判断神经原纤维变性分期的方法

专利名称：：判断神经原纤维变性分期的方法判断神经原纤维变性分期的方法本申请是中国发明专利申请(申请日2002年3月20日；申请号02810291.6(国际申请号PCT/GB02/01318);发明名称神经原纤维标记物)的分案申请。发明领域本发明涉及广泛地用于神经纤维缠结标记及检测的材料、方法及模型。此外，还涉及适于神经病理分期的配体的鉴定及开发以及及其在诸如阿尔茨海默病的诊断、预后及治疗中的用途。
背景技术：
：神经病理分期及AD由Braak(Braak，H等(1991)，Acta.Neuropathol.82，239-259)提出的神经病理分期提供了相对单纯的阿尔茨海默型神经原纤维退化的最佳定义，其可用于AD的诊断(Wischik等(2000)，"NeurobiologyofAlzheimer'sDisease",Eds.Dawbarn等，TheMolecularandCellularNeurobioloySeries,BiosScientificPublishers，Oxford)。在图2B中，示意性地从脑区的角度显示了这种分期，其基于神经原纤维缠结(NFT)的有序区域层次而进行。较早出现层次的脑区与较晚出现层次的脑区相比，具有更多的缠结及更少地侵袭严重病例。AD、痴呆症与神经病理学分期之间的关系Braak分期提供的有效前期评估可用于AD的评估和治疗，其常需与下列病症相鉴别，包括Lewy体痴呆、帕金森病、各种形式的额颞及皮质基底变性、进行性核上性麻痹以及一些少见的神经综合征。Braak原型基本上仅是定性的，还没涉及痴呆症及症状发展的阈值。按照DSM-IV标准评定的痴呆症出现，统计学上，其介于Braak3期与4期的过渡阶段(图2c)。DSM-IV标准(DiagnosticandStatisticalMa丽lofMentalDisorders,IV片反，AmericanPsychiatriAssociation,AmericanPsychiatricPress，WashingtonDC(1994))定义的痴呆症相当于匪SE定义的(MiniMentalStateExamination)约18的临界值，其发病率大约占65岁以上人口的5%(65岁以上人口约占总人口的17%)。Gertz等((1996)Eur.Arch.PsychiatryClin.Neurosci.246，132-6))采用从常规检查到尸检的手段研究病例，其临床特征严格依据CAMDEX进行描述(Roth等，1988，"剑桥老年人精神病测试"剑桥大学出版社)。在排除尸检发现的患不同程度血管疾病的所有病例后，根据Braak标准进行尸检分期，在该过渡值处仍有约三分之一的病例不能确定。即约三分之一具有AD临床诊断的病例实际处于Braak分期的早期(1_3期)，其罹患血管疾病或合并Lewy体病症。因此，即使是最佳的研究实施规范仍存在很高的不确定性。在AD的常规临床诊断中，实际存在的神经病理学底物甚至更不可靠。最近有报道称，给经临床及神经病理学确诊的阿尔茨海默病的病例注射FDDNP分子(FDDNP，2-(l-{6-[(2-[18F]氟乙基)(甲基)氨基]_2-萘基}亚乙基)丙二腈)后，PET显影表明，其在中颞叶脑区(海马，内嗅皮质及扁桃体)有较长的相对保留时间(RRT)(Shoghi-Jadid等，Am.J.Geriatr.精神病学2002，10:24-35)。尽管该化合物结合NFTs及淀粉样斑块的情况已被讨论，但与NFTs的结合情况并不清楚，尽管在体外其对合成的P_淀粉样原纤维具有很高的亲和力。在排除血管疾病的神经疾病患者中，将病例与相应的匪SE评分确定的疾病严重程度相匹配后，发现Shoghi-Jadid等报道的RRT值与斑块计数具有相关性，但与神经原纤维缠结病理测量不相关，结果如下。Spearman秩相关系数MTLAPGlobalAPMTLNFTGlobalNFTRRT0.665**0.654**0.2440.189p<0.01<0.01>0.1>0.1Pearson相关系数MTLAPGlobalAPMTLNFTGlobalNFTRRT0.602*0.596*0.2660.275P<0.05<0.05>0.3>0.3此处，参数定义如下MTLAP指中颞叶淀粉样斑块GlobalAP指12脑区内平均淀粉样斑块负荷MTLNFT指中颞叶神经原纤维缠结GlobalNFT指12脑区内平均神经原纤维缠结负荷然而，|3淀粉样沉积不能区分正常的年龄相关老化与阿尔茨海默病(此处参见图2d)，并且l3淀粉样沉积不能提供神经病理学分期的合理基础。因此，FDDNP-RRT不能作为阿尔茨海默病体内神经病理学分期的方法。尽管借助更特异的神经心理学指示手段(如分散注意力法、样本的延迟匹配等)，临床方法的进一步改进可能提高临床诊断的准确度，然而，其基本难题在于开发能够直接检测生命过程中潜在的神经病理学的方法，尤其是能够直接检测阿尔茨海默型神经原纤维变性的程度。神经原纤维变性及t的进展如上所述，基于t相关的AD病理学是表型的主要特征。其与神经元破坏的程度高度相关(Wischik等综述(2000)loccit)。据信，在细胞水平上，从t到NFTs形成进程如下。在NFTs形成及聚集过程中，成对螺旋丝(PHFs)首先在胞浆中聚集成丝，其可能源于PHF聚集之前进程中截短的早期t寡聚体(见参考文献26、27)。随后，形成经典的细胞内NFTs。此时，PHFs由截短的t的核心及包含全长t的绒状外层组成(Wischik等(2000)1oc.cit.)。该聚集过程呈指数级进行，消耗细胞库中的正常功能t并诱导合成新的t以弥补不足(参考文献29)。最终，神经元的功能损伤发展至细胞死亡，产生细胞外的NFT。细胞死亡与细胞外NFTs的数目高度相关(Bondaref，W.等(1993)Arc.Gen.Psychiatry50:350-6)。当外部神经元胞膜被破坏后，NFTs释放入细胞外空间，导致神经元的绒状外层的进行性丧失，同时伴随相应的N端t免疫反应活性的丧失，但保留了与PHF核相关的t免疫反应活性(图3;参考文献30)。在聚集过程中，t蛋白的重复结构域发生构象变化，同时伴随半重复相移(见参考文献32、33)。生成了蛋白水解稳定片段，其与成对螺旋丝(PHFs)核心处发现的片段完全相同，该成对螺旋丝构成典型AD的神经原纤维缠结特征。与其它蛋白聚集体系类似地，该过程极有可能涉及a螺旋至P链的构象改变(Wischik等综述(2000)1oc.cit.)。因此，一般说来，t的聚集可分为三期细胞内寡聚体；细胞内成丝(图3中的1期)以及细胞外成丝(图3中的第2和3期)。然而，迄今，仍未找到这些阶段之间确切的相关性，各阶段发生在细胞水平且可能不同脑区具有不同的速率以及具有不同的概率，以及具有不同的上述的Braak层次的病理进程，Braak系统是最佳的现有相对单纯神经原纤维变性的限界。评估AD的创伤性方法腰椎穿剌CSF检测能够区别AD、对照及其它神经疾病，但腰椎穿剌较之核医学途径更具有创伤性，且风险更大(见参考文献1721)。EEG神经学诊断也已发展起来(参考文献2225)，但在这方面仍缺乏可资医师使用的廉价操作器械。脑萎縮性神经原纤维变性——SPECT及PET已有大量研究表明，全大脑萎縮及特定的中颞叶萎縮，尤其是海马回，与潜在的阿尔茨海默型神经原纤维变性密切相关，并对于早期AD诊断非常宝贵(见参考文献1-8)。然而，尽管通过监测全大脑萎縮诊断AD可作为研究的方法，但在定义及检测特定脑区的萎縮方面仍存在困难，同样地，这些困难在检测全大脑新皮质萎縮也会存在。在任何情况下，基于可检测的萎縮作出的诊断将延误有效治疗。近年来，随着SPECT扫描(参考文献9-12;HMPAOSPECT检测灌注损伤的特征类型)、PET扫描(参考文献13-15;以葡萄糖代谢特征检测代谢缺损)以及MRI扫描(参考文献16;全大脑萎縮，脑叶萎縮的特征类型)诊断特征的认识，诊断在方法学上已有进展。在这些手段中，以MRI与SPECT最为可行，因为PET目前仅限于当地拥有特定的回旋加速器的中心使用，且这些中心需具备制备短半衰期的可注射放射配体的放射的化学条件(Aberdeen,London,CambridgeinUK)。值得指出的是，HMPAOSPECT检测到的AD患者中特征性的早期颞顶灌注损伤与经生物化学测定的t病理学类型密切一致(图1)。生物化学变化先于NFTs明显神经原纤维变性的出现(图2;Mukaetova-Ladinska等，2000美国病理学杂志Vol.157，No.2,623-636)。然而，尽管MRI及SPECT扫描可用于检测具有AD的灌注损伤的特定类型，但是，辨别不同神经病理分期或辨别AD与其它类型的痴呆症仍然十分困难。例如，SPECT可用于检测具有AD特征的双侧颞顶灌注损伤的特定类型(见参考文献9-ll)，其甚至可用于极早期疾病的检测。然而，SPECT变化区分神经病理分期的效果很差(参考文献12)。此外，其区别AD与Lewy体痴呆也相当困难。由于两者都具有双侧颞顶灌注损伤，但仅后者存在枕骨灌注损伤的倾向。同种类型的损伤可经PET检测葡萄糖代谢证实(参照文献1315)，但识别Lewy体痴呆的困难一直存在。因此，从参考文献12的数据可以推断出，SPECT成功检测出Braakl&2期病例的概率是50%、3&4期的概率是60%。仅在5&6期病例，SPECT阳性的概率是95%。相反地，SPECT阳性检测病例处于l&2期的概率为20%，3&4期为20%或5&6期为60%。因此，SPECT不能检测40-50%的4期以前的目标人群，因而无法提供早期的诊断及治疗干预。进一步的研究表明(未显示数据)，SPECT诊断与临床诊断的总体一致率为50%。因而，在发展具体针对阻止阿尔茨海默型神经原纤维变性的治疗时，极其需要同时开发筛选治疗病人的非侵入行方法，以及根据明确及可重复的定义进行治疗以及监测治疗反应。
发明内容发明概述本发明使用免疫化学特性(见参考文献26、27、30)以区分细胞内缠结与细胞外缠结。在前瞻性病例组中，测定了两类缠结病例的频率(即概率)及数目(即计数/mm2)，并按照Braak系统将其分入代表病理进程分期的脑区。详述如下，这些抗体研究首次证实，通过采用细胞内外特异性的比较，在定义的脑区，PHF-t沉积为AD神经原纤维变性的经验分期提供了基础。因而，本发明一方面提供了一种测定t蛋白疾病(tauopathy)(如AD)相关的神经原纤维变性分期的方法，其用于据信罹患该疾病的研究对象，该方法包括如下步骤(i)将能标记聚集PHFt蛋白的配体引入研究对象，(ii)测定研究对象脑中颞叶处与细胞外聚集PHFt相结合的配体是否存在及/或其量，(iii)将(ii)中测定的结果与患者中神经原纤维变性的程度进行关联。如简介中所述，神经原纤维变性的进展具有确定的Braak神经病理学分期，其反过来又是AD进展的已知最佳的神经病理学定义。因此，本发明方法可用于提供真实的Braak分期结果。在优选实施方案中，其可用于诊断Braak早期阶段(例如Braak第2期)的患者，该诊断甚至在临床指征显现之前即可用于提供直接及时的治疗和建议。有趣的是，Gertz等基于NFTs的免疫检测结果(1996，loccit)，该结果不能区分细胞内、外缠结，也不能表明发狂对象(一般为Braak4_6期)与非发狂对象(一般为Braakl-3期)颞叶结构中测定的缠结数目之间的差异(参见图l及表2，相关结构为标记的Prealphaent.，CAl，PriEnto.)。因而，本发明证实的相关性特别令人惊讶！本发明进一步提供了用于标记t聚集物的新型配体，此外，也提供了发现这些配体的新筛选方法。现详细阐述本发明上述的一些方面。对象选择本方法的合适对象的选择可基于传统因素进行。