专利名称：：从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法
技术领域：
：本发明涉及从动物血液中提取超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的方法，是一种从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法。二
背景技术：
：超氧化物歧化酶(即SuperoxideDismutase，简称S0D)是一种广泛存在于各种生物体内的金属酶。SOD是活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，能够特异性清除生物体产生的超氧化物阴离子自由基(02,)，对机体内因自由基引起的各种损伤均有保护和治疗作用。临床上用于骨性关节炎、类风湿性关节炎、放射与化疗、烧伤、家族性肌萎縮性侧索硬化等方面的治疗。此外在抗辐射、抗肿瘤和预防衰老等多方面研究发现，SOD与多种疾病的预防与治疗有着密切关系。S0D的临床诊断、治疗价值正在不断地被人们所认识，已广泛应用于保健品、食品添加剂及化妆品等其它领域。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽化合物，以还原型(S卩GSH)和氧化型(GSSG)两种形态广泛存在于生物体内，是主要的抗氧化剂，对细胞具有多种生化作用。临床用于中毒性肝炎和感染性肝炎的治疗，对抑制白内障以及角膜与视网膜疾病有一定的作用，对有机物及重金属的解毒、癌症辐射和化疗的保护、对肺纤维化、肝癌、艾滋病也是有益的联合用药，还广泛用于食品加工业，化妆品工业等。自从McCord和Fridovich于1969年首先从牛的红细胞中提取S0D以来，我国学者已经从牛血、猪血、鸭血、猪肝、小白菜、人血红细胞及羊血等物质中纯化出Cu，Zn膪OD。其提取纯化的方法均是在McCord和Fridovich法的基础上加以改进而来的。文献表明，由动物体中提取纯化的Cu，Zn-S0D，其酶比活明显高于从小白菜叶细胞溶质和叶绿体中纯化的Cu，Zn-SOD。SOD的提取纯化方法参考文献家畜生态学报(2006，27(5):46)公开报道了乌云达来、孙振钧、王冲等的牛血铜锌超氧化物歧化酶规模化生产工艺研究，如附图l所示。早在1888年，GSH就已由Rey-Pail-hade，J.首先从酵母中分离出来，1921年Ho沐ins得到结晶，1929年Hopkins、Kendall等提出GSH为三肽，1935年由Harington和Mead阐明其化学结构并加以合成。近些年来，人们已通过直接萃取法、化学合成法、发酵法以及酶转化法等方法成功获得GSH。参考文献中国生化药物杂志(1999，20(5):246)公开报道了刘晓颖、丁毅已从猪血中提纯得到了GSH，如附图2所示。参考文献药物生物技术(1999，6(4):203)公开报道了陶锐、吴梧桐、许激扬的酶法制备谷胱甘肽工艺的研究，如附图3所示。目前，制备SOD主要有沉淀法、热变性法、色谱法及超滤法。沉淀法溶剂消耗大、成本高；热变性法在大规模分离纯化时加热不均匀不易放大；超滤法虽可除去大量小分子杂质，但少量SOD仍可透过PAN膜，浓縮倍数越大，损失也越多，且浓差极化严重，使膜透液量很快下降。阎家麒采用先热变性后用PS膜超滤的方法分离纯化SOD，但在含有有机溶剂的酶液中加热S0D不稳定，而且加热不易均匀能耗大，工艺比较复杂。综上所述，现有公知技术都是分别提取纯化SOD和GSH的，这既造成了资源的浪费，又污染了环境。
发明内容本发明提供了一种从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，克服了现有技术的不足，能同时从动物血液中提取超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽，既提高了资源的利用率又减少了对环境的污染，并且方法简单，生产成本较低，提高了GSH的产品质量。