专利名称：一种利用阴离子交换柱辅助聚乙二醇修饰水蛭素的方法
技术领域：
本发明属于蛋白质修饰技术领域，涉及到蛋白的聚乙二醇固相修饰，特别 涉及一种利用阴离子交换柱辅助聚乙二醇修饰水蛭素的方法。
技术背景聚乙二醇(PEG)修饰是一个用中性的、化学惰性、亲水的PEG聚合物修饰 蛋白药物的化学反应。上世纪70年代以来，科学家们发现一些药用蛋白经PEG 修饰后，其药用性质大大改善，如体内半衰期延长，免疫原性降低等等。现在已经上市的一些PEG-蛋白质偶联物如Adagen， Oncospar， PEG-Intron 等，均是基于第一代PEG化技术制备出来的，其特征是(1)修饰剂的分子量 一般都很低；(2)双官能团聚乙二醇杂质容易引起交联和团聚；(3)连接键的 水解稳定性差；(4)选择性低，即反应后得到修饰度不同的修饰产物，而且存 在副反应。为解决上述弊端，基于第二代PEG化技术的聚乙二醇修饰剂正在得 到越来越广泛的应用。第二代PEG化的聚乙二醇修饰以定点修饰为目标。Nekta公司开发的各类活 化PEG使蛋白的定向修饰成为可能，主要产品有针对氨基、巯基以及N端氨基 修饰的各类直链或支链的PEG衍生物，以及带有标签的各类PEG。但是这种特异 性的修饰也存在其局限性，如巯基的修饰要求被修饰蛋白含有游离巯基，并且 处于活性位点之外；针对N端a -氨基的修饰，需将Lys的e -氨基保护，且反 应条件较为苛刻(一种聚乙二醇修饰蛋白质a-氨基的方法，CN1687106)。水蛭素(hirudin)作为特异性的凝血酶抑制剂，其体内半衰期短的缺点严重地制约了其临床应用，因此有必要采用PEG修饰方法改善其药用性质。分析 水蛭素的氨基酸组成，其分子中无游离的-SH供相应的PEG修饰，而末端氨基是 其活性必需的，故不能选择专一性修饰末端氨基的PEG，最终选择相应的PEG专 一性修饰水蛭素赖氨酸(Lys)。前期的实验研究表明，若水蛭素上4个赖氨酸 残基都被PEG修饰，其生物活性就会明显降低。分析水蛭素与凝血酶的作用情 况，发现47位Lys位于凝血酶与水蛭素作用的凹槽内，若47位Lys被修饰， 其活性会受到影响。为保护水蛭素的活性位点不被修饰，亲和保护是一种常用的固相修饰策略 (亲和方法保护活性位点修饰蛋白质的方法、产品及用途，CN1453292)。这种 方法虽然具有保护活性位点，特异性强等一系列优点，但其缺点是步骤繁琐， 需要找到与目的蛋白具有亲和作用的配基，而且一些配基造价高昂，提高了药 物的成本，限制了其使用范围。 发明内容本发明的目的在于寻找一种蛋白PEG修饰方法，此方法快速、简捷，可得 到单一的、活性更高的修饰产品。发明中提供一种利用阴离子交换柱辅助PEG 修饰水蛭素的方法，这种方法不仅可以利用离子交换柱屏蔽水蛭素的活性中心， 提高PEG修饰的专一性，而且可以简化修饰产物的分离步骤，縮短操作时间。实现本发明方法的步骤如下(A)将溶于20 50mM磷酸盐缓冲液a中的水蛭素上样于经相同缓冲液平 衡的离子柱中，至全部样品吸附于离子交换介质上，没有洗脱物流出为止。其 中水蛭素包括天然提取水蛭素、重组水蛭素各类变异体，水蛭素的浓度范围l 10mg/ml;缓冲液pH范围6 9，离子交换柱中介质为交联葡聚糖或琼脂糖，交 换基团是季氨基，基质平均粒径范围30 90iim。(B) 将溶于a液中的活化PEG溶液泵入步骤A的柱中，至全部溶液充满柱 中，即停止流速。其中PEG与水蛭素摩尔比3:1 9:1， PEG分子量范围2kDa 35kDa之间，mPEG活化方式是琥珀酰亚胺碳酸酯活化法或者羰基二咪唑活化法。(C) 待反应15 120min后，用a液冲洗步骤B的离子交换柱，至无洗脱 物流出。然后用含有1 2M氯化钠或氯化钾的a液对步骤B柱子中物质进行梯 度洗脱，洗脱方式为梯度或阶段洗脱，洗脱时间30 120min。然后收集洗脱组 分。(D) 将步骤C中收集到的组分进行电泳(SDS-PAGE)分析，染色方法为碘 染，即针对PEG的染色方法。(E) 将步骤D中验证的单修饰组分用Lowry法测定蛋白浓度，凝血酶滴定 法测定活力，计算得到其体外比活力。测定活力时，以血纤维蛋白酶原为底物， 加入水蛭素，当凝血酶滴定至血纤维蛋白酶原凝结时为滴定终点，水蛭素活力 用滴定的凝血酶活力表征。本发明的效果和益处是整合反应和分离步骤，縮短操作时间，提高效率。 与传统的液相修饰相比，可以提高产物的单一性以及体外活性。与采用亲和策 略的固相修饰方法相比，简化操作步骤，无需寻找与蛋白相互作用的配基。
具体实施方式
