融合分子与il-15变异体的制作方法

专利名称：：融合分子与il-15变异体的制作方法融合分子与IL-15变异体鹏申i青刻勺綠擅本申请案主张申请于2007年5月11日序列编号60/928，900的美国临时申请案的优先权，该申请案的全部内容藉此并入本文作为参考。政府支揚支持本案之研究由美国以卫生与公众服务部为代表进行。
背景技术：
：T细胞受体(TCR)为免疫系统最主要的效应物(effector)，其作为研发治疗方法的平台具有独特的优点。抗体疗法局限于辨识血液及胞外空间的病原体或者细胞表面上的蛋白标靶，而T细胞受体可辨识通过MHC分子在细胞表面上展现的抗原(包含衍生自胞内蛋白的抗原)。依据辨识所展现的抗原而变得活化之T细胞的亚型，T细胞受体以及具有T细胞受体的T细胞可参与调节各种免疫应答。举例而言，T细胞经由诱导B细胞分化成抗体产生细胞而涉及体液性免疫应答。此外，活化的T细胞发挥作用而起始细胞媒介的免疫应答。因此，T细胞受体可辨识无法使用抗体辨识的其他标靶。T细胞为细胞的次族群，其与其他免疫细胞类型(多形核嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞、肥胖细胞、B细胞、NK细胞)共同构成免疫系统的细胞组分。在生理条件下，T细胞在免疫监控及消灭外来抗原方面发挥作用。然而，在病理条件下，有强烈的证据显示T细胞在疾病的引发及扩散中扮演着重要的角色。于此等疾患中，破坏T细胞免疫耐受性(中枢性或周边性)为引发自体免疫疾病的主要基本过程。—般相信TCR在免疫系统的发展及功能上扮演着重要的角色。举例而言，已有报导指出TCR媒介细胞毒杀作用(cellkilling)、增进B细胞增生、以及影响各种疾患(包含癌症、过敏、病毒感染及自体免疫疾患)的发展及严重度。因此，期望能提供以T细胞受体为主的新颖靶向药剂(targetingagent)，以及制造及使用该等用于治疗及诊断设定之药剂的方法。据此，特别期望能提供相较于先前技术中以抗体靶向为主的复合物而言，具有某些特定优点的分子。再者，期望使用TCR将各种效应物分子标靶至其可提供治疗效益而没有与非靶向系统活性相关的副作用的疾病位置。此等之一者为IL-15(淋巴球激素(lymphokine)的四a螺旋束家族的成员)。IL-15在免疫系统的发展及调控上扮演多方面的角色。更详言之，IL-15影响CD8+T细胞、NK细胞、毒杀性T细胞、B细胞、小肠壁表皮间隙淋巴球(IEL)及抗原呈递细胞(APC)的功能、发展、存活与增生。已证实1卜15-/-基因转殖小鼠与IL-15Ra-/_基因转殖小鼠两者皆缺乏周边NK细胞与毒杀性T细胞族群、某些IEL亚群、以及大部分记忆表型CD8+T细胞，暗示IL-15在此等细胞类型的发展、增生及/或存活上发挥功能。IL-15受体(R)由三种多肽所组成型别特异性IL-15R阿伐(IL-15Ralpha)(〃IL-15Ra〃或〃IL-15Ra〃)、IL-2/IL-15R贝他(IL-2/IL-15Rbeta)(〃IL-2RP〃或〃IL-15Rb")及共同的伽玛链(gammachain)("yC"或"gC〃，其为多种细胞激素受体所共有者)。IL-15讯息传递可经由IL-15Ra、IL-2RP及YC的异三聚体复合物；经由IL-2RP及YC的异三聚体复合物产生。新的IL-15作用机制为转呈递作用(transpresentation)机制，其中，IL-15及IL-15Ra由抗原呈递细胞(单核球及树突细胞)协同地表达，结合至IL-15Ra的IL-15转呈递至邻近的仅表达IL-15RPYC受体之NK细胞或CD8T细胞。就发生于免疫突触的协同剌激事件(co-stimulatoryevent)而言，IL-15转呈递作用目前显示为活体内IL-15作用的主要机制，且其显示出在肿瘤免疫监控上扮演主要的角色(Waldmann，TA，2006，NatureRev.Immunol.6:595-601)。可溶性IL-2Ra次单元(其导致含有外显子3(exon3)缺失及在N端的所谓〃sushi"结构域(domain)的同型异构物(isoform))已显示承载有负责细胞激素结合作用的大部分结构要素。单独的IL-2Ra为IL-2的低亲和性受体(Kd10nM)，而IL-15Ra则以高亲和性与IL-15结合(Kd100pM)。因此，可溶性IL-2Ra与IL-15能够在溶液中形成安定的异二聚体复合物，且此等复合物能够经由该中间型或高亲和性IL-15R复合物调控(亦即，剌激或阻断)免疫应答(Mortieretal.2006.JBiolChem281:1612-1619;Stoklaseketal.2006.JImmunol177:6072-6080;Rubinsteinetal.2006.ProcNatlAcadSciUSA103:9166-9171)。以IL-15对免疫系统的已知功效为前提，为了宿主效益已探讨有多种以IL-15为主的方法来操控免疫系统。IL-15的给予已被用来支援免疫应答或加强免疫系统重建，而阻断IL-15的活性则可抑制自体免疫应答或其他不适的免疫应答(Waldmann，TA，2006，NatureRev.Immunol.6:595-601)。事实上，全身性IL-15治疗的限制之一为可能引发自体免疫疾病。其他限制包含在标准哺乳动物细胞表达系统中此种细胞激素的制造困难，以及其在活体内的半衰期非常短。因此，有需要生产具适当免疫剌激性治疗形式的IL-15,其显现较长的活体内半衰期、增加的免疫细胞结合活性、或增强的生物活性。此外，亦需要有效的IL-15拮抗剂。理想地，此等分子宜为选择性地标靶至疾病位置，以避免不必要的全身性中毒并且提供更有效的治疗效益。
发明内容本发明提供具有治疗用途的多种IL-15变异体与可溶性融合复合物，以及制造该等蛋白的方法。本发明提供使用本发明的可溶性融合复合物杀死靶细胞的方法。此处所述的IL-15变异体与可溶性复合物具有潜在的治疗效用。因此，于一态样中，本发明提供一种可溶性融合蛋白复合物，其包括至少两种可溶性融合蛋白，其中，第一融合蛋白包含第一生物性活性多肽，其共价连结至介白素-15(interleukin-15，IL-15)或其功能性片段，第二融合蛋白包括第二生物性活性多肽，其共价连结至可溶性介白素-15受体a(IL-15Ra)多肽或其功能性片段，其中第一融合蛋白的IL-15结构域结合至第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域以形成可溶性融合蛋白复合物。于一具体例中，第一与第二生物性活性多肽中的一个包括第一可溶性T细胞受体(TCR)或其功能性片段。于另一具体例中，该生物性活性多肽的另一个包括该第一可溶性TCR或其功能性片段，因而创造具有增加的结合活性的多价TCR融合蛋白复合物。于再一具体例中，该另一个生物性活性多肽包括不同于该第一可溶性TCR的第二可溶性TCR或其功能性片段。于此态样的另一具体例中，该TCR对于特定抗原的识别有特异性。于此态样的再一具体例中，该TCR为包括a与b链TCR的异二聚体。于此态样的又一具体例中，该TCR包括单链TCR多肽。于再一具体例中，该单链TCR多肽包括TCRV-a链，其通过肽接头序列(p印tidelinkersequence)共价连结至TCRV-13链。于再另一具体例中，该单链TCR进一步包括共价连结至TCRV-13链的可溶性TCRCP链片段。于另一具体例中，该单链TCR进一步包括共价连结至TCRV_a链的可溶性TCRCa链片段。于再一具体例中，该第一与第二生物性活性多肽的一个或两个包括抗体或其功能性片段。于又另一具体例中，该抗体对于特定抗原的识别有特异性。于再一具体例中，该抗体为单链抗体或单链Fv。于另一特定具体例中，该单链抗体包括免疫球蛋白轻链可变结构域(immunoglobulinlightchainvariabledoamin)，其通过多月太接头序歹lj共价连结至免疫球蛋白重链可变结构域。于上述态样之一具体例中，该第一生物性活性多肽通过多肽接头序列共价连结至IL-15(或其功能性片段)。于上述态样之另一具体例中，该第二生物性活性多肽通过多肽接头序列共价连结至IL-15Ra多肽(或其功能性片段)。于另一具体例中，该TCR结构域的抗原包括呈递于MHC或HLA分子的肽抗原。于再一具体例中，该肽抗原来自于肿瘤相关多肽或病毒编码多肽。于另一具体例中，该抗体结构域的抗原包括细胞表面受体或配体。于再一具体例中，该抗原包括CD抗原、细胞激素或趋化激素受体或配体、生长因子受体或配体、组织因子、细胞粘合分子、MHC/MHC样分子、FC受体、Toll样受体、NK受体、TCR、BCR、正向/负向协同剌激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤相关抗原、或病毒编码抗原。于上述态样之另一具体例中，该IL-15Ra多肽包括能结合IL-15的IL-15受体a的细胞外结构域。于上述态样之另一具体例中，该IL-15Ra多肽包括IL-15asushi结构域(Weietal.JournalofImmunology,2001，167:277-282)或IL-15aAE3结构域(Andersonetal.1995.J.Biol.Chem.270:29862-29869，Duboisetal.1999.J.Biol.Chem.274:26978-26984)。于另一态样中，本发明提供一种IL-15变异体(此处亦称为IL-15突变体)，其具有不同于天然(或野生型)IL-15蛋白以及结合至IL-15Ra多肽的氨基酸序列，且其作用为IL-15激动剂或拮抗剂。本发明的具体例提供一种作为非融合蛋白或作为可溶性融合蛋白的IL-15变异体，其包括上述生物性活性多肽。其中，使用该IL-15变异体来代替该IL-15结构域。于上述态样之一具体例中，本发明的特征在于编码此处所述任一态样或具体例中的第一融合蛋白之核酸序列。9于上述态样之一具体例中，本发明的特征在于编码此处所述任一态样或具体例中的第二融合蛋白之核酸序列。于上述态样之一具体例中，本发明的特征在于编码此处所述任一态样或具体例中的IL-15变异体之核酸序列。于一具体例中，该核酸序列进一步包括可操作性地连结至编码该融合蛋白或IL-15变异体的序列的启动子、翻译起始信号与前导序列。于另一具体例中，上述核酸序列的任一个包括在DNA载体中。于另一态样中，本发明的特征在于一种制造上述态样中的可溶性融合蛋白复合物的方法，该方法包括将上述态样及具体例中编码第一融合蛋白的DNA载体导入第一宿主细胞，在足以于细胞或培养基中表达该第一融合蛋白的条件下，在培养基中培养该第一宿主细胞，由该宿主细胞或培养基纯化该第一融合蛋白，将上述态样及具体例中编码该第二融合蛋白的DNA载体导入第二宿主细胞，在足以于细胞或培养基中表达该第二融合蛋白的条件下，在培养基中培养该第二宿主细胞，由该宿主细胞或培养基纯化该第二融合蛋白，以及在足以使第一融合蛋白的IL-15结构域与第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域之间发生结合的条件下，混合该第一与第二融合蛋白以形成该可溶性融合蛋白复合物。于另一态样中，本发明的特征在于一种制造上述态样中的可溶性融合蛋白复合物的方法，该方法包括将上述态样及具体例中编码该第一融合蛋白的DNA载体与上述态样及具体例中编码该第二融合蛋白的DNA载体导入宿主细胞，在足以于细胞或培养基中表达该融合蛋白的条件下，在培养基中培养该宿主细胞，且使第一融合蛋白的IL-15结构域与第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域之间发生联合，以形成该可溶性融合蛋白复合物，由该宿主细胞或培养基纯化该可溶性融合蛋白复合物。于又一态样中，本发明的特征在于一种制造上述态样中的可溶性融合蛋白复合物的方法，该方法包括将编码该第一与第二融合蛋白的权利要求28的DNA载体导入宿主细胞，在足以于细胞或培养基中表达该融合蛋白的条件下，在培养基中培养该宿主细胞，且使第一融合蛋白的IL-15结构域与第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域之间发生联合，以形成该可溶性融合蛋白复合物，由该宿主细胞或培养基纯化该可溶性融合蛋白复合物。于上述方法的其他态样中，使用编码该IL-15变异体的DNA载体代替编码该第一融合蛋白的DNA载体，以产生能表达该IL-15变异体的宿主细胞且使该IL-15变异体与第二融合蛋白的IL-15Ra结构域发生联合，以形成可溶性融合蛋白复合物。于另一态样中，本发明的特征在于一种制造上述态样中的IL-15变异体的方法，该方法包括将上述态样及具体例中编码IL-15变异体的DNA载体导入宿主细胞，在足以于细胞或培养基中表达该IL-15变异体的条件下，在培养基中培养该宿主细胞，由该宿主细胞或培养基纯化该IL-15变异体。于另一态样中，本发明的特征在于一种杀死靶细胞的方法，该方法包括使多种细胞与上述任一态样或具体例中的可溶性融合蛋白复合物或IL-15变异体接触，其中，该多种细胞进一步包括承载有为上述态样中的IL-15结构域所识别的IL-15R链的免疫细胞，以及承载有为上述态样中的生物性活性多肽的至少一个所识别的抗原的靶细胞；在该靶细胞的抗原与该免疫细胞的IL-15R链之间形成特异性结合复合物(桥联)，其足以结合与活化该免疫细胞；以及通过所结合的经活化免疫细胞杀死该靶细胞。于该方法的一具体例中，该靶细胞为肿瘤细胞或病毒感染细胞。于该方法的另一具体例中，该生物性活性多肽包括TCR。于该方法的又一具体例中，该靶细胞的抗原包括呈递于MHC或HLA分子且可为TCR所识别的肿瘤或病毒编码肽抗原。于该方法的再一具体例中，该免疫细胞为T细胞、LAK细胞或NK细胞。于另一态样中，本发明的特征在于一种预防或治疗患者的疾病的方法，其中，该疾病细胞表达疾病相关抗原，该方法包括对该患者给予包括识别疾病相关抗原的生物性活性多肽的上述任一态样或具体例中的可溶性融合蛋白复合物或IL-15变异体，在抗原表达的疾病细胞与IL-15R表达的免疫细胞之间形成特异性结合复合物(桥联)，其足以定位该免疫细胞，以及伤害或杀死该疾病细胞，其足以预防或治疗患者的疾病。于一态样中，本发明的特征在于一种预防或治疗患者的疾病的方法，其中，该疾病细胞表达疾病相关抗原，该方法包括将承载该IL-15R链的免疫细胞与包括识别疾病相关抗原的生物性活性多肽的权利要求1至22中的可溶性融合蛋白复合物混合，对患者给予免疫细胞_融合蛋白复合物，在抗原表达的疾病细胞与IL-15R表达的免疫细胞之间形成特异性结合复合物(桥联)，其足以定位该免疫细胞，以及伤害或杀死该疾病细胞，其足以预防或治疗患者的疾病。于另一态样中，本发明的特征在于一种预防或治疗患者的疾病的方法，其中，该患者细胞表达疾病相关抗原，该方法包括对该患者给予包括识别疾病相关抗原的生物性活性多肽的上述任一态样或具体例中的可溶性融合蛋白复合物或IL-15变异体，将可溶性融合蛋白复合物或IL-15变异体定位至该疾病细胞，其中，该可溶性融合蛋白复合物的IL-15结构域或IL-15变异体与承载该IL-15R链的免疫细胞结合，以及抑制该免疫细胞的免疫应答。于该方法的一具体例中，该疾病为癌症或病毒感染。于该方法的另一具体例中，该疾病为免疫疾患、自体免疫疾病或炎性疾患。于该方法的另一具体例中，该疾病相关抗原为肽/MHC复合物。于另一具体例中，本发明的特征在于一种剌激哺乳动物的免疫应答的方法，包括对该哺乳动物给予有效量的上述任一态样或具体例中的可溶性融合蛋白复合物或IL-15变异体。于另一具体例中，本发明的特征在于一种抑制哺乳动物的免疫应答的方法，包括对该哺乳动物给予有效量的上述任一态样或具体例中的可溶性融合蛋白复合物或IL-15变异体。图l(A与B)为概要图。(A)为描述含有单链TCR多肽的融合蛋白复合物实例的概要图。(B)为描述包括融合蛋白复合物的代表性融合蛋白构筑体的概要图。图2(A至C)由三个图所组成。(A)描述pNEF38-c264scTCR/huIL15表达载体的图谱。(B)显示c264scTCR/huIL15融合基因的序列。(C)显示c264scTCR/huIL15融合蛋白的序列，其包含前导序列。图3(A至C)由三个图所组成。(A)描述pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15表达载体的图谱。(B)显示c264scTCR-hinge-huIL15融合基因的序列。(C)显示c264scTCR-hinge-huIL15融合蛋白的序列，其包含前导序列。图4(A至C)由三个图所组成。(A)描述pNEF38-c264scTCR/huIL15RaDE3表达载体的图谱。(B)显示c264scTCR/huIL15RaAE3融合基因的序列。(C)显示c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白的序列，其包含前导序列。图5(A至C)由三个图所组成。(A)描述pNEF38-c264scTCR/huIL15RaSushi表达载体的图谱。(B)显示c264scTCR/huIL15RaSushi融合基因的序列。