本发明的技术方案是这样来实现的一种从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其按以下步骤进行前期处理先在新鲜动物血中加入柠檬酸钠后经过离心分离得到红细胞溶液，其次在红细胞溶液中加入去离子水得到溶血液，然后在溶血液中加入硫酸铜和硫酸锌的溶液后离心得到上清液，最后将上清液用中空纤维超滤装置超滤得到浓縮液和透过液；提取超氧化物歧化酶在上述前期处理所得浓縮液中加入硫酸铜和硫酸锌的溶液后离心得到含超氧化物歧化酶上清液，将含超氧化物歧化酶上清液经中空纤维超滤装置超滤得到含超氧化物歧化酶浓縮液；提取还原型谷胱甘肽将上述前期处理所得透过液浓縮后经过732阳离子交换树脂柱和717阴离子交换树脂柱得到含还原型谷胱甘肽洗脱液，将含还原型谷胱甘肽洗脱液浓縮得到含还原型谷胱甘肽浓縮液。下面是对上述技术方案的进一步优化和/或选择前期处理按下述方法进行每升新鲜动物血加125亳升至170亳升、浓度为3.8%至4.2%柠檬酸钠，以每分钟3000转离心10分钟至20分钟分离红细胞，再加入体积是红细胞溶液体积l倍至2倍的生理盐水洗涤红细胞溶液l次至3次；然后将红细胞溶液在O°C下冰浴，并加入体积是红细胞溶液2倍至4倍的去离子水，搅拌溶血30分钟得到溶血液；加入占溶血液总体积l.0%至IO.0%的硫酸铜和硫酸锌的水溶液，硫酸铜溶液的浓度为5%至0.5%，硫酸锌溶液的浓度为7%至0.7%，硫酸铜与硫酸锌溶液的用量按体积比为1:2至2:1，温度控制在55'C至8(TC之间，加热10分钟至20分钟，冷却至室温，以每分钟3000转离心10分钟至30分钟，得到上清液；将上清液过滤除去细小颗粒，再经截留分子量为5KD至15KD的中空纤维超滤装置超滤，控制进口压在15psi至30psi之间，保持回流压为10psi，即保持压强差为5psi至20psi，浓縮至上清液体积的10%至20%，得到浓縮液和透过液。提取超氧化物歧化酶按下述方法进行将上述前期处理所得浓縮液中加1倍至3倍体积的去离子水稀释，再加入体积为稀释液总体积1%至20%的硫酸铜和硫酸锌的水溶液，硫酸铜溶液的浓度为5%至0.5%，硫酸锌溶液浓度为7%至0.7%，硫酸铜与硫酸锌溶液的用量体积比为1:2至2:1，搅匀，55。C至8(TC之间水浴保温10分钟至20分钟，冷却至室温，以每分钟3000转离心10分钟至30分钟，收集含超氧化物歧化酶上清液；将含超氧化物歧化酶上清液经截留分子量为5KD至15KD的中空纤维超滤装置超滤，控制进口压在15psi至30psi之间，保持回流压为10psi，即保持压强差为5psi至20psi，浓縮至含超氧化物歧化酶上清液体积的10%至20%，得到第一次含超氧化物歧化酶浓縮液；取第一次含超氧化物歧化酶浓縮液，经5KD至15KD的中空纤维超滤装置动态透析12小时，每分钟3000转离心10分钟，除去不溶性蛋白，得含超氧化物歧化酶透析液；将含超氧化物歧化酶透析液经截留分子量为5KD至15KD的中空纤维超滤装置超滤，控制进口压力在15psi至30psi之间，保持回流压力为10psi，即保持压强差为5psi至20psi，浓縮至含超氧化物歧化酶透析液体积的10%至20%，得到第二次含超氧化物歧化酶浓縮液；将第二次含超氧化物歧化酶浓縮液加入1倍至2倍体积预冷丙酮，放置l小时至2小时，每分钟3000转离心10分钟至20分钟得沉淀；沉淀干燥得淡绿色或淡蓝绿色冻干粉含超氧化物歧化酶。提取还原型谷胱甘肽按下述方法进行将上述前期处理所得透过液在水浴温度4(TC至50°C，真空度为O.07Mpa至0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍至15倍，得到第一次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将含还原型谷胱甘肽浓縮液用硫酸调pH值至2至4，上732阳离子交换树脂柱，732阳离子树脂目数为60目至80目，洗脱液氨水浓度为0.25摩尔/升至1.0摩尔/升，洗脱液氨水流速为0.5至1.5倍树脂体积/小时，得到第一次含还原型谷胱甘肽洗脱液；将第一次含还原型谷胱甘肽洗脱液在水浴温度4(TC至5(rC，真空度为O.07Mpa至0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍至15倍，得到第二次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第二次含还原型谷胱甘肽浓縮