一种炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体的制作方法

专利名称：一种炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种突变的炭疽芽胞杆菌保护性抗原的基因及其编码蛋白。
背景技术：
炭疽病(anthrax)是由革兰氏阳性的炭疽芽胞杆菌(Aac//^^朋M/"sc")引起的人，畜和野生动物 共患的一种急性、热性、败血性传染病。因为可引起皮肤等组织发生黑炭状坏死，故称为"炭疽"。1849 年德国著名学者考克首先发现了炭疽芽胞杆菌，其后炭疽曾在世界各处多次散发或暴发。炭疽病不仅给人 类生命健康带来威胁，更为世界的畜牧业带来巨大的经济损失。
炭疽病的致病因子主要包括由内生质粒pOT-7编码的细菌荚膜和由质粒pOr-i编码的外毒素。前者的组 成为带负电荷的多聚D谷氨酸，它能够抵御吞噬细胞的吞噬作用以及血清中的阳离子的降解，从而使菌体 细胞能够在体内大量繁殖。后者是炭疽芽胞杆菌主要的致病因子，由保护性抗原(PA, 83kDa),致死因 子(LF, 90 kDa)和水肿因子构成(EF, 89 kDa)组成。PA主要作用是与细胞表面特定的受体结合，并转运 LF和EF进入细胞。LF是有776个氨基酸残基构成的锌离子依赖型的金属蛋白酶，能够特异性结合并且切割 有丝分裂蛋白激激酶家族(MAPPK)的N端，如MEKi, MEK2, MKK3, MKK4, MKK6,和MKK7 。 MAPM的切割 进一步阻断了包括细胞外信号调节激酶(ERK) , p38和J服等细胞信号转导途径，进而导致细胞裂解 (Duesbery and Vande Woude 1999; Vitale, Blanset et al. 2006) 。 EF是由767个氨基酸组成的一种 依赖与钙离子的腺苷酸环化酶，能够催化细胞内的ATP转化为cAMP(Collier and Young 2003)，使得细胞 内外水份失衡进而导致水肿。在致病时，炭疽毒素的单一成分不能发挥作用，水肿因子或致死因子必须与 保护性抗原结合成水肿毒素(EF + PA， EdTx)或致死毒素(LF+PA， LeTx)才具有致病作用。炭疽毒素致 病的过程为保护性抗原与细胞表面的受体肿瘤内皮标志物8 (TEM-8)或毛细管形态生成蛋白2 (CMG-2) 结合(Bradley， Mogr丄dge et al. 2001; Scobie， Rainey et al. 2003)后，被细胞表面弗林类酶特异性 地切割后释放出氨基端20kDa (PA20)的多肽片段，剩下的结合于受体的63 kDa (PA63)形成一个七聚体， 然后七聚体自发地结合LF或EF或同时结合LF和EF，形成一个多聚体复合物。该复合物在细胞表面辅助受体 LPR6的协助下，内吞入胞内。内吞体在胞内酸性环境的诱导下，PA63发生构象重排，插入到内吞体膜中， 形成一个通道。此时，结合于七聚体的EF或者LF在离子梯度和跨膜正电势差的作用下被拉入孔道，迸入受 体细胞，进而发挥致病作用(Young and Collier 2007)。
目前针对炭疸病治疗的药物主要是抗生素和保护性抗原特异性的抗血清。前者主要包括青霉素，四环 素，链霉素，脱氧土霉素，乙酰红霉素，环丙沙星等，后者主要是来源于志愿者的血清。这些传统的药物 和治疗手段存在诸多的缺陷第一抗生素治疗只能杀掉体内感染的炭疸芽胞杆菌菌体'而对于存在巨大潜在危害的芽胞却无能力；第二，对于感染后期的人，因大量的外毒素已经分泌到血液中，抗生素并不能将 其清除；第三，因为目前大量的抗生素的使用导致病原菌都出现了很强的耐药性，第四，对于治疗炭疽病， 这些抗生素都需要很大的剂量，并不适用丁-那些对抗生素过敏的特殊人群。而抗血清治疗虽然能够清除分 泌到血液中的炭疽外毒素，但也存在譬如血淸来源有限，患者注射后出现过敏反应等诸多问题。因此开发 新型高效安全的炭疽病治疔药物己成为全球面临的挑战和各个国家研究的热点(Baillie 2006)
