抗人delta样配体4的人抗体的制作方法

专利名称：：抗人delta样配体4的人抗体的制作方法抗人DELTA样配体4的人抗体
背景技术：
：Notch信号通道是一种细胞间通讯系统，被多种真核细胞用于许多生物过程，例如分化、增殖和自体调节。Delta样4(D14)或delta样配体4(D114)(以下称为"D114")是Notch配体Delta家族的一个成员，它显示出血管内皮的高选择性表达(Shutteretal.(2000)GenesDevelop.14:1313-1318)。D114是Notch受体包括Notch1和Notch4的配体。人D114的核酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO:l-2所示。产生(参阅如美国6，949，245号专利)。请参阅关于能产生人抗体的非人转基因小鼠生产方法的资料，例如WO94/02602(Abgenix)和美国6,596,541号专利(RegeneronPharmaceuticals)。日本专利申请书2003/047470A2(AsahiKaseiKogyo)叙述了人Notch配体蛋白的细胞外部分的抗体。发明概述在第一个方面，本发明提供了特异性结合人delta样配体4(hD114)的人抗体，更佳的是重组人抗体。这些抗体的特点是它以高度亲和力与hD114结合并具有中和D114活性的能力。本发明的抗体能够阻断D114与其Notch受体的结合，从而抑制D114的信号传递。这些抗体可以是全长的(例如，IgGl或IgG4抗体)，或可仅包括一个抗原结合部分(例如Fab、F(ab，)2或scFv片段)，并可加以修饰以实现其功能，例如消除残余的效应子功能(Gluwhicheliminatesresidualeffectorfunctions(消除残余的效应子功能的Glu),Reddyetal.(2000)J.Immunol.164:1925-1933)。在一个实施方案中，本发明之抗体包括一个选自下列序列的重链可变区(HCVR):SEQIDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、397、413、429、445、461、477、493、509、525、541、557、573、589、605、621、637、653、669、685、701、717、733、749、765、781、797、813、893、897、901、905、909、913、917、921、925、935、939、943和947,或一种与其实质上相同的序列。在一个首选的实施方案中，该HCVR是SEQIDNO:429或901氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明之抗体包括一个选自下列序列的轻链可变区(LCVR):SEQIDNO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、405、421、437、453、469、485、501、517、533、549、565、581、597、613、629、645、661、677、693、709、725、741、757、773、789、805、821、895、899、903、907、911、915、919、923、927、937、941、945和949,或一种与其实质上相同的序列。在一个首选的实施方案中，该LCVR是SEQIDNO:437或903氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明之抗体包含一个选自下列序列的HCVR:SEQIDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、397、413、429、445、461、477、493、509、525、541、557、573、589、605、621、637、653、669、685、701、717、733、749、765、781、797、813、893、897、901、905、909、913、917、921、925、935、939、943和947，或一种与其实质上相同的序列；并包含一个选自下列序列的LCVR:SEQIDNO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、405、421、437、453、469、485、501、517、533、549、565、581、597、613、629、645、661、677、693、709、725、741、757、773、789、805、821、895、899、903、907、911、915、919、923、927、937、941、945和949，或一种与其实质上相同的序列。在一个首选的实施方案中，该HCVR/LCVR是SEQIDNO:429/437或901/903氨基酸序列对。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个重链互补决定区1(CDR1)的人抗体或抗体片段，该重链互补决定区l选自下列序列SEQIDNO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、399、415、431、447、463、479、495、511、527、543、559、575、591、607、623、639、655、671、687、703、711119、735、751、767、783、799、815、831、847、863和879,或一种与其实质上相同的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个重链CDR2的人抗体或抗体片段，该重链CDR2选自下列序列SEQIDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577、593、609、625、641、657、673、689、705、721、737、753、769、785、801、817、833、849、865和881，或一种与其实质上相同的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个重链CDR3的人抗体或抗体片段，该重链CDR3选自下列序列SEQIDNO:IO、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579、595、611、627、643、659、675、691、707、723、739、755、771、787、803、819、835、851、867和883，或一种与其实质上相同的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种人抗体或抗体片段，它包含一个选自下列序列的重链CDR1:SEQIDNO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、399、415、431、447、463、479、495、511、527、543、559、575、591、607、623、639、655、671、687、703、711119、735、751、767、783、799、815、831、847、863和879，或一种与其实质上相同的序列；一个选自下列序列的重链CDR2:SEQIDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577、593、609、625、641、657、673、689、705、721、737、753、769、785、801、817、833、849、865和881，或一种与其实质上相同的序列；以及一个选自下列序列的重链CDR3:SEQIDNO:IO、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579、595、611、627、643、659、675、691、707、723、739、755、771、787、803、819、835、851、867和883,或一种与其实质上相同的序列。在一个首选的实施方案中，该抗体或抗体片段包含选自下列序列的重链CDR1、CDR2和CDR3:SEQIDNO:431/433/435;374/376/378;783/785/787;以及799層細。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个轻链CDR1的人抗体或抗体片段，该轻链CDR1选自下列序列SEQIDNO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、407、423、439、455、471、487、503、519、535、551、567、583、599、615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839、855、871和887,或一种与其实质上相同的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个轻链CDR2的人抗体或抗体片段，该轻链CDR2选自下列序列SEQIDNO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、409、425、441、457、473、489、505、521、537、553、569、585、601、617、633、649、665、681、697、713、729、745、761、777、793、809、825、841、857、873和889，或一种与其实质上相同的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个轻链CDR3的人抗体或抗体片段，该轻链CDR3选自下列序列SEQIDNO:18、34、50、66、82、98、11、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587、603、619、635、651、667、683、699、715、731、747、763、779、795、811、827、843、859、875和891，或一种与其实质上相同的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种人抗体或抗体片段，它包含一个选自下列序列的轻链CDR1:SEQIDNO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、407、423、439、455、471、487、503、519、535、551、567、583、599、615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839、855、871和887,或一种与其实质上相同的序列；一个选自下列序列的轻链CDR2:SEQIDNO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、409、425、441、457、473、489、505、521、537、553、569、585、601、617、633、649、665、681、697、713、729、745、761、777、793、809、825、841、857、873和889,或一种与其实质上相同的序列；以及一个选自下列序列的轻链CDR3:SEQIDNO:18、34、50、66、82、98、11、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587、603、619、635、651、667、683、699、715、731、747、763、779、795、811、827、843、859、875和891，或一种与其实质上相同的序列。在一个首选的实施方案中，该抗体或抗体片段包含选自下列序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3:SEQIDNO:439/441/443;382/384/386;791/793/795;以及807/809/811。