专利名称：：鲜地黄中分离梓醇的方法
技术领域：
：本发明涉及一种分离梓醇的方法，尤其涉及一种由鲜地黄中分离梓醇的方法。技术背景地黄是一种常用大宗中药材，需求量约20000吨/年，出口约1000吨/年。由于药效的差异，其可作为不同的药材入药，是典型的经过加工炮制而药性发生改变的药材；其分为鲜地黄、生地黄及熟地黄。鲜地黄清热生津，凉血止血，用于热病伤阴，舌绛烦渴；生地黄清热凉血，养阴生津，用于舌绛烦渴，阴虚内热；熟地黄滋阴补血，益精填髓，用于肝肾阴虚，血虚萎黄。梓醇属环烯醚萜葡萄糖苷类，现代药理实验证明，梓醇具有抗癌、神经保护、降血糖、缓泻、利尿、消炎、解痉等作用，是地黄的有效成分之一,是2005版《中国药典》生地黄的质量控制指标，梓醇在鲜地黄中含量最高(约1%),加工成生地黄后梓醇量大幅下降，炮制成熟地黄后梓醇几乎全部降解。对于梓醇的分离和制取，已有的报道多集中在从地黄中溶出梓醇程度方面，包括所用溶剂，提取时间，提取方法等因素，如李更生等[1将地黄切碎，用水加热回流lh,再用正丁醇提取，回收正丁醇后用甲醇溶解供试；都恒青等w将地黄切成小块，以甲醇回流提取lh;王宏洁等[3]将鲜地黄冷冻干燥后研成粉末(过40目筛)，以甲醇超声提取20min;边宝林等"]和郝武常等[5]均将地黄干燥后粉碎，过80目筛，以甲醇室温浸提2h;汪程远等[61将地黄切成小块，以水浸、超声提取多次；罗燕燕等7]将地黄切成小块，以20%乙醇浸泡15min，匀浆，匀浆液不时振摇，浸泡2h;赵新峰等[8]用剪刀将地黄样品剪碎，以乙醇加热回流0.5h。罗燕燕等w考察了提取溶媒和浸出时间的影响，分别以甲醇、水、15%乙醇、20%乙醇、30%乙醇和50%乙醇提取1、2、4、6、8、26h，高效液相色谱法测定梓醇含量。确定以20%乙醇浸提2h为最佳。张玲等[9〕以双波长薄层扫描法考察了地黄的提取工艺，比较了水提lh、2h、3h、4h、5h和95X乙醇提取2h、4h的梓醇含量，确定以水提取lh-2h梓醇含量最高。刘明等[1°]以梓醇为检测指标，采用高效液相色谱法，以4因素2水平正交试验设计考察了提取溶媒、提取方法、提取次数和溶媒用量等因素的影响，确定最佳工艺条件为用3倍量甲醇回流提取2次，回流时间为2h。李计萍等叫考察了水、甲醇以及10%、20%、50%、70%和95%乙醇作为溶媒，发现甲醇、20%乙醇和50%乙醇提取液中梓醇含量相差不大；同一地黄样品，分别以回流lh、超声lh、浸lh的方法处理，梓醇含量没有明显区别；同一样品超声处理IO、20、30、40、60min，梓醇含量也没有明显差异。宋子荣等^以HPLC为含量测定方法，采用重复-正交实验法，以乙醇浓度、溶剂量、提取时间和提取次数4个因素，每个因素选取3个水平进行实验，最好确定以60%乙醇8倍量，回流提取2次，每次1.5h为梓醇的较佳提取条件张汉忠[13等采用正交试验优选地黄醇浸提取工艺，以醇浸膏得率为考察指标，梓醇定性作参考，确定最佳提取工艺。确定地黄醇浸提取工艺用4倍量60%乙醇，提取3次，每次6d为最佳提取工艺。目前制备小量(毫克级或克级)高纯度(含量高于9890的方法多为实验室方法(如用常规植化分离手段——阴阳离子树脂等，低压层析等技术)，步骤繁琐，制备量小，或使用制备型高效液相色谱仪，但成本高，费时费力，制备量小，均不适宜工业规模化生产，如汪程远等[14]用天然澄清剂与非极性大孔吸附树脂联合应用分离生地黄中的梓醇。王慧森等采用反复硅胶柱层析色谱分离得到梓醇，步骤为地黄药材粉碎、乙醇浸泡、浓縮、D101大孔吸附树脂、硅胶柱层析等。李更生等[15]采低压柱层析法分离得到梓醇，但需反复富集且为毫克级。经检索，目前尚无厂家或单位提供公斤级纯度高于98%的梓醇报道。