因而，患者的最初选择可能涉及一或多个下列因素经验丰富的医师作出的严格评估；以辅助实验室检查或其它检查尽可能排除非AD诊断；使用神经病理学认可的方案客观评估认知功能水平。配体配体能够标记聚集PHFi，后者形成如上所述。配体可特异地或优先地与t结合(优先结合脑部相关区域的竞争结合位点)。适合的配体(包括新配体)及其识别方法如下。更具体说来，本发明公开，即基于此处描述的方法评估Braak分期，在选择和/或发展用于诊断标记的配体方面具有重大意义。免疫方法具有缺陷，即抗体不易以定量方式穿过血脑屏障，此外，由于抗体注入体内将引发副反应，因而该方法不适合用于临床。因此，基于活体中免疫反应活性的不同类型来区别t聚集不同分期是十分困难的。8因此，本发明的发明人考察了与神经原纤维缠结相结合的化合物的重要化学特征。他们在此提供了结合所需要的最小化学结构，在开发用于神经原纤维缠结的化合物中具有重要意义，这些方法、应用及化合物构成了本发明的另一方面。优选的配体，包括新型配体此后详细公开，尤其是包括磺化苯并噻唑类化合物(参见如图4a)，二氨基吩噻嗪类化合物(参见如图8)以及具有这些化合物中任一种共有的合适的最小化学结构的类似化合物。组合物形成了本发明的多种方面，所述组合物包括此处公开的配体组合(优选可区别的配体，如从标记的角度而言)和/或配体与阻断剂的组合(如下)，或其由这些组合组成。与细胞外t结合上述(ii)的测定基于细胞外聚集t。总的说来，在本发明中，其可通过细胞外缠结测定(参见例如参考文献26、27及实施例、方法及材料、表)。先前的组织学研究表明，在聚集过程中，t蛋白需要与诸如噻嗪红及硫黄素-S的结合位点(见参考文献26、27)。已知结合位点位于缠结内部而非外源蛋白内(参考文献34)。因而，细胞内及细胞外缠结都在一定程度上被配体标记，如组织学所判定。—般说来，细胞外结合位点(相对于总的结合位点或细胞内结合位点)的概率或数量既可使用太大不易进入细胞内的配体测定，也可使用可在细胞内起作用的配体，其既定浓度(相对较低)，在该浓度下细胞外的结合作用更有利。大螯合配体，例如，那些易经SPECT检测的配体，其至少应可到达合适的细胞外耙标并与之结合。直接为PET标记的化合物可潜在地检测细胞内或细胞外的靶标，后者在低浓度时更有利。因而，本发明者的工作表明，当使用合适的缠结结合配体时，这两种检测方法在Braak分期上都有应用潜力。尽管如此，根据本发明，为方便地以NFT计数评估Braak分期，应意识到采用下述配体是重要的，即配体不但能穿过血脑屏障并特异地标记细胞内或细胞外沉积的t聚集物，而且优选地在与其他化合物结合时能够保持其这种特性。然而，勿庸置疑，配体可经任何合适的手段显现或检测，本领域普通技术人员将意识到能够用本领域任何合适的检测手段替代这些实例。优先的t结合增强在本发明的一个实施方案中，步骤(i)和/或(ii)再增加一个步骤(优选在前)进行，即向研究对象再引入第二种配体，该配体竞争标记脑中相关区域(即非聚集t)结合位点，该标记与位点结合优于第一种配体。因而，这些方法及此处的其它实施方案可包含步骤(ibis)将阻断配体引入研究对象，其标记对象脑部非聚集t结合位点，该结合优于与能够标记聚集PHFi的配体的结合。竞争结合位点可由诸如淀粉样斑块提供，如可存在于患者体内。通过引入第二配体(或可指为阻断配体)，与聚集t结合的第一配体的相对或有效浓度得到增强。合适的第二配体如下述，其尤其包括苯并噻唑类，例如图5所示的化合物1B及2。另一种合适的阻断剂是前述的FDDNP(Shoghi-Jadid等，Am.J.Geriatr.Psychiatr.2002，10:24-35)脑区中颞叶的意义，即图25、27及29所示的脑E2/Trans(内嗅皮质层2/过渡性内嗅皮质层)，E4/HC(内嗅皮质层4及海马)区，还包括大脑新皮质结构(F/T/P区域-额叶、颞叶及顶叶)。在一个实施方案中，该方法仅包括分析中颞叶细胞外NFTs的数据。在另一实施方案中，分析了该区域及大脑新皮质结构的数据。在后一种情况中，优选分析细胞内的PHF沉积。因而，此处的方法及其它实施方案可再包括一步骤(iib)另外地测定研究对象的大脑新皮质结构处与细胞内聚集PHFt结合的配体存在和/或配体的量，随后的步骤为(iii)将(ii)及任选(iib)中测定的结果与患者神经原纤维变性的程度进行关联，藉此可确定患者的AD状态。原则上，用于细胞内标记的配体可与细胞外标记的配体一样，但优选不同和/或标记有区别(如此，其可经任何可用的显影方法区别)。尤其优选额外步骤，以其评估或确证Braak2-6期的神经原纤维变性。神经原纤维变性的确定既定区域存在的结合可确定神经原纤维变性。该测定然后可涉及无病理特征的病例(即假定Braak分期为l的病例)的正常值范围，或参考值范围，其已经测定了连续Braak分期，用于确定测定值对应的既定神经病理学分期。该相关可借助于查阅表或图完成，如，基于实施例1中的图及表1表征密度的数据。此外，给定的测定可能涉及参考既定的阈值，病例处于l期后某个分期的概率(例如，基于相应概率表的数据)，因此，给出概率有助于阿尔茨海默病的正确诊断。方法的使用测定可作为诊断和预后方法的一部分。其可用于治疗患者的选择，或者评估处理或治疗的效果，如对患者施用t-t组合抑制剂。本发明相关实施方案包括—种能够标记细胞外聚集PHFt配体，其在患者AD诊断或预后方法中的用途，所选研究对象据信罹患疾病，该方法包括如下步骤(i)将标记聚集PHFt的配体引入研究对象，(ii)测定研究对象脑中颞叶处与细胞外聚集PHFt相结合的配体的存在及/或其(iii)将(ii)中测定的结果与研究对象神经原纤维变性的程度进行关联，并因此可确定患者的AD状态。。—种能够标记细胞外聚集PHFt配体在制备诊断或预后试剂的方法中用途，该试剂适用于确证AD相关神经原纤维变性的分期，所选研究对象据信罹患疾病，该方法包括如下步骤(i)将能标记聚集PHFt该试剂引入受试对象，(ii)测定受试对象脑中颞叶处与细胞外聚集PHFt相结合的试剂的存在及/或其(iii)将(ii)中测定的结果与研究对象神经原纤维变性的程度进行关联。本发明另一方面提供了一种实施上述应用及方法的试剂盒，包含一或多种本发明7/41页提供的配体或衍生物，该配体或衍生物可与聚集分子相结合。其可包含能够增加这些化合物检测能力的物质，如锝螯合基团，以及任选能与配体偶联结合的物质，以及任选锝。此处，试剂盒包含本发明公开的化合物的衍生物，其可经由诸如荧光检定，如本发明说明书其他地方所讨论。试剂盒也可包含检测或显现配体的方法，例如，此处配体引入生物素基团，试剂盒优选包含抗生物素抗体。类似地，试剂盒可包含检测化合物固有荧光的方法，检测光敏性基团以及标记的抗体的方法等。现将本发明中的方法及其它实施方案中使用的各种优选配体予以详述。在每种情况下，本领域技术人员将意识到不直接应用配体，而是使用前体形式，其再经存在于，或施用于同一对象体内的活化剂作用转变为活性形式。磺化-苯并噻唑类配体用于本发明该方面的合适配体，为具有下列通式的化合物$03MRL—Ar其中W为S、0或NH;X、Y及Z之一为CH或NX、Y及Z中其它的为CHM1为碱金属阳离子；RL为刚性连接基团；A为Cs2。芳基；n为03的整数；且，每个RBT为核心取代基。在一个实施方案中，各xY及Z为CH，并且所述化合物具有下式结构$03M在一个实施方案中，X为N;Y及Z各为CH;并且所述化合物具有下式结构S03M在一个实施方案中，Y为N;X及Z各为CH;并且化合物具有下式结构S03M在一个实施方案中，Z为N;X及Y各为CH;并且所述化合物具有下式结构$03M在-在-在-在-在-在-在-在-在-RL——Ar在一个实施方案中，w为s，并且所述化合物具有下式结构S03MRL——Ar在一个实施方案中，w为0，并且所述化合物具有下式结构S03M,RL——Ar在一个实施方案中，W为NH，并且所述化合物具有下式结构$03M-个实施方案中，-个实施方案中，-个实施方案中，-个实施方案中，-个实施方案中，-个实施方案中，-个实施方案中，-个实施方案中，-个实施方案中，X、Y及Z各为CH;并且W为S。X、Y及Z各为CH;并且W为0。X、Y及Z各为CH;并且W为NH。X为N;Y及Z各为CH;并且W为S。X为N;Y及Z各为CH;并且W为0。X为N;Y及Z各为CH;并且W为NH。Y为N;X及Z各为CH;并且W为S。Y为N;X及Z各为CH;并且W为0。Y为N;X及Z各为CH;并且W为NH。12在一个实施方案中，Z为N;X及Y各为CH;并且W为S。在一个实施方案中，Z为N;X及Y各为CH;并且W为0。在一个实施方案中，Z为N;X及Y各为CH;并且W为NH。包含W、X、Y及Z的二环基团表示为"核心基团"。当X、Y及Z各为CH，并且W为S时，化合物可视为苯并噻唑化合物，并可认为具有苯并噻唑核心基团。"核心取代基"因而指"苯并噻唑取代基"。用于本发明该方面的优选配体，为式(I)的化合物其中M工为碱金属阳离子；RL为刚性连接基团；A为Cs2o芳基；n为03的整数；并且，每个RBT独立地为苯并噻唑取代基。刚性连接基团RL及芳基Ar1基本上都是共平面的。此外，刚性连接基团RL，芳基Ar1以及核心基团(例如，苯并噻唑基团)共同形成基本上是共平面的化合物。"基本上共平面"是指化合物部分或整体具有高度的共平面性，例如，使用标准化学模型及假设定量计算，其中各部分之间的扭曲小于5、4、3、2或r。优选的扭曲程度不超过图16化合物的扭曲度数。在一个实施方案中，化合物长度为约14.7AU15.3AU。本发明的发明人已确定具有上述特征的化合物尤其适于发明中的Braak分期方法。这些化合物可为本领域的已知化合物，也可为新化合物，详述如下。"化合物长度"指两个相距最远芳香环原子(指"参考原子")之间的距离，例如苯并噻唑化合物，在分子的苯并噻唑"端"，参考原子为标示的二个原子之一在分子的芳基"端"，当Ar1为具有苯核的芳基(见下)时，参考原子为标示的三个原子之一13此处{吏用的"足巨离，，可用'ChemicalDatabaseService'，Daresbury及CambridgeStructureDatabase,使用'化学结构搜索及检索软件'进行计算。这些数据及软件在公共领域可得到。在一个实施方案中，M为Li、Na、K或Cs。在一个实施方案中，M为Na或K。在一个实施方案中，n为0。在一个实施方案中，n为1。在一个实施方案中，n为2。在一个实施方案中，n为3。在一个实施方案中，每个RBT独立地选自Q4烷基、羟基、(V4烷氧基、硝基、氰基、卤素及氨基。在一个实施方案中，每个RBT独立地选自-Me、-Et、-nPr、-iPr、_0H、-OMe、-OEt、-0(nPr)、-0(iPr)、-N02、-CN、-F、Cl、-Br、-I、_NH2、-NH2、-NHMe、-NHEt、-NH(iPr)、-NH(nPr)、_NMe2、-NEt2、N(iPr)2及-N(nPr)2。在一个实施方案中，每个1^独立地选自C卜4烷基。在一个实施方案中，每个RBT选自-Me，-Et，nPr，及-iPr。在一个实施方案中，每个RBT为_Me。在一个实施方案中，n为1及RBT为-Me、-Et、-nPr或-iPr。在一个实施方案中，n为l及RBT为-Me。在一个实施方案中，化合物具有下式结构SO,M个实施方案中，化合物具有下式结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>个实施方案中，RL为如下式的基团<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中m为04的整数，及每个独立地为刚性连接基芳基取代基，并且化合物具有下式结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>在-在-在-在-在一个实施方案中，m为1。