液用硫酸调pH值至4至5，上717阴离子交换树脂柱，717阴离子树脂目数为60目至80目；洗脱液硫酸浓度为O.25摩尔/升至1.0摩尔/升；洗脱液硫酸流速为O.5至2.O倍树脂体积/h，得到第二次含还原型谷胱甘肽洗脱液；将第二次含还原型谷胱甘肽洗脱液装入分子量为100的透析袋中透析12小时除盐，得到含还原型谷胱甘肽透析液；将含还原型谷胱甘肽透析液在水浴温度4(TC至5(TC，真空度为O.07Mpa至0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍至15倍，得到第三次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第三次含还原型谷胱甘肽浓縮液加入1倍至2倍预冷乙醇，放置1小时至2小时，以每分钟3000转离心10分钟至20分钟得到沉淀；沉淀干燥得到还原型谷胱甘肽白色冻干粉。干燥采用冷冻干燥法，干燥室压力为0.8Mpa至0.9Mpa，料层厚度为lcm，冷冻温度为-40。C。新鲜动物血可采用新鲜羊血或新鲜牛血或新鲜牛羊混合血或新鲜猪血或新鲜鸭血或新鲜人血。本发明从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其充分利用了资源，可同时提取SOD和GSH，简化了生产工艺，降低了生产成本，提高了GSH的产品质量。四附图1为现有提取纯化Cu，Zn-SOD方法之一的工艺流程。附图2为现有提取纯化GSH方法之一的工艺流程。附图3是现有提取纯化GSH方法之二的工艺流程。附图4是本发明实施例的生产工艺流程。附图5为还原型谷胱甘肽标准曲线。五具体实施方式本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。下面结合实施例对本发明作进一步论述该从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法按以下步骤进行前期处理先在新鲜动物血中加入柠檬酸钠后经过离心分离得到红细胞溶液，其次在红细胞溶液中加入去离子水得到溶血液，然后在溶血液中加入硫酸铜和硫酸锌的溶液后离心得到上清液，最后将上清液用中空纤维超滤装置超滤得到浓縮液和透过液；提取超氧化物歧化酶在上述前期处理所得浓縮液中加入硫酸铜和硫酸锌的溶液(即铜锌盐溶液)后离心得到含超氧化物歧化酶上清液，将含超氧化物歧化酶上清液经中空纤维超滤装置超滤得到含超氧化物歧化酶浓縮液；提取还原型谷胱甘肽将上述前期处理所得透过液浓縮后经过732阳离子交换树脂柱和717阴离子交换树脂柱得到含还原型谷胱甘肽洗脱液，将含还原型谷胱甘肽洗脱液浓縮得到含还原型谷胱甘肽浓縮液。下面可根据实际需要对该从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法作进一步优化或/和改进上述前期处理可按下述方法进行每升新鲜动物血加125亳升或150亳升或170亳升、浓度为3.8%或4.2%柠檬酸钠，以每分钟3000转离心10分钟或15分钟或20分钟分离红细胞，再加入体积是红细胞溶液体积1倍或2倍的生理盐水洗涤红细胞溶液1次或2次或3次；然后将红细胞溶液在(TC下冰浴，并加入体积是红细胞溶液2倍或3倍或4倍的去离子水，搅拌溶血30分钟得到溶血液；加入占溶血液总体积l.0%或5.0%或10.0%的硫酸铜和硫酸锌的水溶液，硫酸铜溶液的浓度为5%或3%或0.5%，硫酸锌溶液的浓度为7%或3%或0.7%，硫酸铜与硫酸锌溶液的用量按体积比为1:2或2:1，温度控制在55。C或65。C或8(TC之间，加热10分钟或15分钟或20分钟，冷却至室温，以每分钟3000转离心10分钟或20分钟或30分钟，得到上清液；将上清液过滤除去细小颗粒，再经截留分子量为5KD或10KD或15KD的中空纤维超滤装置超滤，控制进口压在15psi或22psi或30psi之间，保持回流压为10psi，即保持压强差为5psi或12psi或20psi，浓縮至上清液体积的10%或20%，得到浓縮液和透过液。