病进展的延迟、生存时间的延长或两者都 有关系)也能导致直接的益处，并具有临床作用 (Eckhardt a a/. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds(发展的治疗学靶化合物的临床试验设计的成功 与失败)；ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003，第209-219 页)。
本发明描述了通过在细胞毒性作用分析和未建立的动物模型中的作 用鉴定的AR53A10.il的开发和应用。本发明描述了特异性结合存在于靶 分子上的 一个或多个抗原决定簇的试剂，其作为棵抗体还对恶性肿瘤细 胞而非正常细胞具有体外细胞毒性作用，并且也可作为棵抗体直接介导 肿瘤生长的抑制。另外的进步是将该抗体包括在抗癌抗体库中，通过确 定不同的抗癌抗体的合适组合会提高靶向表达不同抗原标志物的肿瘤的 可能性，以实现最有效的靶向和抑制所述肿瘤的生长和进展。。既然它能 够在人类患者中显示相似的抗癌特性，因此它也代表癌症治疗方面的进 步。另外的进步是该抗体包括在抗癌抗体库中，通过确定不同的抗癌抗 体的合适组合会提高靶向表达不同抗原标志物的肿瘤的可能性，以实现 最有效的靶向和抑制所述肿瘤的生长和进展。
总之，本发明讲述了 AR53A10.il抗原作为治疗试剂靶点的应用，给予所述治疗试剂时可以减轻哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷。
本发明也讲述了 CDMAB (AR53A10.11)及其衍生物、其抗原结合片段和 其细胞毒性作用诱导配体，靶向它们的抗原以减轻哺乳动物中表达该抗 原的癌症的肿瘤负荷的用途。此外，本发明也讲述了在癌细胞内;^测 AR53A10.il抗原的用途，其用于携带表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊 断、治疗的预测及预后。
因此，本发明的目的是利用制备抗来源于特定个体的癌细胞、或者 一种或多种特定癌细胞系的癌性疾病调节抗体(CDMAB)的方法，以分离 杂交瘤细胞系和该杂交瘤细胞系编码的相应的分离的单克隆抗体及其抗 原结合片段。所述CDMAB对癌细胞有细胞毒性作用，而同时对非癌细 胞相对无毒。
本发明的另外目的涉及癌性疾病调节抗体、配体及其抗原结合片段。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，所述抗体的细胞毒性 作用由抗体依赖的细胞毒性作用介导。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，所述抗体的细胞毒性 作用由补体依赖的细胞毒性作用介导。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，所述抗体的细胞毒性 作用是其催化细胞化学键水解的能力的作用。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，所述抗体用于癌症诊 断、预后和监测的结合分析。
通过本发明下述的说明、举例和一些实施方案的描述，本发明其他 的目的和优点将变得显而易见。
附图简要说明
图1比较了杂交瘤上清对细胞系OCC-l, OVCAR-3和CCD-27sk的 细胞毒性百分比和结合水平。
图2显示了 AR53A10.il和抗-EGFR对照对癌细胞系和正常细胞系 的结合。数据制成表格，以高出同种型对照的倍增显示平均荧光强度。
图3包括了针对几种癌细胞和非癌细胞系的AR53A10.il和抗-EGFR 抗体的代表性FACS直方图。
20图4说明了 AR53A10.il在预防性DLD-1结肠癌模型中对肿瘤生长 的影响。垂直虚线(verticaldashedline)表示给予抗体的时间段。数据点表 示平均值+/-标准误。
图5说明了 AR53A10.il在预防性DLD-1结肠癌模型中对体重的影 响。数据点表示平均值+A标准误。
图6是人组织《效阵列中AR53A10.il与阳性和阴性对照的比较。
图7代表性显微图，显示了人组织微阵列中用AR53A10.11(A)或同 种型对照抗体(B)在结肠肿瘤组织上获得的结合模式，以及用 AR53A10.11(C)或抗-肌动蛋白(D)在结肠正常组织上获得的结合模式。 AR53A10.il对肿瘤细胞显示了强阳性染色，且对正常组织显示了阴性染 色。放大倍数是200x。
发明的详细说明
下面用于概述、描述、实施例和权利要求书中的字词或短语通常都 有其指定的含义。
术语"抗体"使用其最广泛的含义，并特别包括例如单种单克隆抗体 (包括激动剂、拮抗剂和中和抗体、去免疫的、鼠源的、嵌合的或人源化 的抗体)、具有多抗原表位特异性的抗体组合物、单链抗体、双体
(diabodies)、三体(tribodies)、免疫偶联物和抗体片段(见下文)。
本文中使用的术语"单克隆抗体"指从基本同质的抗体群中获得的 抗体，即包含该群抗体的单个抗体是相同的，除了可以少量存在的可能 自然发生的变异。单克隆抗体高度特异性的针对单一抗原位点。此外， 与包含针对不同决定基(抗原决定簇)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比， 每一种单克隆抗体针对抗原上的单一决定基。除了它们的特异性之外， 单克隆抗体的优势还在于它们的合成可以不受其他抗体的污染。修饰语 "单克隆的"指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，而不能解释 为需要通过任何特定的方法来生产该抗体。例如，本发明中使用的单克 隆抗体可以通过由Kohler W iV^we， 256:495 (1975)首次描述的杂交瘤 (鼠或人)方法制备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第 4,816,567号)。还可以使用例如在Clackson & Atowe， 352:624-628(1991)和Marks d a/, 乂 Mo/. 5z'o/， 222:581-597 (1991)中描述的技术，从噬菌体抗体库中分离"单克隆抗体"。
"抗体片段"包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区域或其可变区。抗体片段的实例包括非全长的抗体、Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
"完整"抗体指包括抗原结合可变区，以及轻链恒定区(CJ和重链恒定区Ch1， Ch2和Ch3的抗体。恒定区可以是天然序列的恒定区(例如，人天然序列恒定区)或其氨基酸序列的变体。优选地，所述完整抗体有一个或多个效应器功能。
依据其重链恒定区的氨基酸序列，完整抗体可以分为不同的"种类"。有五主类完整的抗体IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM，并且其中几种可以进一步分为"亚类，，(同种型)，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2。对应于不同种类抗体的重链恒定区分别被称为a;S，e，7和M。不同种类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维空间构型是公知的。
抗体"效应器功能"指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或氨基酸序列变异的Fc区)的生物活性。抗体效应器功能的实例包括Clq结合；补体依赖的细胞毒性作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。
"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用"和"ADCC"指细胞介导的反应，在该反应中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，噬中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后导致所述靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达Fc7Rin,而单核细胞表达FcrvRI、FcryRI1和FcryRni。在Ravetch和Kinet,v4"m/.及ev. 7mm""o/ 9:457-92 (1991)第464页的表3总结了造血细胞的FcR表达。为了测定目标分子的ADCC活性，可以进行诸如在美国第5,500,362或5,821,337号专利中描述的体外ADCC活性测定。用于这类分析的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地或附加地，可在体内评^介目标分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes d a/./WAS (USA) 95:652-656 (1998)中公开的动物模型中。
"效应细胞"指表达一种或多种FcRs并执行效应器功能的白细胞。优选地，这些细胞至少表达FcryRIII，并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源中分离，例如从本文中描述的血液或PBMC中分离。
术语"Fc受体"或"FcR"用于描述结合于抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列的人类FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体Cy受体)的受体，并包括Fc7RI， FctRII和Fcry RIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和选择性的剪切形式。FctRII受体包括FcryRIIA("激活性受体")和F(ryRHB ("抑制性受体")，两者的氨基酸序列相似，区别主要在于其胞浆区。激活性受体Fc7RIIA在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体F(ryRIIB在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见Dagron, 及ev. 7mmw"o/. 15:203-234 (1997)中的综述M)。在Ravetch和Kinet，及ev. /mm""o/ 9:457-92(1991);Capel W a/., /mmwwome^io<is 4:25-34 (1994)禾口 de Haas eZ a/" / 丄a6. C//w.