在第二个方面，本发明提供了编码本发明之抗体或抗原结合部分的核酸分子。本发明还包括运载本发明抗体编码核酸的重组表达载体，以及引入这类载体的宿主细胞，并包括通过培养本发明的宿主细胞来制造本发明抗体的方法。在一个实施方案中，本发明之抗体包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的HCVR:SEQIDNO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、396、412、428、444、460、476、492、508、524、540、556、572、588、604、620、636、652、668、684、700、716、732、748、764、780、796、812、892、896、900、904、908、912、916、920、924、934、938、942和946，或一种与其实质上相似具有至少95%同源性的序列。在一个实施方案中，本发明之抗体包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的LCVR:SEQIDNO:ll、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、404、420、436、452、468、484、500、516、532、548、564、580、596、612、628、644、660、676、692、708、724、740、756、772、788、804、820、894、898、902、906、910、914、918、922、926、936、940、944和948，或一种与其实质上相似具有至少95%同源性的序列。在一个实施方案中，本发明之抗体包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的HCVR:SEQIDNO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、396、412、428、444、460、476、492、508、524、540、556、572、588、604、620、636、652、668、684、700、716、732、748、764、780、796、812、892、896、900、904、908、912、916、920、924、934、938、942和946,或一种与其实质上相似具有至少95%同源性的序列；并包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的LCVR:SEQIDNO:ll、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、404、420、436、452、468、484、500、516、532、548、564、580、596、612、628、644、660、676、692、708、724、740、756、772、788、804、820、894、898、902、906、910、914、918、922、926、936、940、944和948，或一种与其实质上相似具有至少95%同源性的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个重链CDR1的人抗体或抗体片段，该重链CDR1由选自下列序列的核苦酸序列编码SEQIDNO:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373、398、414、430、446、462、478、494、510、526、542、558、574、590、606、622、638、654、670、686、702、718、734、750、766、782、798、814、830、846、862和878，或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个重链CDR2的人抗体或抗体片段，该重链CDR2由选自下列序列的核苷酸序列编码SEQIDNO:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、100、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375、400、416、432、448、464、480、496、512、528、544、560、576、592、608、624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848、864和880,或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个重链CDR3的人抗体或抗体片段，该重链CDR3由选自下列序列的核苷酸序列编码SEQIDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、402、418、434、450、466、482、498、514、530、546、562、578、594、610、626、642、658、674、690、706、722、738、754、770、786、802、818、834、850、866和882，或一种与其实质上相似具有至少95%同源性的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种人抗体或抗体片段，它包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的重链CDR1:SEQIDNO:5、21、37、53、69、85、101、m、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373、398、414、430、446、462、478、494、510、526、542、558、574、590、606、622、638、654、670、686、702、718、734、750、766、782、798、814、830、846、862和878,或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列；并包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的重链CDR2:SEQIDNO:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、100、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375、400、416、432、448、464、480、496、512、528、544、560、576、592、608、624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848、864和880,或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列；还包含一个由选自下列序列的核香酸序列编码的重链CDR3:SEQIDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、402、418、434、450、466、482、498、514、530、546、562、578、594、610、626、642、658、674、690、706、722、738、754、770、786、802、818、834、850、866和882，或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列。在一个首选的实施方案中，该抗体或抗体片段包含由选自下列序列的核酸序列编码的重链CDR1、CDR2和CDR3:SEQIDNO:430/432/434;373/375/377;782/784/786;以及798/800/802。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个轻链CDR1的人抗体或抗体片段，该轻链CDR1由选自下列序列的核苷酸序列编码SEQIDNO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381、406、422、438、454、47Q、486、502、518、534、550、566、582、598、614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838、854、870和886,或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个轻链CDR2的人抗体或抗体片段，该轻链CDR2由选自下列序列的核苷酸序列编码SEQIDNO:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383、408、424、440、456、472、488、504、520、536、552、568、584、600、616、632、648、664、680、696、712、728、744、760、776、792、808、824、840、856、872和888,或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种包含一个轻链CDR3的人抗体或抗体片段，该轻链CDR3由选自下列序列的核苷酸序列编码SEQIDNO:17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、410、426、442、458、474、490、506、522、538、554、570、586、602、618、634、650、666、682、698、714、730、746、762、778、794、810、826、842、858、874和890,或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列。在一个实施方案中，本发明的特点是一种人抗体或抗体片段，它包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的轻链CDR1:SEQIDNO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381、406、422、438、454、470、486、502、518、534、550、566、582、598、614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838、854、870和886,或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列；并包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的轻链CDR2:SEQIDNO:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383、408、424、440、456、472、488、504、520、536、552、568、584、600、616、632、648、664、680、696、712、728、744、760、776、792、808、824、840、856、872和888，或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列；还包含一个由选自下列序列的核香酸序列编码的轻链CDR3:SEQIDN0:17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、410、426、442、458、474、490、506、522、538、554、570、586、602、618、634、650、666、682、698、714、730、746、762、778、794、810、826、842、858、874和890,或一种与其实质上相似的具有至少95%同源性的序列。