随着人们对炭疽芽胞杆菌致病分子机制的深入认识，很多治疗靶点己经被利用来开发新型的炭疽治疗 药物，这些药物主要是通过干扰或者阻断外毒素的作用途径而发挥功能。目前已经开发的抗毒素药物有一 下几种第一，阻断保护性抗原与与受体结合，主要包括PA的单克隆抗体和可溶性的受体分子，它们通 过与细胞表面的两类受体竞争结合PA而发挥作用；第二，阻断PA的激活类试剂，主要是人工合成的D型 精氨酸六聚体，它能够抑制细胞表面弗林类酶的活性，从而阻断PA的激活第三，干扰LF或EF结合PA63 的七聚体，主要有LF或EF单克隆抗体，LF结合功能域(LFn)的多聚体，人工合成的寡肽等；第四，阻 断毒素的转运，包括能够与野生型的PA结合并形成七聚体但能阻止H'诱导的跨膜通道的形成，以及一些 能够堵塞七聚体形成的跨膜通道的小分子物质第五，阻断致死因子和水肿因子的作用，包括这些酶作用 的底物类似物和酶的小分子抑制剂。目前这些药物基本都处于细胞水平试验或小动物水平的研究(Rainey and Young 2004)。

发明内容
本发明的H的在于克服现有技术缺陷，通过体外诱变，结合高通量筛选，获得炭疽芽胞杆菌保护性抗 原蛋白突变体。体外细胞毒性分析表明，该突变体细胞毒性丧失，但能够抑制野生型炭疽芽胞杆菌保护性 抗原的细胞毒性。
本发明提供了一种新型的炭疽抗毒素蛋白。
具体地，申请人提供了一种炭疽芽胞杆闺保护性抗原的突变体基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO: 1所述，序列全长为2208bp，编码735个氨基酸。在该序列表的SEQ ID NO: 1的1130bp处有1个 T130-A1310的碱基突变。
基于上述基因的序列，申请人明确了这种炭疽芽孢杆菌保护性抗原的突变体蛋白氨基酸序列，其具有 如序列表SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，在该氨基酸序列的第377位有1个氨基酸突变，即由缬氨酸 突变为谷氨酸。 更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO: l是本发明炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体基因和编码的蛋白的核苷酸序列和氨基酸序 列；
图l:是本发明实施例l中pGEX-PA质粒图谱； 图2:是本发明实施例4的突变体库的构建过程；图3:是本发明实施例l纯化的炭疽芽胞杆菌保护性抗原(PA) SDS-PAGE分析； 图4:是本发明实施例6纯化的炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体(mPA) SDS-PAGE分析； 图5:是本发明实施例6炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体(mPA)细胞毒性分析； 图6:是本发明实施例6炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体(mPA)体外抗毒素分析； 图7:是本发明实施例l中载体pGEX-KG图谱；
具体实施
实施例l炭疽芽胞杆菌保护性抗原基因的克隆与蛋白的制备
本发明中涉及炭疽芽胞杆菌保护性抗原基因户站的克隆及其相关突变体的克隆，其主要操作包括
(1) 引物设计与合成
根据NCBI GENEBANK公布的pag基因核苷酸序列(登录号YP—016495)设计合成如下引物对正向引 物(PA-F' ):5' -ATTGGATCC GAA GTT AM CAG GAG AAC-3'，包含feMH限制性酶切位点(下划线为酶切 位点)；反向引物(PA-R' ):5， -ACCG CTCGAG TTA TCC TAT CTC ATA GCC-3'，包含J力oT限制性酶切位 点(下划线为酶切位点)。上述引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
(2) 模板制备