参考文献-[I]李更生，刘长河，王慧森，等.不同产地的地黄中梓醇含量比较[J].中草药，2002,33(2):126.[2]都恒青，李赵曦，刘根成，等.地黄的质量研究[J].中国中药杂志，1992,17(6):327.[3]王宏洁，边宝林，杨健，等.地黄中梓醇变化条件的探讨[J].中国中药杂志，1997,22(7):概[4]边宝林，杨健，王宏洁，等.不同干燥条件对鲜地黄中梓醇含量的影响[J].中国中药杂志，1996,21(6):346.[5]郝武常，朱宇红，朱志峰.炮制对地黄中梓醇含量的影响[J].中国中药杂志，1997,22(6):345.[6]汪程远，张浩，孟莉，等.HPLC测定地黄及其制剂中梓醇的含量[J].华西药学杂志，2003,18(2):134.[7]罗燕燕，张绍青，索建政，等.高效液相色谱法测定地黄中梓醇的含量[J].中国药学杂志，1994,29(1):38.[8]赵新峰，孙毓庆.毛细管区带电泳法测定地黄中梓醇的含量[J].药物分析杂志，2002，22(6):471.[9]张玲，徐新刚，时延增，等.地黄提取工艺研究[J].中草药，1998，29(5):308[10]刘明，李更生.鲜地黄中梓醇提取工艺[J].时珍国医国药，2000,11(4):301[II]李计萍，马华，王跃生，等.鲜地黄与干地黄中梓醇、糖类成分含量的比较[J].中国药学杂志，2001,36(5):300.[12]宋子荣，谭梓骏，陈西松，白海波.地黄提取工艺的优化，中国实验方剂学杂志[J]，2006,12:8.[13]张汉忠，张汉贞，邬阳.正交试验优选地黄醇浸提取工艺[J].中国医院药学杂志，2001，21(11):678.[14]汪程远，张浩，张承平，孟莉.生地黄中环烯醚萜类的纯化分离工艺[J].医药导报，2003,22(10):707.[15]李更生，王慧森，都恒青，等.液相层析法分离制备地黄降血糖成分梓醇[J].中医研究，1997,10(3):24。
发明内容针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种大量分离制备梓醇的方法，本发明方法步骤工艺简捷，设备简单，环保节能，适合工业化规模生产。本发明所述鲜地黄中分离梓醇的方法，由如下步骤实现(1)取鲜地黄，弃去霉烂部位，洗净，切成厚度为lmm2cra的切片；(2)立即将鲜地黄切片加热至40"C100X:,保温lmin120min;或直接用水蒸气热处理lmin120min;然后以3000rpm8000rpm转速匀浆5min20min;或者，立即将鲜地黄切片与其等重量的40'C1001C的热水混合，共同以3000rpra8000rpm转速匀桨5min20min;(3)常规过滤匀浆液，去除未破碎的鲜地黄组织及不溶性杂质，得含梓醇的样液；(4)取大孔吸附树脂湿法装柱，对含梓醇的样液进行大孔吸附树脂分离，上样液的重量与大孔吸附树脂体积比例为10g/L10kg/L;先以水洗脱，以molish反应结合TLC检査，至molish反应阴性，同时梓醇出现为止，更换洗脱溶剂为乙醇或甲醇，继续洗脱至无梓醇检出止，将收集的各份洗脱液分别以TLC检测，观察梓醇所在的部位，合并含梓醇的洗脱液，挥发结晶或者旋蒸得梓醇粗品；(5)取梓醇粗品以其体积量13倍的95%乙醇溶解，减压过滤，除去不溶的杂质得样液，然后取柱层析用硅胶湿法装柱，湿法上样，氯仿-甲醇=9:2洗脱，以梓醇标准品对照，TLC检测，合并收集的含梓醇的组分，挥干溶剂，得纯度为98%以上梓醇；或者，取梓醇粗品加入以其体积量12倍的4(TC60'C热甲醇，待完全溶解后滴入氯仿至刚出现晶体止，置20小时以上，减压抽滤，产物60X:干燥，重复此步2~5遍得梓醇纯品。