(C)显示c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白的序列，其包含前导序列。图6(A至C)由三个图所组成。(A)描述pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15RaSushi表达载体。(B)显示c264scTCR-hinge-huIL15RaSushi融合基因的序列。(C)显示c264scTCR-hinge-huIL15RaSushi融合蛋白的序列，其包含前导序列。图7为pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaSushi表达载体的图谱。图8为pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaDE3表达载体的图谱。图9(A与B)阐述表达TCR/IL15Ra融合蛋白的转染细胞的特性。(A)为两个显示融合蛋白表达细胞的流式细胞仪分析的图。(B)为显示融合蛋白产生的以TCR为主的ELISA结果的图。图10(A与B)显示TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白通过还原SDSPAGE的分析。(A)显示含有c264scTCR/huIL15或c264scTCR/huIL15RaSushi的细胞培养物悬浮液。(B)显示含有c264scTCR/huIL15或c264scTCR/huIL15RaAE3的细胞培养物悬浮液。图ll(A至C)显示TCR/IL15、TCR/IL15Ra及融合蛋白复合物通过尺寸排出层析(sizeexclusionchromatography)的分析。(A)为显示c264scTCR/huIL15之SEC层析图谱的图。(B)为显示c264scTCR/huIL15RaSushi之SEC层析图谱的图。(C)为显示c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白复合物之SEC层析图谱的图。图12(A与B)为TCR/IL15Ra及融合蛋白复合物通过尺寸排出层析的分析。(A)为说明c264scTCR/huIL15RaAE3之SEC层析图谱的图。(B)为说明c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白复合物之SEC层析图谱的图。图13为显示通过流式细胞仪所测得的TCR/IL15、TCR/IL15Ra及融合蛋白复合物对细胞呈递的肽/MHC复合物的结合性的图。图14(A至D)由四个图所组成。(A)显示成熟人类IL15蛋白(SEQIDN0:1)的序列，蓝色底线的残基为表1所示的IL-15变异体中经取代者。(B)描述pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8A及pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8N表达载体。(C)显示pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8A及pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8N基因的序歹lj。(D)显示pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8A及pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8N融合蛋白的序列，其包含前导序列。改变蓝色底线的核苷酸以产生指定的IL-15变异体。图15为显示以融合蛋白及复合物染色，接着经TCR特异性肽/MHC试剂的承载有IL-15R的CTLL2细胞的流式细胞仪分析图。图16(A至C)为显示通过流式细胞仪所测得的TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15(包括天然与变异型IL15)的二聚体融合蛋白复合物对于呈递于载入肽的细胞的同源性肽/MHC复合物之结合性的图。亦显示于未载入肽的细胞的二聚体融合蛋白复合物之背景结合率。(A)为显示TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15wt(天然型)、或TCR/IL15D8N或TCR/IL15D8A变异体的二聚体复合物对于呈递于细胞的同源性肽/MHC复合物之结合性的图。(B)为显示TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15wt(天然型)的二聚体复合物对于未载入肽的细胞的微量背景结合率的图。TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15D8N或TCR/IL15D8A变异体的二聚体复合物对未载入肽的细胞未见到背景结合率。(C)为显示以TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15wt(天然型)、或TCR/IL15N72D、TCR/IL15D8N或TCR/IL15D8A变异体的二聚体复合物染色的承载有IL-15RPyC的32DP细胞之流式细胞仪分析图。观察到含有TCR/IL15N72D的复合物的IL-15RPYC结合性增强，以及含有TCR/IL15D8N或TCR/IL15D8A的复合物的IL-15RPyC结合性降低。图17(A与B)为显示通过ELISA所测得的野生型、拮抗剂及激动剂TCR/IL15融合蛋白对于同源性肽/MHC复合物与IL15Ra之结合活性的图。(A)为显示融合蛋白对于同源性肽/MHC复合物之结合活性的分析。(B)为显示融合蛋白对于IL15Ra之结合活性的分析。图18为显示通过细胞增生试验所测得的融合蛋白及融合蛋白复合物维持承载有IL15R的细胞生长的图。图19(A至C)为显示通过细胞增生试验所测得的包括IL-15变异体的TCR/IL-15融合蛋白抑制或增进承载有IL15R的细胞生长的能力的图。(A)为显示包括IL-15变异体的融合蛋白抑制承载有高亲和性IL15R(a|3Y受体复合物)的CTLL-2细胞增生的活性的图。(B)为显示包括IL-15变异体的融合蛋白抑制或增进承载有低亲和性IL15R(ey受体复合物)的32DP细胞增生的活性的图。(C)为显示包括IL-15变异体的融合蛋白阻断承载有高亲和性IL15R(a|3Y受体复合物)的CTLL-2细胞之TCR/IL15wt剌激性增生的活性的图。图20描述活体外培养NK细胞与TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15的二聚体融合蛋白复合物对异体移植荷肿瘤裸小鼠存活率的影响。对无胸腺裸小鼠注射人类NSCLCA549-A2细胞，以建立肺脏转移。将单离自异源供体小鼠脾脏的经纯化NK细胞与rhlL-2、MARTlscTCR-IL2、c264scTCR-IL2或c264scTCR-IL15/c264scTCR-IL15Ra于活体外培养并授受性转移(adoptivetransfer)至经环磷醯胺(cyclophosphamide,CTX)预先处理之荷肿瘤小鼠，如图中说明所示。描绘出处理之后的存活率百分比。图21阐述表l，其显示IL-15变异体中的氨基酸置换以及此等变异对IL-15活性的影响。图22A至B分别阐述IL-15的氨基酸序列(SEQIDNO:1)及IL-15的核酸序列(SEQIDNO:2)。具体实施例方式已确立IL-15稳定地结合至IL-15Ra的细胞外结构域，且所得复合物能够经由该中间型或高亲和性IL-15R复合物调控(亦即，剌激或阻断)免疫应答(l至4)。此外，已证实单链TCR或抗体多肽可融合至细胞激素及其他免疫效应物结构域，且此等双特异性融合分子保有两种融合结构域的功能活性(5至8)。再者，已显示多价型TCR对其配体提供增强的结合性(9)。定义以下定义是为用于下列文字说明中的特定术语而提供。说明书及权利要求书中所使用的单数形式〃a"、〃an"及〃the"包含复数指称，除非内容中另行清楚规定。举例而言，术语〃细胞〃包含多个细胞，包含其混合物。术语〃核酸分子〃包括多个核酸分子。此处所使用的术语〃包括〃意指组成物及方法包含所记载的元素，但不排除其他元素。当用于界定组成物及方法时，〃实质上由…所组成〃应指排除对组合具任何实质重要性的其他元素。因此，此处所定义的实质上由元素所组成的组成物将不排除得自单离及纯化方法的微量污染物以及医药上可接受的载剂，例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。〃由…所组成〃应指排除超过微量的其他成分及用于给予本发明组成物的实质方法步骤的元素。由此等转折语各自界定的具体例皆于本发明的范畴中。〃抗体〃为结合至特定抗原决定基(印itope)的任何免疫球蛋白，包含抗体及其片段。该术语涵括多株抗体、单株抗体、嵌合抗体及单链抗体，以及双特异性抗体。此处所使用的术语〃抗原〃意指会引发免疫系统制造抗体或特定细胞媒介的免疫应答与其对抗的任何物质。疾病相关抗原为与任何疾病相关的任何物质。此处所使用的术语〃生物性活性多肽〃意指氨基酸序列，例如蛋白质、多肽或肽；糖或多糖；脂质或醣脂、醣蛋白、或脂蛋白，其可产生此处讨论的所欲效果，包含TCR或抗体融合蛋白复合物与抗原的结合活性。此处所使用的术语〃细胞〃意图包含任何原核细胞、真核细胞、初级细胞或永生化细胞系(immortalizedcellline)、组织或器官中的此等细胞的任何群集。优选地，细胞得自哺乳动物(尤其是人类)的来源，且可经一种或多种病原体感染。依据本发明的〃宿主细胞〃可为任何来源的经转染(transfected)、经转形(transformed)、经转导(transduced)或经感染(infected)的细胞，包含原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、植物细胞或细菌细胞，或者其可为可用于增殖此处所述核酸的任何来源的细胞。此处所使用的术语〃共轭分子〃意指通过化学方法或其他适当方法共价连结(亦即，融合)的TCR或抗体分子与效应物分子(通常为化学分子或合成分子)。若有需要，共轭分子可经由肽接头序列或载体分子于一个或数个位置融合。或者，肽接头或载体可用于协助构筑共轭分子。特别优选的共轭分子为共轭毒素或可检测性标记。此处所使用的术语〃效应物分子〃意指氨基酸序列，例如蛋白质、多肽或肽；糖或多糖；脂质或醣脂、醣蛋白、或脂蛋白，其可产生此处讨论的所欲效果，包含IL-15结构域、IL-15变异体或IL-15受体(例如IL-15Ra、IL-2RP或yC)、或其功能性片段。术语〃融合分子〃及〃融合蛋白〃可交互地使用且意指通过重组方法、化学方法或其他适当方法共价连结(亦即，融合)的生物性活性多肽(通常为TCR或抗体)与效应物分子(通常为蛋白质或肽序列)。若有需要，融合分子可经由肽接头序列于一个或数个位置融合。或者，肽接头可用于协助构筑融合分子。特别优选的融合分子为融合蛋白。一般而言，融合分子亦可包括共轭分子。术语〃宿主细胞〃意指含有选殖载体或表达载体的任何原核细胞或真核细胞。此14术语亦包含彼等经基因工程而在宿主细胞的染色体或基因体中含有经选殖基因的原核细胞或真核细胞。此处所使用的术语〃免疫应答〃意指经由涉及不同的粘合及活化步骤的多因子过程剌激免疫细胞并从血液将免疫细胞召集至淋巴组织以及非淋巴组织的过程。活化条件引发细胞激素、生长因子、趋化激素及其他因子的释放，向上调节免疫细胞上的黏合分子及其他活化分子的表达，促进黏合、形态变化及/或与趋化作用同时的外渗作用(extravasation)通过组织，增加细胞增生及细胞毒杀活性，剌激抗原呈递以及提供其他表型变化(包括产生记忆细胞类型)。免疫应答亦意指免疫细胞抑制或调节其他免疫细胞的发炎或细胞毒杀活性的活性。此处所使用的术语〃多核苷酸〃及〃核酸分子〃可交互地使用，其意指任何长度的核苷酸的聚合型。多核苷酸可含有去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其类似物。核苷酸可具有任何三维立体结构，且可执行任何已知或未知的功能。术语〃多核苷酸〃包含例如单股、双股及三螺旋分子、基因或基因片段、外显子(exon)、内含子(intron)、mRNA、tRNA、rRNA、核糖酶(ribozyme)、反义分子(antisensemolecule)、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、适体(aptamer)、质体、载体、经单离的任何序列DNA、经单离的任何序列RNA、核酸探针、及引子。核酸分子亦可包括经修饰的核酸分子(例如，包括经修饰的碱基、糖类及/或核苷酸间接头)。术语〃多肽〃意指无论其大小，优选地实质上由任意的20个天然氨基酸所组成的任何聚合物。尽管术语〃蛋白质〃常用来指相对较大的蛋白质，〃肽〃常用来指小的多肽，在此领域中此等术语常部分重叠使用。除非另行注明，否则术语〃多肽〃一般是指蛋白质、多肽、及肽。通过标准分子分级技术(例如离心或SDS-聚丙烯醯胺凝胶电泳)进行判定时，依据本发明普遍适用的肽一般介于约O.1至100KD之间或更大而高达约1000KD，优选地介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30及50KD之间。术语〃预防(prevent)"、〃预防(preventing)"、〃预防(prevention)"、〃预防性治疗(prophylactictreatment)"等意指降低个体发展疾患或病症的可能性，该个体不具有疾患或病症，但有发展疾患或病症的风险或容易发展疾患或病症。术语〃单链抗体〃意指以单链形式为主的抗体。单链抗体可由抗体的最小结合次单元所组成。单链抗体可在单一安定折叠的多肽链上仅组合抗体的彼等抗原结合区域。依此，相较于典型的免疫球蛋白，单链抗体具有相当小的尺寸，但其仍保有抗体的抗原特异性结合性质。单链抗体可连结至广范围的配体，例如效应物分子或药物共轭体。此处所使用的术语〃可溶性〃意指在低G力离心(例如，于标准离心机中每分钟低于约30，000转)的情形下不容易从水性缓冲液(例如，细胞培养基)沉降的融合分子(尤其是融合蛋白)。再者，于低浓度或无阴离子性或非离子性界面活性剂存在下，若融合分子在高于约5至37°C的温度及在中性pH值或接近中性pH值仍维持于水溶液中，则该融合分子为可溶性的。于此等条件下，可溶性蛋白通常具有低沉降值，例如，低于约10至50沉降单位(svedbergunit)。此处所述及的水溶液典型地具有缓冲化合物以确立pH值，典型地，其介于约5至9的pH范围内，且离子强度范围介于约2mM及500mM之间。有时，添加蛋白酶抑制剂或温和的非离子性界面活性剂。此外，若有需要，可添加载体蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)而达到少量mg/ml。例示性水性缓冲液包含标准磷酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水、或其他广为人知的缓冲液及细胞培养基调配物。术语〃剌激(stimulate)"或〃剌激(stimulating)"意指增加、放大、增强、提高免疫应答。剌激可为正向改变。例示性增加可为例如，增加5%、10%、25%、50%、75%或甚至90至100%。其他例示性增加包含增加2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、或甚至100倍。术语〃抑制(suppress)"或〃抑制(su卯ressing)"意指减少、减弱、降低、遏止或平抑免疫应答。抑制可为负向改变。例示性减少可为例如，减少5%、10%、25%、50%、75%或甚至90至100%。例示性减少包含减少2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、或甚至100倍。术语〃T细胞受体〃(TCR)意指参与T细胞应答抗原呈递的活化作用的整合性膜蛋白(integralmembraneprotein)复合物的多肽。T细胞经由ap异二聚体T细胞受体(TCR)辨识结合至MHC产物的肽。TCR库具有广泛的多样性，该多样性由抗体重链及轻链基因中所使用的相同基因重排机制所创造[Toneg,，S.(1988)Biosci.R印.8:3-26]。大部分的多样性产生于编码a及P链的互补性决定区3(complementaritydeterminingregion3，CDR3)的可变(variable,V)区及连接(joining,J)区(或变异(diversity,D)区)的接合处[DavisandBjorkman(1988)Nature334:395-402]。然而，TCR不会如同抗体般，可能不会巧合地，进行体细胞点突变。TCR亦不会进行与抗体相同程度的亲和性成熟(affinitymaturation)。TCR在其自然产生时显现出具有范围介于105至107M—1的亲和性，而抗体则典型地具有范围介于105至109M—1的亲和性[Davisetal.