专利名称：人类附睾表达精子结合蛋白hel-18及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术与医学领域。具体地说，本发明涉及一种新的人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18及其编码基因与应用
背景技术：
本世纪人类的发展面临着两个严峻的问题一方面，全球人口在急速膨胀，预计在2050年将达到90亿；另一方面，据世界卫生组织调查，大约15%的夫妇存在着不育问题，发达国家不育症的发病率在最近IO年飚升，欧洲发达国家可高达30%，其中男性因素约占一半。世界卫生组织预测，随着环境污染和性传播疾病等致病因素的增加，本世纪，不育症将成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病。但男性不育并未引起社会和医学界的足够重视，因此有关男性生殖健康的研究进展缓慢，明显落后于其它学科。缺少分子生物学层面诊断与治疗不育症的有效方法。由于精子发育障碍不能自然受精，需要医生通过做试管婴儿获取后代。利用此种技术获取后代，不仅耗费了宝贵的时间与资金，而且存在很多影响健康的潜在因素，失去了正常生育过程中精卵天然结合、优势选择遗传后代的机会。给家庭与社会带来了沉重的精神和经济负担。 全世界人口的急剧增长造成了资源耗竭和环境恶化，成为人类健康与生存的严重威胁。当前世界人口已超过60亿，据专家估计，中国资源环境能支撑的最大人口容量为15-16亿。目前可供人类选择的避孕措施还很有限，离"高效、安全、可逆"的标准还相差较远。发展安全有效、先进实用的避孕节育新技术、新产品，以满足不同人群、不同层次的避孕用药的个性化要求是近年来国内外避孕节育技术发展的总趋势。 附睾是精子成熟的重要器官，睾丸产生的精子需要通过与附睾管腔微环境相互作用才能获得运动、受精、防御和维持正常胚胎发育以及防御等生物学功能。附睾内大约有200余种分泌蛋白与精子相互作用，参与精子成熟过程，但是人们对这些蛋白的功能知之甚少。与精子成熟相关的附睾蛋白的研究将有助于推动男性生殖医学的研究进展，为男性不育症的诊断和治疗以及开发新型避孕药物提供侯选分子靶标，同时有可能对附睾环节的男性避孕带来新的思路和突破。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新的人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18。
—种人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质或多肽。 本发明的人附睾分泌蛋白命名为HEL-18，由406个氨基酸残基组成。HEL-18蛋白存在有1个酰胺化位点，7个N-十四烷酰基化位点和11个磷酸化位点，包括5个酪蛋白激酶II磷酸化位点和6个蛋白激酶C磷酸化位点。而且，分子中含有1个Homocysteine结合功能域。
本发明的第二个目的是提供编码人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18的基因。它是下列核苷酸序列之一序列表中序列1的DNA序歹lj， GenBank注册号为EU794592 ;
编码序列表中SEQ ID No. 2蛋白质序列的多核苷酸； 与序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。 序列表中的SEQID No. l，全长cDNA序列为2515bp，定位于人5号染色体上，编码406个氨基酸，编码蛋白为HEL-18，含有信号肽，其开放阅读框为1221bp，是一个完整的读码框。 本发明的第三方面，提供了采用基因工程技术制备具有人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞。 本发明的第四方面，提供了与上述人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18特异性结合的抗体，以及由此开发的用于附睾功能异常所致的不育症的辅助诊断。
本发明的第五方面，提供了检测样本中是否存在人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18的方法，它包括将待测样品与分泌蛋白的特异性抗体在一定条件下共同作用，观察是否形成抗原抗体复合物，有抗原抗体复合物形成就提示样品中存在分泌蛋白。
本发明的第六方面，提供了本发明蛋白和其编码序列的用途。例如本发明蛋白可被作为诊断不育症的分子靶点，或作为有效药物成分用于治疗不育症，或作为开发新型避孕药物的靶分子，或被用于筛选促进人类附睾表达蛋白HEL-18活性的激动剂，或被用于筛选抑制人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18活性的拮抗剂，或被用于肽指纹图谱鉴定。根据人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18的编码序列或其片段，可设计引物或探针用于PCR或核酸杂交，或者用于制备基因芯片。本发明蛋白还可用于药物组合物，以此作为有效活性成分，用于生产一种对抗病原微生物感染以及肿瘤等疾病的药物。 本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含本发明所述的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞，以及药学上可接受的载体。 本发明的蛋白能够在附睾内特异性表达，定位于精子头后部，因此可能与精卵识别有关。因为它是一种天然的蛋白多肽，可以预见可能具有较少的副作用，本发明的其他优点可从以下的详细描述获知。