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。实施例一4ml溶于0. 02M pH8磷酸盐缓冲液a中的水蛭素溶液，其浓度为1. 5mg/ml 上样于用相同缓冲液平衡的Hitr即Q HP 5ml预装离子交换柱(柱内微珠结构 为6%高度交联琼脂糖，孔径为34um，带电基团季氨基)，待没有洗脱物流出， 然后将4ml溶于缓冲液a中的琥珀酰亚胺活化mPEG5kDa (SOPEG國)溶液，上样于柱中，上样量与水蛭素摩尔比9:1，反应lh，反应结束后洗脱。洗脱时采 用线性梯度0 30。/。b液，其中b液为含有lMNaCl的a液。洗脱时间100min。手动收集各洗脱物，经电泳验证各洗脱组分，电泳染色方法为碘染。染色液为 0. 1M含有5X BaCh的I/KI溶液。染色时间4min，脱色时间12h。验证得到的 单修饰产物为mPEG5,-hirudin，其分子量为12kDa。比活测定中，蛋白浓度测 定采用Lowry法，修饰后产物活力测定采用凝血酶滴定法。体外比活保留率为 91%。实施例二4ml溶于0. 02M pH 8磷酸盐缓冲液a中的水蛭素溶液，浓度为1. 5mg/ml，上 样于用相同缓冲液平衡的Hitrap Q HP 5ml预装离子交换柱，待没有洗脱物流 出，然后将4 ml溶于缓冲液a中的琥珀酰亚胺活化的mPEG 20kDa (SC-PEG扁。) 溶液，上样于柱中，上样量与水蛭素摩尔比9: 1，反应lh，反应结束后洗脱。 洗脱采用线性梯度0 30% b液，其中b液为含有1M NaCl的a液。洗脱时间 60min。手动收集各洗脱物，经电泳验证各洗脱组分，电泳染色方法为碘染。染 色液为O. 1M含有5X BaCl2的I/KI溶液。染色时间4min，脱色时间12h。收集 到的单修饰产物产物为mPEG2。。。fhirudin，其分子量为27kDa。比活测定中，蛋 白浓度测定采用Lowry法，修饰后产物活力测定采用凝血酶滴定法。 mPEG2。。。。-hirudin体外比活保留率为96%。
权利要求
1. 一种利用阴离子交换柱辅助聚乙二醇修饰水蛭素的方法，其特征包括以下步骤(A)将溶于磷酸盐缓冲液a中的水蛭素上样于经相同缓冲液平衡的离子柱中，直至全部样品吸附于离子交换介质上，没有洗脱物流出为止；(B)将溶于a液中的活化聚乙二醇溶液上样于步骤A的柱中，至全部溶液充满离子柱，停止上样；(C)待反应结束后，用a液冲洗步骤B的反应离子柱，至无洗脱物流出；用含有氯化钠或氯化钾的a液对步骤B柱子中物质进行洗脱，并收集洗脱组分。
2. 根据权利要求1所述的一种利用阴离子交换柱辅助聚乙二醇修饰水蛭素的方 法，其特征在于，步骤A中的水蛭素包括天然提取水蛭素、重组水蛭素各类 变异体，其浓度范围l 10mg/ml;所使用离子柱为强阴离子交换柱，带电基 团为季氨基；柱中基质为交联葡聚糖或琼脂糖，平均粒径范围为30 90tim; 磷酸盐缓冲液a的pH范围为6 9，浓度20 50mM。
3. 根据权利要求1所述的一种利用阴离子交换柱辅助聚乙二醇修饰水蛭素的 方法，其特征在于，步骤B中聚乙二醇分子量在5 kDa到35kDa之间，优 选的聚乙二醇分子量为20 kDa;聚乙二醇的活化形式包括各种以修饰氮基 为目标的活化形式，如羰基二咪唑法活化，琥珀酰亚胺碳酸酯活化；聚乙二 醇与水蛭素摩尔比范围3:1 9:1，反应时间15 120min。
4. 根据权利要求1所述的一种利用阴离子交换柱辅助聚乙二醇修饰水蛭素的方 法，其特征在于，步骤C中洗脱缓冲液为含有1 2M氯化钠或氯化钾的a液， 洗脱方式为梯度洗脱，修饰产物先于原蛋白洗脱，洗脱时间60 120min。
全文摘要
一种利用阴离子交换柱辅助聚乙二醇(PEG)修饰水蛭素的方法，属于蛋白修饰技术领域。本发明的特征是采用离子交换柱辅助蛋白进行PEG修饰。反应pH为6～9，反应时间15～120min，水蛭素与PEG摩尔比1∶3～1∶9。离子交换柱为强阴离子交换柱，带电基团为季氨基。柱中基质为交联葡聚糖或琼脂糖，基质平均粒径范围30～90μm。本发明的效果和益处是简化蛋白修饰中反应和分离的步骤，相应减少各个步骤之间样品的损耗，洗脱水蛭素脱盐后可以回收。与传统的液相方式修饰相比，可以得到体外活性很高的单PEG化水蛭素。
文档编号C07K1/107GK101279999SQ20081001155
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月21日 优先权日2008年5月21日
发明者修志龙, 李晓晖, 李雪芹 申请人:大连理工大学