126:330-41 (1995)中对FcRs进行了综述。其他FcRs,包括将来要被确认的那些，都包括在本文中的术语"FcR"中。所述术语也包括负责将母体的IgGs转移到胎儿体内的新生受体，FcRn (Guyer " a/.， , /mm頭o/. 117:587 (1976)和Kim " a/" 7w画o/. 24:2429 (1994))。
"补体依赖性细胞毒性作用"或"CDC"指分子在补体存在下，裂解靶细胞的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(Clq)与交联了同类抗原的分子(比如，抗体)的结合被启动。为了评价补体激活，可以进行例如在Gazzano-Santoro d a/.， 《/ /mm謂/. McWs 202:163 (1996)中所描述的CDC分析。
术语"可变的"指可变区某些部分的序列在抗体间高度不同，并用于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变异并不是
均匀分布在抗体的可变区内。它集中在轻链和重链可变区的三个所谓的高度可变区的片段内。可变区内更加高度保守的部分被称为骨架区(FR)。每个天然的重链和轻链可变区包含由三个高度可变区连接的主要采用]8-片层构型的四个FRs，其形成环状连接，且在某些情况下形成部分/5-片 层结构。每条链的高度可变区通过FRs以密切靠近的方式结合在一起， 并与另 一条链的高度可变区 一起，促成抗体的抗原结合部位的形成(参见 Kabat e, a/， 5^wewcey o/o/7m腦wo/og/ca/ /她mstf^瘦夢^标蛋 冷射#/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， Md. pp 15-17; 48-53 (1991 ))。恒定区并不直接参与抗体与抗原 的结合，而是呈现各种效应器功能，诸如在抗体依赖性的细胞毒效应 (ADCC)中抗体的参与。
本文中使用的术语"高度可变区"指抗体中负责与抗原结合的氨基 酸残基。高度可变区通常包含"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例 如轻链可变区的氨基酸残基24-34 (LI )、 50-56 (L2)和89-97 (L3)及重链可 变区的氨基酸残基31-35 (Hl)、 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat e a/, 5fegwe"ces o/o/ /mmw"o/og7'ccf/ /她/^^€瘦夢《标蛋4的 , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991))和/或"高变环"区的那些氨基酸残基(例如轻链可变 区的残基2632 (Ll)、 50-52 (L2)和91-96 (L3)及重链可变区的26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia and Lesk /. Mo/. 5zo/. 196:901-917 (1987))。"骨架区"或"FR"残基指除了本文定义的高变区残基之外的那 些可变区的残基。木瓜蛋白酶水解抗体产生了两个相同的被称为"Fab" 片段的抗原结合片段和一个残余的"Fc"片段，每个"Fab"片段都有单 一的抗原结合部位，"Fc"片段的名称反映了其易结晶的能力。胃蛋白酶 处理产生了有两个抗原结合部位且仍能够与抗原交联的F(ab')2片段。
"Fv"是含有完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。该区 域由以紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变区的二聚体组成。 以每个可变区的三个高变区相互作用的这种构型决定Vh-Vl二聚体表面 的抗原结合部位。六个高变区域共同赋予了抗体的抗原结合特异性。然 而，即^^单一的可变区(或只含有三个抗原特异性高变区的Fv的一半)仍 能够识别和结合抗原，尽管比完整结合位点的亲和性低。Fab片段也含 有轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。 Fab'片段不同于Fab片段之处
24在于其重链CH1区的羧基末端多了包括来自抗体铰链区的一个或多个
半胱氨酸的几个氨基酸残基。Fab'-SH在本文中指代Fab',其中所述恒定 区的半胱氨酸残基至少携带一个游离的硫基。最初的F(ab')2抗体片段以 Fab'片段对产生，之间有铰链的半胱氨酸。其他的抗体片段的化学偶联也 是已知的。
来自任何脊推动物的抗体的"轻链"基于其恒定区的氨基酸序列，都 可以归于两种截然不同的所谓kappa (k)和lambda (X)链中的 一种。
"单链Fv"或"scFv"抗体片段包含抗体的Vh区和Vl区，其中这 些区域存在于单一的多肽链上。优选地，所述Fv多肽还包含Vh和Vl 区之间的多肽连接子，所述连接子使scFv形成用于抗原结合的理想结构。 关于scFv的综述参见Pliickthun in Z7ie尸/!ar则co/ogy o/ Mo"oc/o"a/ ^w"力o^sf#义發戎傳秀理夢人vol. 113, Rosenburg and Moore eds.， Springer誦Verlag， New York, pp. 269-315 (1994)。
术语"双体"指带有两个抗原结合位点的小型抗体片段，所述片段 在同一多肽链上(VH-V。包含与轻链可变区(vo结合的重链可变区(Vh)。
通过使用因过短而不能使同一条链上的两个区域配对的连接子，使这些 区域被迫与另一条链上的互补区域配对，由此产生了两个抗原结合位点。
例如在EP 404,097; WO 93/11161 ;和Hollinger & a/. ' /Voc. A^/5W. "SL4， 90:6444-6448 (1993)中对双体作了更详细的描述。
术语"三体"或"三价三聚物"指三个单链抗体的结合。三体用VL 或vh区的氨基酸末端构成，即没有任何连接子序列。三体具有三个其多 肽以环状、头尾相接模式排列的Fv头。所述三体的可能构象是平面的， 位于平面内的三个结合部位彼此成120度的角度。三体可以是单特异性 的、双特异性的或三特异性的。
"分离"抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗 体。其天然环境下的污染成分是指会干扰抗体诊断或治疗作用的物质， 可以包括酶、激素和其它的蛋白质的或非蛋白质的溶解物。因为缺乏抗 体的天然环境中的至少 一种组分，所以分离的抗体包括重组细胞内部的 原位抗体。但是，通常分离的抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。
"结合"目的抗原的抗体是指能够以足够的亲和力结合所述抗原的抗体，以致所述抗体在耙向表达所述抗原的细胞时，可以用作治疗或i貪 断试剂。如果所述抗体是结合目标抗原的抗体，.它通常会优先结合目标 抗原，而不是其它蛋白，这不包括诸如非特异性的Fc接触的偶然结合或 与其他抗原共有的翻译后修饰成分结合，并且所述抗体可以是不会与其 他蛋白有明显的相互作用的抗体。检测与目的抗原结合的抗体的方法在
本领域中是公知的，可以包括但并不限于诸如FACS、细胞ELISA和 Western印迹的分片斤。
如本文所使用的，"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物，，的表述可以交 替使用，所有这些指代都包括其子代。也可以理解为由于人为的或非人 为的突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化细胞 内筛选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。从有意使用的 不同指代的上下文中，指代是清楚的。
"治疗"既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就 是预防或减緩(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经 存在所述病症的个体，还包括那些将发展为所述病症的或欲对所述病症 进行预防的个体。因此，本文中欲被治疗的哺乳动物可已经被诊断为患 有所述病症或倾向于或易感于所述病症。
术语"癌症"和"癌性(的)"是指或描述哺乳动物的生理状态，其典 型特征是细胞生长或死亡不受调控。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴 瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症更多具体的实 例包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺 癌、肺腺癌和肺鳞癌在内的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌在 内的胃癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝脏癌症，膀胱 癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子 宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴肿瘤，曱状腺癌，肝癌，肛癌， 阴茎癌，以及头颈部癌。
"化疗剂"是用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括诸如p塞 替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化剂；诸如白消安(busulfan)、英丙舒 凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；诸如苯佐替派 (benzodopa)、卡波醌、美妥替旅(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)的氮丙
26啶类；包括六曱蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、 三亚乙基硫代磷酰胺和三曱基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙 烯亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamine);诸如瘤可宁 (chlorambucil^萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、 氮芥(mechlorethamine)、盐酸曱氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥 (novembichin)、苯乙酉吏氮芥(phenesterine)、〉发尼莫司汀、曲石粦胺、乌4立莫 司汀(uracil mustard)的氮芥类药物；诸如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、 洛莫司汀、尼莫司丁、雷莫司汀的硝脲类(nitrosureas);诸如阿克拉霉素 类、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里 刹霉素、洋红霉素(carabicin)、碳霉素(carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素、 放线菌素D、柔红霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比 星(doxorubicin)、表阿霉素、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉 素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、 三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星、杀结核菌素、 