图.1HEL-18蛋白在人精子上的免疫荧光定位 红色荧光显示精子核；绿色荧光显示HEL-18蛋白在精子上的定位； A组阳性对照，A3显示HEL-75蛋白结合于整个精子(文章已发表)； B组阴性对照。 C组HEL_18蛋白定位，C3.显示HEL-18蛋白结合在精子头后部区域。 比例尺5mm。 图2HEL-18基因组织表达图谱 1附睾头2附睾体3附睾尾4睾丸5心6肝7脾8肾9胃10阴性对照
图3. HEL-18蛋白在附睾液表达的western blot结果 M -Marker ;1 :阳性对照，HEL-75蛋白；2 :阴性对照，小鼠血清;3 :HEH8蛋白
本发明的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的变异 形式，这些变异形式包括(但并不限于)相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为 1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳的1-10个)氨基酸的缺失、插入和取代。另 外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地 为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)，在本领域中，用性能相近或相似的 氨基酸进行取代时，通常不会改变氨基酸的功能，提供功能相似氨基酸的保守性置换表是 本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸；脂族甘氨酸(G)、丙氨酸 (A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I);芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);碱性精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);酸性天冬
氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了蛋白的片段或衍生物，条件是该片段或衍生
物保留了所希望的蛋白生物活性。 本发明的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对 于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引 物，用本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得有关序列。 这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得 到有关序列。 本发明中，使用本领域技术人员已知的常规方法将包含编码本发明的蛋白的核苷
酸序列插入到载体中，这些方法包括但不限于体外重组DNA技术，体内重组技术等。 上述载体可用于转化或转染适当的原核和真核细胞，以使其能够表达所编码的本
发明的蛋白，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞，或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是
高等真核细胞，如昆虫细胞等。可采用的转化、转染方法包括但并不限于磷酸钙共沉淀法、
显微注射、电穿孔、脂质体介导等。 本发明的蛋白在细胞内表达，如果需要，可利用其物理的、化学的和其他特性通过 各种方法分离和纯化表达产物，这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包 括但不限于常规的复性处理、用常规的蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、声 波破菌、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种层析技术 及这些方法的结合。 本发明还包括对蛋白或其片段具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，还包括具 有免疫活性的抗体片段或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分 的抗体。 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化
的基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，本发明