(1998)An皿.Rev.Immunol.16:523-544;Eisenetal.(1996)Adv.ProteinChem.49:1-56]。尽管在TCR中缺乏体细胞突变可能与较低亲和性相关，但亦有主张认为TCR具有较高亲和性并不具有选择优势。事实上，T细胞活化作用的序列触发(serial-triggering)[Valituttietal.(1995)Nature375:148-151]及云力态校正(kineticproofreading)[Rabinowitzetal.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1401-1405]模型皆提出较长的分离速率(off-rates)(与较高亲和性相关)将不利于讯息传递过程。较高亲和性的TCR亦可能无法维持T细胞应答所需的肽特异性。举例而言，结合于MHC沟(MHCgroove)中的肽呈现有限的可及表面(accessiblesurface)[Bjorkman，P.J.(1997)Cell89:167-170]，其可能进而限制在相互作用可产生能量的量。另一方面，通过将能量导向MHC螺旋来提升TCR的亲和性可能将导致负向选择期间的胸腺缺失[Bevan，M.J.(1997)Immunity7:175-178]。术语"TCR"涵括多株T细胞受体、单株T细胞受体、嵌合T细胞受体、人类化T细胞受体、异二聚体T细胞受体及单链T细胞受体或其功能性片段，包含包括有TCRVa及VP结构域的分子。术语"TCR"亦涵括揭示于例如，2008年3月19日申请且案名为〃TCELLRECEPT0RFUSIONSANDCONJUGATESANDMETHODSOFUSETHERE0F〃的美国临时申请案以及美国专利公开案US200301-44474A1中的T细胞受体。术语〃载体〃为能够在宿主细胞中自行复制且可接受外来DNA的核酸分子。载体带有其本身的复制起始点、可用于插入外来DNA的一种或多种限制性内切酶的独特识别位置、以及通常带有筛选标志(selectablemarker)(例如，编码抗生素抗性的基因)、且常带有用于表达所插入的DNA的识别序列(例如，启动子)。常见的载体包含质体载体及噬菌体载体。T细胞受体(TCR)T细胞为细胞的次族群，其与其他免疫细胞类型(多形核嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞、肥胖细胞、B细胞、NK细胞)共同构成免疫系统的细胞组分。在生理条件下，T细胞在免疫监控及消灭外来抗原方面发挥作用。然而，在病理条件下，有强烈的证据显示T细胞在疾病的引发及扩散中扮演着重要的角色。于此等疾患中，破坏T细胞免疫耐受性(中枢性或周边性)为引发自体免疫疾病的主要基本过程。TCR由至少7个跨膜蛋白(transmembraneprotein)所构成。经二硫键连结的(aP)异二聚体形成单型抗原辨识单元，而CD3的恒定链(invariantchain)(其由e(印silon)、Y(gamma)、S(delta)与;(zeta)及n(eta)链所组成)负责与结合至讯息传递路径的配体联合，造成T细胞活化而发挥细胞免疫应答的作用。无论TCR链的基因多样性为何，所有已知的次单元皆共有两种结构特征。首先，该等次单元为具有单一跨膜结构域(singletransmembranespanningdomain)(可會g为a_螺旋)的跨膜蛋白。其次，所有TCR链皆具有在预定跨膜结构域内有带电荷氨基酸的不寻常特征。恒定链具有单一负电荷，其在小鼠与人类之间具保守性，而可变链则拥有一个(TCR-P)或两个(TCR-a)正电荷。TCR-a的跨膜序列在多种物种中具高度保守性，因此可在系统发生学上扮演重要的功能角色。含有亲水性氨基酸精氨酸及赖氨酸的八肽序列(oct即印tidesequence)在物种之间为相同。T细胞应答是由结合至TCR的抗原所调控。其中一种类型的TCR为由a及|3链(类似免疫球蛋白的可变(V)及恒定(C)区)所组成的膜结合性异二聚体。TCRa链包含共价连结的V-a及C-a链，而|3链则包含共价连结至C-P链的V-P链。V_a及V-P链形成在主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)(在人类中称为HLA复合物)的背景中可与超级抗原(superantigen)或抗原结合的囊状物或凹口。参见DavisAnn.Rev.ofImmunology3:537(1985)fundamentalImmunology3rdEd.，W.PaulEd.RsenPressLTD.NewYork(1993)。融合蛋白本发明的可溶性融合蛋白及共轭分子复合物包括至少两种可溶性融合蛋白，其中，第一融合蛋白包含第一生物性活性多肽，其共价连结至介白素-15(interleukin-15，IL-15)或其功能性片段，第二融合蛋白包括第二生物性活性多肽，其共价连结至可溶性介白素-15受体a(IL-15Ra)多肽或其功能性片段，其中第一融合蛋白的IL_15结构域结合至第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域以形成可溶性融合蛋白复合物。于某些实例中，生物性活性多肽之一个包括第一可溶性TCR或其片段。该生物性活性多肽之另一个或第二生物性活性多肽包含第一可溶性TCR或其功能性片段，因而创造多价TCR融合蛋白复合物，其具有相较于单价TCR而言，对同源性配体增加的结合活性。再者，该另一个生物性活性多肽包括不同于该第一可溶性TCR的第二可溶性TCR或其功能性片段。于某些实例中，相较于天然TCR而言，所产生的TCR具有较高的亲和性，或对同源性配体增加的结合活性。若此处所述的本发明可溶性TCR对其配体具有较高的结合性(avidity)或亲和性，则其适用于作为细胞表面结合性抗原的特异性探针。于本发明的某些优选实例中，TCR特定抗原的辨识具有特异性。于例示性具体例中，TCR为包括a链(此处称为a、阿伐(alpha)或a链)及P链(此处称为P、贝他(beta)或b链)的异二聚体。于其他例示性具体例中，TCR包括单链TCR多肽。单链TCR可包括通过肽接头序列共价连结至TCRV_|3链的TCRV-a链。单链TCR可进一步包括共价连结至TCRV-13链的可溶性TCRCP链片段。单链TCR可进一步包括共价连结至TCRV-a链的可溶性TCRCa链片段。于再一具体例中，第一与第二生物性活性多肽的一个或两个包括抗体或其功能性片段。此处所使用的术语〃生物性活性多肽〃或〃效应物分子〃意指可产生此处讨论的所欲效果的氨基酸序列，例如蛋白质、多肽或肽；糖或多糖；脂质或醣脂、醣蛋白、或脂蛋白。效应物分子亦包含化学药剂。亦涵括编码生物性活性或效应物蛋白、多肽、或肽的效应物分子核酸。因此，适当的分子包含调节因子、酶、抗体或药物，以及DNA、RNA及寡核苷酸。生物性活性多肽或效应物分子可为天然存在的，或者，其可例如通过重组或化学合成法从已知成分合成，且可包含异源组分。通过标准分子分级技术(例如离心或SDS-聚丙烯醯胺凝胶电泳)进行判定时，生物性活性多肽或效应物分子一般介于约0.1至100KD之间或更大而高达约1000KD，优选地介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30及50KD之间。本发明的所欲效果包含，但不限于例如在预防或治疗疾病方面形成具有增加的结合性的TCR融合蛋白复合物、杀死靶细胞，以例如引发细胞增生或细胞死亡、起始免疫应答，或者作为用于诊断目的之检测分子。对于此等检测可使用检定法，例如包含下列连续步骤的检定法培养细胞以使其增生，使该细胞与本发明的TCR融合复合物接触，接着评估TCR融合复合物是否抑制该细胞的进一步发展。依据本发明共价连结效应物分子至TCR肽提供多个显著优点。本发明的TCR融合复合物可制造成含有单一效应物分子，包含具有已知结构的肽。此外，种类繁多的效应物分子可在相似的DNA载体中制造。换言之，不同效应物分子库可连结至TCR分子，以用于呈递经感染细胞或疾病细胞。再者，就治疗应用而言，可对个体给予编码连结至效应物肽的TCR分子的DNA表达载体以于活体内表达TCR融合复合物，而不对个体给予TCR分子。此等方法避免典型地与制备重组蛋白相关的昂贵纯化步骤，且避免与习知方法相关的抗原摄取及加工的复杂步骤。如所述，此处揭示的融合蛋白组分(例如，效应物分子，如细胞激素、趋化激素、生长因子、蛋白毒素、免疫球蛋白结构域或其他生物活性分子以及任何肽接头)可依几乎任合方式组织，限制条件为该融合蛋白具有其所谋求的功能。特定而言，若有需要，融合蛋白的各组分可通过至少一个适当的肽接头序列而彼此隔开。此外，融合蛋白可包含标识物(tag)，以例如帮助融合蛋白的修饰、辨别及/或纯化。更具体的融合蛋白如下文实施例中所述。[接头]本发明的融合复合物优选地亦包含插至于IL-15或IL-15Ra结构域与生物性活性多肽之间的可挠性接头序列(flexiblelinkersequence)。接头序列使生物性活性多肽对IL-15或IL-15Ra结构域的有效定位得以达成，而使该两种结构域的功能活性得以发挥。于生物性活性多肽为TCR的具体例中，接头序列定位TCR分子结合沟，使得T细胞受体可辨识呈递MHC-肽复合物，且可运送效应物分子至所欲位置。通过以下揭示的检定法测定时，效应物分子成功的呈递可调控细胞的活性或者引发或抑制T细胞增生，或者起始或抑制对特定位置的免疫应答，该检定法包含活体外检定法，其包含下列连续步骤培养T细胞以使其增生，使该T细胞与本发明的TCR融合复合物接触，接着评估TCR融合复合物是否抑制该细胞的进一步发展。于某些具体例中，可溶性融合蛋白复合物具有接头，其中，第一生物性活性多肽通过多肽接头序列共价连结至IL-15(或其功能性片段)。于其他具体例中，此处所述的可溶性融合蛋白复合物具有接头，其中，第二生物性活性多肽通过多肽接头序列共价连结至IL-15Ra多肽(或其功能性片段)。接头序列优选地由能得到可有效地定位用于辨识呈递抗原的TCR分子结合沟的肽的核苷酸序列所编码。此处所使用的词语〃生物性活性多肽对IL-15或IL-15Ra结构域的有效定位〃或其他类似词语意指将连结至IL-15或IL-15Ra结构域的生物性活性多肽予以定位，使得IL-15或IL-15Ra结构域能够彼此产生相互作用，以形成蛋白复合物。于某些具体例中，IL-15或IL-15Ra结构域经有效定位，而得以与免疫细胞产生相互作用，以起始或抑制免疫反应、或者抑制或剌激细胞的发展。优选地，接头序列包括约7至20个氨基酸，更优选地，约8至16个氨基酸。接头序列优选地为具可挠性，因而不会将生物性活性多肽或效应物分子固定于单一种非所欲构形。可使用接头序列以例如隔开识别位置与融合分子。详言之，肽接头序列可在生物性活性多肽及效应物分子之间进行定位，以例如将其化学性交联以及提供分子可挠性。接头优选地主要包括具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸及丝氨酸，以提供可挠性。优选地，约80或90%或更高的接头序列包括甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，尤其是甘氨酸及丝氨酸残基。对于包括异二聚体TCR的融合蛋白复合物，接头序列宜连结至TCR分子的b链，尽管接头序列亦可附接至TCR分子的a链。或者，接头序列可连结至TCR分子的a链及b链两个。当此等13肽链与a链同时表达时，连结的TCR-效应物肽会折叠而产生如图1所概述的功能性TCR分子。一种适当的接头序列为ASGGGGSGGG(亦S卩，AlaSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly)，优选地连结至TCR的b结构域的第一个氨基酸。可使用包含任何数目的可挠性接头设计的不同接头序列，其已成功地用于将抗体可变区连接在一起，参见Whitlow,M.etal.，(1991)Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:97-105。于某些实例中，对于共价连结效应物分子至TCRb链分子，接头的氨基酸序列应能从TCRI3链的C-端残基至效应物分子的N-端残基横跨适当的距离。适当的接头序列可凭经验轻易地鉴别。此外，接头序列适当的大小及序列亦可通过以TCR分子的预定大小及形状为基准的习知电脑模拟技术测得。—般而言，本发明融合蛋白复合物的制备可通过此处所揭示的程序以及通过经认可的重组DNA技术来完成，该重组DNA技术涉及例如聚合酶链扩增反应(PCR)、制备质体DNA、以限制酶酶切DNA、制备寡核苷酸、DNA的粘结(ligation)、单离mRNA、将DNA导入适当的细胞、宿主的转形或转染、培养宿主。此外，融合分子可使用离液剂(chaotropicagent)以及广为人知的电泳法、离心法及层析法而单离及纯化。参见Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryMa皿al(2nded.(1989);以及Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork(1989)中与此等方法相关的内容。此处所使用的本发明生物性活性多肽或效应物分子可包含诸如细胞激素、趋化激素、生长因子、蛋白毒素、免疫球蛋白结构域或其他活性蛋白(例如酶)等因子。生物性活19性多肽亦可包含其他化合物的共轭体，例如非蛋白毒素、细胞毒性药剂、化学治疗药剂、可检测性标记、放射活性物质等。本发明的细胞激素界定为由细胞所产生且影响其他细胞且负责任何数目的细胞免疫性多重效果的任何因子。细胞激素的实例包含，但不限于IL-2家族、干扰素(IFN)、IL-10、IL-1、IL-17、TGF及TNF细胞激素家族，以及IL-1至IL-35、IFN-a、IFN-P、IFN-y、TGF_P、TNF_a及T卿。于本发明的一态样中，第一融合蛋白包括第一生物性活性多肽，其共价连结至介白素-15(IL-15)结构域或其功能性片段。IL-15为影响T细胞活化及增生的细胞激素。在影响免疫细胞活化及增生上，IL-15活性在某些方面类似于IL2，尽管已对主要的差异进行充分的定性(Waldmann，TA，2006，NatureRev.Immunol.6:595-601)。于本发明的另一态样中，第一融合蛋白包括为IL-15变异体(此处亦称为IL-15突变体)的介白素-15(IL-15)结构域。IL-15变异体优选地包括与天然(或野生型)IL-15蛋白不同的氨基酸序列。IL-15变异体优选地与IL-15Ra多肽结合且作用为IL-15激动剂或拮抗剂。优选地，具有激动剂活性的IL-15变异体具有极大的激动剂活性。于某些具体例中，无关于其与IL-15Ra的联合作用，IL-15变异体可作用为IL-15激动剂或拮抗剂。IL-15激动剂可例示为相较于野生型IL-15而言具有相当的或增加的生物活性者。IL-15拮抗剂可例示为相较于野生型IL-15而言具有减少的生物活性者，或具有抑制IL-15媒介的应答的能力者。于某些实例中，IL-15变异体以增加或减少的活性结合至IL-15RI3yC受体。于某些具体例中，相较于天然的IL-2序列，IL-15变异体的序列具有至少一个氨基酸变异，例如取代(substitution)或删除(deletion)，此等变异导致IL-15激动剂或拮抗剂活性。优选地，氨基酸取代/删除在IL-15与IL-15RP及/或YC发生相互作用的结构域中。更优选地，氨基酸取代/删除不会影响IL-15Ra多肽的结合性或产生IL-15变异体的能力。用以产生IL-15变异体的适当氨基酸取代/删除可如此处所提供经由理性或随机的诱变及功能检定，依据推定的或已知的IL-15结构、IL-15与同源分子(例如，具有已知结构的IL-2)的比较而加以辨别，或者可利用其他经验方法加以辨另ij。此外，适当的氨基酸取代可为额外氨基酸的保守性或非保守性改变及插入。优选地，本发明的IL-15变异体在成熟人类IL-15序列的位置8、61、65、72、92、101、108或111含有一个或超过一个氨基酸取代/删除；尤其，D8N(〃D8"意指在天然成熟人类IL-15序列中的氨基酸及残基位置，而〃N"意指在IL-15变异体该位置上的取代氨基酸残基)、D8A、D61A、N65A、N72R或Q108A取代产生具有拮抗剂活性的IL-15变异体，而N72D取代将产生具有激动剂活性的IL-15变异体。尽管在本发明的一态样中IL-15变异体为融合蛋白复合物的组分，在其他态样中IL-15变异体为非融合蛋白。优选地，非融合型的IL-15变异体为可溶性细胞激素，其作用为IL-15激动剂或拮抗剂。于某些具体例中，非融合性IL-15变异体与IL-15Ra形成复合物，而于其他具体例中，非融合性IL-15变异体与IL-15Ra独立作用。类似于细胞激素，本发明的趋化激素定义为当暴露于其他细胞时负责任何数目的细胞免疫性多重效果的任何化学因子或分子。适当的趋化激素可包含，但不限于CXC、CC、C及CX3C趋化激素家族，以及CCL-1至CCL-28，以及CXC-1至CXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-lb、IL-8、MCP-1及Rantes。