上述鲜地黄中分离梓醇的方法中步骤(1)所述鲜地黄优选在切片前削皮，尽量除去鲜地黄中部白色和浅黄色菊花芯以外的部分(见图1)。上述鲜地黄中分离梓醇的方法中步骤(2)所述方法优选在无氧条件下进行，其中加热温度优选70。C100"C，保温30min90min;匀浆转速优选500O卬m6000rpm。上述鲜地黄中分离梓醇的方法中步骤(3)所述匀浆液若颜色较深，可加入其重量O.1%10%的活性碳吸附匀浆液，使溶液颜色变浅。上述鲜地黄中分离梓醇的方法中步骤(4)所述大孔吸附树脂优选是HPD-600、HPD~500、HPD-300、HPD-100型号中的一种或者几种等量混合；相对应树脂型号如D101树脂等系列'。上述鲜地黄中分离梓醇的方法中步骤(4)所述分离样品后的大孔吸附树脂优选用体积百分比浓度为20%以上的有机溶剂洗脱再生。其中所述有机溶剂优选是乙醇或甲醇。由于大孔吸附树脂需反复使用，故大孔吸附树脂需要后处理以进行下一批次的分离，大孔吸附树脂再生所需洗脱的溶剂为含量大于10%的乙醇、甲醇等相似有机溶剂。本工艺利用索氏提取器原理，可使溶剂循环使用，反复流洗树脂，节约了溶剂，减轻了工作量。具体装置见图2，右图为整体构造图，左图为局部。上述鲜地黄中分离梓醇的方法中步骤(4)所述洗脱溶剂乙醇或甲醇优选是体积百分比浓度为20%以上的乙醇或甲醇。上述鲜地黄中分离梓醇的方法中步骤(4)或(5)所述TLC检测采用薄层层析硅胶G，氯仿甲醇-l:l展开，茴香醛硫酸显色。上述鲜地黄中分离梓醇的方法中步骤(5)所述柱层析用硅胶优选是60目~100目的硅胶。本发明在国家自然科学基金(基金号30270101)资助下完成，因鲜地黄细胞中存在e-葡萄糖苷酶，本发明方法的关键技术在于对分解梓醇的酶进行灭活从而保证鲜地黄中本身含有的梓醇不被破坏进，进而进行后续分离，而从生地黄和熟地黄中提取梓醇，因其本身梓醇含量低，致使制备成本高。本发明方法可以极大限度的将梓醇和地黄中糖类部分(占鲜重的13%以上，是梓醇含量的十多倍，)分离从而为高纯梓醇的制备扫除障碍，本发明方法制备髙纯(含量大于98%)梓醇能力可达100kg/年，有望中试放大进行工业化生产，年生产能力达10吨，生产过程节能环保，生产成本大幅下降，可以为科研，新药开发，保健品研发提供原料保证。图1:鲜地黄横切片图，示鲜地黄中部白色和浅黄色菊花芯。图2:大孔吸附树脂用有机溶剂洗脱再生装置图，其中右图为整体构造图，左图为局部。具体实施方式实施例1:1)鲜地黄破碎匀浆取鲜地黄，弃去霉烂部位，洗净，削皮(除去鲜地黄中部白色和浅黄色菊花芯以外的部分)，切成厚度为lmra2cm的切片；在无氧条件下，立即将鲜地黄切片加热至8(TC100'C，保温70min80min;或直接用水蒸气热处理60min80min;然后以6000rpm转速匀桨10min;或者，立即将鲜地黄切片与其等重量的IOO'C的热水混合，共同以5000rpm转速匀浆20min;常规过滤匀浆液，去除未破碎的鲜地黄组织及不溶性杂质，得含梓醇的样液。2)大孔吸附树脂分离取大孔吸附树脂HPD-100约5kg湿法装柱，柱体积约5000mL。上样液1000ml，先以水洗脱，以molish反应结合TLC检査，至molish反应阴性，同时梓醇出现为止，更换洗脱溶剂为20%乙醇，继续洗脱至无梓醇检出止。将收集的各份洗脱液分别以TLC检测(薄层层析硅胶G，氯仿甲醇=1:1展开，茴香醛硫酸显色)，以梓醇标准品为对照，观察梓醇所在的部位，合并含梓醇的洗脱液，挥发结晶或者旋蒸得梓醇粗品；将对含梓醇的样液分离完毕的大孔吸附树脂以95%乙醇洗脱，使树脂再生。3)硅胶柱层析取梓醇粗品约20g以95%乙醇50ml溶解，减压过滤，除去不溶的杂质。