在一个首选的实施CDR1、CDR2和CDR3:SEQIDNO:438/440/442;381/383/385;79(V792〃94;以及806/808/810。在第三个方面，本发明的特点是一种分离的抗体或抗体片段，它能特异性结合hD114并包含选自下列序列的CDR1、2和3:(a)—个含有结构式为X1—X2—X3_X4—X5-X6—X7—X8的氨基酸序列(SEQIDNO:928)的重链CDR1区，其中Xi是Gly;X"是Phe或Tyr;X3是Thr;X"是Phe;x5是Ser、Thr或Asn;乂6是Ser、Asn或Tyr;X是Tyr或Phe;以及X8是Gly或Ala;(b)—个含有结构式为X1-X2-X3—X4—X5-X6-X7_X8的氨基酸序列(SEQIDNO:929)的重链CDR2区，其中X1是lie或Leu;x2是Trp或Ser;x3是Tyr、Ala或Gly;x4是Asp、Ser或Tyr;X5是Gly或Asp;乂6是Ser、Gly、Thr或Val;X是Asn或Asp;以及乂8是Lys或Arg;(c)—个含有结构式为X1—X2-X3—X4—X5—X6-X7—X8-X9-X1。-X11—X12—X13—X14—X15—X16的氨基酸序列(SEQIDNO:930)的重链CDR3区，其中Xi是Ala或Ser;乂2是Arg或Lys;乂3是Asp或Tyr;乂4是Ser、Gly或His;乂5是Asp、Ala或Trp;乂6是Asn、或Phe;X是Tyr、Arg或Lys;乂8是His或Ser;乂9是Gly或Trp;X"是Tyr或Phe;X"是Glu或Asp;X。是Gly、His或Pro;X13是Tyr、Trp或缺位；X"是Phe或缺位；X"是Asp或缺位；以及X"是Pro或缺位。在一个首选的实施方案中，抗体或抗体片段包含选自下列序列的重链CDR1、2和3:(a)—个含有结构式为X1—X2—X3—X4—X5—X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDNO:928)的重链CDR1区，其中X"是Gly;X2是Phe;x3是Thr;乂4是Phe;x5是Ser或Asn;x6是Ser或Asn;X是Tyr或Phe;以及乂8是Gly或Ala;(b)—个含有结构式为X1-X2-X3-X4—X5—X6—X7—X8的氨基酸序列(SEQIDNO:929)的重链CDR2区，其中X1是lie或Leu;X2是Trp或Ser;X3是Tyr或Gly;X4是Asp或Ser;乂5是Gly;乂6是Ser、Thr或Val;X是Asn或Asp;以及乂8是Lys或Arg;(c)—个含有结构式为X1—X2-X3—X4—X5-X6—X7-X8—X9-X10-X11-X12-X13—X14—X15—X16的氨基酸序列(SEQIDNO:930)的重链CDR3区，其中Xi是Ala或Ser;乂2是Arg或Lys;乂3是Asp;乂4是Gly或His;x5是Asp或Ala;x6是Phe;x7是Tyr或Arg;乂8是Ser;X9是Gly;X，是Tyr;X"是Glu;X"是Gly或His;X"是Tyr或Trp;X14是Phe或缺位；X"是Asp或缺位；以及X"是Pro或缺位。在一个进一步的实施方案中，该分离的抗体或抗体片段进一步包含(d)—个含有结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-乂7的氨基酸序列(SEQIDNO:931)的轻链CDR1区，其中X1是Gin;X2是Ser;X3是Val;x4是Arg、Ser或Thr;x5是Ser或Gly;x6是Ser或Tyr;以及X7是Tyr或缺位；(e)—个含有结构式为X1-X2-X3的氨基酸序列(SEQIDNO:932)的轻链CDR2区，其中乂i是Gly或Asp;X是Ala或Thr;以及乂3是Ser;以及(f)一个含有结构式为X1-X2—X3-X4—X5—X6—X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQIDNO:933)的轻链CDR3区，其中X!是Gln;X2是Gln或His;x3是Tyr、Arg或Ser;x4是Gly、Ser或Ala;乂5是Ser、Asn或Phe;x6是Trp或Ser;X是Pro;xS是Trp、Pro或Arg;以及X9是Thr。在一个首选的实施方案中，该分离的抗体或抗体片段进一步包含(d)一个含有结构式为X1_X2—X3—X4—X5—X6—X7的氨基酸序列(SEQIDNO:931)的轻链CDR1区，其中X1是Gln;乂2是Ser;乂3是Val;X"是Arg或Ser;乂5是Ser;乂6是Ser或Tyr;以及X是Tyr或缺位；(e)—个含有结构式为X1-X2-乂3的氨基酸序列(SEQIDNO:932)的轻链CDR2区，其中Xi是Gly或Asp;x2是Ala或Thr;以及乂3是Ser;以及(f)一个含有结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQIDNO:933)的轻链CDR3区，其中乂!是Gln;X"是Gln或His;X3是Tyr或Arg;乂4是Gly或Ser;乂5是Ser或Asn;乂6是Tip或Ser;X7是Pro;x8是Pro或Arg;以及x9是Thr。在第四个方面，本发明的特点是一种完全人源化抗体或抗体片段；经体外试验或基于ELISA的D114阻断试验测定(如下所述)，该抗体或抗体片段与hD114结合时ICso低于约10nM。在一个首选的实施方案中，本发明的抗体展示的ICso为约500pM或以下。在一个更为首选的实施方案中，本发明的抗体展示的ICs。为约100pM或以下。在一个实施方案中，本发明提供了一种完全人源化单克隆抗体，它能特异性结合和抑制人D114,如使用hD114-Fc的Notch诱导的荧光素酶生物鉴定所测定，它展示了低于或等于约150pM、100pM、75pM或50pM的IC5o。如以下实验部分所示，本发明的抗hD114抗体与密切相关的delta蛋白如hDlll和hDU3不发生交叉反应。在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它能与hD114结合，经表面等离子体共振技术测定(BIACORETM),例如用二聚hDU4测定，其亲和常数KD小于约500pM、较佳的是小于约300pM、更佳的是小于约100pM、小于约50pM、小于约10pM(表2)。本发明包括具有一种经修饰的糖基化模式的抗hDU4抗体。在某些应用中，进行修饰以除去某些不希望的糖基化位点或除去寡糖链上缺乏岩藻糖基的抗体也许是有益的，例如，可提高抗体依赖细胞毒性(ADCC)功能(参阅Shieldetal.(2002)JBC277:26733)。在其它一些应用中,为了改变补体依赖细胞毒性(CDC),可进行半乳糖基化的修饰。本发明包括能与hD114的特定表位结合并能阻断hD114生物活性的抗hD114抗体。D114的胞外结构域是由一个N端结构域、一个Delta/Serrate/Lag-2(DSL)结构域，以及8个类表皮生长因子(EGF)构成的一串重复序列所组成的。一般而言，EGF结构域大约出现在hD114(SEQIDNO:2)的氨基酸残基218-251(结构域1)、252-282(结构域2)、284-322(结构域3)、324-360(结构域4)和362-400(结构域5)处，DSL结构域大约出现在氨基酸残基173-217处，N端结构域大约出现在氨基酸残基27-172处。在一个实施方案中，本发明的封闭抗体与SEQIDNO:2序列上的27至524位氨基酸残基结合。在一个较特殊的实施方案中，本发明的封闭抗体与SEQIDNO:2的N端-DSL结构域27-217内的表位结合；在一个更特殊的实施方案中，该封闭抗体与大约27-172位氨基酸残基(N端结构域)或173-217(DSL结构域)内的表位结合。在另一个实施方案中，本发明的封闭抗体与SEQIDNO:2序列上大约252-282位氨基酸残基内的EGF-2表位结合。在第五个方面，本发明的特点是一种含有抗人D114重组人抗体和可接受载体的组合物。进一步包括在本发明中的是一些载体以及含有载体的宿主细胞，这些宿主细胞含有编码本发明抗D114人抗体的核酸分子；本发明还包括生产这些新颖抗体的方法，这些方法包括在允许生产蛋白和收集如此生产的蛋白的条件下，培养含有编码本发明抗D114人抗体或抗体片段的核酸分子的宿主细胞。在第六个方面，本发明的特点是一些利用本发明抗体或其抗原结合部分来抑制hD114活性的方法。在一个具体实施方案中，该方法包括让hDU4接触本发明抗体或其抗原结合部分，使得hD114被禁止与Notch受体例如Notch-l结合。在另一个具体实施方案中，该方法包括给患有某种通过抑制D114活性可得以减轻的病症的人类患者施用一种本发明的抗体或抗体片段。所治疗的病症是一种通过消除、抑制或降低D114活性可得以改善、减轻、抑制或预防的疾病或症状，例如与肿瘤血管生成和癌症相关的病理性血管生成、免疫缺陷性疾病、移^L排斥或炎症；以及神经变性症状，例如与朊病毒疾病相关的神经变性症状。本发明还包括在用于减轻或抑制D114介导的人类疾病或病症的药剂制造过程中，应用如上所述的抗体或抗体的抗原结合片段。通过审阅以下的详细说明，本发明的其它目的和优越性将变得很明显。
发明内容在描述本发明的方法之前，应该理解，本发明并非局限于所描述的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并非意在限制本发明，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限定。本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式也具有复数的含义，除非上下文另行明确规定。因此，例如，当提及"一种方法"时，它也包括本文所述的一种或多种方法和/或步骤，和/或本领域技术人员在阅读本公开书时将显而易见的内容。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语将具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明的实施或试验，但现将描述的是首选的方法和材料。定义"Delta样配体4"、D114"、"hD114"可互换地用来表示由SEQIDNO:1核酸序列编码的蛋白质和具有SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白质。本文所用的术语"抗体，，意指由四条多肽链即两条重链(H)和两条轻链(L)通过二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子。每条重链均由重链可变区(本文简称HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域即CH1、CH2和CH3组成。每条轻链均由轻链可变区(本文简称LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域即CL组成。VH区和VL区可进一步细分为^皮称为互4卜决定区(CDR)的超可变区。这些超可变区之间散布着被称为构架区(FR)的较保守区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语"高亲和力，，抗体是指经表面等离子共振技术例如BIACORE或溶液亲和ELISA法测定，其与hD114的结合亲和力为至少10—8M、较佳的是1(T9M、更佳的是10'1QM的抗体。术语"慢解离速率(slowoffrate)"或"Koff，是指经表面等离子共振技术例如BIACORETM测定，以1xl(T3s"或更低、较佳的是以1x10-4s-1或更低的速率常数从hD114解离的抗体。"中和抗体"或"封闭抗体，，意指其与D114的结合将导致D114生物活性被抑制的抗体。这种D114生物活性的抑制可通过测量D114生物活性的一个或多个指标来评估。