生长因子包含当暴露于特定细胞时会引发所影响的细胞的增生及/或分化的任何分子。生长因子包含蛋白质与化学分子，其中某些包含GM-CSF、G-CSF、人类生长因子及干细胞生长因子。其他生长因子亦可适用于本文所述的用途。毒素或细胞毒性药剂包含当暴露于细胞时对生长具有致死效果或抑制效果的任何物质。更详言之，效应物分子可为例如植物或细菌来源的细胞毒素，举例而言，如白喉毒素(diphtheriatoxin，DT)、志贺毒素(shigatoxin)、相思子毒素(abrin)、霍舌L毒素(choleratoxin)、蓖麻毒素(ricin)、阜草素(saporin)、绿月农杆菌夕卜毒素(pseudomonasexotoxin,PE)、商足各抗病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein)或白丰对素(gelonin)。此等毒素的生物性活性片段在此技艺中为广知者，且包含例如DTA链及蓖麻毒素A链。此外，毒素可为在细胞表面具活性的药剂，举例而言，如磷脂酶(phospholipaseenzyme)(例如，磷脂酶C)。再者，效应物分子可为化学治疗药物，举例而言，如长春地辛(vindesine)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastin)、甲氨喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、博来霉素(bleomycin)或顺钼(cisplatin)。此外，效应物分子可为适用于诊断或影像学研究的可检测性标记分子。此等标记包含生物素(biotin)或链霉亲和素/亲和素(str印tavidin/avidin)、可检测性纳米粒子(nanoparticle)或结晶、酶或其催化性活性片段、萤光标记(例如，绿色萤光蛋白、FITC、藻红素(phycoerythrin)、细胞色素(cychome)、德州红(texasred)或量子点(quantumdots));放射核种(radionuclide)，例如碘-131、紀-90、铼-188或铋-212;磷光分子或化学冷光分子、或可经PET、超音波或MRI检测的标记(例如，以Gd为主的对比剂或以顺磁金属离子(paramagneticmetalion)为主的对比剂)。参见例如Moskaug，etal.J.Biol.Chem.264，15709(1989);Pastan，Letal.Cell47，641，1986;Pastanetal.，RecombinantToxinsasNovelTherapeuticAgents,Ann.Rev.Biochem.61，331，(1992);〃ChimericToxins"OlsnesandPhil，Ph翻ac.Ther.，25，355(1982);PCT公开案案号WO94/29350;PCT公开案案号W094/04689;PCT公开案案号W02005046449及美国专利5，620，939中有关制造及使用包括效应物或标识物的蛋白的内容。包含共价连结的IL-15及IL-15Ra结构域的蛋白融合或共轭复合物具有多种重要用途。举例而言，包括TCR的蛋白融合或共轭复合物可用于运送IL-15/IL-15Ra复合物至能够与TCR特异性结合的某些细胞。因此，蛋白融合或共轭复合物提供选择性伤害或杀死包括配体的细胞的手段。能够受到包括TCR的蛋白融合或共轭复合物所伤害或杀死的细胞或组织的实例包含表达一种或多种能够受到TCR特异性结合的配体的肿瘤及经病毒或细菌感染的细胞。容易受到伤害或杀死的细胞或组织可通过此处所揭示的方法轻易地检验出来。本发明的IL-15及IL-15Ra多肽在氨基酸序列上适当地对应于天然存在的IL-15及IL-15Ra分子，例如，人类、小鼠或其他啮齿动物、或其他哺乳动物的IL-15及IL-15Ra分子。在某些情形中，使本发明的蛋白融合或共轭复合物成为多价(例如，增加sc-TCR的价数)可为有利的。特定而言，融合蛋白复合物的IL-15与IL-15Ra结构域之间的相互作用提供产生多价复合物的手段。此外，通过使用例如标准生物-链霉亲和素标记技术，或通过共轭结合至适当固体担体(例如，乳胶珠)，可经由在一及四个蛋白(相同或不同)之21间共价或非共价连结在一起而制造多价融合蛋白。经化学性交联连结的蛋白(例如，交联成树枝状聚合物(dendrimer))亦为适当的多价物种。举例而言，可通过纳入具有化学反应性侧链(例如，Cys或His)的氨基酸残基或是编码可经修饰的标识物序列(例如，生物素化BirA标识物)的序列而修饰蛋白。此等氨基酸标识物或化学反应性氨基酸可位于融合蛋白的各种不同位置，优选地，于生物性活性多肽或效应物分子的活性位置的末端。举例而言，可溶性融合蛋白的C-端可共价连结至标识物或包含此等反应性氨基酸的其他融合蛋白。可纳入适当的侧链以化学性连结两个或更多个融合蛋白至适当的树枝状聚合物或其他纳米粒子，以获得多价分子。树枝状聚合物为合成性化学聚合物，其可于表面具有的任一种多种不同官能基(D.Tomalia，AldrichimicaActa，26:91:101(1993))。依据本发明所使用的例示性树枝状聚合物包含例如E9星爆型聚胺树枝状聚合物(E9starburstpolyaminedendrimer)及E9燃烧型聚胺树枝状聚合物(E9combustpolyaminedendrimer)，其可连结胱氨酸残基。核酸及载体(核酸)本发明另提供编码本发明融合蛋白的核酸序列(尤其是DNA序列)。优选地，该DNA序列由适用于染色体外复制的载体(例如，噬菌体、病毒、质体、噬菌粒(phagemid)、粘质体(cosmid)、YAC或离合染色小体(印isome))所携带。特定而言，编码所欲融合蛋白的DNA载体可用于增进此处所述的制备方法以及获得显著大量的融合蛋白。可将该DNA序列插入适当的表达载体，亦即，含有所插入蛋白质编码序列(protein-codingsequence)的转录及翻译用必要元素的载体。可使用各种宿主-载体系统来表达蛋白质编码序列。此等系统包含经病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；经病毒(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，如含有酵母菌载体的酵母菌，或经噬菌体DNA、质体DNA或粘质体DNA转形的细菌。根据所用的宿主_载体系统，可使用多种适当的转录及翻译元素的任一个。参见上述Sambrooketal.及上述Ausubeletal.。本发明包含制造可溶性融合蛋白复合物的方法，该方法包括将此处所述编码该第一与第二融合蛋白的DNA载体导入宿主细胞，在足以于细胞或培养基中表达该融合蛋白的条件下，在培养基中培养该宿主细胞，且使第一融合蛋白的IL-15结构域与第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域之间发生联合，以形成可溶性融合蛋白复合物，由该宿主细胞或培养基纯化该可溶性融合蛋白复合物。—般而言，根据本发明优选的DNA载体包括通过磷酸二酯键连结的核苷酸序列，其以5'朝向3'方向包括用于导入的编码TCR链的第一核苷酸序列的第一选殖位置，该第一核苷酸序列操作性连结至编码效应物分子的序列。由DNA载体所编码的融合蛋白组分可呈匣盒形式(cassetteformat)提供。术语〃匣盒(cassette)〃意指通过标准重组方法可轻易地将各组分取代另一个组分。特定而言，当所编码的融合复合物是用来对抗可能具有或具有发展出血清型(serotype)的能力的病原体时，配置成匣盒形式的DNA载体尤其适宜。通过使用适当的粘结酶(ligase)，将编码TCR分子的序列连结至编码效应物肽的序列，以制造编码TCR融合复合物的载体。编码呈递的肽的DNA可通过从天然来源(例如，从适当的细胞系)单离DNA而得，或通过已知合成方法(例如，磷酸三酯方法)而得。参见例如OligonucleotideSynthesis,IRLPress(MJ.Gait，ed.，1984)。亦可使用市面上可购得的寡核苷酸自动合成剂来制备合成性寡核苷酸。一旦经过单离后，编码TCR分子的基因可通过聚合酶链反应(PCR)或其他此技艺中已知的手段加以扩增。用以扩增TCR肽基因的适当PCR引子可将限制酶切割位置(restrictionsite)加入PCR产物中。PCR产物优选地包含效应物肽所需的剪接位置(splicesite)以及恰当表达及分泌TCR-效应物融合复合物所需的前导序列。PCR产物亦优选地包含编码接头序列的序列，或用于粘结此等序列的限制酶切割位置。此处所述的融合蛋白优选地通过标准重组DNA技术制成。举例而言，一旦编码TCR蛋白的DNA分子经单离后，序列可连结至编码效应物多肽的另一个DNA分子。编码TCR分子的核苷酸序列可直接接合至编码效应物肽的DNA序列，或者，更详言之，此处所讨论的编码接头序列的DNA序列可插置于编码TCR分子的序列与编码效应物肽的序列之间，并使用适当的粘结酶予以接合。所得杂合DNA分子可在适当宿主细胞中表达，以产生TCR融合复合物。将DNA分子彼此以5'朝向3'方向粘结，使得粘结后，所编码多肽的翻译读框(translationalframe)不会改变(亦及，DNA分子彼此以符合读框(in-frame)的方式连结)。所得DNA分子编码符合读框的融合蛋白。其他核苷酸序列亦可纳入基因构筑体中。举例而言，启动子序列(其控制编码融合至效应物肽的TCR肽的序列的表达)或前导序列(其将TCR融合复合物导向细胞表面或培养基)可纳入构筑体中或存在于构筑体所插入的表达载体中。特别优选者为免疫球蛋白或CMV启动子。于获得的变异TCR编码序列中，熟习此技艺者将了解TCR衍生的蛋白可在不会丧失或降低生物活性的情形下通过某些氨基酸的取代、添加、删除、以及翻译后修饰而加以修饰。特定而言，已广知保守性氨基酸取代(亦即，以一氨基酸取代具有相似大小、电荷、极性及构形的另一个氨基酸)不太可能会显著地改变蛋白质功能。为蛋白质构造成分的20个标准氨基酸可大致分成下列四个保守性氨基酸群组非极性(疏水性)群组，包含丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸及缬氨酸；极性(不带电，中性)群组，包含天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸；正电(碱性)群组，包含精氨酸、组氨酸及赖氨酸；以及负电(酸性)群组，包含天冬氨酸及谷氨酸。于蛋白质中以一氨基酸取代相同群组内的另一个氨基酸不太可能会对蛋白质的生物活性具有不利的影响。核苷酸序列之间的同源性(homology)可通过DNA杂合分析测得，其中，双股DNA杂合体的安定性取决于所发生的碱基配对程度。高温及/或低盐含量的条件降低杂合体的安定性，且可改变此等条件以预防具有低于选定的同源性程度的序列发生缓冷配对(annealing)。举例而言，对于具有约55%G_C含量(G_Ccontent)的序列，40至50°C，6倍SSC(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液)及0.1%SDS(十二基硫酸钠)的杂合及洗涤条件表示约60至70%同源性；50至65t:，l倍SSC及0.1%SDS的杂合及洗涤条件表示约82至97%同源性；以及52°C，0.1倍SSC及0.1%SDS的杂合及洗涤条件表示约99至100%同源性。亦可利用比较核苷酸及氨基酸序列(以及测定同源性程度)用的广范围电脑程式，而提供市面上可购得的软体及免费软体资源的表单可见于Ausubeletal.(1999)。可即时取得的序列比较及多重序列比对演算法分别为基本区域比对搜寻工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLAST)(Altschuletal.，1997)及ClustalW程式(ClustalWprograms)。BLAST可于全球资讯网上在ncbi.nlm.nih.gov取得，而ClustalW的版本可在2.ebi.ac.uk取得。融合蛋白的组分几乎可依任何顺序加以配置，惟其各者能够实施其所预期的功能。举例而言，于一具体例中，TCR是位于效应物分子的C或N端。本发明优选效应物分子的大小为有助于彼等结构域所预期的功能者。本发明的效应物分子可通过各种方法(包含广知的化学交联方法)制造并融合至TCR。参见例如Means,G.E.andFeeney，R.E.(1974)inChemicalModificationofProteins,Holden-Day。亦参见S.S.Wong(1991)inChemistryofProteinConjugationandCross-Linking,CRCPress。然而，一般而言，使用重组操作来制造符合读框的融合蛋白为优选者。如所述，可依数种方式来配置依据本发明的融合分子或共轭分子。于示例性配置中，TCR的C-端操作性连结至效应物分子的N-端。若有需要，该连结可通过重组方法达成。然而，于另一配置中，TCR的N-端连结至效应物分子的C-端。或者，或此外，有需要时，可将一种或多种额外的效应物分子插入TCR融合复合物或共轭复合物。(载体及表达)可利用多种策略来使本发明的蛋白融合复合物表达。举例而言，可通过已知手段(例如，通过使用限制酶在载体中制造切位以用于插入构筑体，随后进行粘结作用)将上述的TCR基因融合构筑体并入适当的载体。接着，将含有基因构筑体的载体导入适当宿主中以用于表达TCR融合肽。参见如上述之Sambrooketal.。可基于与选殖操作流程相关的因素凭经验选择适当载体。举例而言，载体应可与所用的宿主相容且具有对于该宿主而言恰当的复制单元(r印licon)。再者，载体必须能够容纳编码所欲表达的TCR融合复合物的DNA序列。适当的宿主细胞包含真核细胞及原核细胞，优选地为那些可轻易转形且在培养基中显现快速生长性的细胞。特别优选的宿主细胞包含例如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillussubtillus)等原核生物，以及例如动物细胞及酵母菌菌株(例如，啤酒酵母(S.cerevisiae))等真核生物。一般而言，哺乳动物细胞为优选者，尤其是J558、NS0、SP2-0或CH0。其他适当的宿主包含例如昆虫细胞，如Sf9。使用习知的培养条件。参见如上述之Sambrook。接着，可筛选安定的经转形细胞系或经转染细胞系。表达本发明TCR融合复合物的细胞可通过已知程序测定。举例而言，连结至免疫球蛋白的TCR融合复合物的表达可通过对所连结的免疫球蛋白具特异性的ELISA及/或通过免疫转印法(immunoblotting)予以测定。用于检测包括连结至IL-15或IL-15Ra结构域的TCR的融合蛋白的表达的其他方法揭示于实施例中。如以上所概述，宿主细胞可用于制备目的，以增殖编码所欲融合蛋白的核酸。因此，宿主细胞可包含特别谋求产生融合蛋白的原核细胞或真核细胞。因此，特定而言，宿主细胞包含酵母菌、蝇类、虫类、植物、蛙类、哺乳动物细胞以及能够增殖编码该融合物的核酸的器官。可使用的哺乳动物细胞系的非限制性实例包含CHOdhfr-细胞(UrlaubandChasm，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4216(1980))、293细胞(Grahametal，JGen.Virol.，36:59(1977))、或骨髓瘤细胞，如SP2或NSO(GalfreandMilstein，Meth.Enzymol.，73(B):3(1981))。能够增殖编码所欲融合蛋白的核酸的宿主细胞亦涵括非哺乳动物真核细胞，包含昆虫(例如，草地贪夜蛾(Sp.frugiperda))、酵母菌(例如，啤酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、克鲁维酵母(K.lactis)、汉森酵母(H.polymorpha);如Fleer，R.，CurrentOpinioninBiotechnology,3(5):486496(1992)中所概论)、真菌及植物细胞。亦涵括某些原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)及杆菌属(Bacillus)。可通过用于转染细胞的标准技术将编码所欲融合蛋白的核酸导入宿主细胞。术语〃转染(transfecting)"或"转染(transfection)"意图涵括用于将核酸导入宿主细胞的所有习知技术，包含磷酸钙共沉淀法(calciumphosphateco-precipitation)、DEAE-葡聚糖媒介的转染(DEAE-dextran-mediatedtransfection)、脂质体转染(lipofection)、电穿孑L(electroporation)、微注身寸(microinjection)、病毒转导及/或插入。用于转染宿主细胞的适当方法可见于如上述的Sambrooketal以及其他实验室课本。