在一个实施方案中，m为3。-个实施方案中，m为O-个实施方案中，m为2-个实施方案中，m为4。-个实施方案中，每个Rm独立地选自Q烷基、羟基、(V4烷氧基、硝基、氰基、在一个实施方案中，每个RKL独立地选自-Me、-Et、-nPr、-iPr、_0H、-OMe、-OEt、_0(-I、_NH2、-NH2、-NHMe、-NHEt、-NH(iPr)、-NH(nPr)、-NMenPr)、-0(iPr)、_N022、_NEt2N(iPr)2及在-在--CN、-F、Cl、-Br、--N(nPr)2。-个实施方案中，每个Rm独立地选自C卜4烷基。-个实施方案中，RL为具有下式结构的基团N—在一个实施方案中，RL为具有下式结构的基团其中p为0物具有下式结构3的整数，并且每个独立地为刚性连接基芳基取代基，并且化合S03M在一个实施方案中，p为0。在一个实施方案中，p为1。在一个实施方案中，p为2。在一个实施方案中，p为3。在一个实施方案中，每个R^独立地选自C卜4烷基、羟基、C卜4烷氧基、硝基、氰基、卤素及氨基。在一个实施方案中，每个RKL独立地选自-Me、_Et、-nPr、-iPr、_0H、_0Me、_0Et、_0(nPr)、-0(iPr)、-N02、-CN、-F、Cl、-Br、-I、_NH2、-NH2、-NHMe、-NHEt、-NH(iPr)、-NH(nPr)、_NMe2、-NEt2、N(iPr)2及-N(nPr)2。在一个实施方案中，每个R^独立地选自Q—烷基。在一个实施方案中，RL为具有下式结构的基团芳基Ar1为C52。芳基。此处使用的术语"(:52。芳基"为从C52。芳香化合物的芳环原子上脱去一个氢原子形成的单价基团，该芳香化合物含有一个或二个或多个环(例如，稠合)，并有520个环原子，其中，至少一个环为芳香环。优选地，每个环含有57环原子。"(:52。"指环原子，或为碳原子或为杂原子。环上无杂原子的C卜2。芳基(即C卜2。碳芳基)的实例包括，但不限于衍生自苯(即苯基)(Ce)、萘(Q。)、蒽(CJ、菲(CJ、并四苯(C18)以及芘(C卜6)的基团。C52。杂芳基的实例包括，但不限于，C5杂芳基，其衍生自呋喃(oxole)、噻吩(thiole)、妣咯(azole)、咪唑(1，3-二唑)、妣唑(1，2_二唑)、三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、噁二唑及噁三唑；以及C6杂芳基，其衍生自异噁嗪、妣啶(吖嗪)、哒嗪(1，2_二嗪)、嘧啶(1，3-二嗪、如胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶)、吡嗪(1，4-二嗪)、三嗪、四唑及噁二唑(呋咱)。包括稠环的C卜2。杂环基团(包括C卜2。杂芳基)的实例包括，但不限于，Q杂环基团，其衍生自苯并呋喃、异苯并呋喃、吲哚、异吲哚、嘌呤(如腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑；C1Q杂环基团，其衍生自喹啉、异喹啉、苯并二嗪、吡啶并吡啶、喹喔啉；C^杂环基团，其衍生自咔唑；C14杂环基团，其衍生自吖啶、占吨、phenoxathiin、吩嗪、吩噁嗪及吩噻嗪。在一个实施方案中，Ar1为含有苯核的芳基，其具有下式结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中q为05整数；每个RA独立地为芳基取代基；Re存在，为具有反应活性的偶联取代基，或^为或包含可检测的标记；并且该化合物具有下式结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在一个实施方案中，Re如果存在，为具有反应活性的偶联取代基，并为适于与另一分子或化学物质相连接的基团。在一个实施方案中，Re如果存在，为具有反应活性的偶联取代基，并且为或包含，可与另一分子通过化学反应在两者间形成共价键与之相连接的活性官能团。合适的活性官能团实例包括活泼的酯(如琥珀酰亚胺基酯)。在一个实施方案中，Re如果存在，为具有反应活性的偶联取代基，并为或包含，适合以强非共价相互作用与另一分子相连接的基团。这些基团的实例包括生物素(与带有亲和素、链亲和素的分子相结合)。在一个实施方案中，Re如果存在，为具有反应活性的偶联取代基，并为或包含，适合以形成复合物或螯合物与另一分子相连接的活性基团，例如，螯合基团。这些基团的实例包括能与诸如金属离子，如锝离子形成复合物或螯合物的基团。这些基团的实例包括二亚乙基三胺五乙酸。在一个实施方案中，Re如果存在，其为或包含可检测的标记。可检测标记的实例包括诸如染料、荧光标记物、抗原基团、稳定及不稳定同位素以及发射正电子的碳原子。在一个实施方案中，^如果存在，其为或包含含稳定同位素的可检测标记。在一个实施方案中，Re如果存在，其为或包含一含不稳定同位素的可检测标记。在一个实施方案中，！^如果存在，其为或包含^F。在一个实施方案中，Re如果存在，其为或包含含发射正电子的碳原子的可检测标记。其它f取代基如下述。在一个实施方案中，Re存在，并如上所定义。在一个实施方案中，q为0。在一个实施方案中，q为1。在一个实施方案中，q为2。在一个实施方案中，q为3。在一个实施方案中，q为4。在一个实施方案中，q为5。在一个实施方案中，每个RA独立地为选自-OH、_NH2、-NHR1、-NR11^、_S03M2、C卜4烷基，其中W及I^各为C卜4烷基的基团，并且MS为上述的阳离子。在一个实施方案中，至少一个RA为-OH或_NH2。在一个实施方案中，Ar1为含有氨基取代的苯核的芳基，其具有通式其中r为04的整数，每个Ra独立地为上述定义的芳基取代基,在一个实施方案中，r为0。在一个实施方案中，r为1。-个实施方案中，1~为2。在一个实施方案中，r为3。-个实施方案中，r为4。-个实施方案中，r为1，并且A为下式的基团在-在-在-在一个实施方案中，化合物具有下式结构$03M在一个实施方案中，化合物具有下式结构$03M在一个实施方案中，Ar1为含有羟基取代的苯核的芳基，并具有如下结构其中s为04的整数，每个RA独立地为如上述定义的芳基取代基；Re存在，为具有反应活性的偶联取代基，或Re为，或包含上述定义的可检测标记。在一个实施方案中，s为0。在一个实施方案中，s为1。在一个实施方案中，s为2。在一个实施方案中，s为3。18在一个实施方案中，s为4。在一个实施方案中，Ar1为下式的基团在-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>-个实施方案中，Ar1为下式的基团HO在一个实施方案中，Ar1为下式的基团在-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>实施方案中，A为具有萘核的芳基，其结构如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>其中t为03的整数，u为04的整数，每个RA独立地为如上述定义的芳基取代基，并且化合物通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>在一个实施方案中，Ar1为含有羟基取代的萘核的芳基，并具有如下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中v为02的整数，u为04的整数，每个RA独立地为芳基取代基c在一个实施方案中，Ar1具有下式结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>在一个实施方案中，化合物具有下式结构在一个实施方案中，化合物具有下式结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>在一实施方案中，配体为下面在"优选的磺化苯并噻唑类配体"的标题下描述的化合物。用于本发明诊断方法中的上述类型化合物，例如，通式(I)中的化合物，可经由常规方法制备，例如参见参考31。此处描述的所有化合物(或其衍生物)，其具有合适的结构、大小、共平面性及活性，此后可通指为，但不限于"磺化苯并噻唑类化合物"或"SB配体"。这些化合物一般地为聚集t分子的配体，例如所述聚集t分子在成对螺旋丝或神经原纤维缠结处发现。此处描述的配体可被合适地检测，其通过将发射正电子的碳原子掺入到在此处公开的化合物的甲基上，再应用本领域熟知的正电子发射断层摄影(PET)检测。或者，或以其优选的螯合基团中，Re为二亚乙基三胺五乙酸。配体可与其它化学基团、染料、荧光标记物、抗原基团、疗效基团或任何其它有助于预后、诊断或治疗使用的实物共轭、螯合或以其它方式相结合。例如，当配体与染料或荧光基团结合时，结合物可用作聚集t或类t分子的标记。因而，其可用于细胞内或细胞外AD特征的缠结标记。吩噻嗪此前，本发明的发明人已确认出另一类化合物，这些化合物可裂解PHFs的结构，并逆转PHF核的蛋白水解稳定性(W096/30766)。图8a中的结构表示W096/30766中描述的二氨基吩噻嗪类化合物。其中，为清楚起见，式(iv)表示了(ii)的不同共振形式。除化合物(i)为还原形外，化合物(n)-(iv)皆为氧化形。这些化合物(此后指"二氨基吩噻嗪"或"吩噻嗪")包括诸如托洛氯铵(toloniumchloride)及亚甲基蓝。实例见图8b。其中，所有这些化合物都为氧化形式，除劳氏紫(thionine)外都以稳定的盐的形式存在。此处描述的方法中应用的化合物具有图8a显示的通式，其中各R"R3、R4、R6、R7及R9皆独立地为氢原子、卤素、羟基、羧基、取代或未取代的烷基、卤代烷基或烷氧基；R5为氢原子、羟基、羧基、取代或未取代烷基、卤代烷基或烷氧基；以及，Rw及Rn，独立地为氢原子、羟基、羧基、取代或未取代的烷基、卤代烷基或烷氧基；及其药学可接受的盐。在一个实施方案中，各&、R3、R4、R6、R7及R9独立地为氢原子、卤素、羟基、羧基、取代或未取代的C卜6烷基、(V4卤代烷基或(V6烷氧基；R5独立地为氢原子、羟基、羧基、取代或未取代的C卜6烷基、C卜4卤代烷基或C卜6烷氧基；R1Q及Rn独立地为氢原子、羟基、羧基、取代或未取代的C卜6烷基、C卜4卤代烷基或C卜6烷氧基；此处使用的术语"烷基"指直链或支链基团，优选含有18，更优选16个碳原子。例如，"烷基"可指甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、叔戊基、己基、异己基等。本发明使用的取代烷基的合适取代基包括巯基、硫醚、硝基、氨基、芳氧基、卤素、羟基及羰基、以及芳基、环烷基及非芳基杂环基团。术语"烷氧基"指上述定义的烷基基团，其带一个氧原子，该氧原子介于烷基及与相连的底物残基之间。术语"卤代烷基"指含有14个碳原子的直链或支链烷基链，其携带1、2或3卤素原子。典型的卤代烷基包括氯甲基、2-溴甲基、l-氯异丙基、3-氟丙基、2，3-二溴丁基、3_氯异丁基、碘代叔丁基、三氟甲基等。"卤素"指氟、氯、溴或碘。—些吩噻嗪类化合物含有一个或多个不对称的取代碳原子，因而，其存在消旋或光学纯的活性形式。本发明包含消旋化合物及其光学纯活性形式。酸加成的盐可以图8a或8b中的碱性化合物与无机酸，例如氢卤酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸以及磷酸等，或有机酸，如乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、酒石酸、甲磺酸以及对甲苯磺酸等之间形成。