取100g柱层析用硅胶(60-100目)拌样。取柱层析用硅胶2.0kg，湿法装柱湿法上样，氯仿-甲醇=9:2洗脱。以梓醇标准品对照，TLC检测，合并含梓醇的组分，挥干溶剂，得纯度为98%以上梓醇。或者4)重结晶取梓醇粗品加入以其体积量1.5倍的50r6(TC热甲醇,待完全溶解后滴入氯仿至刚出现晶体止，置20小时以上，减压抽滤，产物601C干燥，重复此步3遍得梓醇纯品。鲜地黄中梓醇提取分步收率见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2:0鲜地黄破碎匀浆取鲜地黄，弃去霉烂部位，洗净，削皮(除去鲜地黄中部白色和浅黄色菊花芯以外的部分)，切成厚度为lmm2cm的切片；立即将鲜地黄切片加热至4(TC5(TC，保温100min120min;或直接用水蒸气热处理90min;然后以5000rpm转速匀浆15min;或者，立即将鲜地黄切片与其等重量的60'C的热水混合，共同以5000rpm转速匀浆20min;常规过滤匀浆液，去除未破碎的鲜地黄组织及不溶性杂质，得含梓醇的样液。2)大孔吸附树脂分离取大孔吸附树脂HPD-100约5kg湿法装柱，柱体积约5000mL。上样液1000ral，先以水洗脱，以molish反应结合TLC检査，至molish反应阴性，同时梓醇出现为止，更换洗脱溶剂为30%乙醇，继续洗脱至无梓醇检出止。将收集的各份洗脱液分别以TLC检测(薄层层析硅胶G,氯仿甲醇=1:1展开，茴香醛硫酸显色)，以梓醇标准品为对照，观察梓醇所在的部位，合并含梓醇的洗脱液，挥发结晶或者旋蒸得梓醇粗品；将对含梓醇的样液分离完毕的大孔吸附树脂以95%乙醇洗脱，使树脂再生。3)硅胶柱层析取梓醇粗品约20g以95%乙醇50ml溶解，减压过滤，除去不溶的杂质。取100g柱层析用硅胶(60"100目)拌样。取柱层析用硅胶2.Okg，湿法装柱湿法上样，氯仿-甲醇=9:2洗脱。以梓醇标准品对照，TLC检测，合并含梓醇的组分，挥干溶剂，得纯度为98%以上梓醇。或者4)重结晶取梓醇粗品加入以其体积量1倍的40r热甲醇，待完全溶解后滴入氯仿至刚出现晶体止，置20小时以上，减压抽滤，产物601C干燥，重复此步5遍得梓醇纯品。实施例3:1)鲜地黄破碎匀浆取鲜地黄，弃去霉烂部位，洗净，削皮(除去鲜地黄中部白色和浅黄色菊花芯以外的部分)，切成厚度为lram2cm的切片；立即将鲜地黄切片加热至100'C，保温20min;或直接用水蒸气热处理30min;然后以8000rpm转速匀浆5min;或者，立即将鲜地黄切片与其等重量的8(TC的热水混合，共同以6000rpm转速匀浆20min;常规过滤匀浆液，去除未破碎的鲜地黄组织及不溶性杂质，得含梓醇的样液。2)大孔吸附树脂分离取大孔吸附树脂HPD-IOO约5kg湿法装柱，柱体积约5000mL。上样液1000ml，先以水洗脱，以molish反应结合TLC检査，至molish反应阴性，同时梓醇出现为止，更换洗脱溶剂为30%乙醇，继续洗脱至无梓醇检出止。将收集的各份洗脱液分别以TLC检测(薄层层析硅胶G，氯仿甲醇-l:l展开，茴香醛硫酸显色)，以梓醇标准品为对照，观察梓醇所在的部位，合并含梓醇的洗脱液，挥发结晶或者旋蒸得梓醇粗品；将对含梓醇的样液分离完毕的大孔吸附树脂以95%乙醇洗脱，使树脂再生。3)硅胶柱层析取梓醇粗品约20g以95%乙醇50ml溶解，减压过滤，除去不溶的杂质。取100g柱层析用硅胶(60-100目)拌样。取柱层析用硅胶2.Okg，湿法装柱湿法上样，氯仿-甲醇=9:2洗脱。以梓醇标准品对照，TLC检测，合并含梓醇的组分，挥干溶剂，得纯度为98%以上梓醇。