乌苯美司、净司他丁、佐柔比星的抗生素；诸如曱氨碟呤和5-氟尿嘧啶 (5-FU)的抗代谢类药；诸如二曱叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三曱曲沙的叶 酸类似物；诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、疏米噤呤、硫鸟噪呤的噤呤类似物； 诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、 去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU的嘧啶类似物；诸如卡鲁睾酮、 屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮的男性激素类药物；诸 如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦的抗肾上腺类药物；诸如亚叶酸的叶酸 补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil; 比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋 铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米 托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶 草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链 孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴 嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；嗛泊溴烷；gacytosine;阿 拉伯糖苷("Ara-C");环磷酰胺；塞替派；例如紫杉醇(TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.)和多西他赛(TAXOTERE⑧，Aventis, Rhone-Poulenc Rorer， Antony, France)等紫杉烷类；苯丁酸氮芥； 吉西他滨；6-硫乌噤呤；巯噪呤；曱氨蝶呤；诸如顺铂和卡铂的铂类似物； 长春碱；鉑；依托泊香(VP- 16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌； 长春新碱；长春瑞滨；去曱长春碱；诺消灵(novantrone);替尼泊苷；柔 红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟曱基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；埃斯波霉素(espemmicins);卡 培他滨；以及上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。调节 或抑制激素对胂瘤作用的抗激素类药物也包括在本定义内，诸如包括例 如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、 曲沃昔芬、雷诺昔芬(keoxifene)、 LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐 通)的抗雌激素药物；以及诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林 和戈舍瑞林的抗雄激素物质；以及上述任一种药物在药学上可接受的盐、 酸或书f生物。
用于治疗目的的"哺乳动物"指任何一种可归于哺乳类的动物，包 括人类、小鼠、免疫缺陷鼠(SCID)或棵鼠或品系小鼠、家畜和农场动物 及动物园内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。 优选地，本文中的哺乳动物指人类。
"寡核苷酸"指短长度、单链或双链多聚脱氧核苷酸，其通过已知 的方法(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学，利用诸如发表于1988 年5月4日的EP 266,032中描述的固相技术，或经由Froehler & a/, AW. 爿c/ds 7 &s.， 14:5399-5407， 1986描述的脱氧核苷H-磷酸盐中间物化学合 成。然后将其用聚丙烯酰胺凝胶纯化。
依照本发明，非人类(例如鼠科)免疫球蛋白的"人源化"和/或"嵌 合"形式指抗体，所述抗体包含导致人抗小鼠抗体(HAMA)、人抗嵌合抗
疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab)2或抗体的 其他抗原结合序列)，并且包含再现所需效应必需的来自所述非人免疫球 蛋白的必需部分(诸如CDR(s)、抗原结合区(s)、可变区等等)，同时保留 可与所述非人免疫球蛋白相比的结合特性。在绝大多数情况下，人源化 抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中，来自受者抗体的互补决定区(CDRs)的残基被诸如具有所需的特异性、亲和力、能力的小鼠、大鼠或 兔等非人类抗体(供者抗体)的CDRs的残基所替代。在一些情况下，人类 免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人类FR残基所替代。此夕卜， 人源化抗体可以包含既不在受者抗体也不在引入的CDR或FR序列的残 基。这些修饰被产生以进一步改善和优化抗体的性能。通常，人源化抗 体包含至少一个，通常是两个可变区的基本上所有的部分，其中所有或 基本上所有的CDR区对应非人类免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本 上所有的FR残基是人类免疫球蛋白共有序列的FR残基。最优地，人源 化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋 白的恒定区。
"去免疫化"抗体是对特定的物种没有免疫原性或免疫原性较差的 免疫球蛋白。通过对抗体结构的改造可以实现去免疫化。可以使用任何 本领域技术人员公知的去免疫化技术。例如，在发表于2000年6月15 日的WO 00/34317中，描述了 一项使抗体去免疫原性的适当的技术。
诱导"细胞凋亡"的抗体是通过任何方式诱导程序性细胞死亡的抗 体，这些方式例如但不限于结合膜联蛋白V(Annexin V)、半胱天冬酶 活性、DNA断裂、细胞皱缩、内质网扩张、细胞石皮碎和/或膜嚢泡(所谓 的凋亡小体)的形成。
本文中使用的"抗体诱导的细胞毒性作用"被理解为指来自杂交瘤 上清或由杂交瘤产生的抗体的细胞毒效应，所述杂交瘤以保藏号 141205-04保藏于IDAC，所述毒性效应并不必然与结合程度相关。
在本说明书中，杂交瘤细胞系及其产生的分离的单克隆抗体可选择 用它们的内部分类号AR53A10.il或保藏号IDAC 141205-04来表示。
本文中使用的"抗体-配体"包括至少对靶抗原的一个抗原决定簇有 结合特异性的部分，所述部分可以是完整的抗体分子、抗体片段和至少 有一个抗原结合区或其部分(即抗体分子的可变部分)的任何分子，例如， Fv分子、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、双特异性抗体、融合蛋白或 任何基因工程分子，所述分子特异性识别和结合抗原的至少一个抗原决 定簇，所述抗原可被命名为IDAC 141205-04(IDAC 141205-04抗原)的杂 交瘤细胞系产生的分,离的单克隆抗体结合。
29本文中使用的"癌性疾病调节抗体，，(CDMAB)指以有益于患者的方 式，例如通过减轻肿瘤负荷或延长肿瘤患者的生存期的方式，调节癌性 疾病过程的单克隆抗体，以及其抗体-配体。
使用其最广泛意义的"CDMAB相关结合剂"被理解为包括但不限 于任何形式的竟争性结合至少一个CDMAB靶抗原决定簇的人或非人抗 体、抗体片段、抗体配体或其类似物。
"竟争性结合剂"被理解为包括任何形式的具有针对至少一个 CDMAB靶抗原决定蔟的结合亲和性的人或非人抗体、抗体片段、抗体 配体或其类似物。
欲被治疗的肿瘤包括原发性肿瘤和转移性肿瘤以及耐受性肺瘤 (refractory tumors)。耐受性肺瘤包括对用单独的化学治疗试剂、单独的抗 体、单独的放射或其组合的治疗不发生反应或产生抵抗的肿瘤。耐受性 肿瘤也包括其显示被用这些试剂的治疗抑制，但在治疗中断后5年、有 时一直到IO年或更长的时间复发的肿瘤。
可以被治疗的肺瘤包括没有形成血管的、基本上没有形成血管的以 及形成血管的胂瘤。因此可以被治疗的实体肺瘤的实例包括乳腺癌、肺 癌、结肠直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。这些肿瘤的一些实例 包括表皮样瘤，鳞状紳瘤，诸如头颈肿瘤、结肠直肠肺瘤、前列腺肿瘤、 乳腺肿瘤、包括小细胞和非小细胞肺肿瘤的肺肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺 肿瘤、卵巢肿瘤和肝脏肿瘤。其它的实例包括Kaposi's肉瘤、中;fe神经 系统肿瘤、神经母细胞瘤、毛细血管血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、 黑色素瘤、胃肠道的和肾的癌及肉瘤、横紋肌肉瘤、优选多形性胶质母 细胞瘤的胶质母细胞瘤以及平滑肌肉瘤。
本文中使用的"抗原结合区"指识别靶抗原的分子部分。
本文中使用的"竟争性抑制，，是指通过常规的抗体相互竟争分析 (Belanger L"Sylvestre C.和Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竟争和夹心法 的曱胎蛋白的酶联免疫测定).Clinica Chimica Acta 48, 15)，能够识别和结 合由命名为IDAC 141205-04的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(IDAC 141205-04抗体)4十对的抗原决定表位。
30本文中使用的"靶抗原"指IDAC 141205-04抗原或其部分。 本文中使用的"免疫偶联剂"指以化学或生物学方式连接到细胞毒 素、放射物质、细胞因子、干扰素、靶标部分靶标部分或报告分子部分 报告分子部分、酶、毒素、抗胂瘤药或治疗剂的诸如抗体的任一分子或 CDMAB。只要能够与其靶标结合，该抗体或CDMAB可以在其分子的任 何位置与细胞毒素、放射物质、细胞因子、干扰素、耙标部分或报告分 子部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂连接。免疫偶联剂的实例包括抗 体毒素化学偶联剂和抗体-毒素融合蛋白。
适于用作抗肿瘤试剂的放射性试剂对本领域的技术人员而言是已知 的。例如，使用131I或211At。使用常规的技术(例如Pedley et al, Br. J. Cancer 68， 69-73 (1993))将这些同位素结合于抗体。可选择地，所述结合 到抗体的抗肺瘤试剂是激活前体药物的酶。可以给予前体药物，所述前 体药物保持它完整的形式直至到达肿瘤部位， 一旦给予抗体复合物，所 述前体药物在肿瘤部位转化为它的细胞毒性形式。在实践中，将抗体-酶
偶联物给予患者并且允许其定位于欲被治疗的组织区。然后将所述前体 药物给予患者以使向细胞毒性药物的转化发生在;fe夂被治疗的组织区。可 选择地，偶联到抗体的抗肿瘤试剂是诸如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4) 或肿瘤坏死因子a (TNF-a)的细胞因子。所述抗体将所述细胞因子輩巴向 肿瘤以使所述细胞因子在不影响其它组织的情况下，介导对肿瘤的损伤 或破坏。使用常规的重组DNA技术，将细胞因子在DNA水平融合到抗 体。也可以使用干"t尤素。
本文中使用的"融合蛋白"指任何嵌合蛋白，其中抗原结合区与例 如毒素、酶、荧光蛋白、发光标志物、多肽标签、细胞因子、干扰素、 靶标部分或报告分子部分或蛋白药物的生物活性分子连接。