根据本发明，可使用各种启动子(转录起始调节区)。恰当启动子的选择取决于所提出的表达宿主。可使用得自异源性来源的启动子，只要其在所选的宿主中具有功能即可。启动子的选择亦取决于肽或蛋白质所欲的产生效率及程度。常使用诱发性启动子(例如，tac)以急剧地增加大肠杆菌中的蛋白质表达程度。蛋白质的过量表达(overe邓ression)可能对宿主细胞有害。结果，可能会限制宿主细胞的生长。使用诱发性启动子系统使得宿主细胞得以在诱发基因表达之前培育至可接受的密度，藉此促进较高的产物产率。根据本发明，可使用各种讯息序列。可使用与TCR编码序列同源的讯息序列。或者，亦可使用经选定或设计成会在表达宿主中有效分泌及制造加工的讯息序列。举例而言，适当的讯息序列/宿主细胞配对包含用于在枯草杆菌中表达的枯草杆菌sacB讯息序列(B.subtilissacBsignalsequence)，及啤酒酵母a_交配因子(Saccharomycescerevisiaea-matingfactor)或用于巴其jf德毕赤酵母分泌作用的巴其j德毕赤酵母酸磷酸盐phol讯息序歹lj(P.pastorisacidphosphatasepholsignalsequence)。讯息序列可通过编码该讯息肽酶(signalp印tidase)切割位置的序列直接连接至蛋白质编码序列，或通过由通常少于十个密码子(codon)所组成的短核苷酸桥联(bridge)连接至蛋白质编码序列，其中，该桥联确保正确的下游TCR序列读框。已对真核生物蛋白表达系统鉴别出用于增进转录及翻译的元素。举例而言，将花椰菜镶嵌病毒(cauliflowermosaicvirus,CaMV)启动子1000碱基对(bp)定位于异源性启动子任一侧可在植物细胞中提升转录程度10至400倍。表达构筑体亦应包含适合的翻译起始序列。为了恰当的翻译起始而将表达构筑体纳入Kozak—致性序列(Kozakconsensussequence)的修饰作用可增加翻译程度10倍。通常使用筛选标志，其可为表达构筑体的一部分或与表达构筑体分开(例如，由表达载体携带)，使得该标志可插入不同于感兴趣的基因的位置。标志的实例包含赋予对抗生素的抗性的标志(例如，bla对大肠杆菌宿主细胞赋予对胺苄青霉素(ampicillin)的抗性，nptll对广大种类的原核细胞及真核细胞赋予对卡那霉素(kanamycin)的抗性)或容许宿主在基本培养基(minimalmedium)生长的标志(例如，HIS4使巴斯德毕赤酵母或补25充有组氨酸的啤酒酵母(His.sup,S.cerevisiae)能够在组氨酸缺乏下生长)。筛选标志具有其本身的转录及翻译起始及终止调节区，而使该标志得以独立表达。若利用抗生素抗性作为标志，则用于筛选的抗生素浓度将视抗生素而异，一般介于10至600g抗生素/培养基(mL)的范围。通过使用已知的重组DNA技术来组装表达构筑体(Sambrooketal.，1989;Ausubeletal.，1999)。限制酶酶切及粘结为用于连接两个DNA片段的基本步骤。DNA片段的终端在粘结之前可能需要予以修饰，此修饰作用可通过填补突出部分(overhang)、以核酸酶(nuclease)(例如，ExoIII)删除片段的终端部分、定点突变(sitedirectedmutagenesis)、或通过以PCR添加新的碱基对而完成。可使用多接头(polylinker)及接合子(adaptor)来促进所选择片段的连接。表达构筑体典型地在利用酶切、粘结及大肠杆菌的转形的循环之阶段中予以组装。多种适用于构筑表达构筑体的选殖载体在此技艺中为已知者(lambda.ZAPandpBLUESCRIPTSK_1，Stratagene，LaJoIIa，Calif，pET，NovagenInc.，Madison，Wis.-记载于Ausubeletal.，1999)，且对本发明而言特定的选择并不重要。选殖载体的选择将受到经选定以用来将表达构筑体导入宿主细胞的基因转移系统(genetransfersystem)所影响。在各阶段结束时，所得构筑体可通过酶切、DNA序列、杂合及PCR分析予以分析。表达构筑体可以选殖载体构筑体(线性或环状)的形式转形至宿主中，或可从选殖载体中移除而以其本身使用或导入传递载体(deliveryvector)。传递载体促使表达构筑体在所选定的宿主细胞类型中的导入及维持。表达构筑体是通过多种已知基因转移系统(例如，自然转形能力(naturalcompetence)、化学媒介的转形、原生质体转形(protoplasttransformation)、电穿孑L、基因枪转形(biolistictransformation)、转染或共轭)的任一个导入宿主细胞(Ausubeletal.，1999;Sambrooketal.，1989)。所选择的基因转移系统取决于所使用的宿主细胞及载体系统。举例而言，可通过原生质体转形或电穿孔将表达构筑体导入啤酒酵母。啤酒酵母的电穿孔可轻易完成，且产生与原生质球状体转形(spheroplasttransformation)相当的转形效率。本发明另提供用于单离感兴趣的融合蛋白的制程。在此过程中，已导入操作性连结至调节序列的编码感兴趣的蛋白质之核酸的宿主细胞(例如，酵母菌、真菌、昆虫、细菌或动物细胞)是在融合蛋白存在下于培养基中以生产规模生长，以剌激编码感兴趣的融合蛋白的核苷酸序列的转录。随后，从所收取的宿主细胞中或从培养基中单离感兴趣的融合蛋白。可使用标准蛋白质纯化技术从培养基中或从所收取的宿主细胞中单离感兴趣的蛋白质。特定而言，可使用纯化技术由各种器具(包含转瓶(rollerbottle)、旋转瓶(spi皿erflask)、组织培养盘、生物反应器或发酵器)大规模(亦即，以至少毫克(milligram)量)表达及纯化所欲融合蛋白。所表达的蛋白融合复合物可通过已知方法单离及纯化。典型地，将培养基离心，接着通过亲和性或免疫亲和性层析(例如，蛋白-A(Protein-A)或蛋白_G(Protein-G)亲和性层析)，或包括使用与融合复合物(例如，经连结的TCR或其免疫球蛋白区)结合的单株抗体的免疫亲和性操作流程来纯化上清液。本发明的融合蛋白可通过已知技术的适当组合予以分离及纯化。此等技术包括例如利用溶解度的方法，如盐沉淀及溶剂沉淀；利用分子量的不同的方法，如透析、超过滤、凝胶过滤及SDS-聚丙烯醯胺凝胶电泳；利用电荷的不同的方法，如离子交换管住层析；利用特定亲和性的方法，如亲和性层析；利用疏水性的不同的方法，如逆相高效液相层析；以及利用等电点的不同的方法，如等电焦集电泳，金属亲和性管柱，如Ni-NTA。参见如上述的Sambrooketal.及Ausubeletal.有关于此等方法的内容。优选地，本发明的融合蛋白为实质上纯的。换言之，融合蛋白已从自然伴随而得的细胞取代物中单离，使得融合蛋白优选地以至少80%或90%至95%同质性(homogeneity)(w/V)存在。对于许多医药、临床及研究应用而言，具有至少98至99%同质性(w/w)的融合蛋白为最优选者。一旦经实质纯化后，融合蛋白应为实质上不含污染物(对于治疗应用而言)。一旦经部分纯化或纯化至实质纯度后，可溶性融合蛋白可于治疗上使用，或在实施如此处所揭示的活体外或活体内分析中使用。实质纯度可通过各种标难技术(例如，层析及凝胶电泳)予以测定。本发明的经截头(truncated)TCR融合复合物含有足以被截头的TCR分子，故该TCR融合复合物可在表达后分泌至培养基中。因此，经截头TCR融合复合物将不包含富有疏水性残基的区域，典型地为TCR分子的跨膜及细胞质结构域。因此，举例而言，对于本发明优选的经截头DR1TCR分子而言，TCR分子的b链约第199至237个残基及a链约第193至230个残基优选地不包含在经截头TCR融合复合物中。本发明的TCR融合及共轭复合物适用于与受感染的细胞或可能因一种或多种疾病而成为受感染的细胞于活体外或活体内使用。方法(治疗)本发明包含预防或治疗患者的疾病的方法，其中，该疾病细胞表达疾病相关抗原，该方法包括对该患者给予包括识别疾病相关抗原的生物性活性多肽的可溶性融合蛋白复合物，在抗原表达的疾病细胞与IL-15R表达的免疫细胞之间形成特异性结合复合物(桥联)，其足以定位该免疫细胞，以及伤害或杀死该疾病细胞，其足以预防或治疗患者的疾病。本发明包含预防或治疗患者的疾病的方法，其中，该疾病细胞表达疾病相关抗原，该方法包括将承载该IL-15R链的免疫细胞与包括识别疾病相关抗原的生物性活性多肽的可溶性融合蛋白复合物(例如，肽/MHC复合物)混合，对患者给予免疫细胞-融合蛋白复合物，在抗原表达的疾病细胞与IL-15R表达的免疫细胞之间形成特异性结合复合物(桥联)，其足以定位该免疫细胞，以及伤害或杀死该疾病细胞，其足以预防或治疗患者的疾病。本发明亦包含杀死靶细胞的方法，该方法包括使多种细胞与可溶性融合蛋白复合物接触，其中，该多种细胞进一步包括承载有权利要求1的IL-15结构域所识别的IL-15R链的免疫细胞，以及承载有此处所述的生物性活性多肽的至少一个所识别的抗原的靶细胞；在该靶细胞的抗原与该免疫细胞的IL-15R链之间形成特异性结合复合物(桥联)，其足以结合与活化该免疫细胞；以及通过所结合的经活化免疫细胞杀死该靶细胞。本发明亦包含经由产生可溶性融合蛋白复合物而增加IL-15的活体内半衰期及/或增进其安定结合免疫细胞的能力(例如，增加细胞表面滞留时间)的方法。举例而言，如此处所述，执行融合蛋白复合物的药物动力学参数及细胞表面滞留时间的评估并与IL-15比较。基于其治疗利用性的改善，具有增加的血清半衰期或细胞表面滞留时间的融合蛋白复合物为优选者。可治疗的疾病的实例包含，但不限于肿瘤形成(neoplasia)(包含癌症)、或病毒感染。〃肿瘤形成〃意指由不当的高程度细胞分裂、不当的低程度细胞雕亡(即optosis)或这二个所造成的任何疾病，或导致不当的高程度细胞分裂、不当的低程度细胞雕亡或此二者的任何疾病。举例而言，癌症为肿瘤形成的实例。癌症的实例包含，但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红细胞性白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症(polycythemiavera)、淋巴瘤(何杰金氏症(Hodgkin'sdesease)、非何杰金氏症)、巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重链疾病(heavychaindisease)、及实体肿瘤，如肉瘤及恶性肿瘤(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、依汶氏肿瘤(Ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳突腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精母细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm'stumor)、子宫颈癌、子宫癌、睪丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶瘤、星状细胞瘤、神经管胚细胞瘤、颅咽瘤、类室管膜瘤、松果腺瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡树突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经胚细胞瘤、及视网膜胚细胞瘤)。淋巴增生性疾患亦视为增生性疾病。本发明亦包含剌激哺乳动物的免疫应答的方法，该方法包括对该哺乳动物给予有效量的如此处所述的可溶性融合蛋白复合物或IL-15变异体。本发明亦包含抑制哺乳动物的免疫应答的方法，该方法包括对该哺乳动物给予有效量的如此处所述的可溶性融合蛋白复合物或IL-15变异体。于免疫抑制的情形中，包括IL-15拮抗剂或缺乏与IL-1513yc复合物结合的能力之IL-15结构域的融合蛋白复合物或IL-15变异体可为特别有利者。至于融合蛋白复合物治疗的使用说明，可将经培养的细胞以单一血清型的病原体感染。接着，将受感染的细胞与指定的融合蛋白复合物于活体外接触。如以上所讨论，配置融合蛋白复合物，使得毒杀性结构域通过TCR的联合而呈现至受感染的细胞。将生物活性分子导入细胞后(一般而言，低于约30分钟)，使该细胞引发所欲的效应高达约2至24小时，典型地约18小时的时间。在此时间后，在适当缓冲液或细胞培养基中洗涤该细胞，接着评估存活率。对通过融合蛋白复合物的细胞毒杀或伤害所分配的时间将随所选特定效应物分子而异。然而，存活率则经常可在约2至6小时，且高达约24小时之后评估。下文中将更详细地说明，细胞存活率可通过监测某些广知的染料(例如，台盼蓝(trypanblue))或发光体的摄入性而轻易地予以测定及定量。与本发明的融合蛋白复合物一起培养的细胞可通过标准方法分析存活率。于一例示性方法中，细胞存活率可通过测定在培养后或培养期间的DNA复制而轻易地予以分析。举例而言，优选的分析涉及一种或多种可检测性标记核苷(如放射性标记胸腺嘧啶核苷)的细胞摄入。该摄入可通过多种习知方法(包含三氯乙酸(TCA)沉淀，随后进行闪烁计数)方便地测得。其它细胞存活率方法包含广知的台盼蓝排除技术(trypanblueexclusiontechnique)或以WST-1为主的增生分析。本发明融合复合物的TCR分子在氨基酸序列上适当地对应天然存在的TCR分子，例如，人类、小鼠或其他且啮齿动物、或其他哺乳动物的TCR分子。因此，用于抑制自体免疫或发炎反应的本发明治疗方法包含融合蛋白复合物，其包括对疾病相关抗原具结合特异性的T细胞受体或抗体。优选地，给予〃经截头的〃可溶性TCR复合物，亦即，TCR复合物不含有跨膜部分。融合蛋白复合物亦包括作用为IL-15拮抗剂的IL-15变异体以抑制不必要的免疫应答。给予之后，TCR或抗体结构域将融合蛋白复合物标靶至疾病位置，于此处IL-15拮抗剂抑制自体免疫或发炎反应。此种融合蛋白复合物可特别适用于治疗过敏、自体免疫疾病(例如，多发性硬化症)、胰岛素依赖性糖尿病及风湿性关节炎或移植排斥。类似的非靶向方法可使用拮抗剂IL-15变异体作为非融合蛋白而进行。用于引发免疫应答的本发明其他治疗方法为在任何共同剌激性效应物分子(例如，细胞激素)存在下给予有效量的本发明蛋白融合复合物，藉以在与生物性活性多肽结合的呈递抗原的所在处引发所欲的免疫应答。本发明不同的疗法亦可与其它已知治疗剂(例如，消炎药物)组合使用，以提供对疾患更有效的治疗。举例而言，免疫抑制性蛋白融合复合物或IL-15变异体可与消炎药物(例如，皮质类固醇及非类固醇药物)组合使用，以用于治疗自体免疫疾患及过敏。本发明的化合物尤其适用于具有或疑有恶性疾病、疾患或病症的人类患者。本发明的化合物特别适用于标靶至人类患者中的特定肿瘤抗原。可依据本发明治疗的疾病的具体实例包含癌症，例如乳癌、前列腺癌等；病毒感染，例如HCV、HIV等；以及此处所述及病症的其他特定疾患。不期望受到理论所局限，咸信本发明的多重及不同共价连结化合物(亦即，至少IL-15与至少一个TCR组合)可例如通过增加IL-15对个体的耙抗原的标耙性=而显著地增进IL-15的效力。再者，通过共价连结的优点，本发明的共轭物实质上同时对个体细胞呈递IL-15及TCR，该效果可能无法通过以未共价连结化合物的药物〃调和液(cocktail)〃调配物给予相同化合物而轻易地达成。亦有报导指出利用一种药物的治疗可进而使患者对另一个药物敏感。因此，经由本发明的共轭物实质上同时对个体细胞呈递IL-15及TCR可例如通过提供协同性结果及/或通过增进产生免疫应答而增进药物活性。(诊断)对特定pMHC配体具特异性的高亲和性或多价TCR蛋白适用于诊断动物，包含咸信患有与特定pMHC相关的疾病的人类。本发明的融合蛋白复合物适用于实质上检测任何抗原，包含但不限于彼等与肿瘤病症、异常蛋白、自体免疫疾病或细菌、真菌、病毒、原生动物、酵母菌、线虫或其他寄生虫感染或寄生相关者。于用于检测个体的肿瘤或病毒感染细胞或组织的一方法中，其中，在MHC复合物的背景中该细胞或组织包括呈递于细胞或组织上的肿瘤或病毒相关肽抗原，该方法包括a)在所呈递的肽抗原与TCR之间形成特异性结合复合物的条件下，对个体给予包括可溶性TCR的本发明可溶性融合蛋白复合物；以及b)检测特异性结合复合物，作为包括所呈递的肿瘤或病毒相关肽抗原的肿瘤或病毒感染细胞或组织的指标。29融合蛋白复合物亦可用于诊断会产生异常蛋白的某些基因疾患。融合蛋白复合物的例示性应用为诊断及治疗具有已知的pMHC的自体免疫疾病。关于引起免疫破坏的自体抗原(autoantigen)，已对第I型糖尿病进行相当完整的定性。多发性硬化症、腹腔疾病、发炎性肠胃疾病、克隆氏症(Crohn'sdisease)及风湿性关节炎为此等应用的其他候选疾病。包括IL-15变异体多肽的本发明融合蛋白复合物可尤其适用于此等应用。举例而言，如此处所述，对于包括TCR分子的融合蛋白复合物，IL-15变异体结构域与IL-15Ra多肽之间的相互作用产生具有增进的抗原结合活性的多价TCR分子。