将兽用炭疽芽孢杆菌芽孢疫苗(该菌种购自于新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)用5mL的LB培 养基(1%胰蛋白胨，1%氯化钠,0. 5%酵母粉，pH7. 0)，培养过夜后，收集l. 5mL的菌液,12000rpm离心lmin 收集菌体，然后用去离子水洗涤一次后再次离心收集，加入500uL的去离子水重悬菌体后，置于100'C沸 水浴，5分钟后离心取上清冻存于-2(TC，作为扩增尸站的模板使用。
(3) PCR扩增 PCR体系如下
IOXPCR缓冲液(购自宝生物工程(大连)有限公司，即TAKARA公司，下同)
模板 5 uL
d, (10mM) 1 "
模板 1 PL
正向引物PA-F' (10uM) 1 uL
反向引物PA-R' (IOiiM) 1 UL
尸A DNA聚合酶(购自TAKARA公司) 1 u L
加去离子水至50 uL。
PCR条件95°C预变性4min; 95°C ， 40s; 55°C， 30s; 72°C 2s 30min, 30个循环；72°C延伸10min， 4°C 5min 。 (5)酶切PCR产物和表达载体pGEX-KGPCR产物用限制性内切酶Sa///HI-酶切，酶切反应体系为酶解缓冲液，5 wL; 5a/zfll, ， 2 u L; Wol， 2uL (上述试剂均购自TAKARA公司)；PCR产物，41uL。混匀后置于37。C保温6小时。表达载体 pGEX-KG，图谱见图7 (农业微生物学国家重点实验室动物细菌学实验室郭爱珍教授惠赠)酶解体系和条件 同上一致。
(6) DNA凝胶回收
本发明中涉及到的DNA的纯化均使用试剂盒QIAquick GEL Extraction Kit (购自德国Qiagen公司)， 操作参照产品说明书。具体过程是在紫外灯下将目的条带切下来后至于1.5mL的离心管中，每100mg加 入300uL的QG缓冲液(上述试剂盒自带)，加5(TC水浴锅温浴8min,直到凝胶全部融化。将溶胶液加 入到吸附管12000rpm， 4'C离心lmin，加入750 u L PE缓冲液离心洗脱lmin,加入50 u L去离子水洗脱收 集DNA。
(7) 连接 连接体系
10X连接酶缓冲液 1 u L
双酶切的PCR产物 6uL 双酶切的载体 2uL T4 DNA连接酶(购自TAKARA公司) 1 u L
混匀后，16'C保温过夜。
(8) 转化
将连接混合物与100 u L大肠杆菌感受态细胞￡ coh' DH5 a混合，冰浴放置30分钟，再42'C处理90 秒，加800 u L LB培养基37'C保温45min，涂布于含100 Pg/mL氨苄青霉素阆体LB平皿，37'C培养14小 时，挑取转化子并且抽提质粒。
(9) 序列分析
以pGEX-KG载体的通用引物(5-GGCMGCCACGTTTGGTG-3)为测序引物，以步骤(8)中的质粒为模板进 行测序(由上海生工生物工程技术有限公司完成)。构建好的表达载体图谱如图1所示,命名为pGEX-PA。 实施例2炭疽芽孢杆菌保护性抗原蛋白的表达、纯化与分析 (1)重组蛋白的表达
将重组质粒pGEX-PA转化到宿主细胞大肠杆菌￡ BL21 (DE3)(操作步骤参照实施例1中的转化 部分)。将过夜活化的转化子以1%体积的接种量转接至1L含100M/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，37°C 培养2-3hrs,使OD600达到0. 6-0. 7，加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0. 2mM， 15°C 200 转/分钟培养8小时。离心收集菌体'然后用PBS缓冲液(140.0iiM氯化钠，2.7 mM氯化钾'10. 0 mM磷 酸氢二钠，1.8 mM磷酸氢二钾，pH 7.4)洗涤一次，再用50mL PBS缓冲液悬浮，然后用高压细胞破碎仪 (购自美国THERMO公司)破碎细胞。细胞破碎液于4。C、 12000转/分钟离心30分钟'收集上清。(2) 蛋白的纯化