在一个特别优选的实施方案中，本发明使用吩噻嗪，其中&、R3、R4、R6、R7及R9皆独立地为_H、_CH3、_C2H5或_C3H7;R1Q及Rn独立地为_H、_CH3、_(^5、或_C3H7;R5独立地为-H、_CH3、_(^5、或_C3H7;或其药学可接受的盐类。本发明的发明人此处指出，这些吩噻嗪类化合物可在特定位点与PHFs结合，基于其结合特性，该位点与上述苯并噻唑类化合物能够结合的位点不同。据认为，吩噻嗪化合物与该位点结合可影响t聚集的抑制。引入适当的标记(可用PET检测，见图ll、llb、12、13)后，吩噻嗪化合物可用于上述描述方法及上述其它实施方案中。当这些化合物以发射正电子的官能团标记后，其可用作所有的t聚集物的配体，且可以透过血脑屏障(参考文献36)并进入细胞。在另一实施方案中，根据此处公开内容，应该意识到的是，基于结合抑制剂的治疗效果，尤其是治疗进程可以用SB配体监测。阻断配体优选地阻断配体为具有下式结构的苯并噻唑其中n为04的整数；每个RBT独立地为阻断配体苯并噻唑取代基；m为04的整数；每个If独立地为亚苯基取代基；每个R独立地为氢或氨基取代基；以及或者RN及X—都不存在，以及相关的(三级)氮原子为中性；或者RN为苯并噻唑取代基，且相关的(四级)氮原子带正电荷，X—为反离子。优选的苯并噻唑包括硫黄素T(thioflavinT)。如下述实施例所示，SB配体(如图5中的la)可使这些化合物(如图5中的lb或2)从NFTs上被置换，然而，这些化合物的确优先与淀粉样蛋白结合。在一个实施方案中，n为O。在一个实施方案中，n为1。在一个实施方案中，n为2。在一个实施方案中，n为3。在一个实施方案中，n为4。在一个实施方案中，n为0，1或2。阻断配体苯并噻唑取代基RBT的实例包括，但不限于，C卜4烷基、-S03H及_S03M3，其22施方案中，M3为碱金属阳离子。在一个实施方案中，M3为Li、Na、K或Cs。在一个实施方案中，M3为Na或K。C卜4烷基的实例包括，但不限于-Me、-Et、-nPr及iPr。在一个实施方案中，每个RBT独立地为(V4烷基。在一个实施方案中，每个RBT选自-Me、-Et、-nPr及-iPr。在一个实施方案中，每个RBT为-Me。在一个实施方案中，n为l及RBT为-Me、-Et、-nPr或-iPr。在一个实施方案中，n为1及RBT为_Me。在一个实施方案中，一个RBT基团为-S03H或-S03M3。在一个实施方案中，一个RBT基团为-S03H或-S03M3及另一个RBT基团为C卜4烷基。在一个实施方案中，n为2，一个RBT为C卜4烷基及一个RBT为-S03H或-S03M3。在一个实施方案中，n为2，一个RBT为-Me及一个RBT为-S03H或-S03M3。在一个实施方案中，RW及X—都不存在，以及相关的(三级)氮原子为中性；在一个实施方案中，Rw为苯并噻唑取代基，且相关的(四级)氮原子带正电荷，X—为反离子。苯并噻唑取代基RW的实例包括，但不限于(V4烷基。在一个实施方案中，RW为-Me、-Et、-nPr及-iPr。在一个实施方案中，RN为_Me。反离子的实例包括，但不限于Cl—，Br—及I—。在一个实施方案中，RN为-Me及X—为Cl—。在一个实施方案中，m为0。在一个实施方案中，m为1。在一个实施方案中，m为2。在一个实施方案中，m为3。在一个实施方案中，m为4。亚苯基取代基If的实例包括，但不限于C卜4烷基。在一个实施方案中，每个R为-H及氨基为-NH"在一个实施方案中，一个R为-H及一个R为氨基取代基。在一个实施方案，每个R为氨基取代基。氨基取代基的实例包括，但不限于C卜4烷基。在一个实施方案中，氨基为_NH2、-NHMe、-NHEt、-NH(iPr)、NH(nPr)、_NMe2、_NEt2、N(iPr)2或_N(nPr)2。阻断配体的优选实施方案如图5所示的化合物lb及2。优选的磺化_苯并噻唑类配体本发明一方面，用于标记存在于NFTs中的聚集t，优选细胞外聚集t的配体，为具有下述通式(II)的化合物其中M工为碱金属阳离子；n为03的整数；每个RBT独立地为苯并噻唑取代基；m为04的整数；每个独立地为刚性连接基团芳基取代基；s为04的整数；每个RA独立地为芳基取代基；以及Re如果存在，为活性偶联基团，或Re为，或包含可检测标记。在实施方案中，M^n、每个RBT、每个R每个RA及Re如此所述(如，在上述的"磺化苯并噻唑类配体，"标题下)。刚性连接基团RL、芳基Ar1以及苯并噻唑基团，共同形成基本共平面的化合物，即其具有高度的共平面性。正如此处所述，为便于检测，在这些化合物中引入大体积的基团RE时特别有效。在一个实施方案中，化合物具有下式结构在一个实施方案中，化合物具有下式结构在一个实施方案中，化合物具有下式结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>在一个实施方案中，化合物具有下式结构-R、R在不同实施方案中，s为如上所定义。在一个实施方案中，每个RA独立地选自上述与通式(I)相关的取代基c在一个实施方案中，化合物具有下式结构$〇3M1RR已T-N/=二HON\、V=N—在一个实施方案中，化合物具有下式结构S03M1-N/=RBTHON-在一个实施方案中，化合物具有下式结构在一个实施方案中，化合物具有下式结构S03Na在一个实施方案中，化合物具有下式结构25S03MRBTHOn-在-实施方案中，化合物具有下式结构S03MRBTHO-R、n-在--A实施方案中，化合物具有下式结构S〇3MMe、HOnn-不同的ir取代基将另行讨论。在一个实施方案中，化合物具有下式结构$〇3MRRl_RBTSHO-R、.R、n-Oo、n4.V0在一个实施方案中，化合物具有下式结构S03MRBTRRLn、HONn-OO.ONl4/o在一个实施方案中，化合物具有下式结构26SO,M在一个实施方案中，化合物具有下式结构SO，M1—些优选化合物及其衍生物如图4a-c所示。因而，本发明一方面提供了图4a表示的化合物或其衍生物，如其中Re为上述偶联基团。如后面实施例所示，这些衍生物(如化合物4b)保持适当地结合活性。此处公开的新化合物(如式(II)化合物)，尤其可用作诸如AD特征的神经原纤维缠结。与这些缠结结合需要的最小关键结构的发现为设计靶向这些缠结的高亲和力配体并进而用于诸如AD疾病的诊断、预后或治疗，提供了可能性。这些化合物随后指优选的SB配体。优选SB配体的类似物—般说来，设计一个具有既定靶标性质(在本例中为优选的SBi-t聚集配体)的化合物的类似物需经历几个步骤，其中，最重要的是确定对靶标性质具有至关重要和/或重要的化合物具体部分。本发明提供的具有与聚集t分子相结合的高亲和力必需的最小关键结构解决了该步骤。化合物4a的最小关键结构可根据下述性质模拟，物理性质，如立体化学、成键情况、大小和/或电荷，可用各种来源的数据，如光谱技术、X射线衍射数据及NMR。计算分析、相似性拟合(其模拟的是配体的电荷和/或体积，而不是原子间的成键)以及其它可用于此模拟过程的技术。在此过程中，优选SB配体及其结合物的三维结构被模拟。当配体和/或其结合物在结合时构象产生改变，且这种改变在设计类似物的模拟过程予以考虑时，该方法尤其有27用。然后选择模板分子，再将类似的最小关键结构的化学基团引入其中。模板分子及引入其中的化学基团可方便地选择以利于合成，且可能为药理学可接受，在保持所需的生物活性时又不在体内降解。通过此种途径发现的类似物可经筛选以观察其是否具有目标属性或体现目标属性的程度。然后经过进一步的优化和修饰以找到一个或多个可用于测试和筛选的最终类似物，例如，用于体内或临床测试。优化方法包括选择上述类似物，将类似物与制备的聚集t分子(例如，在溶液中，或与固相结合的，或分离的已聚集的t，见W096/30776及后述的测定)相接触并测定待测物质与聚集t分子结合和/或从分子中置换化合物4a的程度。标记聚集t的方法本发明一方面提供了标记聚集t或t类分子的方法，包括以此处提供的优选SB配体化合物或其衍生物与聚集t分子相接触，并检测该化合物或衍生物的存在。其可参照参考文献第26-34中给出的配体使用用法。此处使用的术语"t蛋白"一般指t蛋白家族中任何一类蛋白。t蛋白是大量蛋白家族中的一类，其为在装配及拆解周期中以微管进行共纯化为特征的蛋白(Shelanski等(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，70.，765-768)，因而被称为微管相关蛋白(MAPs)。t家族的成员具有共同的特征，即其包含特征性N端片段，其中嵌入约50个氨基酸的序列，其受大脑的逐步调节，该特征串联重复区由包含31-32个氨基酸的3或4个串联重复及C端尾部组成。"t类"分子包括诸如MAP2，其是细胞体树状部位(somatodendriticcompartment)主要的微管相关蛋白(Matus，A.，在"Microtubles"[Hyams及Lloyd，eds.]pp155-166，JohnWiley及Sons,NY)。MAP2亚型的串联重复区域与t蛋白几乎一样，但在N端域的序列及范围上两者有本质的差异(Kindler及Garner(1994)Mol.BrainRes.26，218-224)。尽管如此，串联重复区域的聚集对t重复域并非选择性的。因而，应当意识到此处有关t或聚集讨论也应涉及t-MAP2及MAP2-MAP2的聚集等。优选的SB配体可与其它基团或任何其它具有诊断、预后或治疗目的或效果的实物共轭、螯合或以其它方式相结合，例如，配体与荧光基团结合有助于神经原纤维缠结的显影。诊断组合物及其应用—般地，本发明的优选SB配体(如式(II)化合物)可由分离和/或经纯化的形式提供，即基本纯净。这可能包括在组合物中，其至少约占90%有效成分，更优选约占95%及更优选约占98%。然而，此组合物包含惰性载体或其它药学及生理学可接受的赋形剂。本发明的组合物除包含优选的此处公开的SB配体外，其还包含一种或多种其它具有诊断、预后或治疗功效的分子。本发明中的优选SB配体物质或包含该配体的组合物可用于诊断、预测或治疗人或动物，尤其是其罹患诸如下述的AD疾病。本发明的另一方面提供了一种诊断或预后方法，其包括给哺乳动物施用诊断或预后有效剂量的一种或多种所述优选SB配体。该方面包括在诊断或预后方法中使用的化合物。其包括体内及体外应用。体外方法如下，其包括(i)自研究对象中获取合适的组织标28本；(ii)将标本与优选的SB配体相接触；(iii)检测与标本结合的优选SB配体的量及位置；(iv)关联(v)中的结果与对象疾病的分期及严重程度。研究对象的疾病本发明另一方面提供了所述优选SB配体或其衍生物在制备用于上述疾病的诊断、预后及治疗的组合物中的用途。疾病可为AD，AD类或任何其它涉及聚集蛋白分子的疾病。值得指出的是，t蛋白(功能异常或其进程)不仅在阿尔茨海默病中起作用。神经退行性疾病，如Pick's病及进行性核上性麻痹(PSP)，其发病机制似乎分别与大脑新皮质的齿状回及星状锥体细胞累积的病理性截短t聚集物有关。其它痴呆，包括额颞痴呆(FTD);17染色体相关连性痴呆(FTDP-17);脱抑制_痴呆_帕金森综合征_肌萎縮复合体(DDPAC)及苍白球-桥脑-黑质退化(PPND);Guam肌萎縮性侧索硬化症(Guam-ALS);苍白球黑质丘脑下核变性(PNLD);皮质基底变性(CBD)等(参见Wischik等2000，loc.cit，详见表5.1)。所有这些疾病的主要或部分特征为t的异常聚集，此处称为t蛋白病(tauopathies)。除上述的一种SB配体衍生物，诊断组合物可包括诊断可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂及其它本领域技术人员熟知的物质。这些物质应当无毒且不影响与聚集t相连接的物质活性或其它与物质连接的生物活性基团的功效。