再者，IL-15变异体含有氨基酸变异，其可能消除对承载IL-15RI3YC受体的细胞的结合性，藉此降低对免疫细胞的非特异性或非靶向结合。结果，利用此等融合蛋白复合物可达成增进的TCR特异性抗原检测。此外，如此处所述，本发明的融合蛋白复合物可另外经由肽标识物序列或共轭至可检测性标记而予以多聚体化。剂量及给予本发明化合物的给予可通过各种适当的途径进行，包含口服、局部(包含经皮、口颊或舌下)、经鼻及非经肠道(包含腹膜内、皮下、静脉内、皮内或肌肉内注射)，一般以口服或非经肠道为优选者。亦应了解的是优选的给予方法及剂量可依例如接受者的状况及年龄而异。本发明化合物可单独用于疗法中或联合其他药剂(例如彼等具有经认可的药理活性者)来治疗所欲的适应症。例示性药剂包含经认可的疗法，例如外科手术、放射线、化学疗法及其他形式的免疫疗法(例如，疫苗、以抗体为主的疗法)。需要时，可在此等疗法之前、期间或之后给予本发明化合物。尽管可单独给予一种或多种本发明化合物，其亦可呈与习知赋形剂混合的医药组成物的一部分存在，该赋形剂亦即医药上可接受的有机或无机载剂物质，其适用于非经肠道、口服或其他所欲给予方式以及不会与活性化合物有害地反应且不会对其接受者有害。本发明的医药组成物一般包括一种或多种本发明的融合蛋白复合物或IL-15变异体或编码此等化合物的DNA构筑体，连同一种或多种可接受的载剂。从可与调配物的其他成分相容且不会对其接受者有害的意义上而言，载剂必须为〃可接受的〃。适当的医药上可接受的载剂包括，但不限于水、盐溶液、醇类、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉醣(amylose)、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡(viscousparaffin)、香料油、脂肪酸单甘油酯及二甘油酯、石油醚脂肪酸酯(petroethralfattyacidester)、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯啶酮(polyvinylpyrrolidone)等。可将医药制剂进行消毒，以及若有需要，与辅助剂混合，该辅助剂为例如，润滑剂、防腐剂、安定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂、调味剂及/或芳香族物质等，该等辅助剂不会与活性化合物有害地反应。对于非经肠道的应用，尤其适当者为溶液(优选地为油性或水性溶液)及悬浮液、乳液或植入物(包含栓剂)。安瓿为方便的单位剂型。对于经肠道的应用，尤其适当者为锭剂、丸剂或胶囊，其具有滑石及/或碳水化合物载剂、粘结剂等，载剂优选地为乳糖及/或玉米淀粉及/或马铃薯淀粉。可使用糖浆、酏剂等，于该等制剂中采用甜的媒剂。可调配成缓释型组成物，其包含其中活性成分例如通过微包囊、多重包覆等而受到可差异性解的涂层所保护的彼等物质。本发明的治疗性化合物亦可并入脂质体(liposome)中。该并入可依据已知的脂质体制备程序(例如，声裂法(sonication)及挤出法(extrusion))而进行。制备脂质体的适当习知方法亦揭示于例如A.D.Banghametal.，J.Mol.Biol.，23:238-252(1965);F.Olsonetal.，Biochim.Biophys.Acta,557:9-23(1979);F.Szokaetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.，75:4194-4198(1978);S.Kimetal.，Biochim.Biophys.Acta,728:339-348(1983);以及Mayeretal.，Biochim.Biophys.Acta,858:161-168(1986)。本发明亦提供引起哺乳动物(例如，人类)的免疫应答的方法，其包含对哺乳动物(例如，人类)注射疫苗以对抗致病原(infectiousagent)或靶疾患(例如，癌症)。此等方法包括对哺乳动物给予有效量的包括编码本发明融合蛋白复合物或IL-15变异体的DNA载体的DNA序列。融合蛋白复合物及IL-15变异体的表达载体的制备叙述于上文以及以下实施例中。已有报导指出给予质体DNA的方法、由经给予个体的细胞摄入该DNA的方法、以及表达蛋白质的方法。参见Ulmer，J.B.，etal.，Science(1993)259:1745-1749。编码本发明融合蛋白复合物与IL-15变异体的DNA载体优选地通过肌肉内注射适当地给予至哺乳动物(包含人类)。将cDNA给予至哺乳动物的骨胳肌，随后由肌肉细胞摄入所给予的表达载体以及表达该DNA所编码的蛋白质已详述于Ulmeretal.，且其代表例示性操作流程[Ulmer，J.B.，etal.'Science259:1745-1749]。对于指定治疗应用而言最理想的剂量可通过习知手段测得。除了治疗人类疾患之外，本发明融合蛋白复合物及IL-15变异体以及编码此等分子的本发明DNA构筑体对于兽医应用将具有重要的用途，例如，治疗家畜(例如，牛、羊等)及宠物(例如，狗及猫)的疾患。应了解的是，本发明指定的融合蛋白复合物及IL-15变异体或编码该融合蛋白复合物及IL-15变异体的DNA构筑体用于指定疗法的实际优选量将依下列各者而异欲使用的特定一种或多种活性化合物、所调配的特定组成物、应用模式、特定给予位置、患者的体重、一般健康状况、性别等、欲治疗的特定适应症等，以及由彼等熟习此技艺者(包含主治医师或兽医)所认定的其他此种因子。对指定给予操作流程而言最理想的给予率可由彼等熟习此技艺者使用习知的剂量决定测试法轻易地测得，该剂量决定测试法是例如对于前述指导方针及此处所揭示的分析而进行。实施例应了解，本发明不应意图局限于所述实施例；或更确切而言，本发明应意图包含此处所提供的任何及所有应用以及具通常技艺者所知的
技术领域：
内的所有等价变化型。实施例1-包含scTCR/huIL15及scTCR/huIL15Ra融合蛋白的融合蛋白复合物的设计已确立IL-15稳定地结合至IL-15Ra的细胞外结构域，且所得复合物能够经由该中间型或高亲和性IL-15R复合物调控(亦即，剌激或阻断)免疫应答(l至4)。此外，已证实单链TCR或抗体多肽可融合至细胞激素及其他免疫效应物结构域，且此等双特异性融合分子保有两种融合结构域的功能活性(5至8)。再者，已显示多价型TCR对其配体提供增强的结合性(9)。因此，本发明的特征为融合蛋白复合物，其包括至少一种融合蛋白，其中，第一TCR多肽融合至IL-15;以及至少一种融合物，其中，第二TCR多肽融合IL-15Ra的细31胞外结构域，使得该两种融合蛋白经由IL-15与IL-15Ra结构域之间的结合相互作用而形成复合物。于此融合蛋白复合物中，TCR多肽可相同或不同，且呈单链或异二聚体形式。含有单链TCR多肽的融合蛋白复合物的实例概要显示于图1A。于此融合蛋白复合物中，多价TCR结构域对其配体提供增加的结合性/亲和性。例示性配体包括，但不限于肽/MHC复合物。IL-15/IL-15Ra结构域提供免疫调控活性。包括融合蛋白复合物的代表性融合蛋白构筑体概要显示于图1B。于此等构筑体中，TCR多肽为由肽接头序列((G4S)4)连结的TCR-Va及TCR-VP-CP结构域所构成的单链TCR(264scTCR)。scTCR多肽直接或经由肽接头序列融合至IL-15或IL-15Ra结构域。开始scTCR多肽为容许可溶性表达的讯息肽(或前导肽)序列。随后讯息肽在蛋白质运送期间被切割，以产生成熟的融合蛋白。于融合蛋白复合物的其他实例中，可使抗体结构域取代描绘于图1A及1B中的TCR结构域。此等抗体可呈单链或异二聚体形式。对于上述任一种融合蛋白复合物，序列可为人类序列或非人类序列(例如，但不限于小鼠序列)。此等序列可用于作为部分或所有融合蛋白结构域。此外，结构域的配置可不同，只要融合蛋白保有可溶性及功能即可。实施例2-c264scTCR/huIL15基因融合物于表达载体中的构筑对于p53(aa264-272)-特异性TCR的TCR基因的单离及定性如前文所述(5至7)。为获得人类IL15及IL15Ra基因，以HIST0PAGUE-1077(Sigma)从200mL输血者的血液(Lot#2238789，CommunityBloodBank,Miami,FL)中单离人类PBMC。在C02培养器，于含有10%FBS的MDM中，以30ng/ml的PMA(Sigma)、200ng/ml的依诺霉素(ionomycin)、及220ng/ml的重组人类IL2将细胞(1.5X107)活化10天。将经活化的细胞(每mLIX107)冷冻于_70C，以供进一步应用。为从经活化的PBMC中纯化总RNA，依据制造者的操作流程使用RNEASYPLUSMINI(Qiagen)。自总RNA扩增含有编码区以及5'及3'侧区(flankingregion)部分的人类IL15基因，该扩增为利用前引子(frontprimer)5'-CACCTTGCCATAGCCAGCTCTTC-3'与后弓l子(backprimer)5'-GTCTAAGCAGCAGAGTGATGTTTG-3'通过SUPERSCRIPTIIIOne-St印RT-PCRPlatinumTagHiFi(Invitrogen)，依据下列条件而进行对于反转录(RT);55C，30分钟；94C，2分钟；对于扩增cDNA;94C，30秒;53C，30秒；68C，1分钟;x40个循环；68C，5分钟。通过在1%琼脂糖凝胶(agarosegel)上电泳而分开并单离600bp的人类IL15PCR-cDNA产物。以Qiaquick凝胶萃取套组(QiaquickGelExtractionKit(Qiagen))从琼脂糖中纯化cDNA产物。自600bp人类IL15cDNA扩增成熟人类IL15蛋白的基因，该扩增为利用前引子5'-TGGTTAACAACTGGGTGAATGTAATAAGTG-3'与后引子5'-ACGCGTTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTGGAC-3'通过PfuUltra(Stratagene)于下列PCR条件下而进行94C，1分钟；63C，1分钟；72C，1分钟；x35个循环；72C，10分钟。将成熟人类IL15蛋白基因从凝胶纯化并依据制造者的操作流程以TOPO反应选殖入穿梭载体(shuttlevector)pcDNA3.1DirectionalTOPO表达载体(Invitrogen)。基于诊断型PCR(diagnosticPCR)鉴定含有成熟人类IL15蛋白基因插入物的纯系(clone)，该鉴定是利用前引子5'-TGGTTAACAACTGGGTGAATGTAATAAGTG-3'与后引子5'-ACGCGTTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTGGAC-3'通过RedTag(Sigma)于下列条件下而进行94C，1分钟；63C，1分钟；72C，1分钟;x35个循环；72C，10分钟。依据制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT(BeckmanCoulter)以Ge謹eLabDyeTerminationCycleSequencing进行DNA定序来确认正确纯系的序列。通过以Hpal及MluI酶切将成熟人类IL15蛋白基因从穿梭载体移出，并粘结至经Hpal及Mlul酶切的表达载体pNEF38-c264scTCR。pNEF38-c264scTCR表达载体含有编码连结至p53(aa264-272)肽特异性可溶性嵌合单链TCR蛋白的免疫球蛋白轻链前导(或分泌讯息)序列(c264scTCR)的基因片段(5)。载体亦含有5'调节/增强子(enhancer)区、转录调节区及启动子区、翻译调节/起始/终止序列(包含Kozak—致性序列及poly-A终止区)、以及具有推定的基质结合调节元素(matrixattachmentregulatoryelement)的3'调节区。载体亦含有容许在哺乳动物细胞(SV40启动子/neoR基因/poly-A)及细菌(ori/amp基因)中选择性生长的DNA序列。将编码成熟人类IL15蛋白的DNA片段选殖进入pNEF38-c264scTCR载体而得到包括下列序列的c264scTCR/huIL15融合基因3'-免疫球蛋白轻链前导子-264TCRV-a-肽接头-264TCRV-I3-人类TCRC-P-人类IL_15。所得载体(pNEF38-c264scTCR/huIL15)(如图2A所示)是基于诊断型PCR予以鉴定并通过DNA定序再确认。c264scTCR/huIL15融合基因及蛋白质的序列(包含前导序列)分别显示于图2B及图2C。实施例3-含有突变的人类IgGl铰链区(hingeregion)的c264scTCR/huIL15基因融合物于表达载体中的构筑pNEF38-c264scTCR/huIL15载体的构筑详述于实施例2。使用来自人类IgGlH链的突变铰链区(其中，三个半胱氨酸残基经由三个丝氨酸残基所取代)连结至c264scTCR及huIL15。铰链区是从前述的264scTCR/IgGl基因突变及扩增而来(7)，该扩增是利用前引子5'-TGGTGGGTTAACGAGCCCAAATCTTCTG-3'与后引子5'-ATTATTACGCGTTGGAGACGGTGGAGATG-3'通过PfuUltra(Stratagene)于下列PCR条件进行:94C，30秒;65C，30秒；70C，1分钟；x35个循环；72C，10分钟。通过在1%琼脂糖凝胶上电泳而分开并单离70bp突变的人类IgGl铰链PCR-cDNA产物。以Qi叫uick凝胶萃取套组(Qiagen)从琼脂糖中纯化cDNA产物。以Hpal及Mlul酶切突变铰链区基因并粘结至经Hpal及Mlul酶切的pNEF38-c264scTCR。基于诊断型PCR鉴定含有突变铰链区基因插入物的纯系，该鉴定是利用前引子5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'与后引子5'-ATTATTACGCGTTGGAGACGGTGGAGATG-3'通过RedTag(Sigma)于下列条件下进行:94C，30秒;64C，30秒；70C，1分钟;x35个循环；72C，10分钟。自实施例2所述的pNEF38-c264scTCR/huIL15载体扩增huIL15，该扩增是利用前引子5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'与后引子5'-TGGTGGTCTAGAATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'通过PfuUltra(Stratagene)于下列PCR条件下而进行:94C，30秒;65C，30秒;70C，1分钟；x35个循环；72C，10分钟。通过在1%琼脂糖凝胶上电泳而分开并单离380bphuIL15PCR-cDNA产物。以Qiaquick凝胶萃取套组(Qiagen)从琼脂糖中纯化cDNA产物。以Mlul及Xbal酶切huIL15基因并粘结至经Mlul及Xbal酶切的含有突变铰链基因的pNEF38-c264scTCR。基于诊断型PCR鉴定含有huIL15基因插入物的纯系，该鉴定是利用前引子5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'与后引子5'-TGGTGGTCTAGAATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'通过RedTag(Sigma)于下列条件下进行94C，30秒；64C，2分钟；70C，2分钟；x35个循环；72C，10分钟。依据制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT(Beck腿nCoulter)以Ge謹eLabDyeTerminationCycleSequencing进行DNA定序来确认正确纯系的序列。pNEF38-c264scTCR表达载体详述于上述实施例2。编码突变的人类IgGl铰链区及成熟人类IL15蛋白的DNA片段选殖进入pNEF38-c264scTCR载体而得到包括下列序列的c264scTCR-hmt-huIL15融合基因3'_免疫球蛋白轻链前导子-264TCRV-a-肽接头-264TCRV-P-人类TCRC-P-突变的人类IgGl铰链-人类IL_15。所得载体(pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15)(如图3A所示)是基于诊断型PCR予以鉴定并通过DNA定序再确认。c264scTCR-hmt-huIL15融合基因及蛋白质的序列(包含前导序列)分别显示于图3B及图3C。实施例4-c264scTCR/huIL15RaAE3基因融合物于表达载体中的构筑如上所述制备PBMC的总RNA。