本发明利用还原性谷胱甘肽(GST) (Nilsson, Stahl et al. 1997)亲和纯化重组蛋白PA以及突变体, 具体操作步骤如下(所有操作均在4'C进行)
1) 装柱取2 mL亲和填料GSH S印harose 4 B (购自Amersham - Pharmacia公司)层析柱中，用50mL PBS 缓冲液洗脱平衡；
2) 结合将细胞破碎液的上清以1.0mL/min的流速过柱；
3) 流洗用IOO mL PBS缓冲液洗脱没有结合的杂蛋白，流速控制在l. OmL/min以下；
4) 酶解取10uL浓度为10 unit/nL的凝血酶(Thrombin)(购自Merck公司)与lmL的PBS缓冲液混匀， 加入层析柱酶切混匀后4X:酶解16小时；
5) 收集蛋白收集步骤(4)中PBS缓冲液至1.5raL的离心管中，再加lmL PBS缓冲液第一次洗脱收集；
6) 去除凝血酶:将步骤(5)中收集的蛋白经过苯甲脒琼脂糖凝胶(购自Amershara-harmacia公司)去除 Thrombinj
(3) 本发明中检测炭疽芽孢杆菌保护性敏感抗原及其突变体所用到的致死因子(LF)的制备方法参照文 献4(Cao， Liu et al. 2008)。
(4) 纯化蛋白的检测和定量 本发明中涉及到蛋白的检测均使用12。/。的SDS-PAGE分析。配方如下
浓縮胶浓度为5%:
ddH20 1.4mL
30% Acr-Bis (体积比29:1) 0. 33mL
1M Tris-HCL， pH8. 8 0. 25mL
10%十二烷基磺酸钠(SDS) 0.02mL
10%过硫酸铵 0.02mL
四甲基二乙胺(TEMED) 0.002mL 分离胶浓度为12%:
d孤O 1.6mL
30% Acr-Bis (体积比29:1) 2mL
1M Tris-HCL, pH8. 8 1.加L
10% SDS 0. 05mL
10%过硫酸铵 0.05mL
四甲基二乙胺(TEMED) 0. 002mL
检测方法取10uL纯化的蛋白样品，加等体积的蛋白上样缓冲液(2X上样缓冲液配方lOOmm/L Tris-Cl (pH6.8)， 200咖/L 二硫苏糖醇，4% SDS, 0.2%溴酚蓝，20%甘油),沸水浴5-lOrain,然后上样IOpL，以低分子量的蛋白Marker作为对照(购自FERMENTAS公司)。纯化的PA SDS-PAGE结果见图3所示。 (5)蛋白浓度的测定
本发明中涉及到的蛋白质的定量均使用Bradford蛋白定量检测试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限责 任公司)。具体步骤如下
1) 取4UL蛋白标准品(购自上海生工生物工程技术有限公司)力口PBS缓冲液稀释至100itL，使终浓度为 200ug/mL。
2) 取稀释后的标准品按O， 1, 2， 4， 6， 8， 10， 15uL分别加到96孔板中，力QPBS缓冲液补足至20 u L,每 孔蛋白含量分别为O, 0.2, 0.4， 0.8, 1.2, 1.6， 2和3Pg，每个梯度重复3次。
3) 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS缓冲液到20ixL，重复3次。
4) 各孔加入200uL Bradford Reagent,混匀，室温放置5min。
5) 用预热的酶标仪(Thermo Scientific公司)测定A595值。
6) 绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。 实施例3细胞培养与细胞毒性检测
小鼠的单核细胞系MW264.7 (购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)用含10%胎牛血清(购自 杭州四季青生物工程材料有限公司)的D舰M卨糖培养基(购自美国Proraega公司)在37。 C ，含5%0)2， 95% 空气的培养箱(购自日本SANYO公司)中培养。细胞传代用胰酶二乙胺四乙酸〔EDTA)消化液(购自碧云 天生物技术研究所)消化细胞后接种于96孔培养板(购自CORNING公司)，待细胞生长至每孔1.5X1(T1 个细胞时，吸弃培养液，再加入100uL含有待检测样品的DMEM高糖培养基，继续培养三小时，然后每孔 加入荧光染料ALamarBLueM(购自英国AbD Sei-otec公司)10 u L,将培养板用铝箔包裹后置于培养箱中继 续培养4h。采用酶标仪(购自美国BioTek公司)读取每孔的荧光值。读数参数为激发光530nm,发射 光590nm。细胞相对活性按照如下公式计算