载体或其它物质的精细性质决定于服药方式，如口服、静脉内、皮肤及皮下、鼻腔、肌肉以及腹膜内。口腔使用的诊断组合物可为片剂、胶囊、散剂或液体形式。片剂可包含固体载体，如凝胶或佐剂。液体诊断剂一般包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或甘醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。供静脉、皮肤、皮下或痛处注射时，液体可为肠胃外给药可接受的无热源、合适的PH的等渗及稳定的水溶液。本领域相关技术人员使用诸如等渗赋形剂可制备合适的溶液，如氯化钠注射液、林格注射液以及乳酸钠林格注射液。按需加入防腐剂、稳定剂、缓冲溶液、抗氧化剂和/或添加剂。上述组合物可单用或联用其它治疗，视病情同时或依次使用。配体的识别识别聚集t配体的其它方法需要筛选测定，其可应用允许高通量筛选化学库以识别具有所需活性的化合物的筛选形式。迄今，仍无此类方法可资利用。优选方法不需预先标记化合物，由于标记过程将严重限制了化学研究能力。本发明的另一方面提供了一种可用于高通量筛选测定的方法，其不受限于对测试物质的预先标记的需求。在优选实施方案中，该方法采用了以下步骤1.t蛋白的高容量产生，在制备过程中，其发生部分的聚集；2.使用该种方法制备的t蛋白测定假定配体，利用W096/30766提供的t-t结合测定方法，以可识别具有最小或完全没有活性的物质作为t聚集抑制剂，或在高浓度增强t-t的结合；3.测试假定配体，在抑制浓度下典型高效t聚集抑制剂，如D匪B存在下进行；4.识别假定配体，其根据配体不能在重复域阻断t-t的结合，但可阻断高效t聚集抑制剂的抑制活性。因此，本发明提供了体外识别可标记聚集PHFi蛋白配体的方法，据此，该方法包括以下步骤(i)提供第一种怀疑能够标记聚集PHFt蛋白的试剂，(ii)将(a)—种包含t核心片段的t蛋白或其衍生物，其与固相结合以暴露其高亲和力的t捕获位点(例如，对应于核心片段及终止于Ala390-dGA的截短t蛋白)，与(b)液相t蛋白或其衍生物，其可与固相t蛋白或其衍生物相结合(如终止于Glu-391的dGAE)，以及(c)所述已选择的第一种试剂及(d)已知的第二种t-t结合抑制剂的试剂相接触，(iii)选择第一种试剂，全面或部分地解除抑制剂(d)对(b)液相t蛋白或其衍生物对(a)固相t蛋白或其衍生物结合的抑制。满足(iii)的试剂可作为配体。优选地该方法结合下述步骤(在其之前，之中或之后进行)(ibis)将(a)—种包含t核心片段的t蛋白或其衍生物，其与固相结合暴露高亲和力的t捕获位点，(b)液相t蛋白或其衍生物，其可与固相t蛋白或其衍生物相结合，与(c)选择的第一种试剂及，(ibis.1)检测t_t结合的抑制，其通过对(b)液相t蛋白或其衍生物与(a)固相t蛋白或其衍生物结合的抑制展示，(ibis.2)选择第一种试剂，其具有最小或没有作为t-t结合抑制剂的活性，可和/或任选增加t-t连接。满足(iii)及(ibis.2)的试剂可作为配体。抑制剂优选地为上述的二氨基吩噻嗪(最优选D匪B)。选择用于筛选的化合物可为任何化合物，包括SB配体。在优选形式中，液相t蛋白或其衍生物被制备成在暴露于固相之前发生部分聚集。除此之外，测定可按W096/30766所述的很宽范围内进行，其细节详见后述实施例。优选的碱或生理条件(如PBS)用于结合步骤，其结果以免疫学方法测定。参阅随后的非限制性实施例，本发明的这些及其它方面将更为清晰，其中，本发明的实施方案只是以实施例的形式进行描述。附图作为参考，其中附图概述图1表明PHFt的区域性分布，18例AD患者(A)以抗体mAb423或(B)PHF片段经甲酸处理后用mAb7.51测定。选自Mukaetova-Ladinska等，(1993)，美国病理学杂志143，565-578。图2(a)显示在AD的病理阶段t分子的聚集以及神经原纤维缠结的出现。选自(Mukaetova-Ladinska，E.B.等(2000)美国病理学杂志Vol.157，No.2，623-636);(b)显示Braak提出的神经病理分期；(c)显示按照DSM-IV标准的临床痴呆症的出现，其在统计学上对应III-IV期的过渡部分。(d)显示SDS不溶解的13淀粉样蛋白的水平，据Harrington等报道(美国病理学杂志1994;145:1472-1484)，样品分离自对照与阿尔茨海默病病例。尽管AD组的平均值水平高于对照组，但70X的AD病例的13淀粉样蛋白水平与对照交叠。图3示意性地显示神经原纤维缠结的图表说明(顶部)，以及在疾病进程中观察到的免疫活性的改变(底部)。选自Bondareff等(1994)J.Neuropathol.Exp.Neurol.53，2，30158-164。图4显示下述化学结构，能以高亲和力与聚集t分子相结合的最小关键结构(化合物4a);生物素修饰的化合物4a(化合物4b)及4a化合物的R取代衍生物(化合物4c)，其中，R为任何合适的取代基。图5显示下述化学结构其包括樱草灵(化合物la);硫磺素-T(化合物lb);2-(4-氨基苯基)-6-甲基-7-磺化苯并噻唑(化合2);噻嗪红(化合物3a);噻嗪黄(化合物3b)。图6显示樱草灵溶液(左)及其与纯PHFs制剂相结合(右)的荧光峰。图7显示樱草灵溶液与PHFs相结合的荧光峰，分别对应柠康酐不存在(左)及存在(右)的情况。如之所示，柠康酐可破坏PHFs结构并释放游离的t及游离未结合的樱草灵。柠康酐也具有逆转赖氨酸残基电性的效果，这对樱草灵的释放也起作用。图8a及8b举例说明典型的t-t结合抑制剂，其公开于WO96/30766。图9显示了在阿尔新蓝(alcianblue)存在下结合PHFs的樱草灵产生的荧光。该图证实，在PHF结构破坏物质阿尔新蓝的存在下，其对结合的樱草灵在460nm处产生的特征荧光峰无影响。图10显示不同的化合物("MR"指化合物与t的摩尔比)对t-t结合的影响效果，其使用W096/30766提供的方法制备t蛋白，此处称为"制备1"。图lla示意性显示["C]标记的亚甲基蓝的合成。该反应以胺与["C]碘甲烷进行N-甲基化反应。HPLC用于除去副产物以纯化需要产品。图11b显示基于劳氏紫、NaH及CH3I的反应。图12示意性显示["C]标记的天蓝B(AzureB)的合成。该反应以胺与["C]碘甲烷进行N-甲基化反应。HPLC用于除去副产品以纯化需要产品。图13以示意性显示[18F]标记的图4中化合物4a衍生物的合成。该反应通过芳香的亲核取代反应进行，由此，前体化合物的硝基与[18F]的氟基团相交换。HPLC用于除去副产品以纯化预期产品。图14显示樱草灵、苯并噻唑类似物及噻嗪黄的结构。这些分子的大小基于晶体结构提供的C-C距离以及分子中指定的A和B予以确证。C-C长度如下樱草灵最小值14.78AU最大值15.11AU平均值14.95AU类似物最小值15.05AU最大值15.26AU平均值15.17AU噻嗪黄最小值15.73AU最大值16.14AU平均值15.93AU图15及16举例说明樱草灵结构'B'部分的晶体结构(Soon-BengTeo等，1995，ActaCrystallogr.，Sect.C，591.图17及18举例说明化合物N2A的晶体结构结构(Gilardi，R.D.，1972，Acta31Chrystallogr.，Sect.B，107).图19及20显示重氮氨基苯的晶体结构(Gladkova&Kondrashev，1972，Kristallografiya(41)1733.图21及22举例说明图15及16的分子如何在空间中结晶。图23显示活性配体分子(樱草灵及其"类似物")与噻嗪黄(无活性配体分子)大小的平均值、最大值、最小值的比较。空间单位为埃(AU)。图24显示基本苯并噻唑核(即图5中的分子lb及2)与二氨基吩噻嗪的类似比较。其距离为碳碳间距离。图25显示为Braak分期函数的细胞外缠结的概率。基于E2/Trans及E4/HC细胞外缠结的概率，2-4期可清晰地与1期区分。图26显示为Braak分期函数的细胞内缠结的概率。细胞内缠结为这些区域早期区分提供了较差的效果，但在大脑新皮质区可很好区分4及5期。图27相应于图25，其中病例选择于死亡前12个月，其匪SE评分大于21。得到类似结果。图28相应于图26，其中病例选择于死亡前12月，其匪SE评分大于21。得到类似结果。图29显示为Braak分期函数的细胞外缠结的密度(计数/mm2)。图25得到类似结果。图30显示为Braak分期函数的细胞外缠结的密度(计数/mm2)。图31a显示以0.001%硫磺素显色很淡的缠结(箭头)。在此ifl悬液中，缠结可经蓝色荧光观察，但其不能区分在制各过程中与污染物结合产生的干扰。底板部显示0.001%硫磺素产生的蓝色缠结荧光为0.001%樱草灵产生的黄色缠结荧光所替代。图31b显示经链霉蛋白酶消化的标记PHFs电子显微图像。(a)生物素修饰的苯并噻唑类似物的化学标记，其如图4中4b所示。PHFs沉积于经链霉蛋白酶消化的敷碳载网，先以化合物4b简要孵育后，再以结合胶体金的抗生物素抗体制剂孵育。分离PHFs的修饰可确定化合物4b结合蛋白水解稳定的PHF结构。(b)经链霉蛋白酶消化后，以mAb423免疫标记分离的PHFs，然后以偶联金的羊抗鼠二抗体孵育(Novak等，阿尔茨海默病的成对螺旋丝的最小抗蛋白酶t单元的分子特征，EMB0J12:365-370)。如该文所述，mAb423标记源自细胞内缠结PHFs的效果很差(其维持了绒毛外层N端t的免疫活性)，但可有效标记链霉蛋白酶消化的PHFs。同样地，Mena等(1996)(MenaR，EdwardsPC，HarringtonCR，Mukaetova-LadinskaEB，WischikCM，阿尔茨海默病的成对螺旋丝对截短的t蛋白病理聚集物的分期，神经病理学学报91:633-641)显示，细胞内缠结中的mAb423的免疫活性可极大地被封闭，但经甲酸预处理后可暴露。图32显示后述实施例7中纯化t蛋白的"制备2"。图33显示dGA制备性过程结果的图表。"纯化倍数"表述为每个组份的特异免疫反应活性(即免疫反应性/蛋白浓度)与DE流量的特异免疫活性的比。图34显示纯化的dGAE的凝胶滤过色谱。不变性条件下的表观洗脱大小为1_320kD;2-80kD;3-30kD;4-10kD。约64%的mAb7.51洗脱分子量大于15kD。图35显示纯化的T40的凝胶滤过色谱。不变性条件下的表观洗脱大小为132450kD;2160kD;355kD。约50%的mAb499免疫反应活性洗脱分子量大于60kD。图36显示劳氏紫对制备1&2中t-t结合的活性。图37显示托洛氯铵(toloniumchloride)对制备1&2中t-t结合的活性。图38显示D匪B对制备1&2中对t-t结合的活性。图39a_c显示全长的t蛋白(hT40)，其按制备2的方案制备，当与固相(b)上的dGA同用于水相时证实了最小的结合活性。然而，当hT40应用于固相(c)上，其与dGAE的结合类似于dGAE与dGA在固相(a)上的结合。图40显示，樱草灵及噻嗪红对在制备2中的t-t结合无抑制活性，然而其在高浓度又的确增强此结合。图41显示递增浓度的樱草灵(a)及噻嗪红(b)阻断5yMD匪B对t-t结合的抑制效果，所用浓度表述为相对于D匪B"摩尔过量"。递增浓度的樱草灵(c)及噻嗪红(d)对15iiMD匪B显示了同样的结果。图42显示在递增摩尔过量的樱草灵存在下，D匪B对t-t结合抑制的减弱与逆转。在各图中，分别显示了在0x、lx、5x、10x、100xD匪B浓度的樱草灵存在下，稳定浓度D匪B对的t-t的结合影响。在递增摩尔过量的樱草灵存在下，D匪B产生的t-t结合逐渐地被减弱并逆转。