上述提取超氧化物歧化酶可按下述方法进行将上述前期处理所得浓縮液中加1倍或2倍或3倍体积的去离子水稀释，再加入体积为稀释液总体积1%或6%或10%或15%或20%的硫酸铜和硫酸锌的水溶液，硫酸铜溶液的浓度为5%或2%或0.5%，硫酸锌溶液浓度为7%或3.5%或0.7%，硫酸铜与硫酸锌溶液的用量体积比为1:2或2:1，搅匀，55°C或6(TC或8(TC之间水浴保温1O分钟或15分钟或20分钟，冷却至室温，以每分钟3000转离心10分钟或20分钟或30分钟，收集含超氧化物歧化酶上清液；将含超氧化物歧化酶上清液经截留分子量为5KD或10KD或15KD的中空纤维超滤装置超滤，控制进口压在15psi或22psi或30psi之间，保持回流压为10psi，即保持压强差为5psi或12psi或20psi，浓縮至含超氧化物歧化酶上清液体积的10%或20%，得到第一次含超氧化物歧化酶浓縮液；取第一次含超氧化物歧化酶浓縮液，经5KD或10KD或15KD的中空纤维超滤装置动态透析12小时，每分钟3000转离心10分钟，除去不溶性蛋白，得含超氧化物歧化酶透析液；将含超氧化物歧化酶透析液经截留分子量为5KD或10KD或15KD的中空纤维超滤装置超滤，控制进口压力在15psi或22psi或30psi之间，保持回流压力为10psi，即保持压强差为5psi或12psi或20psi，浓縮至含超氧化物歧化酶透析液体积的10%或20%，得到第二次含超氧化物歧化酶浓縮液；将第二次含超氧化物歧化酶浓縮液加入1倍或2倍体积预冷丙酮，放置1小时或2小时，每分钟3000转离心10分钟或15分钟或20分钟得沉淀；沉淀干燥得淡绿色或淡蓝绿色冻干粉含超氧化物歧化酶。上述提取还原型谷胱甘肽可按下述方法进行将上述前期处理所得透过液在水浴温度40。C或5(TC，真空度为O.07Mpa或0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍或10倍或15倍，得到第一次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将含还原型谷胱甘肽浓縮液用硫酸调pH值至2或4，上732阳离子交换树脂柱，732阳离子树脂目数为60目或70目或80目，洗脱液氨水浓度为O.25摩尔/升或O.5摩尔/升或1.0摩尔/升，洗脱液氨水流速为O.5或1.O或l.5倍树脂体积/小时，得到第一次含还原型谷胱甘肽洗脱液；将第一次含还原型谷胱甘肽洗脱液在水浴温度4(TC或5(rC，真空度为O.07Mpa或0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍或10倍或15倍，得到第二次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第二次含还原型谷胱甘肽浓縮液用硫酸调PH值至4或5，上717阴离子交换树脂柱，717阴离子树脂目数为60目或70目或80目；洗脱液硫酸浓度为O.25摩尔/升或0.50摩尔/升或1.0摩尔/升；洗脱液硫酸流速为O.5或1.O或l.5或2.0倍树脂体积/h，得到第二次含还原型谷胱甘肽洗脱液；将第二次含还原型谷胱甘肽洗脱液装入分子量为100的透析袋中透析12小时除盐，得到含还原型谷胱甘肽透析液；将含还原型谷胱甘肽透析液在水浴温度4(TC或5(TC，真空度为O.07Mpa或0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍或10倍或15倍，得到第三次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第三次含还原型谷胱甘肽浓縮液加入1倍或2倍预冷乙醇，放置1小时或2小时，以每分钟3000转离心10分钟或15分钟或20分钟得到沉淀；沉淀干燥得到还原型谷胱甘肽白色冻干粉。上述干燥方法可采用冷冻干燥法，干燥室压力为0.8Mpa至0.9Mpa，料层厚度为lcm，冷冻温度为-4(TC。上述新鲜动物血可采用新鲜羊血或新鲜牛血或新鲜牛羊混合血或新鲜猪血或新鲜鸭血或新鲜人血。以上技术特征构成了本发明的最佳实施例，其具有较强的适应性和最佳实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。下面将上述实施例进行如下测试对照品、试药:还原型谷胱甘肽对照品(Sigma公司生产，进口分装)，甲醇、乙腈为美国Fisher公司产色谱纯，水为重蒸水，732阳离子交换树脂和717阴离子交换树脂(上海三浦化工仪器有限公司)，其余试剂均为国产分析纯，实验用水为去离子水。