细胞相对存活率％= J口口口孑L,她-藩掘^雌x謂。/。 — 、活细胞7L的荧光值-对照孔的荧光值
说明对照孔为致死毒素(PA和LF各l.(Uig/mL)处理；活细胞孔为不加毒素。 实施例4炭疽芽孢杆菌保护性抗原突变体库的构建
本发明采用易错PCR的方法构建PA的突变体库，具体操作如下
(1) 根据功能域二两端的序列设计合成如下引物(Petosa, Collier et al. 1997) PADII-F: MGTCCATGCGTCGTTCTTTGATATTG,
PAD II -R:TCITCAATTTGCGGTACCACTTCACTCCAG 正向引物PADI1-F和反向引物PADII-R分别含有Sp力I和7T;ml酶切位点(以下划线表示)。
(2) 以实施例l中构建的载体pGEX-PA作为模板'PADII-F和PADI1-R为引物'采用低保真度的DNA聚合酶(购自于Clontech公司)扩增功能域II。 PCR体系如下:
IOXPCR缓冲液(购自TAKARA公司) 5 yL
dNTP (10mM) 1 uL
模板pGEX-PA 1 uL
PADII-F (lOuM) 1 uL
PADII-R (lOuM) 1 yL
低保真度的&。聚合酶 1 uL
加无离子水至 50 uL
PCR条件95。C预变性4min; 95°C 40s; 55°C， 30s; 72°C lmin， 20个循环；72°C延伸8分钟，4°C 5分钟。
(3)双酶切将步骤(3)中的PCR产物和模板pGEX-PA用^^I和J/wI进行双酶切，并回收酶切产物。酶 切产物回收后用T4连接酶连接，并将连接产物转化感受态细胞￡coh'BL21(DE3)，涂布于含有IOO ug/mL氨苄青霉素(A即)LB培养板。所有转化子即为PA突变体库。本实施例中的具体操作如同实施 例2，实施过程见图l所示。 实施例5 PA突变体筛选
突变体的筛选方法如下
(1) 挑取实施例4中的转化子接种于含有1.0mL LB培养基中(附加IOO w g/mL Amp, 0. 2mM IPTG)，固定 于16'C的摇床，200 rpm培养12小时，诱导蛋白的表达；
(2) 向步骤(1)诱导后的菌液中加入IO uL的Ecoh'T7噬菌体(购自Novagen公司)，37°C， 200rpm 继续培养约三小时，直到菌体完全裂解而澄清，即为细胞裂解液；
(3) 将步骤(2)中的细胞裂解液置于4'C的离心机，12000rpm离心10min后，取上清并冻存于-20°C;
(4) 吸取10y L裂解液上清与90y L含有l. 0 u g/u L致死因子LF(来源见实施例1所述)的DMEM高糖培养基 混匀后，加入到接种有小鼠单核细胞系RAW264.7的96孔培养板，分析突变体的细胞毒性。操作方法同 实施例3;
(5) 将步骤(4)中检测到的无毒性的突变体的裂解液10uL与90nL含有1.0yg/mLPA和1.0 ug/yLLF 的DMEM高糖培养基混匀后，加入到接种有小鼠单核细胞系RAW264. 7的96孔培养板，分析无活性突变体 对野生型炭疽毒素的抑制作用。操作方法同实施例3;
(6) 对步骤(5)中筛选到得的突变体进行序列分析；
以pGEX-KG载体通用引物(5-GGCMGCCACGTTTGGTG-3)为测序引物，以步骤(5)中筛选到得突变体的质粒 为模板进行测序。
实施例6炭疽芽孢杆菌保护性抗原突变体的活性分析与体外抗毒素活性分析
(1)表达，纯化实施例5中获得的炭疽芽孢杆菌保护性抗原突变体(以下縮写为mPA)，具体操作步骤参照实施例l。纯化得到的mPA的SDS-PAGE分析结果如图.4。