D114生物活性的这些指标可通过本领域内周知的若干标准体外或体内测定法(参阅下文实施例)中一种或多种方法进行评估。抗体中和D114活性的能力最好是以对D114与Notch受体结合的抑制程度来评估。本文所用的抗体的"抗原结合部分"(或简称"抗体部分"或"抗体片段")这一术语是指抗体中一个或多个保持了与抗原(例如hD114)特异性结合能力的片段。业已证实，抗体的抗原结合功能可通过一个全长抗体的各个片段来实现。抗体的"抗原结合部分"这一术语所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CHI等结构域所组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含由铰链区二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH结构域和CHI结构域所组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂VL结构域和VH结构域所组成的Fv片段；(v)由VH结构域所组成的dAb片段(Wardetal.(1989)Nature241:544-546)以及(vi)分离的CDR。此外，虽然Fv片段的两个结构域即VL和VH是由分别的基因所编码，但可用重组方法通过一个合成接头将它们连接在一起；该合成接头能够使它们成为一条单一的蛋白质链，链中的VL区和VH区会配对而形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参阅例如Birdetal.(1988)Science242:423-426;和Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。这种单链抗体也被涵盖在抗体的"抗原结合部分"这一术语之中。其它形式的单链抗体如双抗体(diabody)也被涵盖在内。双抗体是双价双特异性抗体，其中的VH结构域和VL结构域被表达在单一多肽链上，但所使用的接头太短以致于同一链上的这两个结构域无法配对，从而迫使这两个结构域与另一条链上的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点(参阅例如Holligeretal.(1993)Proc.Natl.AcadSci,USA90:6444-6448;Poljaketal.(1994)Structure2:1121-1123)。此外，一个抗体或其抗原结合部分可以是一个较大的免疫黏附分子的一部分；该免疫黏附分子是该抗体或抗体部分与一个或多个其它的蛋白质或肽通过共价或非共价締合所形成的。这种免疫黏附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区来制备四聚scFv分子(Kipriyanovetal.(1995)HumanAntibodiesandHybridomas6:93-101)，以及j吏用半胱氨酸残基、标记肽和C端聚组氨酸标签来制备二价和生物素酰化的scFv分子(Kipriyanovetal.(1994)Mol,Immunol.31:1047-1058)。抗体部分如Fab片段和F(ab')2片段可用常规的技术如对完整抗体分别进行木瓜蛋白酶消化或胃蛋白酶消化等技术从完整抗体制备。此外，如本文所述，抗体、抗体部分和免疫翻附分子还可用标准的重组DNA技术获得。本文所用的术语"人抗体"意在涵盖含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括这样的氨基酸残基。但是，本文所用的术语"人抗体"并不意图包括其中衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的CDR序列被嫁接到人构架序列上的抗体。本文所用的术语"重组人抗体"意在包括所有以重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(将在下文进一步描述)，从重组的组合人抗体库分离的抗体(将在下文进一步描述)，从人免疫球蛋白转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参阅例如Tayloretal.(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287-6295)，或者以任何其它涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列上的方法所制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，这类重组人抗体经受体外诱变(或者当使用人免疫球蛋白序列转基因动物时，经受体内体细胞诱变)，从而使得重组抗体的vh区和vl区的氨基酸序列成为这样的序列它们虽然衍生自人种系vh序列和vl序列并与人种系vh序列和vl序列有亲缘关系，但也许并不天然地存在于所有的体内人种系抗体之中。本文所用的"分离抗体"意指实质上不含其它具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如特异性结合hD114的分离抗体就实质上不含能特异性结合hD114之外抗原的抗体)。但是，特异性结合hD114的分离抗体对于其它抗原如来自其它物种的hD114分子可具有交叉反应性。此外，分离抗体可实质上不含其它细胞材料和/或化学物质。本文所用的术语"表面等离子共振"是指一种光学现象。基于这种光学现象可利用例如BIACOREtm系统(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N丄)来检测生物传感器基质中蛋白质浓度的变化，从而对实时生物特异性相互作用进行分析。本文所用的术语"KD"意指特定的抗体-抗原相互作用的解离常数。术语"表位"包括任何能够特异性结合免疫球蛋白或t细胞受体的决定簇，较佳的是多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基类或磺酰基类；在某些实施方案中，表位决定簇可具有特定的三维结构特征和/或特定电荷特征。表位是抗原中与抗体结合的区域。在某些实施方案中，当一种抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别它的靶标抗原时，就被称为是特异性地与抗原结合。在某些首选的实施方案中，当平衡解离常数小于或等于io—sm，更佳的是当平衡解离常数小于或等于10—9m,最佳的是当平衡解离常数小于或等于10-"m时，就被称为是特异性地与抗原结合。当蛋白质或多肽样品的至少约60-75%显示为单一多肽时，该蛋白质或多肽则被称为"实质上纯的"、"实质上均一的"或"实质上纯化的"。该多肽或蛋白质可以是单体或多聚的。实质上纯的多肽或蛋白质通常会占蛋白质样品的约50%、60、70%、80%或90%(重)，更经常地为约95%纯，较佳的是纯度为99%以上。蛋白质的纯度或均一性可通过本领域内众所周知的许多方法来显示，例如对蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用本领域内众所周知的着色剂对凝胶染色以显现单一的多肽条带。出于某些目的，可采用HLPC或本领域内众所周知的其它纯化方法，来达到更高的分辨率。本文所用的术语"多肽类似物或变体"是指由一个由至少25个氨基酸的片段所组成的多肽，该氨基酸片段与某氨基酸序列的一部分具有实质的同一性，且具有至少一种下列性质(1)在适宜的结合条件下与hD114特异性结合，或者(2)能够阻断D114与Notch受体的结合。通常，相对于天然的序列，多肽类似物或变体包含一个保守的氨基酸取代(或者插入或缺失)。类似物的长度通常为至少20个氨基酸，较佳的是至少50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸或更长，且往往可以和全长的天然多肽一样长。首选的氨基酸取代是这样的氨基酸取代，它们(l)能降低对蛋白水解的敏感性，(2)能降低对氧化的敏感性，(3)能改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)能改变结合亲和力，和(4)[sic]能赋予或修饰这种类似物的其它物理化学性质或功能性质。除了天然肽序列之外，类似物可包括各种各样的序列突变。例如，可在天然序列中实现(较佳的是在多肽中形成分子间接触的结构域外的部分中实现)单个或多个氨基酸取代(较佳的是保守的氨基酸取代)。保守的氨基酸取代不应在实质上改变母体序列的结构特征(例如取代的氨基酸不应损坏母体序列中出现的螺旋，或者破坏其它类型的作为母体序列特征的二级结构)。Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(蛋白、结构与分子原J里)(Creighton1984W.H.FreemanandCompany,NewYork)、IntroductiontoProteinStructure(蛋白结构导论)(Branden&Tooze，eds"1991，GarlandPublishing,NY),以及Thorntonetat.1991，Nature354:105都描述了本领域内公认的多肽二级结构和三级结构的实例。非肽类似物在制药工业中常作为性质类似于模板肽的药物来使用。这类非肽化合物被称为"肽模拟物"或"模拟肽，，(参阅例如Fauchere(1986)J.Adv.DrugRes.15:29;和Evansetal.(1987)J.Med.Chem.30:1229)。也可用同一类型的D-氨基酸对共有序列的一个或多个氨基酸进行系统性取代(例如用D-赖氨酸取代L-赖氨酸)，以产生更稳定的肽。另外，可通过本领域内周知的方法(Rizoetal.(1992)Ann.Rev.Biochem.61:387)，例如通过加入能够形成使肽环化的分子内二碌^桥4定的内部半胱氨酸残基，来产生包含一个共有序列或实质上相同的共有序列变异的受约束的肽。在涉及核酸序列的情形下，术语"序列同一性百分数"是指对两个序列进行最大对应程度的比对时两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是至少约9个或更多的核苷酸，通常至少约18个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，典型的是至少约28个核苷酸，更典型的是至少约32个核苷酸，最好是至少约36、48个或更多的核苷酸。本领域内已知有多种不同的算法可用于测量核苷酸序列同一性。例如，可采用FASTA、Gap或Bestfit来比较多核苷酸序列，它们是WisconsinPackageVersion10.0(GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wis)中的程序。FASTA包括例如FASTA2程序和FASTA3程序，能提供被查询序列和被检索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分数(Pearson(1990)MethodsEnzymol.183:63-98和(2000)MethodsMol.Biol.132:185-219)。除非另有规定，否则将使用具体程序或算法的默认参数。例如，各核酸序列之间的序列同一性百分数，可用FASTA以其默认参数(字长6,记分矩阵的NOPAM因子)进行测定，或者用Gap以其在GCGVersion6.1中提供的默认参数进行测定。当提到核苷酸序列时，也包括其互补序列，除非另有说明。因此，若提及某个具有特定序列的核酸分子时，应理解为包括它的具有互补序列的互补链。通常，本领域的术语"序列同一性百分数，，、"序列相似性百分数，，和"序列同源性百分数，，可互换使用。在本申请书中，对于核酸序列而言，这些术语将具有相同的含义。