仪器与设备LC-IOAVP高效液相色谱仪(日本岛津制造所)，包括LC-IOATVP二元高压泵，SPD-IOAVP检测器，CTO-IOASVP柱温箱，SCL-IOAVP系统控制器，Shim-PackCLC-ODS柱(150mmX6.Omm，5ym);UV-2501PC型紫外分光光度计(日本岛津制造所)；SZ-96自动纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；BS110S电子天平(德国Sartorius公司)，PB-10pH计(德国Sartorius公司)。TDL-5型离心机(上海安亭科学仪器厂)；VV-2000旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；SHB-循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；WS2-261-79型数显控温水温箱(上海苏进仪器设备厂)；DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；R0-40膜超滤装置即中空纤维超滤装置(天津膜天膜工程技术有限公司)。(一)指标的确定及测定方法超氧化物歧化酶(g卩SOD)和还原型谷胱甘肽(g卩GSH)的提取率，采用综合评分(分值分配分别为O.5，0.5)。综合评分^SOD总活力/最大SOD总活力)X50+(GSH含量/最大GSH含量)X501.SOD的活力测定照改良的微量连苯三酚自氧化法即325nm法(《中国国家标准》GB/T5009.171—003)测定其活力。1.1供试品溶液的制备取SOD样液，加水稀释，摇匀，使测定时的自氧化速率控制在0.030(±0.002)0.D./min，将此浓度的SOD作为供试品溶液。1.2测定法连苯三酚自氧化速率的测定在25。C下，按表l加入Tris-HCl缓冲液，然后加入连苯三酚溶液，迅速摇匀置lcm比色杯中，用空白管作对照，在325nm波长下，每隔O.5min读取l次A值，连续记录7.Omin的A值，按照自氧化速率计算公式计算其自氧化速率，要求控制连苯三酚自氧化速率在0.060(±0.002)0.D./min。可通过微调连苯三酚溶液的加入量加以控制。连苯三酚自氧化速率计算公式自氧化速率(每分钟)=(A7min—A6.5min)+(八6.5min画—A6.Omin)+…+(Al.5min画—Al.0min)+(Al.Omin一Ao.5min)-X2131.3供试品的测定取SOD供试品溶液，25°C，依次按表l加入Tris-HCl缓冲液、连苯三酚溶液和样液，迅速摇匀置lcm比色杯中，用空白管作对照，用紫外分光光度计在325nm波长下测定，要求自氧化速率控制在0.030(±0.002)O.D./min。按活力单位公式计算，即得。SOD活力单位定义在一定条件下，lml的反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。活力单位计算公式单位体积活力(u/ml)=自氧化速率一样液速率-X100%自氧化速率样液稀释倍数X反应液总体积X50%样液体积总活力(u)=单位体积活力(u/ml)X原液总体积2.GSH的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版二部，附录VD)测定。2.l色谱条件与系统适用性试验色谱柱Shim-PackCLC-ODS柱(150mmX6.Omm);流动相0.025mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液(用磷酸调节pH值至3.15);检测波长220nm。理论塔板数按还原型谷胱甘肽峰计算，应不低于2000，与相邻峰的分离度大于2.0。2.2对照品溶液的制备精密称取还原型谷胱甘肽对照品15mg，置25ml棕色量瓶中，加流动相制成每lml含O.6mg的对照品溶液，即得。2.3供试品溶液的制备取GSH样液经微孔滤膜(0.45ym)滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。2.