专利名称：：一种细菌五型分泌蛋白及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学、基因工程及免疫学领域，具体的说是一种荧光假单胞菌五型分泌蛋白及其构建方法和应用。
背景技术：
：原核生物分泌蛋白可以依据其在细胞中的转运特征而划分为几大类。其中，五型分泌蛋白具有十分独特的性质。不同于其它分泌蛋白，五型分泌蛋白自身具有完全的转运功能，不依赖于细胞的任何其它蛋白质转运系统，因而这类分泌蛋白亦称为自我运输蛋白。在功能结构上，五型分泌蛋白通常具有一个位于N端的分泌信号肽，一个位于前端的被运输的"乘客"蛋白域，以及一个C端的转运功能域。N端信号肽指导蛋白质进入胞间质，随后转运功能域在细胞膜上形成一个运输通道，被运输的"乘客"蛋白通过此通道而被输送至胞外。由于这类蛋白的各功能域结构相对独立，因而这些功能域可以被不同的异源蛋白代替，例如被运输的"乘客"蛋白可以被某些合适的异源蛋白取代，这种取代不影响N端信号肽和C端转运功能域的作用
发明内容本发明目的在于提供一种荧光假单胞菌五型分泌蛋白及其构建方法和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为细菌五型分泌蛋白由序列表SEQIDNo.1中的碱基序列组成。细菌五型分泌蛋白的构建方法l)质粒pATl构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，用引物AF11和AR9进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5oc,得质粒pBSAl;将用Seal酶切的质粒pBR322与寡聚核苷酸L11连接，连接液转化大肠杆菌DH5a,得质粒p329;将用EcoRV酶切的质粒p329与用Swal/Smal酶切的质粒pBSAl连接，连接液转化大肠杆菌DH5a,得质粒pATl;所述寡聚核苦酸L11序歹'J为5，-AAATCCCGGTCTAGAATTT-3，；2)质粒pAT2的构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，用引物AF12和AR12进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5cx,得质粒pBSA2，将用Seal酶切的质粒pBSA2回收的2kb片段与用EcoRV酶切的质粒pATl回收的5.lkb片段连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a,得质粒pAT2;3)质粒pAT18的构建以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物ETF6和ETR1进行PCR扩增，产物与Seal酶切的质粒pAT2连接，连接液转化大肠杆菌DH5oc,得质粒pAT18具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列的细菌五型分泌蛋白。所述步骤l)中用Scal酶切质粒pBR322,回收13kb片段，而后将其与寡聚核苷酸Lll用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a。所述步骤l)中用EcoRV酶切质粒p329,回收4Mkb片段；将其与用Swal/Smal酶切质粒pBSAl的回收M0bp片段连接，用T4駆连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a。所述步骤3)中PCR产物与Seal酶切质粒pAT2回收的7.lkb片段于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5a。所述转化入大肠杆菌DH5a后均在含有100ug/ml安卡青霉素、40ug/mlXgal和24ug/ml异丙基-P-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选白色转化子质粒。将所述具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列的细菌五型分泌蛋白在含有100ug/ml的Ap的LB液体培养基中过夜培养，取lml过夜后的培养液将其加入100ml新鲜的LB液体培养基中，于37。C下摇动培养至OD鋼为0.8,而后离心，收集菌液，即得表达具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列的细菌五型分泌蛋白的疫苗抗原，其具有免疫功能。所述以160-200rpm摇动培养，离心条件为5000g,4。C，10min。本发明具有如下优点1.应用性广。本发明的五型分泌蛋白具自我运输功能，不依赖于宿主细胞的蛋白质转运系统，可以将其所携带的异源抗原蛋白成功运至胞外并展示于细菌表面。因而可以在多种革兰氏阴性菌中自我分泌。另外，本发明的五型分泌蛋白对于异源蛋白的结构和大小要求低，能够容忍大型异源蛋白的插入，故可用作不同类型异源蛋白的运输载体。2.高保护率。本发明的Pfa表面展示疫苗对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率达80%。3.省时省力、简单易行。本发明的疫苗抗原制备过程简单，无需蛋白质提取、纯化等。图1为疫苗抗原细菌表面展示图(其中图1:Westernimmunoblot实验检测含有pAT18的DH5oc是否能将疫苗展示到细胞外膜。泳道l:分子量marker;泳道2、3、4分别为细胞外膜蛋白、细胞内蛋白、胞间质蛋白)。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均釆用如下方法l.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(SambrookandRussell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001);3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"，北京。4.所有抗生素的使用浓度如下安卡青霉素Up),100叫/ml;卡那霉素(Kn),50ug/ml;氯霉素(Cm),30ug/ml;四环素(Tc),15ug/ml。实施例1本发明的五型分泌蛋白由序列表SEQIDNo.1中的pfal碱基序列组成。