当提及核酸或其片段时，术语"实质的相似性"或"实质的序列相似性，，表示该核酸或其片段在以适当的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)进行最佳比对时，经用任何众所周知的序列同一性算法例如上述的FASTA、BLAST或Gap测定，在至少约90%、较佳的是至少约95%、更佳的是至少约96%、97%、98%或99%的核苷酸碱基中存在着核苷酸序列同一性。当用于多肽时，术语"实质的同一性"或"实质上相同"是指两个肽序列在通过例如GAP程序或BESTFIT程序以默认空隙分量进行最佳比对时，共享至少80%的序列同一性，较佳的是至少90%或95%的序列同一性，更佳的是至少98%或99%的序列同一性。最好的是，不相同的残基位置的差别仅在于保守的氨基酸取代。"保守的氨基酸取代"是指这样一种取代，即一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守的氨基酸取代不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的氨基酸序列相互之间的差别仅在于保守的取代的情况中，可将序列同一性百分数或相似性程度向上调整，以针对取代的保守特性作出校正。进行这种调整的方法是本领域技术人员众所周知的。参阅例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331。含有化学性质相似侧链的氨基酸分类的实例包括l)脂族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链天冬氨酸和谷氨酰胺；4)芳族侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和6)含硫侧链半胱氨酸和曱硫氨酸。首选的保守氨基酸取代是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代是Gonnetetal.(1992)Science256:144345中所公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihoodmatrix)中任何正值的变化。"中度保守的"取代是PAM250对数似然矩阵中非负值的任何变化。多肽的序列相似性，也称为序列同一性，通常是用序列分析软件来测量的。蛋白质分析软件是用指定给各种取代(包括保守氨基酸取代)、缺失和其它修饰的相似性程度对相似的序列进行比对。例如，GCG含有诸如"Gap"和"Bestfit，，的程序，可以默认参数使用这些程序，以确定紧密相关的多肽例如来自不同生物物种的同源多肽之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质及其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参阅例如GCGVersion6.1。还可以用GCGVersion6.1中的FASTA程序以默认参数或推荐参数来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查询序列和被搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分数(Pearson(2000)，出处同上)。当将本发明的序列与含有大量的来自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一首选的算法是BLAST计算机程序，尤其是blastp或tblastn,使用默认参数。参阅例如Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403410和Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389402。进行同源性比较的多肽序列的长度一般是至少约16个氨基酸残基，通常是至少约20个残基，更通常是至少约24个残基，典型的是至少约28个残基，最好是多于约35个残基。当搜索含有来自大量不同生物的序列的数据库时，最好是比较氨基酸序列。人抗体的制备产生人抗体的方法包括例如VELOCIMMUNE(RegeneronPharmaceuticals)、XENOMOUSEtm技水(Abgenix)、"微小基因座"法以及喧菌体展示技术。VELOCIMMUNE⑧技术(美国专利6,596,541)包括一种针对选定抗原而产生高特异性完全人抗体的方法。这种技术涉及到这样一种转基因小鼠的产生该小鼠的基因组包含一些与内源小鼠恒定区基因座有效地连接(operablylinked)的人重链和轻链可变区，使得该小鼠能响应抗原刺激而产生一种包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。将编码该抗体的重链和轻链的可变区的DNA分离出来，并与编码人重^^和轻链恒定区的DNA有效地连接。然后在能够表达完全人抗体的细胞中表达该DNA。在具体的实施方案中，该细胞是一种CHO细胞。XENOMOUSEtm才支木(Greenetal.(1994)NatureGenetics7:13-21)能产生一种小鼠，它同时具有来自重链基因座和K链基因座的人可变区和恒定区。在一种供选择的途径中，其他一些人采用了"微小基因座"法。其中，通过将来自该免疫球蛋白基因座的各个基因包括在内的方式模拟了一种外源免疫球蛋白基因座(参阅例如美国专利5,545,807)。编码可变区的DNA可在与编码人重链和轻链恒定区的DNA有效地连接或不连接的情况下进行分离。其它产生人抗体的方法，包括从人供体分离的方法，是众所周知的。参阅例如美国专利6，787，637。抗体可在治疗过程中用于阻断配体-受体之间的相互作用或者抑制受体组分之间的相互作用，而不是通过固定补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)机制来杀灭细胞。抗体的恒定区对于抗体固定补体和参与CDC或者通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来引导细胞杀灭的能力是重要的。因此，可根据抗体固定补体的需求来选择抗体的同型。人免疫球蛋白可以两种与铰链异质性有关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含一种约150-160kDa的稳定的四链构建物，其中两个二聚体通过一个重链间的二硫键连接在一起。在第二种形式中，该二聚体不是通过重链间的二硫键连接在一起，而是形成了一个由单一轻链和重链组成的约75-80kDa的分子。这两种形式一直难以分离，甚至在亲和纯化之后也是如此。第二种形式在各种完整IgG同型中的出现频率，是由于但不限于与抗体的铰链区同型相关的结构差异。事实上，人IgG4铰链的铰链区中的单一氨基酸取代，能使第二种形式的出现频率(Angaletal.1993MolecularImmunology30:105)显著地降到使用人IgGl铰链时通常观察到的水平。本发明包括在铰链区、CH2区或CH3区中含有一个或多个突变的抗体。所述的突变可能是合乎需要的，例如在生产中用于提高产率或调节效应子功能。本发明的抗体最好是用VELOCIMMUNE技术来制备。用目的抗原攻击其内源免疫球蛋白重链和轻链可变区被相应的人可变区取代的转基因小鼠，从表达抗体的小鼠回收淋巴细胞(如B细胞)。可将该淋巴细胞与骨髓型细胞系融合，以制备无限增殖的杂交瘤细胞系，再筛选这种杂交瘤细胞系，以鉴别能产生对目的抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。可将编码重链和轻链可变区的DNA分离出来，并与合乎需要的重链和轻链的同型恒定区连接。这种抗体蛋白可在一种细胞如CHO细胞中产生。或者，也可从抗原特异性淋巴细胞直接分离编码抗原特异性嵌合抗体的DNA。在各种实施方案中，转基因小鼠包含12个功能性人源可变重链基因和11个功能性人源可变k轻链基因；25-30个人源重链可变基因和18-20个人源可变k轻链基因；43-48个人源重链可变基因和20-22个人源可变k轻链基因；或者约80个人源重链可变基因和40个人源可变k轻链基因。一般而言，本发明的抗体具有非常高的亲和力，当根据其与固定在固相或溶液相的抗原之间的结合进行测量时，通常具有约10力M至约l(T11M的KD。用合乎需要的人恒定区取代小鼠恒定区，以产生本发明的完全人抗体，例如野生型的或经修饰的IgGl或IgG4(例如SEQIDNO:950、951或952)。所选择的恒定区可根据具体的用途而改变，但高亲和力抗原结合特性和靶标特异性特性存在于可变区中。癌症、传染病、自身免疫性、免疫缺陷、移植、炎症、损伤和退行性病症均可通过调节免疫系统而进行治疗。在因免疫系统功能不当或活性过高所导致的疾病如自身免疫性或炎症的情况下，可通过抑制免疫细胞功能或减少免疫细胞数目来改善疾病状况。这一步可通过阻断施加在对疾病过程很关键的免疫细胞群体上的正信号，或者刺激施加在这些免疫细胞群体上的负信号来实现。所述的免疫细胞群体如T细胞、B细胞或NK细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞、肥大细胞或其它细胞类型。也可通过消除各种免疫细胞群体来抑制过高的活性，例如刺激细胞凋亡，用消耗性抗体或抗体-药物缀合物靶向特定的表面受体，或者阻断或改变免疫细胞谱系或特定细胞类型的分化。效率低的或降低的免疫功能可导致各种疾病如癌症、传染病和其它免疫缺陷，或使病情恶化。免疫系统的活性减退可通过激活免疫细胞来改善，例如通过用交联抗体或激动性抗体刺激正信号，或者通过阻断负信号来激活免疫细胞。免疫细胞群体可通过刺激某些或所有免疫细胞谱系的发育、防止细胞凋亡，或者消除抑制性信号来增加。在一个具体的应用中，本发明的抗体被用于治疗、抑制或改善病症或疾病，例如癌症、免疫缺陷、移植排斥或炎症。表位作图和相关技术为筛选能结合特定表位的抗体(例如能阻断IgE与其高亲和力受体结合的抗体)，可进行常规的交联-阻断分析，如HarlowandLane(1990)(出处同上)描述的交联-阻断分析。其它方法包括丙氨酸扫描突变体分析、肽印迹分析(Reineke(2004)MethodsMolBiol248:443-63)或肽切割分析。另外，还可采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(Tomer(2000)ProteinScience9:487-496)。术语"表位"是指抗原上B细胞和/或T细胞能对其作出响应的位点。B细胞表位可从毗连的氨基酸形成，或者从通过蛋白质的三级折叠而并列在一起的非毗连的氨基酸形成。从毗连的氨基酸形成的表位在接触变性溶剂时通常可得以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常会失去。表位通常包括至少3个、更经常是至少5个或8-10个以独特空间构象出现的氨基酸。修饰辅助概况分析(Modification-AssistedProfiling,MAP),也被称为基于抗原结构的^元体积X况分一斤(AntigenStructure-basedAntibodyProfiling,ASAP),是一种根据每种抗体与经化学或酶学修饰的抗原表面的结合状况的相似性对大量的抗同一抗原的单克隆抗体(mAbs)进行分类的方法(美国专利公开说明书2004/0101920号)。每一类别均可反映与另一类别所代表的表位截然不同或部分重叠的独特表位。这种技术可以快速过滤遗传上相同的抗体，从而可使鉴定工作集中在遗传上不同的抗体上。当应用于杂交瘤篩选时，MAP有助于鉴定能产生具有预期特性的mAbs的罕见杂交瘤克隆。MAP可用来将本发明的hD114抗体分类成结合不同表位的抗体组。可用于改变固定化抗原的结构的物质有酶类，例如蛋白水解酶，如胰蛋白酶、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等。可用于改变固定化抗原的结构的物质还可以是化学物质，如琥珀酰亚胺酯类和它们的衍生物、含伯胺的化合物、肼和碳酰肼、游离氨基酸等。抗原蛋白可固定化在生物传感器芯片表面或聚苯乙烯珠粒上。