本发明还涉及耙标部分或l艮告分子部分连接的本发明的CDMAB。 靶标部分是结合对的第一成员。例如抗肿瘤试剂偶联到这种对的第二成 员并由此指向抗原结合蛋白结合的部位。这样一种结合对的共有实例是 抗生物素蛋白和抗生素。在优选的实施方案中，抗生物素蛋白偶联到本 发明所述的CDMAB的靶抗原，并由此为偶联到抗生物素蛋白或抗生蛋 白链菌素的抗肿瘤试剂或其它部分提供耙标。可选择地，生物素或其它这样的部分连接到本发明所述的CDMAB的靶抗原并用作报告分子，例 如在诊断系统中，其中可4企测的信号产生剂偶联到抗生物素蛋白和抗生 蛋白链菌素。
可检测的信号产生剂用于体内和体外的诊断目的。所述信号产生剂 产生可测量的信号，所述信号可以通过体外的装置检测，通常是电磁辐 射的测量。通常，所述信号产生剂是酶或生色团，或通过荧光、磷光或 化学发光的发光。生色团包括吸收紫外线或可见区的光的染料，也可以 是酶催化反应的底物或降解产物。
此外，所述CDMAB在体内和体外用于本领域公知的研究的或诊断 的方法包括在本发明范围内。为了实施本文所涉及的诊断方法，本发明 还可以包括包含本发明的CDMAB的试剂盒。所述试剂盒可以通过4企测 个体细胞上的所述CDMAB的靶抗原用于鉴定有患某些类型肿瘤风险的 个体。
诊断分析试剂盒
以诊断分析试剂盒的形式利用本发明所述的CDMAB来确定肿瘤的 存在是被考虑的。患者体内的肿瘤通常基于一个或多个肿瘤特异性抗原 的存在被4企测，例如在从所述患者获得的诸如血液、血清、尿液和/或肿 瘤活组织的生物样本中的蛋白和/或编码这些蛋白的多核苷酸。
所述蛋白作为指示例如结肠、乳腺、肺或前列腺肺瘤的特定肿瘤存 在与否的标志物起作用。还涉及所述抗原具有用于检测其它癌性肿瘤的
包括在诊断分析试剂盒中使与生物样本中的试剂结合的抗原的水平能够 被检测。多聚核甘酸引物和探针可以用于检测编码肿瘤蛋白的mRNA水 平，所述mRNA水平也指示肿瘤的存在与否。为了使所述结合分析有诊 断价值，产生与抗原的显著水平在统计学上相关的数据以使结合的识别 对癌性肿瘤的存在有决定性的诊断价值，所述显著水平相对于在正常组 织内存在的抗原水平。涉及如本领域的技术人员熟知的多种形式可以用 于本发明的诊断分析，用于使用结合剂检测样本中的多肽标志物。。例 ^口, 3口在Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual(^t体实马全室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.中示例的。还涉及前述it断分析 形式的任何和所有的组合物、变换或修饰。
剂接触;'(bM企测样本中与结合剂结合的多肽水平；以及(c)比较有预定临 界值的多肽水平决定。
在示例性实施方案中，涉及所述分析会包括使用固定于固体载体的基 于CDMAB的结合试剂以结合和移除来自剩余样本的多肽。然后可以使 用包含报告分子基团并且特异性结合于结合试剂/多肽复合物的检测试剂 检测结合的多肽。示例性检测试剂可以包括特异性与多肽结合的基于 CDMAB的结合试剂或特异性结合于所述结合剂的抗体或其它试剂，诸 如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或植物凝集素。在一个可选择的实施 方案中，涉及使用竟争性分析，其中多肽用报告分子基团标记并在将固 定的结合剂与样本孵育后能够与所述结合剂结合。样本组分抑制标记的 多肽与结合剂结合的程度指示样本与固定的结合剂的反应。用于所述分 析的合适多肽包括结合剂对其有结合亲和力的全长的肿瘤特异性蛋白和/ 或其部分。
诊断试剂盒带有以本领域技术人员已知的任何材料的形式的固体载 体，蛋白可以结合到所述载体。合适的实例可以包括微孔板中的测试孔 或硝酸纤维素或其它合适的膜。可选择地，所述载体可以是诸如玻璃、 纤维玻璃、乳胶的小珠或圓盘，或诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯的塑料。所 述载体也可以是》兹性颗粒或光纤传感器，诸如例如在美国第5,359,681号 专利中公开的那些。
本发明涉及使用在专利和科学文献中详细描述的多种本领域技术人 员已知的方法将所述结合剂固定于所述固体载体。术语"固定"既指诸如 吸附的非共价结合，又指共价结合。在本发明的上下文中，所述共价结 合可以是载体上的试剂和功能团的直接连接，或者可以是通过交联剂的 连接。在优选的但非限定性实施方案中，通过吸附固定到微孔板内的孔 或固定到膜上是优选的。可以通过将所述结合试剂在合适的緩沖液中与 固体载体接触合适的时间来实现吸附。接触时间可以随着温度变化，并
通常会在约1小时到约1天的范围内。结合剂与固体载体的共价结合通常通过首先将载体与双功能试剂起 反应而完成，所述双功能试剂与载体以及结合剂上诸如羟基或氨基的功 能基团起作用。例如，使用苯醌或通过载体上的醛基与结合伴倡上的胺 和活性氢的缩合，可以将所述结合剂共价结合到具有适当的多聚体包被
的载体(参见,例如，Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (Pierce免疫技术目录和手册)，1991,在Al 2 A13)。
本发明还涉及所述诊断分析试剂盒会采用双抗体的夹心分析法的形 式。该测定可以通过首先将例如本发明公开的CDMAB的抗体与所述样 本接触来进行该分析，以致样本中的多肽能够结合到固定的抗体，所述 CDMAB已经被固定于固体载体，通常是微孔板的孔。然后将未结合的 样本从固定的多肽-抗体复合物中去除，并加入包含报告分子基团的检测 试剂(优选能结合到多肽的不同部位的第二抗体)。然后使用适于特定报告 分子基团的方法确定保持与固体载体结合的检测试剂的量。
在具体的实施方案中，涉及一旦抗体被固定于如上所述的载体上， 载体上剩余的蛋白结合位点会通过使用本领域技术人员已知的诸如牛血 清白蛋白或吐温20TM (Sigma Chemical Co.， St. Louis, Mo.)的任何适当的 封闭试剂被封闭。然后将固定的抗体与样本孵育，使多肽结合到所述抗 体。所述样本可以在孵育前，用诸如磷酸緩沖盐(PBS)的合适稀释剂被稀 释。通常，会选择适当的接触时间(即，孵育时间)以对应足以检测多肽在 从带有特定选择的肿瘤的个体中获得的样本内存在的时期。优选地，所 述接触时间足以完成在结合和非结合多肽平衡时达到的结合水平的至少 95%的结合水平。本领域的技术人员会认识到可以通过分析一段时间发生 的结合水平容易地确定达到平衡所必需的时间。
本发明还涉及然后将未结合的样本通过用适当的緩冲液沖洗固体 载体去除。接着将包含4艮告分子基团的第二抗体加入到固体载体。然后 将检测试剂与固定的抗体多肽复合物粹育一段足以检测结合的多肽的时 间。随后，未结合的检测试剂会被去除，而结合的检测试剂会被使用报 告分子基团检测。用于检测报告分子基团的方法必定是对所选择的报告 分子基团的类型特异的，例如对放射活性基团而言，闪烁计数或放射自 显影的方法通常是合适的。可以使用光谱法检测染料、发光基团和荧光基团。可以使用偶联到不同报告分子基团(通常是放射活性或荧光基团或 酶)的抗生物素蛋白来检测生物素。酶报告分子基团通常可以通过添加底测。
为了利用本发明的诊断分析试剂盒以确定诸如前列腺癌的癌症的存 在与否，从保持结合在固定载体的报告分子基团中检测的信号通常会被 与对应预定临界值的信号比较。例如，用于检测肿瘤的示例性临界值可 以是当固定的抗体被用来自无所述肿瘤的患者的样本孵育时获得的平均 信号的平均值。通常，产生高于预定的临界值约三个标准差的信号的样
本会被认为是所述肿瘤阳性的。在可选择的实施方案中，依照Sackett & a/.， Clinical Epidemiology. A Basic Science for Clinical Medicine (临床;充4亍病 学.临床医学的基础科学)，Little Brown and Co" 1985， p. 106-7的方法，所 述临界值可以通过〗吏用受试者工作特性曲线(Receiver Operator Curve)来 确定。在这种实施方案中，所述临界值可以由对应于诊断测试结果的每 个可能临界值的成对的真阳性率(即，敏感性)和假阳性率(100%-特异性) 的曲线来确定。最"l妄近于左侧转弯上方的曲线上的临界值(即，包:fe最大 面积的值)是最准确的临界值，产生高于由该方法确定的临界值的信号的 样本可以被认为是阳性的。可选择地，所述临界值可以沿曲线转移到左 侧以使假阳性率最小，或转移到右侧以使假阴性率最小。通常，产生高 于由该方法确定的临界值的信号的样本被认为是肿瘤阳性的。
本发明涉及通过所述试剂盒实现的诊断分析会以流动(flow-through) 或检验条的形式进行，其中所述结合剂固定于诸如硝酸纤维素的膜上。 在流动测试中，样本内的多肽在所述样本通过膜时结合到固定的结合剂。 然后第二标记的结合剂在包含所述第二结合剂的溶液流经膜时结合到所 述结合剂-多肽复合物。然后可以如上所述进行结合的第二结合剂的检测。 在检验条的形式中，结合剂结合的膜的一端会被浸于包含样本的溶液中。 所述样本沿着膜迁移，经过包含第二结合剂的区域，到达固定的结合剂 的部位。第二结合剂在固定的抗体区的浓缩提示肺瘤的存在。视觉可以 辨认的诸如线的样式在结合部位的产生提示阳性检测。缺乏这样一种样 式提示阴性结果。通常，当生物样本包含足以在以如上所述的形式的双
35抗夹心分析中产生阳性信号的多肽水平时，选择固定于膜上的结合剂的 量以产生一见觉上可以辨认的样式。用于所述诊断分析的优选结合剂是本
发明公开的抗体、其抗原结合片段以及本文描述的任何CDMAB相关结 合剂。固定于膜上的抗体量可以是有效产生诊断分析的任何量，并且可 以从约25纳克至约1微克变动。通常这样的测试可以用极少量的生物样 本来完成。
此外，本发明的CDMAB由于它能识别其耙抗原，可以用于实^^室 研究。
为了更充分理解本文中描述的发明，进行下述说明。
本发明提供CDMAB (即IDAC 141205-04 CDMAB)，其特异性识别 和结合IDAC 141205-04抗原。
以保藏号141205-04保藏于IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 的CDMAB可以是任何形式，只要其具有竟争性抑制IDAC 141205-04杂 交瘤产生的分离的单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异性结合的抗原结合 区。因此，具有与IDAC 141205-04抗体相同的结合特异性的任何重组蛋 白(例如融合蛋白，其中抗体与诸如淋巴因子或肺瘤生长抑制因子的另一 种蛋白结合)都在本发明的范围内。
在本发明的一个实施方案中，所述CDMAB是IDAC 141205-04抗体。
在其他实施方案中，所述CDMAB是抗原结合片段，其可以是具有 IDAC 141205-04抗体的抗原结合区的Fv分子(例如单链Fv分子)、Fab 分子、Fab'分子、F(ab')2分子、融合蛋白、双特异性抗体、异种抗体或任 何重组分子。本发明中的CDMAB针对的抗原决定簇是IDAC 141205-04 单克隆抗体针对的抗原决定簇。
本发明中的CDMAB可以^皮修饰，即通过分子内的氨基酸修饰，以 产生衍生分子。也可能是化学修饰。也可能是通过直接的突变、亲和力 成熟方法、噬菌体展示或链替换的修饰。
亲和力和特异性可以通过突变CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)残基 以及筛选具有所需特性的抗原结合位点来修饰或改善(例如，Yang d a/.， J. Mol. Biol.,(1995)254: 392-403)。 一种方式就是使个别残基或残基组合随才几 排列以使在否则完全相同的抗原结合部位群中，在特定的位置找到两个
36到二十个氨基酸的亚群。可选择地，可以通过易错聚合酶链反应的方法(例
如，Hawkins & a/., J. Mol. Biol., (1992) 226: 889-96)诱导整个残基范围内的突变。在另一个实施例中，包含重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌的增变抹内繁殖(例如，Lowda/., J. Mol. Biol.， (1996)250: 359-68)。这些突变的方法用以说明本领域技术人员已知的许多方法。