的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。 发明人通过研究进一步发现，该蛋白定位于成熟精子的头后部(图l)，在附睾、
心、肺组织有微量表达(图2)，发明人在大肠杆菌中表达了人HEL-18蛋白，用其免疫小鼠，
获得了其多抗血清。发明人用Western blot在附睾体部检测到一条40KD左右条带(图3)。
本发明的药物组合可根据各种需要制成各种剂型，通常可将药物组合物制成可注 射剂，例如液体溶液或悬浮液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、溶液载体的固体 形式，脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中，本发明的药物组合物可由医师根据 患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用， 为了提高用药效果，本发明的蛋白也可以与其他药物共同使用。 下面结合具体实例，进一步阐述本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围，除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组 DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下面文献中有完 整的描述例如Sambrook《分子克隆实验指南》第二版(1989);《DNA克隆》第I和第II巻 (D. N. Glover编辑，1985);《寡核苷酸合成》(M. J. Gait编辑，1984);《核酸杂交》(B. D. H謙s 和S。 J。 Higgins编辑。1984);《蛋白质纯化；原理和实践》第2版(Spring-Verlag，N. Y.)， 以及《实验免疫学手册》I-IV巻(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)或者，可以按照试 剂生产商所提供的说明书进行。
具体实施例方式
具体实施例方式
实施例l.采用基因工程技术制备人类附睾表达蛋白HEL-18
基因克隆及序列分析 对本实验室构建的人附睾cDNA文库进行大规模测序筛选，获取表达序列标 签(EST)，利用Unigene数据库进行电子克隆，获得人HEL-18全长cDNA。使用E邓asy Translate tool (http://us. expasy. orghttp://us. expasy. org)， InterProScan(http:// www. ebi.ac.uk/Tools/http://www. ebi.ac.uk/Tools/) 禾口 Protein 代 roteinblast(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/)等预测HEL-18肽序列及假定功能。SignalP (http: 〃www. cbs. dtu. dkhttp:〃www. cbs. dtu. dk) ， PS0RTII和WoLFPSORT (http: 〃psort. nibb. ac. jp)等软件分析预测该蛋白 的信号肽及胞内定位。ProfileScan(http:〃myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCANhttp:〃 myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCAN)预测N端糖基化和磷酸化位点。
对获得的人HEL-18全长cDNA，根据生物信息学预测编码HEL-18的基因序列 设计一对特异引物FOl :5' -TTGGTACCGACGACGACGACAAG CCACCCGTTGGGGGCAAA-3' ， F02 : 5' -GCGGCGAATTC CTGTGATTTGAATTTTTGTT-3'，上下游引物两端分别引进限制性内切酶位点 KpnI和EcoRI。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以本实验室构建的人附 睾cDNA文库为模板，PCR扩增HEL-18基因片段。PCR反应条件94。C预变性lOmin， (94°C， 40s ;55。C，45s ;70。C ， 30s) 30个循环，70。C延伸10min，4。C保存。反应结束后，1. 0%琼脂糖 凝胶电泳检测并分离回收目的片段，插入克隆载体pMD-18T中进行测序鉴定。
重组HEL-18蛋白表达及纯化 测序鉴定后HEL-18基因通过Kpnl和EcoRI位点克隆至表达载体pET-32b (+)中， 使其与融合标签阅读框一致。重组表达载体pET32b(+)-HEL-18转入E. coli BL21(DE3)感 受态细胞，利用菌落PCR筛选阳性克隆，工程菌株在lmM IPTG，32t:条件下诱导4h后，N端 带有His-tag的重组蛋白通过〃 两步镍亲和层析法〃 对重组HEL-18蛋白进行分离纯化。简单地说， 〃 第一步亲和层析〃 用于纯化重组Trx-HEL-18融合蛋白。然后融合蛋白用重组 肠激酶裂解，释放融合标签。最后，运用〃 第二步亲和层析〃 回收重组HEL-18蛋白。纯化 后的重组蛋白用Bradford (Bradford 1976)法进行定量，然后用冷冻干燥进行保存。