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。2.5线性及范围的考察按2.2项下方法配制0.16、0.32、0.48、0.64、0.80mg/ml5个不同浓度的对照品溶液，精密吸取对照品溶液10ul，分别注入液相色谱仪，记录峰面积。实验结果见表2，标准曲线见图5。以对照品浓度(mg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归。回归方程为y=301.362x+3.6659r=0.9997。结果表明谷胱甘肽对照品在O.16mg/ml0.8mg/ml浓度范围之间与峰面积呈良好的线性关系。2.l对牛血和羊血进行比较试验分别取新鲜抗凝牛血、羊血各两份，每份300ml，离心除血浆，生理盐水浮洗后得干净红细胞约100ml，在相同的实验条件下，按传统的提取工艺溶血、乙醇氯仿沉淀、热变性后得上清液，分别测定上清液SOD活力和GSH含量，结果见表3。从表3中数据可以看出用同一方法从牛血和羊血中提取SOD和GSH时，所得上清液的SOD总活力和GSH总量，牛血比羊血略高，但都比较接近。2.2对羊血的来源进行比较试验分别取新鲜抗凝绵羊血、山羊血各两份，每份300ml，离心除血浆，生理盐水浮洗后得干净红细胞约100ml，在相同的实验条件下，按传统的提取工艺溶血、乙醇氯仿沉淀、热变性后得上清液，分别测定其SOD活力和GSH含量，结果见表4。从表4中数据可以看出用同一方法从绵羊血和山羊血中提取SOD和GSH时，所得上清液的SOD总活力和GSH总量没有明显差异。(二)小试试验结果将上述实施例所得超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽进行如下测试用325nm法测定SOD活力，用Lowry法测定蛋白质含量，用HPLC法测定GSH含量，实验室小试结果见表5、表6。(三)中试试验将上述实施例所得超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽的三批样品进行测试，中试三批结果见表7、表8、表9。从表9中数据可以看出用本方法从羊血中同时提取SOD和GSH，三批样品的收率和质量较稳定，其中三批GSH样品均能达到92。/。，较参考文献陶锐、吴梧桐、许激扬在药物生物技术(1999，6(4):203)发表的酶法制备谷胱甘肽工艺的研究中报道的有所提高。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2线性关系考察实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表7中试试验SOD数据<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>权利要求1、一种从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于按以下步骤进行前期处理先在新鲜动物血中加入柠檬酸钠后经过离心分离得到红细胞溶液，其次在红细胞溶液中加入去离子水得到溶血液，然后在溶血液中加入硫酸铜和硫酸锌的溶液后离心得到上清液，最后将上清液用中空纤维超滤装置超滤得到浓缩液和透过液；提取超氧化物歧化酶在上述前期处理所得浓缩液中加入硫酸铜和硫酸锌的溶液后离心得到含超氧化物歧化酶上清液，将含超氧化物歧化酶上清液经中空纤维超滤装置超滤得到含超氧化物歧化酶浓缩液；提取还原型谷胱甘肽将上述前期处理所得透过液浓缩后经过732阳离子交换树脂柱和717阴离子交换树脂柱得到含还原型谷胱甘肽洗脱液，将含还原型谷胱甘肽洗脱液浓缩得到含还原型谷胱甘肽浓缩液。2、根据权利要求l所述的从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于前期处理按下述方法进行每升新鲜动物血加125亳升至170亳升、浓度为3.8%至4.2%柠檬酸钠，以每分钟3000转离心10分钟至20分钟分离红细胞，再加入体积是红细胞溶液体积1倍至2倍的生理盐水洗涤红细胞溶液1次至3次；然后将红细胞溶液在(TC下冰浴，并加入体积是红细胞溶液2倍至4倍的去离子水，搅拌溶血30分钟得到溶血液；加入占溶血液总体积l.0%至10.0%的硫酸铜和硫酸锌的水溶液，硫酸铜溶液的浓度为5%至O.5%，硫酸锌溶液的浓度为7%至0.7%，硫酸铜与硫酸锌溶液的用量按体积比为1:2至2:1，温度控制在55。