增加本发明的抗体的亲和力另 一种方式是进行链替换，其中将重链或轻链与另一重链或轻链随机配对以制备具有较高亲和力的抗体。抗体的多种CDRs也可以被用其它抗体中对应的CDRs替换。
衍生分子要保留多肽的功能特性，也就是说，具有这类取代的分子仍能够^使所述多肽与IDAC 141205-04抗原或其部分结合。
氨基酸取代包括但不必然限于在本领域中已知的"保守，，氨基酸取代。
举例来说，被称为"保守氨基酸取代"的某些氨基酸取代能够在蛋白中频繁出现，但并不改变所述蛋白的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。
这些改变包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)的任一种取代任何其他的疏水氨基酸；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E),反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T),反之亦然。依据特定氨基酸的环境和其在蛋白质三维结构中的作用，其他的取代也可以被认为是保守的。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可经常互换，丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的蛋氨酸(M)可经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常互换，其发生部位氨基酸的重要特征是其带电特性，而这两种氨基酸的不同的pK并不重要。在特定环境中，仍有其他的变化可以被认为是"保守的"。
实施例1
杂交瘤生产一杂交瘤细胞系AR53A10.il
依据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系AR53A10.il于2005年12月14日保藏于加拿大国际微生物保藏单位(IDAC),位于加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿潜f道1015的加拿大卫生部微生物局，R3E 3R2，保藏号为141205-04。依据37 CFR 1.808的规定，保藏者保证在专利授权时将不可撤销地取消对公众获取该保藏材料的所有限制。
为了制备产生AR53A10.il抗癌抗体的杂交瘤，在PBS中制备冷冻的人前列腺肿瘤组织(Genomics Collaborative, Cambridge, MA)的单细胞悬浮液。将IMMUNEASY (Qiagen， Venlo， Netherlands)佐剂轻轻混合后备用。通过皮下注射含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂来免疫5到7周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后2到5周，用新鲜制备的含2百万个细胞的50微升抗原-佐剂腹腔注射加强免疫鼠。末次免疫后第3天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与NSO-l骨髓瘤细胞伴侣融合，制备杂交瘤。；险测所述杂交瘤亚克隆融合的上清。
为了确定杂交瘤分泌的抗体是IgG，还是IgM同种型，进行ELISA分析。将4。C包被緩冲液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐緩沖液，pH 9.2至9.6)中的浓度为2.4微克/mL的山羊抗小鼠的IgG + IgM (H+L),按100微升/孔加入ELISA板过夜。该ELISA板用洗涤緩沖液(PBS+0.05。/。吐温-20)洗三次。按100微升/孔加入封闭緩沖液(5%奶洗涤緩沖液)，室温1小时，随后用洗涤緩沖液洗三次。按100微升/孔加入杂交瘤上清，将该板室温孵育1小时。该板用洗涤緩沖液洗三次，按100微升/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣才艮过氧化物酶偶联物的1/100,000稀释液(用含1%奶的PBS稀释)。将所述板在室温孵育1小时后，该板用洗涤緩冲液洗三次。按100微升/孔加入TMB溶液，室温孵育1-3分钟。通过加入50微升/孔的2 M H2S04终止颜色反应，并用Perkin-Elmer HTS7000酶标仪在450nm波长处读板。如图l所示，AR53A10.il杂交瘤主要分泌IgG同种型抗体。
为了确定杂交瘤细胞分泌抗体的亚类，使用小鼠单克隆抗体同种型分片斤^式齐'J盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit) (HyCuItBiotechnology, Frontstraat, Netherlands)进4亍同种型分型(isotyping)实-验。将500微升的緩冲液加到含有大鼠抗小鼠的亚类特异性抗体的测试条上。将500 ^t升的杂交瘤上清加到试管中，并通过轻轻搅拌浸没。捕获的小鼠免疫球蛋白被用偶联到胶体微粒的第二大鼠单克隆抗体直接检测。这两种蛋白的结合产生了用于分析同种型的视觉信号。抗癌抗体
38AR53A10.il为IgG2b， k同种型。
经过一轮限制稀释，在细胞ELISA分析中，检测杂交瘤上清中与靶 细胞结合的抗体。检测了两种人卵巢癌细胞系和一种人正常皮肤细胞系 分别是OCC-l、 OVCAR隱3和CCD-27sk。除了 0CC-1卯巢癌细胞系夕卜， 所述细胞系均获自美国典型培养物保存中心(ATCC; Manassas, VA)。 OCC-l卵巢癌细胞系获自渥太华地区癌症中心(Ottawa， ON)。
板内的细胞在使用前先固定。室温下，该板用含MgCl2和CaCl2的 PBS洗三次。每孔加PBS稀释的2%的多聚曱醛100微升，室温10分 钟，然后弃掉多聚曱醛。再用含MgCl2和CaCl2的PBS在室温下洗涤该 板三次。每孔加100微升5。/。奶洗涤液(PBS + 0.05。/。吐温-20)进行封闭， 室温1小时。该板用洗涤液洗三次，按100樣t升/孔加入杂交瘤上清，室 温孵育1小时。用洗涤緩沖液将该板洗三次，按IOO微升/孔加入辣才艮过 氧化物酶偶联的山羊抗小鼠的IgG抗体的1/25,000稀释液(用含1%奶的 PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤緩沖液洗三次，每孔加入100 微升TMB底物，室温孵育1-3分钟。每孔加入50微升的2 M硫酸终 止反应，并且用Perkin-ElmerHTS7000酶标仪在450nm波长处读板。如 图1列表所示，结果表示为与内部(in-house)的IgG同种型对照相比，高 出背景的倍数，事先已经证明所述对照不与所检测的细胞系结合。来自 AR53A10.11杂交瘤的抗体没有显示与所检测的细胞系可检测的结合。
进行抗体结合试验的同时，在OCC-l、 OVCAR-3和CCD-27sk这些 细胞系上，检测了杂交瘤上清的细胞毒性作用。钓黄绿素(calcein)AM购 自Molecular Probes (Eugene, OR)公司。根据厂商的说明并作下述的+务改 后进行所述分析。在分析前，将细胞根据预先确定的适当密度进行铺板。
两天后，将100jLtl来自杂交瘤微孔板的上清转移到细胞培养板中，在5% C02孵箱中孵育5天。将阳性对照孔吸净，加入100微升叠氮钠(NaN3) 或放线菌酮。经过5天的处理后，倒空反应板的液体并吸干。将来自多 通道塑料才齐瓶的含MgCl2和CaCl2的室温DPBS (Dulbecco's磷酸盐纟爰冲 液)分到每孔中，叩打三次，倒出液体并吸干。每孔加入50微升稀释于含 有MgCl2和CaCl2的DPBS中的荧光染料钙黄绿素，并在37°C含5% C02的孵箱内孵育30分钟。该板置于Perkin-Elmer HTS7000荧光读板仪内读数，数据用Microsoft Excel进行分析。结果在图1的表格中列出。 AR53A10.il杂交瘤上清对OCC-l细胞产生了 13%的特异性细胞毒性作 用，这分别是由阳性对照叠氮钠和放线菌酮获得的细胞毒性作用的16% 和14%。在OVCAR-3细胞上也观察到了 15%的特异性细胞毒性作用， 这分别是由阳性对照叠氮钠和放线菌酮获得的细胞毒性作用的25%和 33%。图1的结果表明AR53A10.il的细胞毒效应并不与其对这些癌细胞 型的结合水平成正比。如图l列表所示，AR53A10.il对CCD-27sk正常 细胞系没有产生细胞毒性作用。已知的非特异性的细胞毒物质放线菌酮 和叠氮钠普遍产生了预期的细胞毒性作用。
实施例2
体外结合
通过在CL-1000并瓦(BD Biosciences, Oakville， ON)中培养所述杂交瘤 来制备AR53A10.il单克隆抗体，每星期进行两次收集和再#~种。然后用 蛋白G琼脂糖4 '决i亿(Protein G Sepharose 4 Fast Flow) (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, QC)进行标准的抗体纯化操作。利用去免疫化的、 人源化的、嵌合的或鼠源化的单克隆抗体均属于本发明的范围。
用流式细胞仪(FACS)评价了 AR53A10.il与结肠(SW1116, Lovo和 DLD-1)、前列腺(PC-3和Du-145)、胰腺(PL45， ASPC-l和BxPC-3)、乳腺 (MDA-MB-231、 MDA-MB-468和MCF-7)、肺脏(A549)和卯巢(OV2008, ES-2， Hey， A2780-cp, A2780匿s， OCC-l, OVCAR-3， C-13, ES-2和 OVCA-429)的癌细胞系，以及来自皮肤(CCD-27sk)和肺脏(Hs888丄u)的非 癌细胞系的结合。除了大多数所述的卵巢癌细胞系外，所有细胞系获自 美国典型培养物保存中心(ATCC; Manassas， VA)。 OV2008， ES-2， Hey, A2780-cp， A2780-s, OCC-l, C-13， ES-2和OVCA-429卵巢癌细胞系获自 渥太华地区癌症中心(Ottawa, ON)。
通过首先用DPBS(不含钙离子和镁离子)洗涤单层细胞来制备用于流 式细胞术(FACS)的细胞。然后在37°C条件下，用细胞解离緩冲液 (INVITROGEN, Burlington, ON)将细胞从它们的细胞培养板上分离出来。 离心收集细胞后，在4。C下，将细胞重悬在含MgCl2、 CaCl2和2。/。胎牛血清的DPBS(标记培养液)中并计数，等分到合适的细胞密度，离心沉淀
细胞并在测试抗体(AR53A10.11)或对照抗体(同种型对照，抗-EGFR)存在 下，将细胞重悬在4。C的标记培养液中。同种型对照和测试抗体在20微 克/mL浓度下置于冰上30分钟被评估，而抗-EGFR在5」微克/mL浓度下 置于冰上30分钟被评估。在加AlexaFluor546偶联的二抗前，所述细胞 用标记液洗一次。然后加入溶于标记培养液中的Alexa Fluor 546偶联的 二抗，4°C置30分钟。最后洗涤一次细胞，并将其重悬在固定培养基(含 1.5%多聚曱醛的标记培养液)中。通过在使用FACSarmyTM系统软件(BD Biosciences, Oakville， ON)的FACSarrayTM上运行样本来评估流式细胞计 数的细胞获取结果。通过调整前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)探测 器上的电压和振幅，设置细胞的FSC和SSC。运行未标记的细胞来调整 荧光(Alexa-546)通道的探测器，使这些细胞有一个统一的约为1至5单 位的中等荧光强度的波峰。对于每一个样本，约需要获取10， 000个门 事件(标记的固定细胞)，用于分析，结果见图3。