后者可用例如多重LUMINEXTM检测测定法(LuminexCorp.,Austin,TX)之类的测定法进4亍处理。由于LUMINEXTM具有以最多可达100种不同类型的珠粒处理多重分析的能力，LUMINEXtm可提供几乎无限的包含各种修饰的抗原表面，从而使经由生物传感器测定进行的抗体表位概况分析的分辨率得以提高。治疗给药和制剂本发明的治疗剂将与适宜的载体、赋形剂和其它被加入到制剂中使转移、递送、耐受性等得到改进的物质一起施用。在雷氏药学大全(Remington'sPharmaceuticalSciences,15thed.,MackPublishingCompany,Easton,PA)这一所有药剂师都知道的处方集里，可找到多种适当的剂型。这些制剂包括例如散剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡剂、油剂、脂质剂、含脂质(阳离子型或阴离子型)的嚢剂(如LIPOFECTIN)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油型或油包水型乳剂、carbowax乳剂(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂和含有carbowax的半固体混合物。任何前述混合物在按照本发明的治疗和疗法中都可能是适宜的，其前提是该制剂不会使制剂中的活性成分失活，且该制剂在生理上与给药途径是相容的和可接受的。有关药剂师众所周知的赋形剂和载体的进一步4言息,可参阅Powelletal."Compendiumofexcipientsforparenteralformulations"PDA(1998)JPharmSciTechnol.52:238-311及其中的引用文献。实施例实施例1:抗人D114的人抗体的产生可通过本领域内周知的任何方法进行小鼠的免疫(参阅例如HarlowandLane，出处同上)。在一个实施方案中，将hD114抗原随佐剂一起，直接给予包含编码人免疫球蛋白重链可变区和k轻链可变区的DNA基因座的VELOCIMMUNE⑧小鼠，以刺激免疫应答。这种佐剂包括完全和不完全弗氏佐剂、MPL+TDM佐剂系统(Sigma)或RIBI(胞壁酰二肽)(参阅O，Hagan2000VaccineAdjuvant,HumanPress,Totawa，NJ)。以才示准的抗原特异性免疫测定法监测抗体免疫应答。当达到预期的免疫应答时，收获表达抗体的B细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合以保存它们的存活力，从而形成杂交瘤细胞系。用下文描述的测定法，对这种杂交瘤细胞系进行筛选和选择，以鉴定出能产生抗原特异性抗体的细胞系。或者，可通过流式细胞术分离抗原特异性杂交瘤细胞。简言之，在杂交瘤细胞与骨髓瘤细胞融合后，将其集中在HAT培养基中培养10天。然后收获细胞，用2mg/ml的生物素标记D114染色1小时，然后加入藻红蛋白-链霉亲和素。将荧光标记的细胞以流式细胞术分选(向含有杂交瘤生长培养基的96孔平板的每孔中加入单个细胞)，培养8-10天，如下所述对经调理的培养基进行筛选，以确定功能上合乎需要的单克隆抗体是否存在。通过直接分离脾细胞产生的抗hD114抗体。如美国专利公开书2007/0280945A1中所述，抗原特异性抗体还可从经抗原免疫而不与骨髓瘤细胞融合的B细胞直接分离。从分离出的正确重组子建立稳定的表达抗体的重组CHO细胞系。实施例2:抗原结合亲和力测定抗原与上述选定抗体结合的平衡解离常数(Ko值)，根据实时生物传感器表面等离子共振分析(BIACORE2000)的表面动力学进行测定。将抗体捕获在通过与BIACORETM芯片直接化学偶联而产生的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体表面上，以形成捕获抗体表面。将不同浓度的单聚hD114或二聚hD114-hFc注射在捕获抗体表面，实时监测抗原-抗体结合和解离情况。进行动力学分析，以计算抗原/抗体复合物解离的解离速率常数Kd和半寿期(表1)。应用类似的方法来测量单一B细胞衍生的、经修饰含有人lgG恒定结构域的单克隆抗体。抗体通过固定在BIACORE芯片上的山羊抗hFc多克隆抗体试剂(JacksonImmunoResearchLab)呈递，并接触二聚D114-mFc或单聚D114蛋白(表2)。抗体-抗原结合亲和力还可用基于ELISA的溶液竟争分析进行评估。简言之，在96孔微量滴定板上，将抗体(纯化的蛋白质或者在经调理的培养基中)与0-10pg/ml的抗原蛋白(单聚或二聚)系列稀释液进行预混合，并保持抗体浓度恒定。抗原与抗体温育2小时后，将各溶液转移到用抗原预包被的微量滴定板以测量游离抗体(MAXISORBTM，VWR,WestChester,PA)。该微量滴定板是用1|ig/mlhD114-hFc蛋白的PBS溶液于4°C包被过夜，非特异性结合位点用BSA封闭2小时。转移后经温育1小时后，洗涤该微量滴定板，用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体试剂(JacksonImmunoLaboratory)4全测与板结合的抗体，用比色底物(OPTEIA;BDBiosciencesPharmingen，SanDiego，CA)显色。用1M磷酸终止酶促反应，记录450nm处的光吸收，数据用S形剂量响应^^莫型(sigmoidaldose-responsemodel)进4亍分才斤，并才艮告ICso^(直(表1)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例3:D114与Notch相互作用的抑制用基于ELISA的免疫测定法，评估抗体阻断D114与Notch结合的能力。简言之，将Notch-hFc重组蛋白以在PBS緩沖液中1mg/ml的浓度在96孔板上于4°C包被过夜，用BSA封闭非特异性结合位点。此板用于测量来自抗体滴定样品溶液的游离生物素-D114-hFc。为制备抗体滴定样品，将25pM的恒定量的生物素-D114-hFc与不同数量的抗体预混合；所述抗体或置于粗杂交瘤调理培养基中，或以纯化的抗体蛋白使用，在系列稀释液中的浓度为0至约50nM;接着在室温下温育2小时，让抗体-抗原结合达到平衡。然后将平衡的样品溶液转移到Notch-hFc包被的板上，以测量游离的生物素-D114-hFc。结合1小时后，洗涤该板，用HRP缀合的链霉亲和素(PolyHRPstreptavidin,PierceEndogen)检测结合的生物素-D114-hFc，用TMB底物(BDPharmigen)显色。用GraphPadPrism软件分析数据，确定与包被^1上Notch-Fc结合的生物素-D114-hFc减少达50%所需的抗体量即为ICso值(表3)(*经调理的培养基)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>仍使用上述的基于ELISA的免疫测定法，评估选定的经纯化的抗hD114抗体阻断D114与Notch结合的能力，但对该测定法作出如下修改用30pM的生物素-D114-hFc替代25pM的生物素-D114-hFc,并将抗体-抗原温育时间从2小时减到1小时。为方便起见，将抗体318518-01A10-D8重新命名为"REGN281"(HCVR/LCVRSEQIDNO:429/437和hlgGlSEQIDNO:950)。受试的书亍生抗体包括REGN421(HCVR/LCVRSEQIDNO:901/903、hlgGlSEQIDNO:950)和REGN422(HCVR/LCVRSEQIDNO:901/903,经修饰的hlgG4SEQIDNO:952)。结果如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>使用表达D114的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),在体外测试抗体中和D114介导的细胞功能的能力。如下所述，监测衍生抗体对HUVEC中Notch介导的hHesl和EphB2基因表达的抑制将低传代HUVEC在MCDB-131培养基(VecTechnologies)中培养。在分析前一天，以2x105个细胞/孔的密度将HUVEC细胞接种在培养基总体积为1ml的24孔板中。将试验抗体或其它抑制剂一式三份直接加到各个样品孔中，然后于37°C培养5小时。在培养期末，除去培养基，用QIAZOIJM和脂EASYtmLipidTissueKit(Qiagen)分离总RNA。采用PCR和荧光5，核酸酶分析法(TAQMANassay,AppiedBiosystems)定量分析mRNA水平。对于每个样品，从l-2mg的总RNA合成cDNA。将从等量的原始RNA(通常25ng)产生的cDNA—式三份加载于ABIPRISMtm光学反应板上。对于每个RNA样品，还进行其中未加入反转录酶(RT)的"无RT"对照试验，以便减去基因组DNA对信号的任何潜在影响。在每个反应中加入2xMastermix(TAQMAN2xPCRMastermix;ABI)直至lx的终浓度。另外，在每个反应中加入目的基因的TAQMAN⑧探针和引物。每种引物均以900nM的终浓度使用，探针以200nM的终浓度加入。以人基因组DNA作为标准物。分析是在标准的TAQMAN⑧条件下在ABI7900HT仪器上进^亍的。测量Hesl和EphrinB2的水平，并参照内源对照基因(亲环蛋白)进行归一化(表5)。探针和引物人Hesl探针(SEQIDNO:387),引物hHesl-869F(SEQIDNO:388)，hHesl-940R(SEQIDNO:389);人ephrinB2探针hEphB2-773T(SEQIDNO:390),引物hEphB2-752F(SEQIDNO:391),hEphB2-812R(SEQIDNO:392);人亲环蛋白探针人亲环蛋白-343T(SEQIDNO:393)，引物人亲环蛋白-323F(SEQIDNO:394),人亲环蛋白-389R(SEQIDNO:395)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>HUVEC增殖分析。在体外细胞增殖分析中，测试抗体阻断D114介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长抑制的能力。获得低传代HUVEC细胞，并在MCDB-131培养基(VecTechnologies)培养。在分析前一天，将各个12孔组织培养板用hD114-hFc的PBS溶液于4°C包被过夜(0.2pg/ml;0.5mlPBS/孔)。用PBS洗涤(lx)各板，以4xl03个细胞/孔的密度将HUVEC细胞接种在总体积为1.0ml的培养基中。在加入细胞后，随即加入各种浓度的抗hD114抗体，总体积为0.5ml,以产生抑制曲线。细胞于37。C生长96小时。细胞数量用CCK-8试剂(Dojindo)定量。所有分軒都重复三次。(表6,NB:不封闭)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>Notch可诱导萤光素酶分析。开发了一种生物分析法，使用组成性表达人Notchl和含有Notch响应性启动子驱动萤光素酶(Notch-responsivepromoterdrivingluciferase)的经工程改造的HEK293细胞系(ATCC),测定选定的经纯化抗体在体外中和D114介导的细胞功能的能力。按照如下所述测定Notch可诱导萤光素酶活性的抑制在测定前一天，将不透明96孔组织培养板的每个孔用100pi的1nM或1.5nMhD114-hFc的PBS溶液于4。C包被过夜。以2xl(^个细胞/孔(培养基中)的密度将细胞接种到经包被的板上。将纯化的抗体蛋白与细胞于37。C温育24小时；所述抗体蛋白是在细胞培养基中的系列稀释液，起始浓度为2nM。