本发明五型分泌蛋白构建方法1)质粒pATl的构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，用下列引物PCR:AF11(5，-CGCGGCGTTAACATTTAAATTGATGACGCACATATCCA-3，)，AR9(5，-CCCGGGATATCAGTACTATTGACCTGAGCTTCC-3，),PCR条件为:94。C60s预变性模板DM，然后94t40s，51°C60s,72°C60s，5个循环后改为94°C40s，66°C60s，72°C60s，25个循环后再在72"C延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于"天根生化科技有限公司"，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5oc后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/mlXga1(5-溴-4--氯-3--乳糖普)和24ug/ml异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养24-30小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为pBSAl。将质粒pBR322(购于"纽英伦生物技术有限公司"，北京)用Seal酶切，回收4.3kb片段，将其与寡聚核苷酸Lll,其中寡聚核苷酸Lll为5'-AAATCCCGGTCTAGAATTT-3，，用T4薩A连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5oc后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取l个转化子，提取质粒，将该质粒命名为p329。将p329用EcoRV酶切，回收4.4kb片段；将上述pBSAl用Swal/Smal酶切，回收650bp片段，将其与前述4.4kb片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取1个转化子，提取质粒，即为pATl。所述LB固体培养基组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97.5%蒸馏水；所述荧光假单胞菌TSS1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2329。2)质粒pAT2的构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，用下列引物进行PCR扩增，引物AF12(5，—AGTACTACGCTGACCGGTGGC—3，)，AR12(5，—CAGTACTATTTAAATTAGAACAGGAAGGTAAACCCG-3，)，PCR条件为:94°C60s预变性模板画A,然后94。C40s,57。C60s，72。C60s,5个循环后改为94。C40s,62°C60s,72°C60s,25个循环后再在72°C延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5cc后在含有Ap、Xgal和IPTG(浓度同上)的LB固体培养基上培养24-30小时，筛选出白色转化子，提取质粒，将其命名为pBSA2。将pBSA2用Seal酶切，回收2kb片段；将上述步骤1)的质粒pATl用EcoRV酶切，回收5.lkb片段，将其与前述Ab片段用TMDNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5cx后在含有Kn的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取1个转化子，提取质粒，即为质粒pAT2。3)质粒pAT18的构建以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用Pfu酶和下列引物PCR扩增保护性抗原基因ETF6(5，-CTCGAGGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCGTCGCCGCCGT-3，，划线碱基为Xhol位点),ETR1(5，-CTCGAGCCCGGGCTTCAGCAGCGAGAACGCG-3，，划线碱基为Xhol位点)，PCR条件为94aC60s预变性模板DNA，然后94°C40s,58。C60s，72°C60s,5个循环后改为94。C40s，72"C100s，25个循环后再在72"C延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将上述步骤2)的质粒pAT2用Seal酶切，回收7.lkb片段，将其与前述纯化的PCR产物于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5a后在含有Ap的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取1个转化子，提取质粒，得质粒pAT18具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列的细菌五型分泌蛋白。其中所述迟缓爱德华氏菌TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.2330。(a)序列特征*长度3249bp*类型碱基序列*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型双链DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源荧光假单胞菌TSS1(f)特异性名称PfaN端前624个碱基；中间部分中间555个碱基(即碱基625-1179;);C端最后2070个碱基(即碱基1180-3249)。实施例2表面展示型疫苗制备将含有上述实施例1所得具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列的细菌五型分泌蛋白的质粒pAT18的大肠杆菌DH5ot在含有Ap的LB培养基中过夜培养；取lml过夜后的培养液将其加入100ml新鲜的LB液体培养基中，于37"C下转速160r-200pm摇动培养至OD6。。