图2以高出同种型对照的倍增表示平均荧光强度。图3汇集了 AR53A10.il抗体代表性的直方图。AR53A10.il对结肠癌细胞系Lovo和 DLD-1(分别是1.6和1.5倍)以及对胰腺癌细胞系PL45 (2.0倍)显示弱结 合。AR53A10.il对其它癌细胞系没有表现出可检测的结合。在这些条件 下，未才企测到对CCD-27sk非癌皮肤细胞系和Hs888丄u非癌肺细胞系的 结合。显然从实施例1和2中，使用细胞ELISA或FACS不能4企测到 AR53A10.il对OCC-l和OVCAR-3癌细胞系的结合。然而，所述抗体能 够在这些细胞系诱导细胞毒效应。该效应可能是由下述因素导致。可能 OCC-l/OVCAR-3卵巢癌细胞系表达的靶抗原的水平低于在这些条件下 该方法的检测阈值，但所述低水平的表达足以触发导致肿瘤生长延迟的 事件。在OCC-l和OVCAR-3卵巢癌模型中，该抗体的细胞毒效应是不 能基于结合预测出的非显而易见的结果。
实施例3
在体DLD-1细月包的肺瘤实—验
实施例1和2表明AR53A10.il有针对人癌细胞系的抗癌特性，且对结肠和胰腺癌的标志有可检测的结合。参见图4和5，颈背皮下注射的 100微升生理盐水中的5百万个人结肠癌细胞(DLD-1)植入到4-6周的 雌性SCID小鼠。这些小鼠被随机分成两个治疗组，每组5只。植入癌细 胞后第一天，每组小鼠腹腔给予300微升的AR53A10.il测试抗体(20 mg/kg)或緩冲液对照，所述液体由含2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释液将储存液稀后得到。随后抗体组和对照 组在整个研究期间以相同的方式每周给药一次。大约每7天用测径器测 量肿瘤生长。研究在7次注射(48天)后结束，因为动物由于大溃疡性损 伤达到CCAC的终点。在整个研究期间， 一周记录一次动物的体重。研 究结束时，依据CCAC的指导方针，所有的动物都采取安乐死。
在人结肠癌的高侵入性(aggressive) DLD-1预防性体内模型中， AR53A10.il抑制肿瘤生长。在植入后的第48天，也是最后一次给药后 第5天，AR53A10.il治疗组肿瘤的平均体积比緩沖液对照治疗组胂瘤体 积小65%(图4)。研究结束时AR53A10.il治疗组的肿瘤体积与对照组的 肿瘤体积有显著差异(p-0.019， t-检验)。最终时间点的肿瘤平均体积受到 治疗期结束前由于溃疡损害所致的小鼠缺失(特别是来自对照组的小鼠的 缺失)的影响。在第27天，当所有小鼠仍然存活时，AR53A10.il使肿瘤 体积P争低约62% (p=0.005)。仅在4次抗体注射后就观察到该显著降低。
在整个研究中，没有出现临床毒性症状。每周测得的体重用做动物 健康和发育停止的指标。如图5所示，整个研究期间对照或AR53A10.il 治疗组的体重没有显著差异。在治疗期结束时，两组间的体重也没有差 异(p^.641,t-检验)。
因此，AR53A10.il在该人类结肠癌异种移植模型中耐受性良好，并 降低了肿瘤的负荷。在公认的人癌症疾病结肠模型中观察到了治疗益处， 这表明了该抗体用于治疗包括人的其它哺乳动物的药理和药学益处。
实施例4
^v类正常和多肿瘤组织染色
进行免疫组化(IHC)研究来表现AR53A10.il抗原在人类中的分布特 征。使用人正常器官组织和肺瘤器官组织筛选阵列(Tri Star， Rockville,
42MD)进行抗体与4种人正常(结肠、肺脏、前列腺和乳腺)和16种人肿 瘤组织(结肠、肺脏、前列腺和乳腺各4个)的结合。
切片用冷(-20。C)丙酮固定IO分钟，然后回到室温中。切片用4。C冷 磷酸緩沖盐(PBS)洗三次，每次2分钟，随后在3%过氧化氢中洗涤10 分钟封闭内源性过氧化物酶活性。然后将切片用PBS洗3次，每次5分 钟，随后在通用的封闭液(Dako， Toronto, Ontario)中于室温孵育5分钟。 将AR53A10.11、抗-人肌肉肌动蛋白(克隆HHF35， Dako， Toronto, Ontario) 或同种型对照抗体(靶向黑曲霉(A^e7^7/^ m'gw)葡萄糖氧化酶， 一种 在哺乳动物组织中不存在也不可i秀导的酶；Dako, Toronto, Ontario)在 抗体稀释緩沖液中被稀释到其工作浓度(每种抗体都是5微克/mL,除
了抗-肌动蛋白为0.5孩i克/mL外)，并在室温孵育1小时。用PBS洗 涤切片3次，每次2分钟。用所提供的HRP偶联的二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)来检测/显现一抗的免疫活性，室温下30分钟。 这步之后，将切片用PBS洗3次，每次5分钟，然后通过加入DAB (3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako， Toronto, Ontario)显色底物液在室温下进行 免疫过氧化物酶染色10分钟，发生颜色反应。自来水冲洗切片，终止显 色反应。切片用Meyer's苏木精(Sigma Diagnostics, Oakville, ON)复染后， 用梯度酒精(75-100%)脱水并用二曱苯透明。使用封固剂(Dako Faramount， Toronto, Ontario)去于片。 <吏用 Axiovert 200 (Zeiss Canada, Toronto, ON)显孩i观察切片，并用Northern Eclipse成l象软件(Mississauga， ON)获取和储存图像。结果由组织病理学家读取、评分和解释。
图6显示了人正常组织和肿瘤组织阵列的AR53Al0.11染色的结果 汇总。所述AR53A10.il抗体显示了对结肠、乳腺、肺脏和前列腺肿瘤组 织的4/4结合(图7),而对它们相应的正常组织没有结合，前列腺除外。
在这些组织切片内，抗体的结合限于肿瘤细胞。细胞的定位是细胞质的 和膜的。这些结果表明AR53A10.il针对的抗原表达在多种肿瘤类型。此 外，AR53A10.il针对的抗原并不在正常组织广泛表达，这表明所述抗体 特异性结合于人类有限数目的组织。
实施例5
43竟争性结合剂的分离
给定一种抗体，本领域的技术人员能够产生例如竟争性抗体的竟争
性抑制CDMAB,其是与给定抗体识别相同抗原决定簇的抗体(BelangerL "a/. C/z'm'cfl CA/mz'ca48: 15-18 (1973》。 一种方法是用表达该4元体识 别的抗原的免疫原产生免疫。该样本可以包括但不限于组织、分离的蛋 白或细胞系。可以用诸如ELISA、 FACS或Western印迹的竟争分析来筛 选产生的杂交瘤，所述竟争分析能鉴别抑制所测试抗体结合的抗体。。另 一种方法可以利用噬菌体展示抗体库，淘选识别所述抗原至少一个决定 簇的抗体(Rubinstein JL a/. ^wa/314:294-300 (2003))。在任何一 种情况下，抗体的选择都是基于它们能够取代原始标记的抗体与其靶抗 原的至少一个决定簇的结合。因此这种抗体具有识别原始抗体识别的至 少一个抗原决定簇的特性。
实施例6
AR53A10.il单克隆抗体的可变区的克隆
由AR53A10.il杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的重链(Vn)和轻链 (VL )的可变区的序列可以被确定。可以使用包括用异硫氰酸胍的细胞增 溶作用的标准方法从所述杂交瘤中提取编码免疫球蛋白的重链和轻链的 RNA(Chirgwin " a/. Biochem. 18:5294-5299 (1979))。通过本领;或已知的 PCR方法学(Sambrook^ a/.，eds.， Molecular Cloning(分子克隆)，第14章, 冷泉港实验室出版社，N.Y.(1989))，可以使用mRNA制备用于随后Vh和 VL基因分离的cDNA。重链和轻链的N-末端氨基S殳序列可以分别由自动 化的Edman测序来确定。CDRs和侧翼FRs的进一步伸展也可以由VH和 VL片段的氨基^f列确定。然后可以设计合成引物用于分离AR53A10.il 单克隆抗体的Vh和Vl基因，并可以将所分离的基因连接到用于序列测 定的适当载体。为了产生嵌合的和人源化的IgG,可以将可变的轻链区和 可变的重链区亚克隆入用于表达的适当载体。
在另一个实施方案中，AR53A10.il或其去免疫化的、嵌合的或人源
述抗体被表达且可以被回收。例如，可以以促进回收和纯化的组织特异性方式表达所述抗体。在一个这样的实施方案中，本发明的抗体表达于乳腺用于哺乳期的分泌。转基因动物包括但不限于小鼠、山羊和兔。
(i) 单克隆抗体
使用常规的操作(例如，通过使用能够特异性结合于编码所述单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)很容易分离编码单克隆抗体的
DNA(如实施例1中所述)并测序。杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。所述DNA—旦被分离，就可以被置于表达载体内，然后将所述载体转染入诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细月包的宿主细胞以在重组的宿主细胞内实现单克隆抗体的合成，否则这些细胞不产生免疫球蛋白。所述DNA也可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列替代同源的鼠序列。使用合成蛋白质化学中已知的方法，包括涉及交联剂的那些方法，也可以在体外制备嵌合的或杂交的抗体。例如，利用二石克化物交换反应或通过形成辟K醚4建可以构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的实例包括亚胺基硫醇盐和4-曱基-巯基丁基酰胺化物。
(ii) 人源化抗体
人源化抗体有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类的氨基酸残基经常被称为"输入，，残基，其通常来自"输入，，可变区。依照Winter和同事的方法，可以通过用啮齿类CDRs或CDR序列替代人抗体的相应序列进行人源化操作(Jones C a/., Nature 321:522-525(1986); Riechmami & a/" Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen d a/，Science 239:1534-1536(1988);在Clark， Immunol. Today 21:397-402 (2000)中净皮综述)。
可以通过亲代序列和多种概念上的人源化产物的分析方法，利用亲代序列的和人源化的序列的三维模型来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可得到的并为本领域的技术人员所熟悉。可利用计算机程序示例和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的。检验这些显示能够分析残基在候选的免疫球蛋白序列中可能的作用，即分析影响所述候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，FR残基可以从共有序列和输入序列中被选择和结合，以实现所需的抗体特性，诸如增加对靶抗原的亲和力。通常，CDR残基直接和最大程度上参与影响
抗原结合。
(iii)抗体片段
已开发了多种制备抗体片段的技术。这些片段可以通过重组的宿主 细胞来制备(在Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999); Little et al.， Immunol. Today 21:364-370 (2000)中被综述)。例如，可以从大肠杆菌 中直接回收Fab'-SH片段并将其以化学方法偶联以形成F(ab')2片段(Carter "a/.， Biotechnology 10:163-167(1992))。在另一个实施方案中，使用亮氨 酸拉链GCN4促进F(ab')2分子的装配以形成F(ab') 2。根据另 一种方法， Fv， Fab或F(ab')2片段可以从重组的宿主细胞培养物中直接被分离。
实施例7
包含本发明所述的抗体的组合物
本发明所述的抗体可以用作预防/治疗癌症的组合物。包含本发明所 述的抗体的用于预防/治疗癌症的组合物是低毒性的，并且能够在它们是 液体制剂的形式时或作为合适制剂的药物组合物经口或经胃肠外(例如， 血管内、腹腔内、皮下等)给予人或哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、 牛、猫、犬、猿猴等)。可以给予本发明所述的抗体本身，或可以将其作 为适当的组合物给予。用于给药的组合物可以包含携带本发明所述的抗 体或其盐的药物上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样一种组合物 具有适合经口或经胃肠外给予的药物制剂的形式。