萤光素酶活性是通过加入相等孔体积的STEADY-GLO⑧底物(Promega)测定的(表7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>实施例4:Notchl切割的抑制通过用SDS-PAGE/蛋白质印迹法检查总的被切割Notchl蛋白，来测试选定的抗hD114抗体抑制Notchl切割的能力。如上所述培养低传代HUVEC细胞。在分析前一天，将各个6孔板用hD114-hFc的PBS溶液于4。C包被过夜(0.2吗/ml;1.0mlPBS/孔)。用PBS洗涤(lx)各板，以7.5乂105个细胞/孔的密度将HUVEC细胞接种在总体积为2.0ml的培养基中。在细胞接种后，随即向每孔加入抗hD114抗体，终浓度为10nM。让细胞于37°C生长24小时，然后制备全细胞提取物，并进行SDS-PAGE分析。用抗被切割的Notchl(Val1744)的抗体(CellSignaling)和标准的蛋白质印迹技术，测定被切割的Notchl的水平。抗hD114抗体能够完全阻断包祐:才反上hD114-hFc所诱导的Notchl切割(数据未显示)。实施例5:ADCC测定和CDC测定用一组具有不同hD114表达水平的八个靶标细胞系，评估两种试验抗体(REGN421、REGN422)所诱导的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)。这八个靶标细胞系是(1)HUVEC;(2)用10nMVEGF刺激24小时的HUVEC;(3)Colo205;(4)表达eGFP的经工程改造的C6大鼠神经胶质瘤细胞；(5)表达hD114的经工程改造的C6大鼠神经胶质瘤细胞；，(6)表达eGFP的经工程改造的HT1080细胞；(7)表达hDU4的经工程改造的HT1080细胞；和(8)HT29。通过反转录病毒转染将人D114或eGFP整合到C6细胞或HT1080基因组中。简言之，首先将每个靶标细胞系的细胞(10,000个细胞/孔，50|al)与等体积的经系列稀释的REGN421或REGN422混合(该系列稀释产生的最终抗体浓度为0.169pM-10nM),然后在96孔板中于室温温育10分钟(对照=无抗体的孔)。另外，按照常规的Ficoll-Hypaque梯度离心富集程序，制备人外周血单核细胞(PBMC,效应子细胞)。将大约300,000PBMC加入每个抗体-靶标细胞混合物，使效应子细胞与靶标细胞的最终比例大约为30:1。然后将该96孔板在37。C、5%C02条件下温育4小时，接着以250xg进行离心。收获上清液，用CYTOTOX96@非放射性细胞毒性测定系统(Promega)测定乳酸脱氬酶(LDH)活性。结果如表8所示。REGN421诱导的剂量依赖性细胞裂解仅在表达hD114的C6细胞中观察到(第5列)，该细胞在所有细胞系中显示出最高的hD114表达水平(由免疫沉淀法/蛋白质印迹法和流式细胞计量法测出)。C6-hD114细胞系中的最大细胞毒性在20%-60%之间。在其余七个靶标细胞系中没有观察到REGN421诱导的细胞裂解。REGN422在任何靶标细胞系中都没有诱导细胞裂解。表8抗体最大细胞毒性％1245678REGN421000020-60000REGN42200000000用上述的同一组细胞系，评估REGN421诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)。简言之，首先将每个耙标细胞系的细胞(50,000个细胞/孔，50pl)与等体积的经系列稀释的REGN421混合(该系列稀释产生的最终抗体浓度为0.169pM-10nM),然后在96孔板中于室温下温育10分钟。向每孔加入带补体成分的正常人血清(QuidelCorp.，SanDiego，CA)，产生的最终血清浓度为5%。然后将各板在37。C、5。/oC02条件下温育2小时，接着加入CELLTITER-BLUE⑧试剂(Promega)(对照二无抗体的孔和有抗体但无血清的孔)。将各^反温育过夜，测定细月包存活率(CDC水平)。Daudi细胞用利妥昔单抗处理，作为阳性对照。REGN421没有显示对任何受试靶标细胞系的CDC(数据未显示)。实施例6:表位作图和特异性为了测定表位结合特异性，产生了一系列共七个嵌合D114蛋白，其中特定的人D114结构域按照如下所述被置换进一个小鼠D114蛋白#1含有人N端结构域和DSL结构域(S27-Q218);#2含有人N端结构域、DSL结构域和EGF-1结构域(S27-N252);#3含有人N端结构域、DSL结构域、EGF-1结构域和EGF-2结构域(S27-Q283);糾含有人N端结构域、DSL结构域、EGF-1结构域、EGF-2结构域、EGF-3结构域、EGF-4结构域和EGF-5结构域；#5含有人N端结构域(S27-R172);#6含有人DSL结构域(V173-Q218);#7含有人EGF-2结构域(E252-D282)。将各嵌合蛋白与小鼠IgG2a-Fc片段融合，并在CH0-K1细胞中表达。收获经调理的培养基，通过蛋白质印迹法证实蛋白质表达。按如下所述测试试验抗体与hD114、mD114及嵌合蛋白弁l、#2、#3和糾的结合特异性将纯化的抗体22G12、VAW3A7-2和15E10在CM5芯片上进行胺偶联(5000-6000RU之间)。依序注入来自CHOKl细胞的含有嵌合D114蛋白、hD114-mFc和mD114-mFc的经调理培养基，接着在抗体偶联的表面上进行表面再生。以空白的胺偶联流通池(flowcell)表面作为经调理的培养基的非特异性结合的对照。其结果总结在表9中。22G12结合hDU4的S27-Q218之间的表位；VAW3A7-2结合hDU4的Q283-E400的表位；15E10结合hDU4的E252-D282之间的表位。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>测定了纯化的试验单克隆抗体与hD114、mD114和嵌合蛋白(如上所述)的结合特异性(REGN279=314266-6F12-B7;REGN287=318518-1G04-F3;REGN289=318518-1H08-E9;REGN290=318518-2A07画B3;REGN306=318518-3F06-A3)。简言之，将每个D114蛋白捕获(70-130RU)在山羊抗小鼠IgG抗体的表面，然后注入浓度为100^g/ml的试验单克隆抗体。以结合mD114-mFc的抗体作为阳性对照(阳性对照=6C10)。结果(表10)显示REGN279结合hDU4的S27-Q218之间的表位；REGN287在hD114的Q283-E400之间结合；REGN289、REGN290和REGN306在hDU4的S27-E400之间结合。表IO<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>用下列纯化试验抗体，按照如上所述进行更多的表位结合特异性测定REGN281=318518-1A10-D8;REGN305=318518-3F04-A6;REGN309=318518-14A07-C4;REGN310=318518-14D08-G1;REGN421和REGN422。简言之，将每个D114蛋白捕获(240-470RU)在山羊抗小鼠IgG抗体的表面，然后注入浓度为100|ag/ml的试-验抗体(表11)。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>[sic]蛋白质印迹分析。以蛋白质印迹分析法测定选定的抗体与嵌合的小鼠和人D114的结合特异性。简言之，使用非还原性样品緩沖液，使hD114-mFc(200ng/泳道)、mD114-mFc(200ng/泳道)和嵌合蛋白弁l画#7(大约150ng/泳道)在双份SDS-PAGE凝胶上进行电泳。然后将每份凝胶转移到PVDF膜上。让各印迹首先接触0.2|ig/ml的REGN421,然后接触HRP缀合的抗hlgG抗体(Pierce)。让对照印迹接触HRP缀合的抗mFc抗体(Pierce)。结果:REGN421识别出hD114-mFc和含有人N端结构域(#5)、人DSL结构域(#6)或者这两个结构域(#1、#2、#3和#4)的嵌合蛋白。REGN421未识别出含有人GF-2结构域的嵌合蛋白(#7)。蛋白酶消化分析。用HPLC1100(Agilent)和LCQClassical离子阱质谱仪(Thermo),通过保护性蛋白酶消化和液相色谱/质谱(LC/MS)进一步评估REGN281和hD114之间的结合。简言之，将摩尔比为1:5的hD114和REGN281的混合物或单独的hD114,与蛋白酶于25°C(对于GluC蛋白酶)或于37。C(对于胰蛋白酶)温育过夜。然后将所得的每一种蛋白水解消化混合物以LC/MS分析。在REGN281不存在的条件下进行的蛋白水解其消化物中存在着独特的肽峰，而在REGN281存在的条件下进行的蛋白水解其消化物中这些肽峰变小或消失。这些肽峰表示hD114上由于REGN281与hD114的结合而受到保护免被蛋白酶消化的潜在REGN281结合位点。通过质谱对这些独特的肽峰进行分析。这些肽的观测质量、预测质量和N端序列如表12中所示。表12峰观测质量预测质量hD114肽(SEQIDNO:2)蛋白酶结构城Gl521521.5Phe37-Glu40GluCN端G21362.81363.4Alal21-Glu132GluCN端Tl758760.8Pro49-Arg55胰蛋白酶N端T2587.1587.2Tyrl69-Arg172胰蛋白酶N端T31607.41607.6Vall73-Arg186胰蛋白酶DSLT413991400.7Gly42-Arg55胰蛋白酶N端T5569.2569.3Thr56-Arg59胰蛋白酶N端T726152613.4Hel43-Arg166胰蛋白酶N端T8腦.2画.9Ser27-Arg41胰蛋白酶N端实施例7:純化的抗体与人和猴D1W的结合亲和力用BIACORE2000和3000,对选定的纯化抗体与hDU4单体、马来猕猴(M/ac^cw/a&)D114单体(mfDU4，SEQINNO:956),以及恒河猕猴(Mmw/a加)D114单体(mmD114,SEQIDNO:957)的结合亲和力进行测定。用固定在BIACOREtm芯片上的山羊抗hFc多克隆抗体试剂呈递REGN281、REGN421和REGN422以不同浓度的每种蛋白质hDU4(12.5nM-100nM)、mfDU4(3.13.nM-100nM)或mmDU4U2.5nM-100nM)作为被分析物，注射在抗体表面上。实时监测结合的复合物的抗原-抗体结合和解离情况(表13)。表13ka(M-ls國l)kd(s-l)KD(nM)hDU4m咖4mmDU4h加4mfDU4mmDU4tiDU4mfD114mmDU4REGN2811.56x1056.64x1049.27x1042.30x10-52.04x10-53.05x10-50.1480.3070.329REGN4211.63x1057.28x1049.70x1042.17x10-52.02x10-53.23x10-50.1330.2780.333REGN4221.64x1058.01x1049.27x票2.36x10-52.88x10-53.41x10-50.1440.3600.375仍使用BIACORE2000和上述方法，但用hD114-mFc(3.13nM-100nM)代替hDU4或者用mmD114-mFc(0.78nM-25nM)代替mmDU4作为被分析物，测定了抗hD114抗体对hDU4二聚体和mmD114二聚体的结合亲和力(表14)。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>实施例8:抗体对hDlll、hDU3、mDU4或mfDU4的交叉反应性测定了抗体对人Delta样配体1蛋白(SEQIDNO:953)和人Delta样配体3蛋白(SEQIDNO:954)的交叉反应性。REGN281、REGN421和REGN422通过固定在BIACOREtm芯片上的山羊抗人k(hK)多克隆抗体试剂(SouthernBiotech)呈递，以100jug/ml的hD114-hFc蛋白或hDlll-hFc蛋白作为被分析物注射在抗体表面上。