或者4)重结晶取梓醇粗品加入以其体积量1倍的60C热甲醇，待完全溶解后滴入氯仿至刚出现晶体止，置20小时以上，减压抽滤，产物60"C干燥，重复此步4遍得梓醇纯品。权利要求1.一种鲜地黄中分离梓醇的方法，由如下步骤实现(1)取鲜地黄，弃去霉烂部位，洗净，切成厚度为1mm～2cm的切片；(2)立即将鲜地黄切片加热至40℃～100℃，保温1min～120min；或直接用水蒸气热处理1min～120min；然后以3000rpm～8000rpm转速匀浆5min～20min；或者，立即将鲜地黄切片与其等重量的40℃～100℃的热水混合，共同以3000rpm～8000rpm转速匀浆5min～20min；(3)常规过滤匀浆液，去除未破碎的鲜地黄组织及不溶性杂质，得含梓醇的样液；(4)取大孔吸附树脂湿法装柱，对含梓醇的样液进行大孔吸附树脂分离，上样液的重量与大孔吸附树脂体积比例为10g/L～10kg/L；先以水洗脱，以molish反应结合TLC检查，至molish反应阴性，同时梓醇出现为止，更换洗脱溶剂为乙醇或甲醇，继续洗脱至无梓醇检出止，将收集的各份洗脱液分别以TLC检测，观察梓醇所在的部位，合并含梓醇的洗脱液，挥发结晶或者旋蒸得梓醇粗品；(5)取梓醇粗品以其体积量1～3倍的95％乙醇溶解，减压过滤，除去不溶的杂质得样液，然后取柱层析用硅胶湿法装柱，湿法上样，氯仿-甲醇＝9∶2洗脱，以梓醇标准品对照，TLC检测，合并收集的含梓醇的组分，挥干溶剂，得纯度为98％以上梓醇；或者，取梓醇粗品加入以其体积量1～2倍的40℃～60℃热甲醇，待完全溶解后滴入氯仿至刚出现晶体止，置20小时以上，减压抽滤，产物60℃干燥，重复此步2～5遍得梓醇纯品。2.如权利要求1所述鲜地黄中分离梓醇的方法，其特征是步骤(l)所述鲜地黄在切片前削皮，除去鲜地黄中部白色和浅黄色菊花芯以外的部分。3.如权利要求1所述鲜地黄中分离梓醇的方法，其特征是步骤(2)所述方法在无氧条件下进行。4.如权利要求1所述鲜地黄中分离梓醇的方法，其特征是步骤(3)所述匀浆液若颜色较深，加入其重量0.01%10%的活性碳吸附匀浆液，使溶液颜色变浅。5.如权利要求1所述鲜地黄中分离梓醇的方法，其特征是步骤(4)所述大孔吸附树脂是HPD-600、HPD-500、HPD-300、HPD-100型号或者相对应型号中的一种或者几种等量混合。6.如权利要求1所述鲜地黄中分离梓醇的方法，其特征是步骤(4)所述分离样品后的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为20%以上的有机溶剂洗脱再生。7.如权利要求6所述鲜地黄中分离梓醇的方法，其特征是所述有机溶剂是乙醇或甲醇。8.如权利要求1所述鲜地黄中分离梓醇的方法，其特征是步骤(4)所述洗脱溶剂乙醇或甲醇是体积百分比浓度为20%以上的乙醇或甲醇。9.如权利要求1所述鲜地黄中分离梓醇的方法，其特征是步骤(4)或(5)所述TLC检测采用薄层层析硅胶G，氯仿甲醇-l:l展开，茴香醛硫酸显色。10.如权利要求1所述鲜地黄中分离梓醇的方法，其特征是步骤(5)所述柱层析用硅胶是60目300目的硅胶。全文摘要本发明公开了一种鲜地黄中分离梓醇的方法，由鲜地黄破碎匀浆得含梓醇的样液；大孔吸附树脂分离；硅胶柱层析或重结晶步骤实现。本发明方法可以极大限度的将梓醇和地黄中糖类部分分离从而为高纯梓醇的制备扫除障碍，本发明方法制备高纯梓醇能力可达100kg/年，且生产过程节能环保，生产成本低，可以为科研，新药开发，保健品研发提供原料保证。文档编号C07H17/04GK101265282SQ20081001600公开日2008年9月17日申请日期2008年5月5日优先权日2008年5月5日发明者刘彦飞,温学森,宇赵申请人:山东大学