图43显示在所示的25iiMD匪B及高摩尔过量的樱草灵存在下的t-t结合曲线。t_t结合可模拟如下结合=(BMaxx[樱草灵])/(Kd+[樱草灵])其中BMax=1.67Kd=13.37r=0.977(观测值对预测值)图44显示在所示的5iiMD匪B及增加的樱草灵摩尔过量下的t-t结合曲线。t_t结合可模拟如下结合=(BMaxx[樱草灵])/(Kd+[樱草灵])其中BMax=1.38Kd=13.86r=0.927(观测值对预测值)图45显示在所示的5iiMD匪B及增加的噻嗪红摩尔过量下的t-t结合曲线。T-T结合可模拟如下结合=(BMaxx[噻嗪红])/(Kd+[噻嗪红])其中BMax=1.64Kd=17.45r=0.915(观测值对预测值)实施例方法与材料PHF结合化合物除非另有说明，此处使用的化合物由ICIPharmaceuticals提供。硫磺素及噻嗪黄(thiazineyellow)购自FlukaAG。33荧光的定量系列16iim切片切自经过临床及神经病理学确证的AD患者的海马。这些切片以0.01%、0.001%或0.0001%的樱草灵水溶液染色5-10分钟，然后以水冲洗再置于Apathe's水溶液中。在第二系列的试验中，切片切自海马及Meynert基底核。这些切片以0.01%、0.001%或0.0001%的樱草灵水溶液染色5-10分钟，然后以水冲洗再置于Apathe's水溶液中。配有光电倍增管(ModelMPV-2)的Leitz荧光显微镜用于定量荧光发射，使用的三个Leitz滤件如下1.滤件H2，代码513417通过的激发光带宽390-490nm光镜RKP510(即传输510nm以下)抑制滤器LP515(即反射515nm以上)3.滤件G，代码513416通过的激发光带宽350-460nm光镜RKP510(即传输510nm以下)抑制滤器LP515(即反射515nm以上)4.滤件A，代码513410通过的激发光带宽340-380nm光镜RKP400(即传输400nm以下)抑制滤器LP430(即反射430nm以上)ifI及II的制备Ifl材料按Wischik等(1985)JCellBiol100:1905-1912所述的方法制备。IfII材料按Wischik等(1995NeurobiolAging16:409-431)所述的方法制备。至于涉及使用非链霉蛋白酶消化的ifll试验，可遵循上述资料，但可省略链霉蛋白酶消化步骤。inI荧光光谱测定法所有的测定均在Perkin-Elmer荧光光谱仪(MPF-3型)上测定。0.00001%配体浓度常规用于所有测试。樱草灵的激发峰在370nm，发射峰在515nm。因而所有测试均在标准的370nm激发波长下测定，狭缝的宽度恒为3mm。竞争结合分析Ifl材料在PBS中以0.2ml匀浆器中匀浆。向悬液中加入测试化合物至终浓度为0.1%0.00001%.。孵育5分钟后加入相同和较低浓度的樱草灵。然后，将悬液转移至载玻片上中并用包含一组荧光滤件的荧光显微镜检测，所述滤件包括380nm570nm的激发和发射波长。观测的终点为典型的樱草灵荧光自缠结片断上被置换。配体的电子显微光谱测定经链霉蛋白酶消化后，取自ifl级分的PHFs沉积在敷碳载网上，先以生物素化的樱草灵制剂简要孵育后，再如Slot及Gueze(1981)方法以结合了胶体金的抗生物素抗体孵育。IflI的琥珀酰化及色谱分离洗脱的组份溶解在8M脲/50mM硼酸盐(lml，pH9)中并进行超声处理，加入1ml琥珀酸酐的丙酮溶液至4ml终浓度为250mM的琥珀酸酯中，用氢氧化钠将ffl维持在8.5。溶液离心澄清后，载于碳酸氢盐平衡的S印hacrylS200柱上。在230或280nm处检测柱流份。由于琥珀酰化组份不能被凝胶考马斯染色(Coomassiestaining)和银染色显现，以Bolton-Hunter试剂(Amersham)进行特异性化学标记后，色带以放射自显影检测。为进行PHF衍生肽的光亲和标记，将组份ifl或ifll与I125标记的光敏衍生物预先孵育。Kay为0.21的光学标记组份经Amicon预2(10ml)膜超滤富集后，在50mM碳酸氢铵中以糜蛋白酶(0.01mg/ml)消化。作序列分析的糜蛋白酶所致的碎片如DrH.C.Thogersen方法分离得至IJ，用反相(^HPLC，经0-100%乙腈及0.1%三氟乙酸梯度洗脱。糜蛋白酶生成肽作序列分析。在吩噻嗪存在下PHFs的形态学研究为进行这些诶试验，ifll级分按照上述用于电子显微镜检测的方法制备。该材料也可直接以终浓度为O.0001%0.1%的吩噻嗪制剂孵育，然后用于敷碳载网上，再以LiPTA染色(1%)后直接测定。或者，ifll沉积于敷碳载网上，部分干燥后，再以吩噻嗪溶液冲洗。这些制备也可直接以LiPTA染色或使用6.423作为主要抗体进一步处理用于免疫电子显微镜检测。电子显微镜检查满意的放大倍数为25，00045，000倍。细胞外空间聚集t蛋白的计算，以iig/g脑组织表示，为Braak分期的函数先前报道了pmol/g(P)级水平的PHF-t以及在临床及神经病理学分期队列统计中的缠结计数/mM2(T)(R.Y.K.Lai，等，NeurobiolAging16，433(1995))，用来估计每个受损锥体细胞(PC)的PHF-t水平，其单位为Pg/细胞，采用同样的ELISA方法。缠结计数/慮2提供了用于估计lmmXlmmXO.lmm(O.0001cm3)空间内受损锥体细胞的数目，考虑到在7iim的切面计算的任何缠结轮廓可沿不同方向正交延伸至约45iim(S.M.Blinkov，I.I.Glezer，图表中的人类大脑，定量手册；Ple皿mPress，NY，1968，表204)。由于PHF为核心t片段为10kD，核心PHF-t水平为10XP，其单位为pg/cm3(C.M.Wischik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,4506(1988))。从这可知，PC=(PX10)/(T/0.0001)。在Braak4-6期(H.Braak，E.Braak，ActaNeuropathol.82，239(1991))中，灰质中不同部位的PC值为:额叶，O.13±0.05pg/细胞;海马，O.60±0.39pg/细胞；颞部皮质，1.074±0.44pg/细胞；内嗅皮质，1.56士0.63pg/细胞。这些差异反映了解剖学差异，不同区域疾病的发展速度(C.Bancher，H.Braak，P.F为cher，K.Jellinger，Neurosci.Lett.162，179(1993)，以及Gertz等，神经病理学学报95，154(1988))，以及在病理后期缠结计数低估营养障碍性神经炎中累积的PHFs(Lai等，1995，loccit)。总体平均值给出了AD相关的KF/细胞水平的近似值。在Braak1-3期病例中，其为0.37±0.08pg/细胞；在Braak4-6期中，其为1.08±0.28pg/细胞。为估计细胞外聚集PHF-i，随后的表格及图26、27、29及31所示，若在用mAb423孵育1小时之前，经98%甲酸处理玻璃放置切片5分钟，可以证实mAb423的免疫反应活性，则可计作细胞外缠结计数。为避免疑问，该方法学与Mena等报道(1996)不同，在后者的方法中，自由漂浮vibrotome切片先经甲酸简要处理，再以mAb423孵育过夜。如该报道所示，后者过夜自由漂浮切片方案达到细胞内缠结最大的mAb423免疫反应活性，且表明了所有细胞内缠结包含mAb423免疫反应活性，即使PHF的绒毛外层处于基本封闭状态(参见图3)。本方案的目的为确保图3所示的3期及2期缠结得到最大标记。一些标记程度较低的细胞内缠结不能被完全排除，因而试图通过主观辨别进行计数。然而，后者的估计与以mAbAT8(图28、30、32)标记缠结的密度及概率不一致，由于其仅涉及细胞内且与由mAb423揭示的神经病理分期具有完全不同的特征。因而，为便于计算，mAb423免疫反应活性的缠结计数可基本上或完全视为图3所示的2期及3期细胞外缠结病理学的代表，而非图3所示的1期的代表。为避免疑问，图3中的分期不是Braak分期，而是包含缠结的单一神经元的变性期。表1所示特征数据基于如下数据NumberBSTME1T4PCPT4REG3BSE1T411.00000.39821.56000.62121.00000.398222.00006.72591.560010.49241.00002.704733.000014.96461.560023.34481.00002.983644.000033.62971.560052.46241.000010.988355.000044.31021.560069.12401.000013.029861.00000.00.60000.02.00000.072.00001.38650.60000.83192.00000.453183.00003.71690.60002.23022.00000.806094.00008.93840.60005.36302.00003.0048105.000023.94790.600014.36872.00004.0567111.00000.00.60000.03.00000.0122.00000.00.60000.03.000.0133.00000.00.60000.03.00000.0144.00000.12930.60000.07763.00000.1293155.00002.20070.60001.32043.00001.0634其中BST为Braak分期ME1T4为细胞外缠结计数PC为每个细胞PHF-t浓度的估计值(如上计算)PT4为有关细胞外缠结的PHF含量(PCxMEIT4)REG3B为如图26及27将脑区分为3组的聚类，SE1T4为细胞外缠结计数的标准误。实施例l-Braak分期的聚集t基于免疫化学性质(见参考文献26，27，30)，将细胞内缠结与细胞外缠结进行区分是可能的。在该范畴内，缠结病例的频率(即概率)及其数量(即计数/mm2)两者皆于预期病例中测定，并且按照Braak系统分成病理学进程中代表分期的区域。如图25所示，基于E2/Trans及E4/HC的细胞外缠结的概率，可将2_4期与1期明显爱地区分开来。描述F/T/P区域(大脑新皮质区的额叶、颞叶及顶叶)的图片也表明了HC/E4这一点。相反地，细胞内缠结对这些区域的早期区分效果不佳，但使用大脑新皮质区可很好区分4及5期。类似地，选择于死亡前12月，匪SE评分大于21的病例，其可得类似结果。同样地，当缠结密度被测定时，可得类似结果。如材料与方法中所述，这些结果可转变为细胞外空间聚集t蛋白数量的近似值，以Pg/g脑组织表示。这些结果如表l所示，其值偏低，由于缠结计数低估了聚集t蛋白的数量。表1:不同区域及分期的ECT中的PHF-T含量的估计区域BSTPHF/T(iig/g)E2/T廳S10.62210.4923.3452.4669.1200.832.235.3614.360000.081.32表l显示细胞外空间聚集t蛋白的数量，表示为Pg/g脑组织，为Braak分期的数据的计算如材料与方法所述。总之，这些结果证实在中颞叶的细胞外PHF-t沉积，为AD神经原纤维变性的经验分期提供了基础。若有合适的配体，该分期仅可以用放射自显影的方法实现。实施例2-与PHF核心t蛋白聚集重复域相结合的化合物的评价获得的原型化合物作为购买的硫磺素-S粗品的组份之一，所述粗品经分析薄层色谱以及制备性色谱可分成约20种不同的成分。测试表明，并非所有的这些组份可作为有效的缠结配体。具体说来，发现纯净的樱草灵(图5，化合物la)可标记缠结，但苯并噻唑硫黄素-T效果较差，尽管其优选标记淀粉样蛋白。