所有三种抗hD114抗体仅与hD114-hFc结合，但不与hDlll-hFc结合。用另选的BIACOREtm模式(format)，评估抗hDU4抗体和hDlll-hFc或hD113-hFc之间的交叉反应性。简言之，将配体hD114-hFc、hDlll-hFc和hD113-hFc分别通过胺偶联共价连接到CM-5芯片上至约8,000-10,000的RU范围。将300lig/ml的REGN421注射到每个芯片的表面。REGN421仅与hD114-hFc结合；未观察到其与hDlll-hFc或hD113-hFc的结合。用REGN422代替REGN421也观察到相同的结果。采用基于OCTET的结合测定法，来测定选定的经纯化的抗hD114抗体和hD114-hFc、hD113-hFc、hDlll-hFc、mfD114-mmh或mD114-mFc之间的结合。简言之，将链霉亲和素高结合FA生物传感器(ForteBio,Inc.，MenloPark,CA)首先与5^ig/ml的生物素-抗hK于30。C温育10分钟，以达到饱和。接着将生物素-抗hK结合的生物传感器与20pg/ml的抗体REGN281、REGN421或REGN422于30。C温育10分钟，以达到饱和。然后将抗体结合的生物传感器与200nM的hD114-hFc或hD113-hFc、hDlll-hFc或mD114-mFc或100nM的mfD114-mmh于30。C温育10分钟。然后将抗体结合的生物传感器与200nM的hD114-hFc或hD113-hFc、h謹-hFc或mD114画mFc或100nM的mfD114-mmh于30。C温育IO分钟。测量每次温育后生物层的厚度的变化。hD114-hFc和mfD114-mmh结合了抗hDU4抗体结合的生物传感器，而hD113-hFc、hDlll-hFc和mD114-mFc未与抗hD114抗体结合的生物传感器结合。实施例9:抗hD114抗体对肺瘤生长的影响在表达人源化D114蛋白的严重复合型免疫缺乏症(SCID)小鼠(SCIDxhD114)体内所植入的肺瘤上，评估REGN421对肿瘤生长的影响。简言之，该人源化D114小鼠是这样制备的用胚胎千(ES)细胞中人D114基因(7kb)的相应胞外区取代小鼠D114基因的整个胞外域。产生出纯合的hD114小鼠，并繁殖到SCID背景中。然后给每只小鼠皮下(SC)植入2.5x106个人HT1080肺瘤细胞。待肿瘤在小鼠中定植后(~100-150mm3,植入后18天)，对各小鼠进行测量并用hFc、hD114-Fc或REGN421处理。将总共7只小鼠分成三组。第一组(n=3)用25mg/kg的hFc皮下处理；第二组(n=l)用25mg/kg的hD114-Fc处理；第三组(n=3)用10mg/kg的REGN421处理。这类处理是从第18天开始每48小时重复进行。体内肿瘤测量值是在初始处理前三天(第15天)、每次处理的当天(第18、20和22天)和在第25天获得。肿瘤大小用公式lxw"2计算。结果如表15所示。在第25天，对小鼠施以安乐死，移取每个肿瘤，进行离体(exvivo)测量及计算(长x宽x高)(表16)。另外，给一组表达内源mD114的SCID小鼠(n=2)植入肿瘤细胞，并按相同的剂量方案用hD114-Fc(25mg/kg)进行处理。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>权利要求1.一种特异性结合人delta样配体4(hDll4)的人抗体或抗体片段，经表面等离子体共振技术测量，其亲和常数(KD)等于或小于约500pM。2.如权利要求l所述的人抗体或抗体片段，其特征为亲和常数Ko等于或小于约400pM。3.如权利要求1或2所述的人抗体或抗体片段，它包括一个选自下列序列的重链可变区(HCVR):SEQIDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、397、413、429、445、461、477、493、509、525、541、557、573、589、605、621、637、653、669、685、701、717、733、749、765、781、797、813、893、897、901、905、909、913、917、921、925、935、939、943和947。4.如权利要求3所述的人抗体或抗体片段，它包括一个选自下列序列的轻链可变区(LCVR):SEQIDNO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、405、421、437、453、469、485、501、517、533、549、565、581、597、613、629、645、661、677、693、709、725、741、757、773、789、805、821、895、899、903、907、911、915、919、923、927、937、941、945和949。5.如权利要求4所述的人抗体或抗体片段，其特征为该HCVR/LCVR是选自SEQIDNO:429/437和901/903序列。6.如权利要求5所述的人抗体或抗体片段，其进一步包括一个选自SEQIDNO:950、951和952的恒定区。7.如权利要求1或2所述的人抗体或抗体片段，它包括一个重链互补决定区3(CDR3)和一个轻链CDR3，其特征为该重链CDR3包含一个结构式为X1—X2—X3-X4-X5-X6—X7-X8—X9—X10-X11—X12-X13-X14—X15-X16的氨基酸序列(SEQIDNO:930)，其中X!是Ala或Ser;乂2是Arg或Lys;乂3是Asp;乂4是Gly或His;x5是Asp或Ala;乂6是Phe;x7是Tyr或Arg;乂8是Ser;乂9是Gly;X"是Tyr;X11是Glu;X12是Gly或His;X13是Tyr或Trp;X"是Phe或缺位；X"是Asp或缺位；以及X"是Pro或缺位；且该轻链CDR3包含一个结构式为X1-X2—X3-X4-X5-X6-X7-X8一乂9的#、基酸序列(SEQIDNO:933)，其中乂！是Gin;乂2是Gki或His;x3是Tyr或Arg;x4是Gly或Ser;x5是Ser或Asn;x6是Trp或Ser;X7APro;x8是Pro或Arg;以及x9是Thr。8.如权利要求7所述的人抗体或抗体片段，它进一步包括一个包含结构式为X1，X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDNO:928)的重链CDR1区，其中乂i是Gly;乂2是Phe;乂3是Thr;乂4是Phe;乂5是Ser或Asn;x6是Ser或Asn;x7是Tyr或Phe;以及x8是Gly或Ala;一个包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDNO:929)的重链CDR2区，其中乂!是lie或Leu;X"是Tip或Ser;乂3是Tyr或Gly;乂4是Asp或Ser;乂5是Gly;乂6是Ser、Thr或Val;X是Asn或Asp;以及乂8是Lys或Arg;一个包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7的氨基酸序列(SEQIDNO:931)的轻链CDR1区，其中乂!是Gin;X"是Ser;乂3是Val;X"是Arg或Ser;乂5是Ser;乂6是Ser或Tyr;以及X是Tyr或缺位；以及一个包含结构式为X1-X2-X3的氨基酸序列(SEQIDNO:932)的轻链CDR2区，其中乂！是Gly或Asp;X"是Ala或Thr;以及乂3是Ser。9.如权利要求1或2所述的人抗体或抗体片段，它包括一个选自下列序列的重链CDR3区SEQIDNO:IO、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579、595、611、627、643、659、675、691、707、723、739、755、771、787、803、819、835、851、867和883;以及一个选自下列序列的轻链CDR3区SEQIDNO:18、34、50、66、82、98、11、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587、603、619、635、651、667、683、699、715、731、747、763、779、795、811、827、843、859、875和891。10.如权利要求9所述的人抗体或抗体片段，它进一步包括一-个选自下列序列的重链CDR1区SEQIDNO:6、22、354、7086、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、399、415、431、447、463、479、495、511、527、543、559、575、591、607、623、639、655、671、687、703、711119、735、751、767、783、799、815、831、847、863和879;-个选自下列序列的重链CDR2区SEQIDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577、593、609、625、641、657、673、689、705、721、737、753、769、785、801、817、833、849、865和881;一个选自下列序列的轻链CDR1区78、94、110、126、142、158、174、270、286、302、318、334、350、366471、487、503、519、535、551、567663、679、695、711、727、743、759855、871和887;以及一个选自下列序列的轻链CDR2区80、96、112、128、144、160、176、272、288、304、320、336、352、368473、489、505、521、537、553、569665、681、697、713、729、745、761857、873和889。11.一种编码上述任何一项权利要求所述抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。12.—种含有如权利要求11所述核苷酸序列的载体。13.—种宿主-载体系统，用于生产特异性结合人D114的抗体或抗体的抗原结合片段，并在适宜的宿主细胞中含有如权利要求12所述的载体。14.一种如权利要求11所述的宿主-载体系统，其特征为该宿主细胞是一种选自大肠杆菌或CHO细胞的原核细胞或真核细胞。15.—种生产抗人D114抗体或其抗原结合片段的方法，它包括在允许生产抗体或其片段以及收集如此生产的抗体或其片段的条件下，培养如权利要求13或14所述宿主-载体系统的细胞。SEQIDNO:14、30、46、62、l卯、206、222、238、254、、382、407、423、439、455、、583、599、615、631、647、、775、791、807、823、839、SEQIDNO:16、32、48、64、192、208、224、240、256、、384、409、425、441、457、、585、601、617、633、649、、777、793、809、825、841、16.在用于减轻或抑制D114介导的人类疾病或病症的药剂制造过程中，应用如权利要求1至10中任何一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段。17.如权利要求16所述的应用，其中所述D114相关的症状或疾病是病理性血管生成、癌症、免疫缺陷性疾病、移植排斥或炎症。全文摘要一种分离的人抗体或人抗体片段，它能特异性结合人delta样配体4(hDll4)并阻断hDll4与Notch受体的结合。该抗hDll4人抗体或抗体片段能与hDll4结合，经表面等离子体共振技术测量，其亲和常数≤500pM。文档编号C07K16/18GK101611055SQ200780046030公开日2009年12月23日申请日期2007年12月14日优先权日2006年12月14日发明者E·史密斯,G·瑟斯顿,I·诺古埃拉-特罗伊塞,J·H·玛丁,N·J·帕帕多波洛斯申请人:里珍纳龙药品有限公司