自PBMC的总RNA扩增含有编码区以及5'及3'侧区部分的人类IL15Ra基因，该扩增是利用前引子5'-AGTCCAGCGGTGTCCTGTGG-3'与后引子5'-TGACGCGTTTAAGTGGTGTCGCTGTGCCCTG-3'通过SUPERSCRIPTIIIOne-St印RT-PCRPlatinumTagHiFi(Invitrogen)依据下列条件而进行对于RT;55C，30分钟；94C，2分钟；对于扩增cDNA;94C，1分钟；66C，1分钟；72C，1分钟；x35个循环；72C，5分钟。通过在l^琼脂糖凝胶上电泳而分开并单离970bp人类IL15RaPCRcDNA产物。以Qiaquick凝胶萃取套组(Qiagen)从琼脂糖中纯化cDNA产物。自970bp人类IL15RacDNA扩增人类IL15Ra细胞外结构域基因，该扩增是利用前引子5'-TGGTTAACATCACGTGCCCTCCCCCCATG-3'与后引子5'-TGACGCGTTTAAGTGGTGTCGCTGTGCCCTG-3'通过PfiiULTRA(Stratagene)于下列PCR条件下而进行94C，1分钟；72C，2分钟；x35个循环，72C，10分钟。将人类IL15Ra细胞外结构域基因从凝胶纯化并依据制造者的操作流程以T0P0反应选殖入穿梭载体pcDNA3.1DirectionalT0P0表达载体(Invitrogen)。基于诊断型PCR选择含有正确人类IL15Ra细胞外结构域基因插入物的纯系，并依据制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT以GenomeLabDyeTerminationCycleSequencing进行DNA定序予以确认。该基因经判定为人类IL15RaAE3细胞外结构域基因。通过以Hpal及MluI酶切将人类IL15RaAE3细胞外结构域基因从穿梭载体移出，并粘结至经HpaI及MluI酶切的pNEF38-c264scTCR。将编码人类IL15RaAE3细胞外结构域的DNA片段选殖进入pNEF38-c264scTCR载体而得到包括下列序列的c264scTCR/huIL15Ra融合基因3'-免疫球蛋白轻链前导子-26410V-a-肽接头-264TCRV-P-人类TCRC-P-IL15RaAE3细胞外结构域。含有正确IL15RaAE3细胞外结构域基因插入物的所得载体(pNEF38-c264scTCR/huIL15RaDE3)(如图4A所示)是基于诊断型PCR予以鉴定并通过DNA定序再确认。的序列c264scTCR/huIL15RaAE3基因及蛋白质分别显示于图4B及图4C。实施例5-c264scTCR/huIL15RaSushi基因融合物于表达载体中的构筑如上所述制备PBMC的总RNA。自970bp人类IL15RacDNA(参见实施例3)扩增人类IL15RaSushi基因，该扩增是利用前引子5'-TGGTTAACATCACGTGCCCTCCCCCCATG-3'与后引子5'-TTGTTGACGCGTTTATCTAATGCATTTGAGACTGG-3'通过PfuUltra(Stratagene)于下列PCR条件下而进行94C，1分钟；66C，1分钟；70C，1分钟;x35个循环；72C，10分钟。将人类IL15RaSushi基因的PCR产物从凝胶纯化并以Hpal及Mlul酶切。将该基因粘结至经Hpal及Mlul酶切的pNEF38-c264scTCR。将编码人类IL15RaSushi结构域的DNA片段选殖进入pNEF38-c264scTCR载体而得到包括下列序列的c264scTCR/huIL15Ra融合基因3'_免疫球蛋白轻链前导子-264TCRV-a-肽接头-264TCRV-P-人类TCRC_P-人类IL15RaSushi。含有正确人类IL15RaSushi基因插入物的所得载体(如图5A所示)是基于诊断型PCR予以鉴定并通过DNA定序再确认。c264scTCR/huIL15RaSushi基因及蛋白质的序列分别显示于图5B及图5C。实施例6-含有突变的人类IgGl铰链区的c264scTCR/huIL15RaSushi基因融合物于表达载体中的构筑如上所述构筑pNEF38-c264scTCR/huIL15RaSushi载体。使用来自人类IgGlH链的突变铰链区(其中，三个半胱氨酸残基经由三个丝氨酸残基所取代)连结至c264scTCR及huIL15RaSushi。如上所述，将该铰链区突变、扩增、粘结、及确认。自上述pNEF38-c264scTCR/huIL15RaSushi载体扩增huIL15RaSushi，该扩增是利用前引子5'-TAATAAACGCGTATCACGTGCCCTC-3'与后引子5'-TGGTGGTCTAGATTATCATCTAATGCATTTG-3'通过PfuUltra(Stratagene)于下列PCR条件下而进行:94C，30秒;65C，30秒;70C，1分钟；x35个循环；72C，10分钟。通过在1%琼脂糖凝胶上电泳而分开并单离250bphuIL15RaSushiPCR-cDNA产物。以Qiaquick凝胶萃取套组(Qiagen)从琼脂糖中纯化cDNA产物。以Mlul及Xbal酶切huIL15RaSushi基因并粘结至经MluI及Xbal酶切的含有突变铰链基因的pNEF38-c264scTCR。基于诊断型PCR鉴定含有huIL15基因插入物的纯系，该鉴定是利用前引子5'-TGGTGGGTTAACGAGCCCAAATCTTCTG-3'与后引子5'-TGGTGGTCTAGATTATCATCTAATGCATTTG-3'通过RedTag(Sigma)于下列条件下进行94C，30秒；65C，1分钟；70C，1分钟;x35个循环；72C，10分钟。依据制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT(Beck腿nCoulter)以Ge謹eLabDyeTerminationCycleSequencing进行DNA定序来确认正确纯系的序列。pNEF38-c264scTCR表达载体为如上所述。将编码突变的人类IgGl铰链区及人类IL15RSushi蛋白的DNA片段选殖进入pNEF38-c264scTCR载体而得到包括下列序列的c264scTCR-hmt-huIL15RSushi融合基因3'-免疫球蛋白轻链前导子-264TCRV-a-肽接头-264TCRV-P-人类TCRC_P-突变的人类IgGl铰链-人类IL15RSushi。所得载体(pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15RSushi)(如图6所示)是基于诊断型PCR予以鉴定并通过DNA定序再确认。c264scTCR-hmt-huIL15RSushi融合基因及蛋白质的序列(包含前导序列)分别显示于图6B及图6C。实施例7-c264scTCR/huIL15RaSushi及c264scTCR/huIL15基因于单一表达载体中的构筑为达成在单一表达宿主细胞中表达本发明的两种融合蛋白，将编码c264scTCR/huIL15RaSushi及c264scTCR/huIL15的基因选殖入单一表达载体。自实施例5所述的模板通过PfuUltra(Stratagene)扩增c264scTCR/huIL15RaSushi基因，该扩增是利用前引子5'-TGAGTGTCCGGAACCACCATGGAGACAGACAC-3'与后引子5'-TTGTTGGCGGCCGCTTATCATCTAATGCATTTGAG-3'于下列条件下进行94C，1分钟；68C，1分钟；72C，2分钟；x35个循环；72C，10分钟。将264scTCR/huIL15RaSushi基因的PCR产物从凝胶纯化，以BspEI及Notl酶切并粘结至经BspEI及Notl酶切th印SUN34Rl表达载体。pSUN34Rl表达载体含有两个用于选殖感兴趣的基因的位置以及5'调节/增强子区、转录调节区及启动子区、翻译调节/起始/终止序列(包含Kozak—致性序列及poly-A终止区)、及内含子以及具有调节元素的3'区。此载体亦含有容许在哺乳动物细胞(SV40启动子/neoR基因/poly-A)及细菌(ori/amp基因)中选择性生长的DNA序列。含有正确c264scTCR/IL15RSushi基因插入物的载体是基于诊断型PCR予以鉴定并通过DNA定序再确认。自实施例2所述的模板扩增c264scTCR/huIL15基因，该扩增是利用前引子5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'与后引子5'-TGAGTGTTCGAATTATCAAGAAGTGTTGATGAAC-3'于下列条件下进行94C，1分钟；65C，1分钟；72C，2分钟；x35个循环；72C，10分钟。将c264scTCR/huIL15基因的PCR产物从凝胶纯化，以Clal及Csp451酶切并粘结至经Clal及Csp451酶切的pSUN34Rl-c264scTCR/huIL15RaSushi表达载体。含有正确c264scTCR/huIL15基因插入物的所得载体(pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaSushi)(如图7所示)是基于诊断型PCR予以鉴定并通过DNA定序再确认。此载体含有c264scTCR/36huIL15RaSushi及c264scTCR/huIL15基因。实施例8-c264scTCR/huIL15RaAE3及c264scTCR/huIL15基因于单一表达载体中的构筑自实施例4所述的模板通过PfuUltra(Stratagene)扩增c264scTCR/huIL15RaAE3融合基因，该扩增是利用前引子5'-TGAGTGTCCGGAACCACCATGGAGACAGACAC-3'与后引子5'-TTGTTGGCGGCCGCTTATCAAGTGGTGTCGCTG-3'于下列条件下进行94C，1分钟；68C，1分钟；72C，2分钟；x35个循环；72C，10分钟。将c264scTCR/huIL15RaAE3基因的PCR产物从凝胶纯化，以BspEI及Notl酶切并粘结至经BspEI及Notl酶切的表达载体pSUN34Rl。含有正确c264scTCR/huIL15RaAE3基因插入物的载体是基于诊断型PCR予以鉴定并通过DNA定序再确认。扩增c264scTCR/huIL15基因并选殖进入如实施例7所述的表达载体。含有正确c264scTCR/huIL15基因插入物的所得载体(pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaDE3)(如图8所示)是基于诊断型PCR予以鉴定并通过DNA定序再确认。此载体含有c264scTCR/huIL15RaAE3及c264scTCR/huIL15基因。实施例9-产生融合蛋白的经转染宿主细胞系的生成可通过多种不同的转形、转染或转导方法将表达载体导入各种宿主细胞系。于一此等方法中，将CH0-K1细胞(5X104)接种于6孔盘并于C02培养器中培养一整夜。依据制造者的操作流程，使用10iiLMirusTransIT-LTl试剂(Mirus)，以5yg含有TCR/IL15及/或TCR/IL15Ra融合基因的表达载体转染该细胞。转染后一天将细胞以4mg/mLG418(Invitrogen)筛选。具G418抗性的细胞经扩充以及通过3至5回合如下文所述的MACS筛选来富集化(enrich)TCR融合蛋白表达细胞。将细胞于10mMEDTA中剥离并以含有10%FBS的MDM洗涤一次。将细胞再悬浮(107个细胞于100iiL)并与5iig经R-藻红素(R-Phycoerythrin，PE)共轭的p53(aa264-272)/HLA-A2四聚体试剂于4C培养15分钟。将细胞洗涤一次并与经抗PE抗体共轭的磁珠(MiltenyiBiotec)于4C培养15分钟。将细胞载入磁性管柱(于磁场中)，并以洗涤缓冲液(含有0.5%BSA的PBS)去除未结合的细胞。将管柱从磁场中移走后，以含有10%FBS的IMDM冲提与管柱结合的细胞。基于在制造/分泌过程的期间细胞表面上的可溶性融合蛋白的短暂呈现，此程序使融合蛋白表达细胞富集化。在各富集化作用后，监测融合蛋白的细胞表面联合作用。将通过流式细胞仪所测得的与细胞表面结合的融合蛋白浓度与通过ELISA所测得的存在于细胞培养基中的可溶性融合蛋白浓度进行比较。该比较的实例显示于图9A及9B。于此实例中，经pNEF38-c264scTCR/huIL15RaSushi转染的CH0-K1细胞通过MACS富集化一至五次，接着接种(1Xl()6个细胞/孔)于6孔盘。24小时后，接着将细胞以10mMEDTA剥离，以MDM+10%FBS洗涤一次，并以0.6iig经PE共轭的p53(aa264-272)/HLA-A2四聚体或相同量的对照组经PE共轭的CMVpp65(aa495-503)/HLA-A2四聚体于4C染色(2X105个细胞/100iiL的IMDM+10%FBS)30分钟。将细胞洗涤一次并通过流式细胞仪分析与细胞表面联合的可溶性融合蛋白浓度，如图9A所示。分泌至细胞培养基的可溶性融合蛋白浓度亦如前述通过TCR特异性ELISA，利用捕捉抗体(抗人类TCRCP抗体(BFl))及检测抗体(生物素化抗人类37TCRCP抗体(W4F))予以测定(5)，如图9B所示。结果显示以磁珠为主的富集化过程所得到的转染株产生的可溶性融合蛋白浓度增加。接着，将经富集化的转染细胞通过极限稀释(limitingdilution)次选殖(subclone)三次，并基于分泌至培养基中的可溶性融合蛋白浓度(由前述ELISA所测得)筛选生产细胞系(productioncellline)。在适于生成可溶性融合蛋白的条件(亦即，烧瓶、旋转器、发酵器、培养袋、培养瓶)使生产细胞系扩充并生长于MDM+10%FBS或不含血清的培养基中。于某些情形中，将宿主细胞利用不同表达载体共转染以生成能够表达多种融合蛋白的转染株。表达一种融合蛋白的转染株亦可利用一种或多种表达载体再转染，以生成表达多种融合蛋白的转染株。细胞亦利用一个含有超过一种融合蛋白基因的表达载体(如例示于实施例7及8者)转染，以生成表达多种融合蛋白的转染株。所得细胞可用于制造于细胞培养基中呈可溶性分子形式的本发明多成分型融合蛋白复合物。经由U.S.S.N.09/204，979中所述的细胞转染及筛选方法亦可达到高浓度的融合蛋白或融合蛋白复合物产量。实施例10-TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白或融合蛋白复合物的纯化本发明的可溶性融合蛋白或融合蛋白复合物可使用各种方法从宿主细胞或细胞培养基中纯化，该等方法包含利用在溶剂中的选择性分溶或溶解度的方法、或者利用基于电荷、疏水性、亲水性、尺寸大小及/或对配体的选择性或半选择性结合的分离的方法(亦即，经由层析)。可经由使用适当的蛋白折叠条件而自不可溶性物质中生成可溶性融合蛋白或融合蛋白复合物。于一实例中，通过使用辨识人类TCR-CP结构域的抗体(BF1)的亲和性层析而自细胞培养基中纯化c264scTCR/IL15融合蛋白。典型地，首先将含有经BF1共轭的S印harose的管柱以20mMTris-HClpH8.O(载入缓冲液(loadingbuffer))平衡，接着以2ml/分钟载入含有c264scTCR/IL15融合蛋白的pH经调整的细胞培养基。接着，将管柱以5管柱容积的载入缓冲液洗涤，以去除未结合的蛋白质，并将c264scTCR/IL15融合蛋白以4管柱容积的0.5M柠檬酸钠(pH4)冲提。收集后，将冲出液通过2MTris-HCl(pH8.0)调整至pH8.0。将经纯化的蛋白予以缓冲交换(bufferexchange)为PBS，并使用0.22ym过滤器过滤。将BF1管柱以50mM甘氨酸-HCl(pH3.0)予以剥离，并存放在20%乙醇，4C中，以供进一步使用。融合蛋白可进一步通过离子交换及/或尺寸排出层析予以纯化。将含有c264scTCR/IL15、c264scTCR/IL15RaSushi及c264scTCR/IL15RaAE3融合蛋白的细胞培养物悬浮液通过上述方法纯化，并将经纯化融合蛋白样品在还原条件下通过在SDS聚丙烯醯胺凝胶上电泳而进行分析，随后以考马斯亮蓝(Coomassiebrilliantblue)予以染色。此等凝焦的实例显示于图10。主要的蛋白质条带对应于基于融合蛋白序列所预期的正确分子量。实施例11-TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白的融合蛋白复合物的生成IL15以高亲和性而特异性结合至细胞外IL15Ra结构域(4)。因此，承载IL-15及IL15Ra结构域的融合蛋白的复合物可在各种条件下形成，包含于表达细胞之内或于细胞外以未经纯化或经纯化的融合蛋白形成。于一实例中，可将等摩尔量(molaramount)的经纯化融合蛋白于适当条件下(亦即，于室温10分钟，)混合，以形成融合蛋白复合物。可使用各种技术监测复合物的形成，该等技术包含直接结合分析、竞争性结合分析、免疫沉淀、表面电浆共振、或基于复合物尺寸大小、活性或其他性质的分析。