用于胃肠外给药的组合物的实例是可注射的制剂、栓剂等。所述可 注射的制剂可以包括诸如静脉内的、皮下的、皮内的和肌肉内的注射、 点滴、关节腔内注射等剂型。可以通过公知的方法制备这些可注射的制 剂。例如，可以通过将本发明的抗体或其盐在常规用于注射的无菌水性 介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化来制备所述的可注射制剂。例如生 理盐水， 一种含有葡萄糖和其它辅助剂等的等渗液作为用于注射的水性 介质，其可以与诸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非 离子表面活性剂(例如，聚山梨酯80、 HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50 摩尔)加合物)等适当的增溶剂组合使用。使用例如芝麻油、大豆油等作为油性介质，其可以与诸如苯曱酸千酯、苯曱醇等增溶性组合使用。这样 制备的注射剂通常装入合适的安瓶。用于直肠给药的栓剂可以通过将本 发明的抗体或其盐与常规的栓剂基质混合来制备。用于口服给药的组合 物包括固体或液体制剂，特别是片剂(包括糖锭剂和薄膜衣片)、丸剂、颗 粒剂、粉状制剂、胶嚢(包括软胶嚢)、糖浆剂、乳状剂、悬浮剂等。这样 一种组合物可以通过公知的方法制备，并且可以包含常规用于药物制剂 领域的载体、稀释剂或赋形剂。用于片剂的载体或赋形剂的实例是乳糖、 淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
优选地，上述经口或经胃肠外使用的组合物被制备成药物制剂，所 述药物制剂的单位剂量被调适到适合活性成分的一次剂量。这种单位剂 量制剂包括，例如片剂、丸剂、胶嚢、注射剂(安瓶)、栓剂等。所包含的
上述化合物的量通常是每剂量单位形式5至500 mg;包含的上述抗体优 选为约5mg至约100 mg，特别是在注射形式时，对于其它形式，优选包 含上述抗体10至250 mg。
取决于欲给药的个体、目标疾病、症状、给药途径等，前述包含本 发明的抗体的预防/治疗性试剂或调节剂的剂量可以变动。例如，当用于 治疗/预防例如成年个体的乳腺癌目的时，以约0.01至约20 mg/kg体重 的剂量通过静脉注射给予本发明的抗体是有利的，优选O.l至约10mg/kg 体重且更优选地约0.1至约5 mg/kg，每天约1至5次，优选每天约1至 3次。在其它经胃肠外和经口给药中，以与上面给出的剂量相应的剂量给 予所述试剂。当症状特别严重时，可以根据症状增加剂量。
本发明的抗体可以单独给予或以适当组合物的形式给予。用于给药 的组合物可以包含携带前述抗体或其盐的药物上可接受的载体、稀释剂 或赋形剂。这样一种组合物具有适于经口或经胃肠外(例如，静脉内注射、 皮下注射等)给药的药物制剂的形式。上述每一种组合物还可以包含其它 的活性成分。此外，本发明的抗体可以用于与其它药物的组合，例如， 烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺等)、代谢拮抗剂(例如，曱氨蝶呤、 5-氟尿嘧啶等)、抗肿瘤抗生素类(例如，丝裂霉素、阿霉素等)、植物来源 的抗肿瘤剂(例如，长春新4^、长春地辛、紫杉醇注射液等)、顺铂、卡柏、 依托泊甙、伊立替康等。可以将本发明的抗体和上述药物同时给予患者或在不同的时间给予患者。
本发明描述的治疗方法，特别是针对癌症的治疗方法也可以用给予
其它抗体或化疗剂来实施。例如，也可以给予诸如ERBITUX (西妥昔 单抗)的针对EGFR的抗体，特别是当治疗结肠癌时。已经表明ERBITUX 用于银屑病的治疗是有效的。用于联合使用的其它抗体包括Herceptin (曲妥珠单抗)，特别当治疗乳腺癌时；包括AVASTIN ,特别当治疗结 肠癌时；以及包括SGN-15，特别当治疗非小细胞肺癌时。可以将本发明
使用的化疗剂/其它抗体的方案包括任何被认为最适于患者症状治 疗的方案。不同的恶性肿瘤需要使用特定的抗肿瘤抗体和特定的化疗剂， 这将根据患者确定。在本发明优选的实施方案中，化疗与抗体治疗同时 给予，或更优选地，化疗在抗体治疗后给予。然而，需要强调的是，本 发明并不限于任何特定的给药方法或途径。
此优势证据表明AR53A10.il通过癌细胞系和人肿瘤组织上的抗原 决定簇的连接(ligation)介导了抗癌作用。进一步表明，利用例如但并不限 于FACS、细胞ELISA或IHC等技术，AR53A10.il抗体可以用于检测表 达与之特异性结合的抗原决定簇的细胞和/或组织。
技术人员的水平。所有专利和公开出版物通过引用的方式并入本文，其 亏1用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。
应该明白，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限 定在本文所描述和显示的特定形式或布局。对本领域的4支术人员显而易 见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化，且不应当 认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。本领域的技术人员很容 易看出使本发明较好地适合实现所描述的目的并获得提及的结果和益 处，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生 物相关化合物、方法、流程和技术都是优选实施方案中有代表性的，其 目的在于示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到 包括在本发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的 范围所限定。尽管借助特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解
48描述的实施本发明的方式的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而 易见的，均在所附权利要求书的范围内。加拿大国际保藏机构加拿大公共卫生部国立微生物学实验室加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015电话(204)789-6030 传真(204)789-2018R3E 3R2国际IDAC/BP/4表微生物保藏证明(译文)(根据布达佩斯条约第7.1条发布)所附文件为原始保藏合同与存活声明的副本1. 国际保藏机构接受了以下具体描述的微生物 保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)地址 ARIUS Research Inc., 55 York Street. Suite 1600, Toronto, ON. M5J 1R7(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司) 提交日期2005年12月14日2. 保藏的标识保藏人对培养物指定的名称和符号AR53A10.il由该国际保藏机构给予的保藏号:141205-04以上标识的保藏附有□科学性描述□建议的分类指定3.国际保藏机构IDAC授权代表签^i日期2005年12月14日微生物保藏证IJI」1/1 文件''')084(05)加拿大国际保藏机构加拿大公共卫生部国立微生物学实验室加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015电话(204)789-6030 传真(204)789-2018R3E 3R2国际IDAC/BP/9表微生物保藏存活证明译文(根据布达佩斯条约第10.2条发布)姓名Fertis Lander地址2855 PGA Boulevard. Palm Beach Gardens. Florida, USA 33410(美国佛罗里达)1.保藏人姓名Valerie Harris f哈里斯'瓦莱丽)地址ARIUS Research Inc.. 55 York Street. Suite 1600, Toronto. ON. M5J 1R7(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司)2. 保藏标识由国际保藏机构给予的保藏号141205-04 保藏日期(或最近相关日期)2005年12月14日3. 存活检测于(最近检测日期)对以上标识的微生物进行存活检测 在以上指出的日期，所述微生物0存活□不再存活进行存活检测的条件(在已请求该信息且检测结果为阴性时填写):4.国际保藏机构授权代表签字: 曰期2006年1月09日微生物保藏存活证明1/1 文件号084(05)5权利要求
1.由杂交瘤产生的分离的单克隆抗体，该杂交瘤保藏于IDAC，保藏号为141205-04。
2. 权利要求1所述的分离的单克隆抗体的CDMAB。
3. 由以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单 克隆抗体的人源化抗体或者从所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
4. 权利要求3所述的人源化抗体的CDMAB。
5. 由以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单 克隆抗体的嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
6. 权利要求5所述的嵌合抗体的CDMAB。
7. 权利要求1、 2、 3、 4、 5或6中的任一项所述的分离抗体或其 CDMAB，其与选自细胞毒部分、酶、放射活性化合物、细胞因子、干扰 素、靶标部分或报告分子部分和造血细胞的成员偶联。
8. 分离的杂交瘤细胞系，以保藏号141205-04保藏在IDAC。
9. 引发抗体诱导的选自人类卯巢或结肠肿瘤组织样本中癌细胞的 细胞毒性作用的方法，其包括提供来自所述人类卵巢或结肠肿瘤的组织样本；4是供由以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单 克隆抗体、由以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的 单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号141205-04保藏在ID AC的杂交 瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或其CDMAB,该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力；以及将所述的分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或其CDMAB与所述组织样本接触；其中所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或其 CDMAB与所述组织样本的结合诱导细胞毒性作用。
10. 减小哺乳动物内对抗体诱导的细胞毒性作用敏感的人类卯巢 或结肠肿瘤的方法，其中所述人类肿瘤至少表达一种特异性结合于由 保藏于IDAC、保藏号为141205-04的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体 或其CDMA的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所 述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺 乳动物有效导致所述哺乳动物的卵巢或结肠肿瘤负荷降低的量的所述 单克隆抗体或其所述CDMAB。
11. 如权利要求IO所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体偶联 到细胞毒性部分。