(2) 分别将O. lu gZmL, 0. 5ug/mL， 1.0iig/mL， 3. 0ug/mL， 5. 0u g/mL的mPA与含有1. 0 u g/mL LF的 DMEM高糖培养基混匀后，加入到接种有小鼠单核细胞系RAW264. 7的96孔培养板，分析突变体的活性， 操作方法同实施例3，结果如图5。
(3) 分别将O u g/mL, 0. 25 u g/mL, 0. 5 u g/mL， 0. 75 u g/raL， 1. 0 u g/mL, 2. 0 u g/mL mPA与含有致死毒 素(1. 0 u g/mL PA+1. 0 u g /mL LF)的DMEM高糖培养基混匀后，S卩mPA与PA的比例分别为O, 0. 25, 0. 50, 0.75, 1.00, 2.00，加入到接种有小鼠单核细胞系RAW264.7的96孔培养板。分析mPA对野生型PA的抑 制作用，操作方法同实施例3，结果如图6。
参考文献
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〈141〉 2008—12—05
<160〉 2
Patentln version 3. 1 1
2208 DNA
炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)
g6朋
(l)..
(2208)
mutation (1130).. (1130)
CDS
(1). . (2208)
〈170> 〈210> <211〉 <212> 〈213〉 〈220〉 <221> <222> <223〉 <220> <221> <222> <223> <220> <221〉 〈222> <223> 00〉 1
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〈211〉 735
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〈213〉炭疽芽胞杆菌
(Bacillus anthracis)
〈400〉 2<image>image see original document page 15</image>340 345 350
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lie Lys Lys lie Leu lie.Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu lie Gly 725 730 73权利要求
1、一种炭疽芽胞杆菌保护性抗原的突变体基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO1所述。
2、 一种炭疽芽孢杆菌保护性抗原的突变体蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所述。
3、 根据权利要求1所述的一种炭疽芽胞杆菌保护性抗原的突变体基因，其核苷 酸序列表SEQ ID NO: 1的l懸p处有1个T1310-A1310的碱基突变。
4、 根据权利要求2所述的一种炭疽芽孢杆菌保护性抗原的突变体蛋白，在序列 表SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列第377位的缬氨酸被谷氨酸替代。
全文摘要
本发明属于微生物基因工程技术领域。具体涉及一种炭疽芽孢杆菌保护性抗原的突变体及其编码蛋白。所述突变基因的序列及其编码的突变蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO1所示。经过生物学验证，该突变体蛋白完全丧失细胞毒性，且能够抑制野生型致死毒素的细胞毒性。
文档编号C07K14/32GK101434960SQ20081023696
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者刘子铎, 吴高兵, 封纯芳, 莎 曹, 洪玉枝, 郭爱珍 申请人:华中农业大学