为0.9。而后将细菌培养液离心(5000g,4°C,l(kin),收集菌液，即得表面展示型疫苗。该疫苗由于是插入在五型分泌蛋白Pfa中间，因而被Pfa携带分泌至细胞外，以蛋白质的形式覆于细胞表面，故称其为表面展示型抗原。Westernimmunoblot实验结果表明含有pAT18的大肠杆菌DH5a确实能够通过Pfa将疫苗展示到细胞表面(即外膜)(参见图l)。疫苗的免疫应用步骤1)疫苗的免疫注射。将上述表面展示型疫苗所收集的菌体悬浮于PBS中至终浓度为5xl08cfu/ml,即为疫苗制备液。将60条牙鲆(每条重约14g)随机分为2组，每组30条。将这2组分别命名为A和B组。将A组的每条鱼分别腹腔注射100til上述疫苗制备液。将B组的每条鱼分别腹腔注射100ulPBS。其中PBS组成成分为0.8gNaCl，0.02gKC1，0.358gNa2HPO"12H20，0.024gNaH2P04。步骤2)迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱德华氏菌TX1至OD,为0.5，然后离心(5000g，4。C)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为lxl07cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液。步骤3)以五型分泌蛋白Pfal为基础的表面展示型疫苗的免疫保护效应检测。在步骤1)第一次免疫注射后的第32天，用上述步骤2)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤l)的A和B组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的21天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。21天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，5条；B组，24条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS):RPS=100x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)由此得出疫苗针对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率为80%,故其能够有效地保护牙鲆抵御迟缓爱德华氏菌侵染。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>303540gcccgcatetecaacgccctgageaaagacgcacagctgaagaaagag795AlaArglieSerAsnAlaLeuSerLysAspAlaGinLeuLvsLvsGlu455055gcgcgcgtcgtggtaaccgcctatcaggggcaggtgctgctgaccggt843AlaArgValValValThrAlaTvrGinGlvGinValLeuLeuThrGlv606570caggcgccaagecaggcgctgattagecgcgccaagcagategcgatg891G]nAlaProSerGinAlaLeulieSerArgAlaLysGinlieAlaMet758085ggcgttgaaggcaccaaggcggtctataatgagatecgttt.aggccag939GlvValGluG1yThrLysAlaValTyrAsnGlulieArgLeuGlvGin909^100105ccggtcagectgggcactgccteggccgatgcctggateaccaccaag987ProValSerLeuGlvThrAlaSerAlaAspAlaTrplieThrThr匕vs110115120gtccgcteccagctgctggccagegaccaggtgaaatecaccaacgtg1035ValArgSerGinLeuLeuAlaSerAspGinValLvsSerThrAsn\^125130135aaggtgaccaccgaaaatggcgaggtcttcctgctggggctggtgacg1083LysValThrThrGluAsnGlyGluVa_lPheLeuLeuGlyLeu寸"Thr140145150cccaaagagProLysGlu155ggacaggccgccgcgcaaacggccG1yGinAlaAlaAlaGinThrAla160agtaaagtcSerLvsVal165agegggSerG]y1131gtaaaacatValLysHis170gtcactaccgcgttct.cgctgctgValThrThrAlaPheSerLeuLeu175180aagetcgagLysLeuGlu:cccgggPro6iv1851179acgctgaccggtggccgcscctacgacaacctgcaaccggtgcatgatgcgccgccgggt1239acgccgcaagtgccaggtgtggtcagtggttggggcttgcccaacctgcaaaaagccatg1299caagggceggggcagttcttcggtgcggtggcagtggctt,tgcccagcggt,acccgcgat1359atctgggctaacccgatttcegatgaageeattcgcgcccgtcgegtagaggacgctgcc1419gaacaggegacctgggccgcca,ctaaagcgca^^iggctggctcaatggcctgcccgcc1479aatgcct.cggccgatgatcagttcgaatacgaeateggtcatgcccgggagcaggcaaca.1539ctcacccgcggccaggacgcgctcacgggcagtacctacgtcggt,agcctggt,ca.agtcc1599gg哪tggcgagctggtgctggaaggccagaacagctat"tcgggcagcacUgggtacgc1659ggtggca犯ttgtcggtg印cggcgcgUgacctctgccgtgacggtergatggcagcgcc1719gtgggcatgcgeaatgeegat朋cggcgtgatgaccacac"tgggeggcaccct,ggccggc1779aaeggcaeggtgggtgccttgaccgtcaacaaeggegggegagtggccccggggcattcg1839attggcacgctgcgcaccggcgatgtcatgttcaatcegggttcggtgtatgccgt.cgaa1899gtCggCgCC3atggtca.gagcgaccagctccagagcaatggcgtggcgactetcaaeggt1959ggtgtggtgaacgtgtccctggag獄agccccaatctgttgaccgccaccgaggcgcgc2019agettgetgggecagcagttcactatcctcagcgccagccaaggcatxcaggggcagttt.2079gcggcgtccgCCCCC肪Ct3CCtgttC3tt,ggcactgcgctcaactatcaaccgaaccag2139ttgaccctggCg3t3gCCCgc朋ccagaccacctccgccagCgtC,gCgC3aacc,cgc.aat2199gsgeggteggtggegaeggeagecgagacatlgggcgctggcagcccggtctacgaaagc2259ctgctggcgtcggattccgccgctcaggcgCggg33gggttcaggcaactgtcggggcaa2319<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1.一种细菌五型分泌蛋白，其特征在于具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列。2.—种按权利要求1所述的细菌五型分泌蛋白的构建方法，其特征在于l)质粒pATl构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，用引物AF11和AR9进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5cx，得质粒pBSAl;将用Seal酶切的质粒pBR322与寡聚核苷酸Lll连接，连接液转化大肠杆菌DH5a，得质粒p329;将用EcoRV酶切的质粒p3"与用Swal/Smal酶切的质粒pBSAl连接，连接液转化大肠杆菌DH5cx,得质粒pATl;所述寡聚核脊酸Lll序歹寸为5，一AAATCCCGGTCTAGAATTT—3，；2)质粒pAT2的构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，用引物AF12和AR12进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5oc,得质粒pBSA2，将用Seal酶切的质粒pBSA2回收的2kb片段与用EcoRV酶切的质粒pATl回收的5.lkb片段连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，得质粒pAT2;3)质粒pAT18的构建以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物ETF6和ETR1进行PCR扩增，产物与Seal酶切的质粒pAT2连接，连接液转化大肠杆菌DH5a,得质粒pAT18具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列的细菌五型分泌蛋白。3.按权利要求2所述的细菌五型分泌蛋白的构建方法，其特征在于所述步骤l)中用Seal酶切质粒pBR322,回收4.3kb片段，而后将其与寡聚核苷酸Lll用T4讓A连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5cc。4.按权利要求2所述的细菌五型分泌蛋白的构建方法，其特征在于所述步骤l)中用EcoRV酶切质粒p329,回收4.4kb片段；将其与用Swal/Smal酶切质粒pBSAl的回收65Qbp片段连接，用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a。5.按权利要求2所述的细菌五型分泌蛋白的构建方法，其特征在于所述步骤3)中PCR产物与Seal酶切质粒pAT2回收的7.lkb片段于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5a。6.按权利要求2所述的细菌五型分泌蛋白的构建方法，其特征在于所述转化入大肠杆菌DH5a后均在含有100ug/ml安卡青霉素、40ug/mlXgal和24ug/ml异丙基-p-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选白色转化子质粒。7.按权利要求l所述细菌五型分泌蛋白的应用，其特征在于将所述具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列的细菌五型分泌蛋白在含有100ug/ml的Ap的LB液体培养基中过夜培养，取1ml过夜后的培养液将其加入100ml新鲜的LB液体培养基中，于37"C下摇动培养至OD融为0.8，而后离心，收集菌液，即得表达具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列的细菌五型分泌蛋白的疫苗抗原，其具有免疫功能。8.按权利要求7所述的细菌五型分泌蛋白的应用，其特征在于所述以160-200rpm摇动培养，离心条件为5000g,4UC,10min。全文摘要本发明涉及分子生物学、基因工程及免疫学领域，具体的说是一种细菌五型分泌蛋白、其自我运输和表面展示功能在疫苗抗原表达及传递中的应用。具体为所述五型分泌蛋白具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列，其应用方法以荧光假单胞菌TSS1为模板，通过PCR获得五型分泌蛋白基因，用其构建质粒pAT2；以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，通过PCR获得抗原蛋白基因，与质粒pAT2连接而得表面展示型质粒pAT18，后者转化入大肠杆菌，即得细菌表面展示型保护性疫苗，可以直接接种免疫。文档编号C07K14/21GK101456905SQ200810237788公开日2009年6月17日申请日期2008年12月5日优先权日2008年12月5日发明者黎孙,胡永华申请人:中国科学院海洋研究所