此外，发现化合物la能够替换缠结处的化合物lb，当后者以IO倍过量加入至缠结粗提取物的时候。差异的可能假定为位置1处(图5，化合物2[2-(4-氨基苯基)-6_甲基-l-磺化苯并噻唑])的磺化基团。然而，发现樱草灵(化合物la)能够从缠结(认为没有淀粉样蛋白)替换该化合物。因此，缠结标记不应仅仅限于磺化苯并噻唑结构，表明需要较长的芳香结构。函数。F/T/P3451234512345发现相同浓度的噻嗪红(thiazinred)(图5，化合物3a)能竞争樱草灵，然而化合物3b(噻嗪黄，图5)却不能。因此，较长的芳香苯并噻唑结构本身并不能决定其与缠结的高结合力。为了定义竞争结合的最小关键必需结构，通过引入单个跨双氨基链的苯基来延长磺化苯并噻唑。该化合物(图4，化合物4a)尽管没有荧光，但发现其在相同浓度时可竞争噻嗪红及樱草灵。因而，化合物4a定义了能与缠结高亲和结合的最小必需结构。为了证明缠结上的结合位点就是PHF自身，通过引入生物素基团(图4，化合物4b)进一步延长化合物4a。由于发现其仍能竞争樱草灵及噻嗪红，化合物4b保持了与缠结的高亲和结合力。此外，发现与免疫金偶联的抗生物素抗体可标记用化合物4b预孵育的分离PHFs，然而，已证实没有预孵育或仅以生物素预孵育无法标记(图31b)。最终，当制备出光活化的偶联物后，即有可能识别蛋白及测定标记蛋白的序列。已发现，其具有与经PHF核心分离出的相同的核心t片段，其包含t蛋白的重复区域。总之，这些结果清晰地表明了化合物4a及4b的结合位点在PHF核心t蛋白的聚集重复域。此外，其证实化合物4a可用作螯合剂，引入官能团而不影响PHF核心与配体的活性。因此，化合物4a可用作螯合剂，可引入锝或其它显影基团以生成合适的配体，用于如AD的细胞外缠结的检测。实施例3-确定配体分子的最佳空间图14表明了上述的三个结构及其显示的大小。例如，显示了樱草灵，一种苯并噻唑类似物(称为"类似物")以及噻嗪黄的Cn-Q及Q。-Q间距。图15及16表明了樱草灵结构'B'部分的晶体结构(Soon-BengTeo等，1995，ActaCrystallogr.，Sect.C，591。如图16中所见为分子的侧影，其基本上是平面的，尽管略有扭曲。自同一分子计算樱草灵的'A'部分。在此，也可推出分子的A+B值，其提供了本发明一个有效品种的实际长度。为了计算图14表明的"类似物"的大小，使用图15中的数据测量A，以及从N2A分子，图17及18(Gilardi，R.D.，1972，ActaChrystallogr.，Sect.B，107)中确定测量B。从图18中分子的侧影可见分子的该部分是完全平面的。对噻嗪红使用了同样的测量，其大小同"类似物"相同。噻嗪黄(图14所示)的大小按如下确定。'A'部分源自图15的分子，其用于樱草灵，然而'B'部分源于图19及20的分子(Gladkova等，1972，Kristallografiya41)。再次，分子的B部分完全是平面的，其与图17中所示的分子之间唯一的差别为芳香基团间的距离。图21及22表明图15及16的分子如何在空间中结晶。可以看出，分子形成了交互的"鲱骨"图案，且不是堆积。通过比较，亚甲基蓝的晶体结构表明分子以n键间的堆积交互的水分子片形成堆积。表2制表给出了樱草灵("PRIM")、类似物("ANAL")，噻嗪黄及一个苯并噻唑单位(即图5所示的结构lb及2)的空间最小值、最大值及平均值。相应的亚甲基蓝的空间给定为'MBCC'(碳碳间)以及'MBNN'(氮氮间)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>图23表明活性配体分子(樱草灵及"类似物")及噻嗪黄(其为惰性配体)的平均值、最大值及最小值范围的比较。空间大小的单位为埃(AU)。在图24中，在基本的苯并噻唑核(即图5所示的分子lb及2)及二氨基吩噻嗪作了类似的比较。这些距离为碳碳间的距离。上述结果表明此处所示的分子基本上都是平面的，然而，本发明配体及上述的其它分子间的活性有着根本的差异。如图所示，根据本发明，合适的配体包括大小在14.78315.261AU的长平面分子。另一方面，较长分子如噻嗪黄，其大小超出该范围(平均值15.927AU)而不能成为有效的配体，即使其是平面分子。然而，有些较短的平面分子优先与淀粉样蛋白结合。实施例4-使用配体分子或抑制剂的PET图11-13表明了典型的合成方法，其可将二氨基吩噻嗪或"类似物"转变为发射正电子的物质。图llb具体表明了一种方法，其中先以NaH处理劳氏紫，然后以标记的碘甲烷处理生成亚甲基蓝。在以天蓝A及天蓝B合成亚甲基蓝时，可采用类似的合成方法。也可使用其它强碱。其它可使用的方法包括HC1及标记的MeOH;标记的磷酸三甲酯；标记的二甲基亚砜及标记的甲酰胺。化学合成及一般方法学为本领域技术人员所熟知。这些给出的实施例并不包含任何对完善的方法学的限制。实施例5-阻断配体诸如硫磺素-T及-S的化合物可对淀粉样沉积强烈地染色。然而，图31证实这些化合物可被樱草灵从缠结置换下来。因此，这些化合物可用作阻断试剂以饱和不感兴趣结合位点，同时不抑制配体对聚集t的结合。实施例6-配体分子与抑制剂的比较与结合的有效抑制剂相比，有效配体的分子的活性似乎存在根本的差异。苯并噻唑分子并不裂断PHFs，任一种配体也不产生裂断作用，然而，二氨基吩噻嗪构成了PHF裂断剂及t聚集抑制剂。使用樱草灵，对聚集依赖型t配体及聚集t抑制剂之间的关系进行进一步的探讨。溶液中的樱草灵的荧光峰在520nm，当其与纯净的PHFs(图6)制剂结合时荧光峰移至470nm。经拧檬酸酐处理PHFs后470nm荧光峰消失(图7)，拧檬酸酐裂断了PHF的结构并释放出游离的t(同时逆转了赖氨酸的电荷)。因此，此类化合物的结合依赖于PHF中发现的t聚合状态，但游离的t不存在聚合状态。39已经识别出裂断PHF结构及逆转PHF核的蛋白水解稳定性的化合物(参见W096/30766)。这类化合物的实例见图8。本发明的发明人已经确证在特定结合位点，这些化合物在高亲和力的t-t结合域内与t结合。然而，发现这些化合物并不能破坏樱草灵与聚集t分子中的t的结合，如在阿尔新蓝(alcianblue)(图9)存在下，樱草灵在470nm保持荧光峰。因而，尽管阿尔新蓝可抑制的相互作用，或其作用的抑制位点或也许结合反应的级数，为SB配体留下了结合位点。因而，作为聚集t配体的化合物似乎与为t聚集抑制剂的化合物不在相同位点结合，尽管其仍影响这些抑制剂的抑制性质(参见随后的实施例7)。通过研究典型用作t聚集抑制剂的聚集t配体的效力，进一步检视了该点。先前研究表明，基于固相测定中t-t结合抑制(WO96/30766)，可确认t聚集抑制剂(如二氨基吩噻嗪)。当在同样的测定中测试时，樱草灵及噻嗪红发现对t-t结合有弱的抑制活性(图IO)。因而，尽管这些化合物是PHF核心t的强力配体，它们至多是t-t结合抑制位点的弱抑制剂。在足够高浓度尤其是诸如亚甲基蓝化合物的存在下，二氨基吩噻嗪类化合物与聚集状态的t相结合的证实，由PHF结构的裂断直接证实。因而，为结合抑制剂的二氨基吩噻嗪类化合物在低浓度时可用作聚集t的配体。总之，本发明的发明人发现在核心PHFi聚集体内可定义两类结合位点，都有可能用于开发放射显影配体(i)磺化苯并噻唑类位点此类化合物由于具有合适的大小及电荷，其与合适的螯合物如锝结合，可用作细胞外缠结的配体。(ii)二氨基吩噻嗪类位点此类化合物以发射正电子的官能团适当标记后，可用作所有的t聚集体的配体，且可跨越血脑屏障(参考文献36)并进入细胞。因而，此类化合物及其衍生物可潜在用于标记细胞内缠结，例如，存在于AD患者脑部的缠结，或其以低浓度时使用时用于细胞内缠结。实施例7-基于对抑制的解除识别其它诊断性配体的实例分析(i)其中已经发生部分聚集的t蛋白的制备制备("制备2")以图表示意性地显示于图32，其与较早描述的方法(如W096/30766-"制备l"-如下(ii)所示)不同。重组cDNA质粒如W096/30766所述，其内容此处引入作为参考。简要说来，使用标准方法(Sambrook，Fritsch&Maniat为"分子克隆.实验室手册1"(1989)冷泉港实验室，N.Y.)，自阿尔茨海默病患者脑组织中分离mRNA生成tcDNA，该组织于患者死亡3小时后获取。cDNA库用合成的17-mer寡核苷酸探针筛选，该探针为PHF核心蛋白部分的序列(Goedert等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，4051-4055)。全长的cDNA克隆被亚克隆入M13mp19的EcoRI位点及用于在起始密码子邻近区定点诱变引入Ndel位点。用Ndel及EcoRI裂解后，生成的cDNA片段经亚克隆到T7RNA聚合酶启动子的下游并进入Ndel/EcoRI切割的表达质粒pRK172中(McLeod等(1987)EMB0J.，6,729-736)。PRK172为pBR322的衍生物，由于除去了pBR322拷贝数控制区，其在E.coli大量繁殖。质粒携带了氨苄青霉素的抗性基因，以进行重组的克隆选择。编码截短t的cDNA构建，如Novak等((1993)EMB0J.，12,365-370)所述的方法自mRNA制备。使用特异的寡核苷酸引物，用mRNA作模板进行聚合酶链反应(PCR)。正义引物包含Ndel位点，反义引物包含EcoRI位点。如上所述，将PCR片段亚克隆入pRK172。用于构建dGAE的引物如图22所示。所有用于表达的DNA片段的真实性以双链全长测序确定。构建hT40("T40")cDNA的细节如Goedert等((1989)，神经3:519-526)所述。该序列是发现于CNS的最大形式的i，其编码t蛋白，该蛋白包含29个氨基酸的2N端嵌入体及在微管蛋白结合域的额外的31个氨基酸重复片段。DNA及其预期的氨基酸序列如图21(SEQIDNO:4)所示。使用重组质粒转化E.coliBL21(DE3)，后者为原核表达的菌株，其携带在lacUV5启动子控制的噬菌体T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝(Studier及Moffat(1986)，分子生物学杂志189，113-130)。培养物以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导指数生长3小时。按照Goedert及Jakes所述(1990，EMB0J.，9，4225-4230)的方法，适当改进可大量(1L细菌培养物)纯化t片段。通过将细胞片状沉淀物在液氮下快速冷冻将细胞破碎，然后将该片状物悬于包含50mMPIPES及lmM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液(pH6.8)中。上清热稳定蛋白以PIPES/DTT透析，然后载于包含磷酸纤维素的以同样缓冲液平衡的柱上。以在上述缓冲液中的NaCl(0-0.5M)梯度洗脱t蛋白。组份以SDS-PAGE、考马斯染色及免疫印迹法分析。收集含t组份，用25mMMES、lmMDTT(pH6.25)透析后，以约5mg/ml浓度-2(TC贮存。蛋白的浓度以Lowry方法测定(HarringtonCR(1990)，"lxwryproteinassaycontainingsodiumdodecylsulphateinmicrotitr印latesforproteindeterminationonfractionsfrombraintissue",AnalyticalBiochemistry186:285-287)。制备2不同于上述制备1，差异如下(1)超声阶段的细胞浓度增加5倍。(2)包含DE52对非t蛋白的批吸收。