实施例2.抗HEL-18多克隆抗血清的制备 用重组HEL-18蛋白免疫BALB/C小鼠制备多抗。简单地说，每只老鼠于第1天注 射50iig重组蛋白与等量的完全福氏佐剂(CFA)。然后在第15，30和45天注射25iig重组 蛋白和等量的不完全福氏佐剂(IFA)加强免疫。第60天从眼球取血，分离血清后用ELASA 和western blot分析抗体的效价和特异性。ELISA分析表明抗体效价达到1 : 10000。 Westernblot显示对重组蛋白和从人附睾液中抽取的天然HEL-18都具有良好的特异性。
实施例3.人HEL-18mRNA组织表达谱研究 为了确定HEL-18的表达模式，采用半定量RT-PCR分析HEL-18基因在人附睾 头、体、尾，睾丸，心，肝，脾，肺，肾，胃等组织中的表达差异。用TRIzol(Tiangen， Beijing, China)抽提总RNA， lug总RNA用20UAMV逆转录酶(Promega)和0. 3ugoligodT18 (Promega) 反转录成cDNA。然后，2ul合成的cDNA利用基因特异引物进行PCR扩增。20ul反应体系含 有2ul 10XPCR buffer(with MgCl2)，2ul dNTP Mix(10mmol/L) ， lul每个引ul (25umo1/ L)，lul Taq DNA聚合酶(2. 5U/ul) ， 2ulcDNA模板以及llulddH20。 PCR反应的程序为94。C， 10min ;94。C， lmin ;54。C (对HEL-18)/49°C ( P-actin) 30s ;72。C ， lmin (35循环);72。C延 伸7min。 e-actin的表达作为内参。所有PCR扩增产物用1. 5%琼脂糖电泳分析。该基因 的mRNA在人附睾及其它组织中表达量很低。
实施例4.人HEL-18蛋白在组织的免疫荧光定位 取人睾丸、附睾组织冰冻切片，进行免疫荧光染色，其中一抗为鼠抗rHEL-18多抗 (1 : 400)，二抗为FITC-标记羊抗鼠IgG(1 : 200)，细胞核用PI染色。染色后所有的切片 用80%甘油封片，然后用共聚焦显微镜(LeicaTCSSP2A0BS)观察结果。实验同时以小鼠免 疫前血清替代一抗作为阴性对照。 实施例5.人附睾蛋白提取物与Western blot 将从人附睾液中提取的总蛋白抽提物20ug，用15% SDS-PAGE分离，然后湿转到 PVDF膜上进行western blot。鼠抗人HEL-18多抗为一抗(1 : 5000) ， 二抗为HRP-标 记羊抗鼠IgG(l : 500)。辣根过氧化酶的活性用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒分析 Westernblot显示抗人HEL-18多抗对重组蛋白和从人附睾液中抽取的天然HEL-18都具有 良好的特异性。 实施例6.人HEL-18蛋白在精子的免疫荧光定位 收集精子用PBS洗涤后涂布于1%明胶包被的载玻片上，自然晾干，然后用甲醇固 定10分钟。含有精子的载玻片用3% BSA在室温下封闭1小时，然后添加鼠抗rhBD32多抗 (1 : 200)，4。C过夜。免疫前小鼠血清做阴性对照。用PBST(PBScontaining0. l%Tween_20) 洗涤三次，加入对应的FITC-标记羊抗鼠IgG 二抗(1 : 200)。载玻片用PBST洗涤三次，然 后用80%甘油封片。用Olympus BX-52显微镜观察，HEL-18蛋白结合在精子的头后部，可 能与精卵识别有关。 实施例7. HEL-18重组蛋白的抗菌活性 运用克隆菌落形成单位(CFU)分析抗菌活性。简单地说，过夜培养的E.coli
7XL-lblue生长到对数期(0D600 = 0. 4-0. 5)后用10mM PBS(pH 7. 4)稀释。大约2X 106CFU/ ml细菌在与12. 5 100ug/ml的HEL-6混合，37。C培养。在开始培养后的15，30，60和 120min分别在取样。将样品用10mMPBS(pH7. 4)做系列稀释，每个稀释度取lOOul涂布于 LB琼脂平板，37t:培养过夜至形成单菌落。统计菌落个数，抗菌活性用细菌存活的百分数表 示，公式为％存活=(蛋白处理后存活克隆数/未经蛋白处理后存活的克隆数)X100。 实验以10mM PBS(pH 7.4)代替蛋白处理细菌作为阴性对照。
实施例8HEL-18与精子运动性以及体外受精的关系研究 利用HEL-18多抗封闭正常人精子，然后进行精子运动性和体外受精分析。实验按 照vitro life标准试剂盒提供的方法进行。简单地说，精子先用SpermRinse-30于37°C、 5% C02培养1小时获能。然后按照1 : 200加入鼠抗rHEL-18多抗，于37°C、6% C02培养 2小时进行封闭。封闭后的精子分成两部分， 一部分直接利用计算机辅助系统分析精子的运 动性。另一部分用G-Fert洗涤2次，并调整至终浓度为1. 0X 107cells/ml。加入lOOul精 子样品于35mm的培养皿中，然后覆盖石蜡油放入37°C、6% C02和饱和湿度培养箱内待用。 经G-MOPS处理后成熟卵母细胞加入预先准备好的受精滴中，在37°C 、6% C02和饱和湿度培 养箱中培养观察受精情况，每日记录胚胎发育情况。以上所有实验同时用免疫前小鼠血清 作为阴性对照。