C至8(TC之间，加热10分钟至20分钟，冷却至室温，以每分钟3000转离心10分钟至30分钟，得到上清液；将上清液过滤除去细小颗粒，再经截留分子量为5KD至15KD的中空纤维超滤装置超滤，控制进口压在15psi至30psi之间，保持回流压为10psi，即保持压强差为5psi至20psi，浓縮至上清液体积的10%至20%，得到浓縮液和透过液。3、根据权利要求1或2所述的从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于提取超氧化物歧化酶按下述方法进行将上述前期处理所得浓縮液中加1倍至3倍体积的去离子水稀释，再加入体积为稀释液总体积1%至20%的硫酸铜和硫酸锌的水溶液，硫酸铜溶液的浓度为5%至0.5%，硫酸锌溶液浓度为7%至0.7%，硫酸铜与硫酸锌溶液的用量体积比为1:2至2:1，搅匀，55。C至8(TC之间水浴保温10分钟至20分钟，冷却至室温，以每分钟3000转离心10分钟至30分钟，收集含超氧化物歧化酶上清液；将含超氧化物歧化酶上清液经截留分子量为5KD至15KD的中空纤维超滤装置超滤，控制进口压在15psi至30psi之间，保持回流压为10psi，即保持压强差为5psi至20psi，浓縮至含超氧化物歧化酶上清液体积的10%至20%，得到第一次含超氧化物歧化酶浓縮液；取第一次含超氧化物歧化酶浓縮液，经5KD至15KD的中空纤维超滤装置动态透析12小时，每分钟3000转离心10分钟，除去不溶性蛋白，得含超氧化物歧化酶透析液；将含超氧化物歧化酶透析液经截留分子量为5KD至15KD的中空纤维超滤装置超滤，控制进口压力在15psi至30psi之间，保持回流压力为10psi，即保持压强差为5psi至20psi，浓縮至含超氧化物歧化酶透析液体积的10%至20%，得到第二次含超氧化物歧化酶浓縮液；将第二次含超氧化物歧化酶浓縮液加入1倍至2倍体积预冷丙酮，放置1小时至2小时，每分钟3000转离心10分钟至20分钟得沉淀；沉淀干燥得淡绿色或淡蓝绿色冻干粉含超氧化物歧化酶。4、根据权利要求1或2所述的从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于提取还原型谷胱甘肽按下述方法进行将上述前期处理所得透过液在水浴温度4(TC至5(rC，真空度为O.07Mpa至0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍至15倍，得到第一次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第一次含还原型谷胱甘肽浓縮液用硫酸调pH值至2至4，上732阳离子交换树脂柱，732阳离子树脂目数为60目至80目，洗脱液氨水浓度为0.25摩尔/升至1.0摩尔/升，洗脱液氨水流速为O.5至1.5倍树脂体积/小时，得到第一次含还原型谷胱甘肽洗脱液；将第一次含还原型谷胱甘肽洗脱液在水浴温度4(TC至5(rC，真空度为O.07Mpa至0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍至15倍，得到第二次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第二次含还原型谷胱甘肽浓縮液用硫酸调pH值至4至5，上717阴离子交换树脂柱，717阴离子树脂目数为60目至80目；洗脱液硫酸浓度为O.25摩尔/升至1.0摩尔/升；洗脱液硫酸流速为O.5至2.0倍树脂体积/h，得到第二次含还原型谷胱甘肽洗脱液；将第二次含还原型谷胱甘肽洗脱液装入分子量为100的透析袋中透析12小时除盐，得到含还原型谷胱甘肽透析液；将含还原型谷胱甘肽透析液在水浴温度4(TC至5(rC，真空度为O.07Mpa至0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍至15倍，得到第三次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第三次含还原型谷胱甘肽浓縮液加入1倍至2倍预冷乙醇，放置1小时至2小时，以每分钟3000转离心10分钟至20分钟得到沉淀；沉淀干燥得到还原型谷胱甘肽白色冻干粉。