(3)蛋白质不必以热处理。(4)最后一步使用聚乙二醇浓縮。大肠杆菌生长于2xTY培养基(0xoid)中，在对数生长后期以氨苄青霉素(50y/ml)处理。离心收集5L培养物中的细胞，细胞片状沉淀物以液氮快速冷冻。将片状物以50mMPIPES(pH6.8)溶解，其包含lmMEDTA、lmM二硫苏糖醇及lmM苯基甲基磺酰氟(PMSF)，再在4t:将细胞超声(2X3分钟)裂解。混合物10，000rpm离心20分钟，上清液在4°C以lgWhatmanDE52旋转3小时。混合物上柱分离，不能结合于DE52的洗脱物在4。C孵育3小时，再以0.4gWhatmanPll(按照厂商推荐新鲜再生)旋转。柱以柱缓冲液(50mMPIPES，pH6.8，包含lmMEGTA、5mMEDTA、0.2mMMgCl2、5mMP-巯基乙醇及lmMPMSF)冲洗。t蛋白以在柱缓冲液中的0.11MKC1梯度逐步洗脱。收集所得包含t组份(免疫测定法确定)，用80mMPIPES透析(p朋.8)，透析液包含lmMEGTA、lmMMgCl2及5mMP-巯基乙醇，用分子量临界值为1000的透析管进行。透析液以聚乙二醇8000浓縮滤袋2-3小时。t的终浓度310mg/ml为。在典型的大量制备过程中，t的特异性免疫反应活性从不能与DE52结合的材料纯化了30-40倍。约60%的t自终产品中回收，有10X不能与P11结合，柱组份中的残留物忽略。表3详细地表明了dGA的制备过程。"纯化倍数"为每个组份的特异性免疫反应活性(即免疫反应活性/蛋白浓度)与DE洗脱流份的特异性免疫反应活性的比。Vol(ml)mg/mlAU/mlAUAU/mgPurifn(-fold)Recovery(%AU)Totalcells200264000080000001538DEflowthro'240204000096000002000|1.00I100%|P11flowthro'220195000110000026311%iinP"flowthro'Fractions#11.4850003000033882(6mleach)#20.98200001200002049210#31.60800004800005000025#42.69200000120000074^437#53.0920000012加00064767':;::;-■■32.粘3.312000001200000604593062%inpooledfractions#72.7120000012000007374637粘2.701250007500004629623#92.20100000600000455372320%indiscardedfrac化ns#101.83800004800004376422PuredGA14.58.460000087000007142936图33是表3的数据图。表4汇总了t蛋白品种dGA、dGAE及hT40的制备过程的产出。TauProteinconcentration(mg/ml)basedon:lmmunoreactivityProteinyie|dpreparationabsat280nmProteinassay(BSAref)(mAb7/51;AU/ml)(per10litres)dGAE(711)3.33.8300,000100mgdGA(1511)8.18.4600,000122mgT40(13")3.53.1125,000120mgbasedonextinctioncoefficients3bs3t280nmBSA(reference)10mg/ml6.6Tauprotein_10mg/ml_14.7__蛋白以PBS缓冲液平衡的50X1cm琼脂糖凝胶CL_6B硅胶滤过柱分离，在室温操作。制作了12，400200，000范围柱的分子量标准曲线。绘制了1o&。标准对数曲线，其以Kd为单位的Mr对Ve/Vo作图，其中，Ve标准洗脱体积，Vo为以葡聚糖蓝测定的柱空体积。T40或dGAE载于包含5%甘油的0.5ml缓冲液中，组份以1ml为单位收集。组份中的蛋白的存在用分光光度法测定280nm的吸收。采用ELISA方法分别以单克隆抗体7/51或499检测dGAE或T40的存在。ELISA测定在96孔PVC板中进行，其测定如下50ill的各组份在37°C孵育1小时，以0.05%tween-20洗板，然后以200iilPBS+2^脱脂奶粉于37。C阻断位点1小时。以0.05%tween-20洗板，用50iU经PBS+2X脱脂奶粉稀释至1:10的第一抗体37t:孵育1小时。再以0.05%tween-20洗板，以50iU经PBS+2^脱脂奶粉稀释至l:10的二级抗体(羊抗鼠IgG:HRP偶联物)37t:孵育1小时。以0.05%tween-20洗板，再以去离子水冲洗后加入50yl新制备的底物(TMB[四甲基联苯胺]的乙酸钠的缓冲液^朋.0，含11202，新鲜制备)，并用2分钟在00650读入变化速率。纯化的dGAE及T40的洗脱曲线如图34(dGAE)即35(hT40)所示。尽管两者的片段典型地分别位于12kD及55kD，约64%的mAb7.51免疫反应活性(dGAE)组份的分子量>15kD，约50X的mAb499免疫反应活性(hT40)组份的分子量>60kD。因而，t蛋白存在，至少部分地存在聚集形式。(ii)使用不同的t蛋白制剂检测t聚集抑制剂的效果当蛋白dGA及dGAE如上制备时("制备2")，相对于W096/30766("制备1")所述制备方法获得的性质，t-t结合测定的性质产生改变。测定在96孔PVC板(Falcon目录号353912)中进行，其步骤如下1.将50illdGA(-10yg/ml)的碳酸盐缓冲液37。C孵育1小时(碳酸盐缓冲液50mM碳酸盐-碳酸氢盐，pH9.6(Na2C031.59g/l，NaHC032.93g/l))。2.以0.05%Tween-20洗板。3.200ii1PBS+2%Marvel,37。C孵育1小时。4.以去离子水清洗板2次，再以0.05%Tween-20洗涤。5.50ii1dGAE(-10iig/ml)与药物的PBS+1%鱼皮胶+0.05%Tween-20溶液，37°C孵育1小时。6.以0.05%Tween-20洗板。7.50ii1抗体423(1:10，以PBS+2%Marvel稀释)，37。C孵育1小时。8.以去离子水清洗板2次，再以0.05%Tween-20洗涤。9.50iilHRP-抗-鼠(l:1000，以PBS+O.05%Tween-20稀释)，37。C孵育1小时。10.以0.05%Tween-20洗涤，再以去离子水清洗板2次。11.501底物溶液，用2分钟以板读取器立即读取在0D650的起始速度。(底物溶液50mM乙酸钠，pH5.O+TMB(lml/100ml的10mg/mlDMS0溶液)+^02(1011l/100ml))发现在制备2中，化合物劳氏紫及托洛氯铵需要较制备1更高的浓度才能发挥抑制效果。如图36及37所示。此外，发现二甲基亚甲基蓝(D匪B)在制备2中较在制备1中具有更高的抑制效力，如图38所示。在以制备1方法制备的t蛋白中可观察到类似的差别，但制备1允许其在体外超时聚集，其效果解释如下。由于这两种效果必须达到，因而诸如化合物劳氏紫及托洛氯铵需要较高浓度才能达到最大抑制t-t结合1.破坏水相中预先存在的聚集物；2.抑制水相中的物质与固相的结合。制备2中D匪B的较大效力可解释为，在需要双重抑制效果的作用位点上，其具有更大的结合亲和力。全长的t蛋白(hT40)，其按制备2的方案制备，当与固相上的dGA用于水相时证实了最小的t-t结合活性。然而，当hT40在固相上应用时，dGAE的结合类似于固相中dGAE与dGA的结合(参见图39a-c)。其可解释为，在水相中形成的hT40聚集体中，在或通过其需要与固相上dGA的结合作用的结构已经形成结合。当hT40首先固定(plate)于固相时，其与PVC的结合暴露蛋白/聚集物，以使关键的结合位点可资利用。(iii)使用不同的t蛋白制剂检测t聚集抑制剂的效果按照在制备2的测定方法，以樱草灵及噻嗪红为代表的强活性配体对t-t结合无抑制活性，如图40(cf.图10)所示。在该检测中，这些化合物在高于100iim(即相对于t蛋白IOO倍摩尔比)浓度时的确增强结合。较之无D匪B时，5iim的D匪B—般可降低t-t结合(t的浓度一般为liiM)23X，15iim的D匪B降低17%。意外的是，此种抑制效果可在高浓度的高亲和配体，如樱草灵及噻嗪红共孵育时完全逆转，如图41所示。因此，聚集t配体的功能特征在于其自身并不抑制t-t结合，但可阻断结合的强效抑制剂的抑制效果。如图42所示，在增加樱草灵摩尔过量下，D匪B产生的t-t结合抑制得到进行性减弱或逆转。噻嗪红可得到类似结果。这表明，D匪B的最大抑制效果可被这些化合物降低，因而，其可用作D匪B的非竞争性抑制剂。一个可能的解释是，配体稳定了测定中使用的t聚集物，例如，在D匪B活性所需的关键结合域的外部区域，因而，其阻止了D匪B对t-t结合的抑制效果。图43-45表明任何既定浓度的D匪B，在樱草灵(43，44)或噻嗪红(45)存在下，t_t结合有定量的增强，其可经标准的Michaelis-Menten方程模拟。这表明，这些配体的t聚集增强效果与占据的配体结合区域的分数成比例，据推测其在引入测定的水相的t聚集物内。两种配体的平均Bmax为约1.6，即最大的配体效果是产生1.6倍的t-t结合信号，其可在无药物存在时观察到。这种效果的平均Kd是约15x，即任何既定的大于4ym浓度的D匪B，当配体相对于D匪B浓度有15倍的摩尔过量时，可观察到最大50%的t-t结合增强。实施例8-基于此处提供的配体识别其它诊断配体的实例测定定义了两类上述的用于标记AD的PHFs合适配体后，在筛选测定中可使用化合物/衍生物方法开发新的配体。模拟的方法可基于已存在的配体。(i)在磺化苯并噻唑位点识别新的配体使用合适标记的已知磺化苯并噻唑制剂，与聚集t分子(例如在溶液中或与固相结合的聚集t或自AD患者脑中分离的高度富积的PHFs，参见W096/30766)的制剂孵育后，引入可能为合适配体的化合物，然后测定其竞争已知配体抑制PHF内的结合的能力。(ii)在吩噻嗪位点识别新配体如WO96/30766所述的t-t结合测定，其可用作初步筛选以识别t-t结合位点处的潜在抑制剂。同样地，合适标记的已知二氨基吩噻嗪的制剂，与上述聚集t孵育后，可用于筛选其它可能为PHF结合位点竞争者的化合物，并为潜在的合适PHF配体。竞争测定的物理手段为本领域所熟知。其可包括荧光测定、放射性或任何其它合适的报告系统，其源于不与存在于溶液中的PHFs结合的磺化苯并噻唑类或二氨基吩噻嗪类化合物。参考文献1.DeToleda-Morrell，L.etal.(1997)，NeurobiologyofAging18，5，463-8;2.DeLeonetal.(1997)，Neurobiol.OfAging，18，1，1—11;3.Mori，Eetal.(1997)，Am.J.Psychiatry154:l，pl8;4.Juotto體，K.(1998);J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry65，322-327;5.Bobinski，M.etal.(1999)，Lancet353，p.38;6.Fox，N.C.(1999)Neurol.52，1687-9;7.Jack,C.R.etal.(1997)Neurol.49:786-794;8.Fox，N.etal.(1996)，Brain119,2001—7;9.Johnson,K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