序列表
〈110〉李建远 〈120〉人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18及其编码基因与应用
〈130>11
〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 5 〈210>1 〈211>2515 〈212>DNA 〈213>Homo sapiens 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (106) . (1326) 〈400〉 1 ateaagaggc aggctgcgga ctcggagcag ctcggggctg cgcagcggga aggctcgcct 60
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145150155160PheGluHisValGluGluAlaValTrpAlaValGluThrLeulieAla165170175SerGlyLysProValAlaAlaThrMetCyslieGlyProGluGlyAsp180185190LeuHisGlyValProProGlyGluCysAlaValArgLeuValLysAla195200205GlyAlaSerlielieGlyValAsnCysHisPheAspProThrlieSer210215220LeuLysThrValLysLeuMetLysGluGlyLeuGluAlaAlaArgLeu225230235240LysAlaHisLeuMetSerGinProLeuAlaTyrHisThrProAspCys245250255AsnLysGinGlyPhelieAspLeuProGluPheProPheGlyLeuGlu260265270ProArgValAlaThrArgTrpAsplieGinLysTyrAlaArgGluAla275280285TyrAsnLeuGlyValArgTyrlieGlyGlyCysCysGlyPheGluPro290295300TyrHislieArgAlalieAlaGluGluLeuAlaProGluArgGlyPhe305310315320LeuProProAlaSerGluLysHisGlySerTrpGlySerGlyLeuAsp325330335MetHisThrLysProTrpValArgAlaArgAlaArgLysGluTyrTrp340345350GluAsnLeuArglieAlaSerGlyArgProTyrAsnProSerMetSer355360365LysProAspGlyTrpGlyValThrLysGlyThrAlaGluLeuMetGin370375380GinLysGluAlaThrThrGluGinGinLeuLysGluLeuPheGluLys385390395400GinLysPheLysSerGin40权利要求
一种人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18，其特征在于，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的序列2衍生的蛋白质和通过化学方法合成的蛋白质。
2. —种人类附睾表达精子结合蛋白HEL-18的编码基因，它是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的核苷酸序列；与序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白的DNA 序列。
3. 含有权利要求2所述基因的真核和原核表达载体。
4. 含有权利要求2所述基因的细胞系。
5. 针对权利要求1所述蛋白质所制备的各种抗体以及以该抗体为活性成分的试剂。
6. 针对权利要求1所述蛋白质提供的药物组合物，所述组合物包含本发明所述的蛋 白、核苷酸序列、构建物或细胞，以及药学上可接受的载体。
7. 根据权利要求l所述的蛋白在不育症诊断中的应用。
8. 根据权利要求l所述的蛋白在不育症治疗中的应用。
9. 根据权利要求2所述的基因在开发新的避孕药物中的应用。
10. 根据权利要求1所述的蛋白在制备新的抗生素中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术和医学领域。本发明公开了一种新的人附睾特异表达精子结合蛋白HEL-18及其制备和应用。公开了本发明编码HEL-18蛋白的氨基酸序列，提供携带编码本发明蛋白的DNA序列的重组表达载体。本发明还公开了该蛋白的制备和检测HEL-6蛋白生物学功能的方法。这种蛋白在人附睾、心、肺组织有微量表达，并结合在精子头后部；对精子受精，识别、运动发挥重要作用。HEL-18蛋白可作为免疫性避孕药的研发，以及男性不育症的临床诊断与治疗的靶蛋白。基于HEL-18蛋白开发的相应基因或蛋白检测方法，将广泛用于生殖医学研究领域。
文档编号C07K14/435GK101724046SQ20081030515
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者李建远 申请人:李建远