5、根据权利要求3所述的从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于提取还原型谷胱甘肽按下述方法进行将上述前期处理所得透过液在水浴温度4(TC至5(rC，真空度为O.07Mpa至0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍至15倍，得到第一次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第一次含还原型谷胱甘肽浓縮液用硫酸调pH值至2至4，上732阳离子交换树脂柱，732阳离子树脂目数为60目至80目，洗脱液氨水浓度为0.25摩尔/升至1.0摩尔/升，洗脱液氨水流速为O.5至1.5倍树脂体积/小时，得到第一次含还原型谷胱甘肽洗脱液；将第一次含还原型谷胱甘肽洗脱液在水浴温度4(TC至5(rC，真空度为O.07Mpa至0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍至15倍，得到第二次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第二次含还原型谷胱甘肽浓縮液用硫酸调pH值至4至5，上717阴离子交换树脂柱，717阴离子树脂目数为60目至80目；洗脱液硫酸浓度为O.25摩尔/升至1.0摩尔/升；洗脱液硫酸流速为O.5至2.0倍树脂体积/h，得到第二次含还原型谷胱甘肽洗脱液；将第二次含还原型谷胱甘肽洗脱液装入分子量为100的透析袋中透析12小时除盐，得到含还原型谷胱甘肽透析液；将含还原型谷胱甘肽透析液在水浴温度4(TC至5(rC，真空度为O.07Mpa至0.08Mpa的条件下浓縮，浓縮倍数为5倍至15倍，得到第三次含还原型谷胱甘肽浓縮液；将第三次含还原型谷胱甘肽浓縮液加入1倍至2倍预冷乙醇，放置1小时至2小时，以每分钟3000转离心10分钟至20分钟得到沉淀；沉淀干燥得到还原型谷胱甘肽白色冻干粉。6、根据权利要求3所述从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于干燥采用冷冻干燥法，干燥室压力为0.8Mpa至0.9Mpa，料层厚度为lcm，冷冻温度为-4CTC。7、根据权利要求4所述从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于干燥采用冷冻干燥法，干燥室压力为0.8Mpa至0.9Mpa，料层厚度为lcm，冷冻温度为-4CTC。8、根据权利要求5所述从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于干燥采用冷冻干燥法，干燥室压力为0.8Mpa至0.9Mpa，料层厚度为lcm，冷冻温度为-4CTC。9、根据权利要求1或2所述从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于新鲜动物血采用新鲜羊血或新鲜牛血或新鲜牛羊混合血。10、根据权利要求8所述从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其特征在于新鲜动物血采用新鲜羊血或新鲜牛血或新鲜牛羊混合血或新鲜猪血或新鲜鸭血或新鲜人血。全文摘要一种从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其按以下步骤进行前期处理、提取超氧化物歧化酶和提取还原型谷胱甘肽。本发明从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法，其充分利用了资源，可同时提取超氧化物歧化酶SOD和还原型谷胱甘肽GSH，简化了生产工艺，降低了生产成本，提高了还原型谷胱甘肽GSH的产品质量。文档编号C07K1/18GK101338305SQ20081030425公开日2009年1月7日申请日期2008年8月28日优先权日2008年8月28日发明者刘砥威,安熙强,顾政一,媛马,马晓康申请人:新疆维吾尔自治区药物研究所