12. 如权利要求11所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性 同位素。
13. 如权利要求IO所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB激活补体。
14. 如权利要求10所述的方法，其中所述的分离的单克隆抗体或 其CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
15. 如权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的
16. 如权利要求IO所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
17. 特异性结合于一个或多个抗原决定簇的单克隆抗体，所述抗原决定簇与由以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体结合的抗原决定簇相同。
18. 减小哺乳动物内人类卵巢或结肠肿瘤的方法，其中所述人类卵巢或结肠肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保藏号为141205-04的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所述哺乳动物的卵巢或结肠肿瘤负荷降低的量的所述单克隆抗体或其所述CDMAB 。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分偶联。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
21. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
22. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
23. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的 人源化抗体或者从所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
24. 如权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的 嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
25. 减小哺乳动物内人类卵巢或结肠肿瘤的方法，其中所述人类 卵巢或结肠胂瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保藏号 为141205-04的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗原决 定簇，该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与 其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所述 哺乳动物的卵巢或结肠胂瘤负荷降低的量的、与至少 一种化学治疗试 剂联用的所述单克隆抗体或其CDMAB。
26. 如权利要求25所述的方法， 胞毒性部分偶联。
27. 如权利要求26所述的方法, 性同位素。
28. 如4又利要求25所述的方法， CDMAB激活补体。其中所述分离的单克隆抗体与细其中所述的细胞毒性部分是放射其中所述分离的单克隆抗体或其
29. 如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
30. 如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-04保藏在ID AC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的
31. 如权利要求25所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的 嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
32. 确定选自人类肿瘤的组织样本中癌细胞存在的结合分析，所述癌 细胞^皮IDAC保藏号为141205-04的AR53A10.il杂交瘤细胞系产生的分 离的单克隆抗体、由以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的 分离的单克隆抗体的人源化抗体或由以保藏号141205-04保藏在IDAC 的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体特异性结合，所述分析包 括提供来自所述人类肿瘤的组织样本；提供至少一种所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合 抗体或其CDMAB，其识别的一种或多种抗原决定簇与AR53A10.il杂交 瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体识别的抗原决定簇相同，该杂交瘤细 胞系在IDAC的保藏号为141205-04;将至少一种所述提供的抗体或其CDMAB与所述组织样本接触；以及确定所述至少一种提供的抗体或其CDMAB与所述组织样本的结合；由此指示出在所述组织样本中所述癌细胞的存在。
33. 单克隆抗体降低人类卵巢或结肠肿瘤负荷的用途，其中所述 人类卵巢或结肠肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保 藏号为141205-04的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗 原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗 体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所 述哺乳动物的人类卵巢或结肠肿瘤负荷降低的量的所述单克隆抗体或 其CDMAB 。
34. 如^L利要求33所述的方法,胞毒性部分偶联。
35. 如权利要求34所述的方法, 同位素。
36. 如权利要求33所述的方法， CDMAB激活补体。其中所述分离的单克隆抗体与细其中所述细胞毒性部分是放射性其中所述分离的单克隆抗体或其
37. 如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
38. 如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的 人源化抗体或者从所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
39. 如权利要求33所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-04保藏在ID AC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的 嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
40. 单克隆抗体降低人类卵巢或结肠肿瘤负荷的用途，其中所述 人类卵巢或结肠肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保 藏号为141205-04的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗 原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗 体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所述哺乳动物有效导致所 述哺乳动物的人类卵巢或结肠肿瘤负荷降低的量的、与至少 一种化学 治疗试剂^:用的所述单克隆抗体或其CDMAB。
41. 如斥又利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细 胞毒性部分偶联。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述的细胞毒性部分是放射 性同位素。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB激活补体。
44.如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其 CDMAB介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。
45.如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的
46.如权利要求40所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由 以保藏号141205-04保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的 嵌合抗体或者从所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
47.对治疗人类癌性肿瘤有效的组合物包括下列组合斗又利要求1、 2、 3、 6、 7、 8或17中的4壬一项所述的抗体或CDMAB;所述抗体或其抗原结合片段与选自细胞毒性部分、酶、放射性化 合物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分以及造血细胞的成 员的偶耳关物；以及必需量的药学上可接受的载体；其中所述组合物对治疗所述人类癌性肿瘤是有效的。
48.对治疗人类癌性肿瘤有效的组合物包括下列组合权利要求1、 2、 3、 6、 7、 8或17中的任一项所述的抗体或CDMAB;以及必需量的药学上可接受的载体；其中所述组合物对治疗所述人类癌性肿瘤是有效的。
49. 对治疗人类癌性肿瘤有效的组合物包括下列组合权利要求l、 2、 3、 6、 7、 8或17中的任一项所述的抗体、抗原结合片段或CDMAB与选自细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分以及造血细胞的成员的偶联物；以及必需量的药学上可接受的载体；其中所述组合物对治疗所述人类癌性肿瘤是有效的。
50. 检测人类癌性肿瘤存在的分析试剂盒，其中所述人类癌性肿瘤至少表达一种特异性结合于由保藏于IDAC、保藏号为141205-04的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA的抗原决定簇，该CDMAB的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力。所述试剂盒包括由保藏于IDAC、保藏号为141205-04的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMA，以及4企测所述的单克隆抗体或其CDMAB是否结合于多肽的装置，所述多肽在特定临界水平的存在对于所述人类癌性肿瘤的所述存在具有诊断价值。
全文摘要
本发明涉及使用新型筛选模式制备癌性疾病调节抗体的方法。所述方法利用癌细胞细胞毒性作用作为指标来分离抗癌抗体，使制备用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。所述抗体可以用于辅助肿瘤分期和诊断，并且可以用于治疗原发性肿瘤和肿瘤转移。所述抗癌抗体能够与毒素、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标部分或报告分子部分以及造血细胞偶联。
文档编号C07K16/18GK101675158SQ200780014768
公开日2010年3月17日 申请日期2007年2月22日 优先权日2006年2月24日
发明者大卫·S·F·杨, 戴德·萨耶和, 海伦·P·芬德利, 苏姗·E·哈恩 申请人:阿里乌斯研究公司