举例而言，如图ll所示，尺寸排出层析可基于分子量监测包括c264scTCR/huIL15及c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白的复合物的形成。于此研究中，将约100iig的c264scTCR/huIL15(0.5mg/ml)载于Superdex200HR10/30管柱以供分析。c264scTCR/huIL15的计算分子量为约57kD。基于SEC图谱(图11)，估计分子量为约98kD，显示此融合蛋白似乎为单体。同样地，将约60g的c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白(0.3mg/ml)载于S卯erdex管柱。c264scTCR/huIL15RaSushi的计算分子量为约52kD。基于SEC图谱(图11B)，融合蛋白的估计分子量为约81kD，再次显示此融合蛋白为单体。过去其他以TCR为主体的融合蛋白的SEC分析显示类似的糖化融合蛋白的计算分子量与估计分子量之间的差异。当以等摩尔量混合c264scTCR/huIL15及c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白并将约126iig的混合蛋白(0.63mg/ml)载于管柱时，获得图11所示的图谱。估计两个主要波峰的分子量一个为约170kD，其为两个融合蛋白的异二聚体；而另一个为约91kD，其似乎为单体型融合蛋白的混合物。因此，在混合的c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白制备物中出现170kD物种为可生成本发明融合蛋白复合物的证据。亦进行包括c264scTCR/huIL15及c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白的融合蛋白复合物的分析。将约100iig的c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白(0.5mg/ml)载于Superdex管柱。c264scTCR/huIL15RaAE3的计算分子量为约60kD。基于SEC图i普(图12A)，该蛋白的估计分子量为约173KD，显示此蛋白是以同型二聚体(homodimer)存在。当以等摩尔量混合c264scTCR/huIL15及c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白并将约118iig的混合蛋白(0.59mg/ml)载于管柱，获得图12B所示的图谱。估计两个主要波峰的分子量一个为>210kD，其似乎为两个异二聚体所构成的四聚体；而另一个为约93kD，其似乎为c264scTCR/huIL15单体。因此，在混合的c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白制备物中出现170kD物种为可生成本发明融合蛋白复合物的证据。实施例12-TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白的融合蛋白复合物显现出对肽/MHC复合物增强的结合性对上述所生成的融合蛋白复合物结合TCR特异性抗原p53(aa264-272/HLA-A2.1的能力进行定性。为生成呈递此抗原的细胞，于26C以p53(aa264-272)肽载入HLA-A2.1阳性T2细胞一整夜，接着以5X106细胞/mL存放于液态氮中。将未与肽共同培养的T2细胞作为对照组。将载入p53肽的T2细胞或对照组T2细胞解冻并再悬浮于lmL的MDM+10XFBS中。接着，以0.5iig的下列融合蛋白将细胞(5X105/100yL)于室温染色30分钟c264scTCR/huIL15、c264scTCR/huIL15RaSushi、c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi复合物。将细胞以洗涤缓冲液(含有O.5%BSA及0.05%叠氮化钠的PBS)洗涤一次，并于lOOyL洗涤缓冲液中以O.liig生物素化小鼠单株抗人类TCRCP抗体(BF1)于室温染色30分钟。将细胞洗涤一次并于lOOiiL洗涤缓冲液中以O.5iig经R-藻红素共轭的链霉亲和素于室温染色30分钟。洗涤并再悬浮该细胞以供通过流式细胞仪进行分析。如图13所示，各融合蛋白能够对载入p53肽的细胞进行特异性染色。此外，c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白复合物经由多价c264scTCR结构域而对呈递于T2细胞的p53(aa264-272)/HLA-A2.1复合物呈现增强的特异性结合性。特定而言，相较于单体c264scTCR/huIL15或c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白，二聚体融合蛋白复合物对载入p53肽的T2细胞显现出较佳的染色。此等数据显示相较于单体型融39合蛋白，多聚体融合蛋白复合物将提供较佳的抗原辨识性质。实施例13-huIL-15突变基因的生成以及c264scTCR-hmt-huIL15突变基因表达载体的构筑如上所述，c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi多月太能够经由IL-15与IL-15Ra结构域的相互作用而形成复合物，且多价融合蛋白复合物对肽/MHC复合物具有增强的结合性。基于增强的结合活性，此融合蛋白复合物具有作为抗原特异性或靶向研究的诊断及治疗剂的优点。如此处所表明，融合蛋白的IL-15/IL-15Ra结构域与表达IL-15受体的细胞结合的能力亦为所期望的特征。然而，有些应用中，增加或降低IL-15/IL-15Ra结构域与表达IL15受体的细胞的相互作用的能力及/或影响表达IL15受体的细胞的反应的能力将为有利的。举例而言，在主要目标为使用融合蛋白复合物特异性检测肽/MHC复合物的应用(亦即，研究及诊断用途)中，减少此相互作用可为适宜的。于治疗应用中，生成能够增加或降低IL-15媒介的应答的含有IL-15结构域的融合蛋白复合物亦可为适宜的。为解决此问题，已进行突变分析来鉴定IL-15中影响其对IL-2/15RI3Yc复合物的结合性但不影响其对IL-15Ra的相互作用的残基。所得突变可创造IL-15变异体，包含拮抗剂或激动剂。除了用于本发明的融合蛋白以外，所得IL-15拮抗剂及激动剂亦可具有作为可溶性细胞激素(亦即，非融合蛋白)或作为具有IL-15Ra结构域的复合物以供研究、诊断或治疗应用的效用。举例而言，于治疗策略中，IL-15拮抗剂可用于抑制不想要的免疫应答，而IL-15激动剂可用于剌激免疫应答，以治疗各种疾病。基于IL-15与IL-2的氨基酸序列及结构之间的比较，数个氨基酸被鉴定为可能影响IL-15与IL-15Ra、IL-15RP及/或YC之间的相互作用。如表1及图14A所示，所创造的IL-15变异体中，成熟人类IL-15蛋白对IL-15RPYc受体的可能结合位置，于位置8、61、65、72及108的氨基酸(基于成熟天然人类IL-15序列予以编号)，为各自经取代或各自与两个或更多个其他取代组合。位置8的天冬氨酸经丙氨酸或天冬酰胺所取代。位置61的天冬氨酸经丙氨酸所取代。位置65的天冬酰胺经丙氨酸或天冬氨酸所取代。位置72的天冬酰胺经精氨酸或天冬氨酸所取代。位置108的谷氨酰胺经丙氨酸所取代。位置8的Asp及位置108的Gin两者各自经丙氨酸所取代。位置8的Asp及位置65的Asn两者各自经天冬酰胺或丙氨酸所取代。位置8的Asp及位置65的Asn两者各自经丝氨酸或精氨酸所取代。使用重叠PCR(overla卯ingPCR)来生成IL-15突变体。举例而言，为生成位置8的Asp经丙氨酸或天冬酰胺残基取代的突变体，使用pNEF38-c264scTCR/huIL15载体作为模板来扩增两个重叠的c-DNA片段，该扩增是利用片段l的前引子5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'与片段l的后引子5'-AGATCTTCAATTTTTTTCAAMKHACTTATTACATTCACCCAG-3'以及利用片段2的前引子5'-ACTGGGTGAATGTAATAAGTDMKTTGAAAAAAATTGAAGATC-3'与片段2的后引子5'-TGGTGGTCTAGATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'通过PfuUltra(Stratagene)于下列PCR条件下而进行94C，1分钟；66C，1.5分钟；72C，1.5分钟；x35个循环；72C，10分钟。通过在1%琼脂糖凝胶上电泳而分开并单离片段l及片段2的PCR-cDNA产物。以Qiaquick凝胶萃取套组(Qiagen)从琼脂糖中纯化cDNA产物。将片段1及片段2的PCR-cDNA产物融合在一起，该融合是利用PfuUltra(Stratagene)于下列PCR条件下而进行94C，1分钟；66C，1.5分钟；72C，1.5分钟；x10个循环。扩增重叠的PCR-cDNA片段，该扩增是利用前引子5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'与后引子5'-TGGTGGTCTAGATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'通过PfuUltra(Stratagene)于下列PCR条件下而进行94C，1分钟；64C，1.5分钟；69C，1.5分钟；x30个循环；72C，10分钟。通过在1%琼脂糖凝胶上电泳而分开并单离huIL-15突变的PCR-cDNA产物。以Qiaquick凝胶萃取套组(Qiagen)从琼脂糖中纯化cDNA产物。以Mlul及Xbal酶切huIL15突变基因并粘结至经Mlul及Xbal酶切的pNEF38-c264scTCR-hmt。依据制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT(BeckmanCoulter)以GenomeLabDyeTerminationCycleSequencing进行DNA定序来确认含有于位置8具有丙氨酸或天冬酰胺取代的huIL15基因的纯系。pNEF38-c264scTCR表达载体如上所述。将编码突变的人类IL-15蛋白的DNA片段选殖入pNEF38-c264scTCR载体而得到包括下列序列的c264scTCR-hmt-huIL15D8A或c264scTCR-hmt-huIL15D8N融合基因3'-免疫球蛋白轻链前导子-64TCRV-a-肽接头-264TCRV-I3-人类TCRC-P-突变的人类IgGl铰链_人类IL15D8A或-人类IL15D8N。将所得载体(pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8A或pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8N)(如图14B所示)通过DNA定序确认。pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8A或pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8N融合基因及蛋白质的序列(包含前导序列)分别显示于图14C及图14D。如上所述以类似方式将其他突变导入所构筑的表达载体。如实施例9所述将表达载体导入CH0.K1细胞以生成安定的转染株。TCR/IL15融合蛋白及包括IL-15变异体的融合蛋白复合物的制造及纯化是使用类似于实施例10及11所述的方法而进行。呈可溶性细胞激素形式的IL-15变异体的生成可经由此技艺中已知的各种方法进行，该等方法包含于原核及真核表达系统中制造(参见例如W09527722;Hsuetal.2005J.Immunol.175:7226)。实施例14-TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白以及融合蛋白复合物的功能定性基于实施例9中所述的使用p53(aa264-272)/HLA-A2.1试剂的ELISA及细胞染色法，以及实施例12中所述的抗原呈递细胞染色法证实融合蛋白TCR结构域的功能性结合。如实施例ll所述，证实融合蛋自IL15及IL15Ra结构域相互作用的能力。再者，可经由各种方法评估IL15及IL15Ra结构域的功能活性，该等方法包含结合至IL-2/15RPYc受体或调控承载有IL-15受体的免疫细胞的活性。于一实例中，将表达异三聚体IL-15R(a|3yc链)的CTLL-2细胞与0.5yg的下列个别融合蛋白于室温培养30分钟c264scTCR/huIL15、264scTCR/huIL15RaSushi或c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi复合物。将细胞以洗涤缓冲液(含有0.5%BSA及0.05%叠氮化钠的PBS)洗涤一次，并以0.5iig经R-藻红素(PE)共轭的p53(aa264-272)/HLA-A2四聚体于室温染色30分钟。洗涤并再悬浮该细胞以供通过流式细胞仪进行分析。如图15所示，c264scTCR/huIL15融合蛋白及c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi复合物经由其huIL15结构域与CTLL-2细胞上的IL-15受体的联合作用可利用能辨识所结合的融合蛋白c264scTCR结构域的经PE共轭的p53(aa264-272)/HLA-A2四聚体与以检测。此等结果显示融合蛋白/融合蛋白复合物的IL-15及TCR结构域皆能够与其同源性配体功能性地相互作用。此外，CTLL-2细胞依赖细胞激素生长且可对重组人类IL-15产生应答。发展出使用CTLL-2细胞的以细胞为主的WST-l增生分析来评估融合蛋白及融合蛋白复合物的IL-15生物活性。WST-1(Roche)为可通过代谢活性细胞中所发现的去氢酶而转化成甲臜(formazan)的试剂。于WST-1分析中，通过440至450nm吸光度的量值所测得的培养基中甲臜的量直接与培养物中的活细胞数成比例。于37C，在C02培养器中，将CTLL-2细胞(2X104/200iiL)与下列指定浓度的融合蛋白(0至28ng/mL)于96孔盘中培养3天c264scTCR/huIL15、c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi复合物或c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaAE3复合物。将该细胞与10iiL的WST-1培养4小时之后，收取100iiL的培养基，以利用微量滴定盘判读机进行440至450nm吸光度测定。如图16所示，c264scTCR/huIL15融合蛋白可以低至1.8ng/mL(31.25pM)的浓度维持CTLL-2细胞增生，显示c264scTCR/huIL15融合蛋白经由高亲和性的IL15受体活化CTLL-2细胞。令人感兴趣的是，融合蛋白复合物亦维持CTLL-2细胞增生，但达到较低的程度，显示在与c264scTCR/huIL15RaSushi或c264scTCR/huIL15RaAE3形成复合物之后，c264scTCR/huIL15剌激活性受到抑制(分别为一倍或四倍)。此结果显示c264scTCR/huIL15对高亲和性IL15受体的结合性受到c264scTCR/huIL15RaSushi或c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白的抑制。此等结果提供融合蛋白及融合蛋白复合物可于不同条件下活化或抑制免疫细胞的应答的证据。对仅表达中间型亲和性的IL-1513yc受体的细胞系(例如，32DP细胞系(参见下文))进行类似的分析。于某些情形中，当IL15呈具有IL15Ra结构域的复合物形式时，可能会增强IL15剌激承载有IL-15R的细胞增生的生物活性(1至3)。评估c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi或c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaAE3复合物对细胞增生的剌激，其可提供融合蛋白复合物可剌激或活化免疫细胞的免疫应答的其他证据。实施例15-TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15变异体的二聚体融合蛋白复合物对肽/腿C复合物显现出TCR特异性结合，但对IL-15RPyc受体显现出较低的结合对如上所述包括IL-15变异体的融合蛋白复合物结合TCR特异性抗原p53(aa264-272)/HLA-A2.1的能力进行定性。为了生成呈递p53(aa264-272)/HLA-A2.1的细胞，于37C在lxPLE(AltorBioscience)存在下以20iiMp53(aa264-272)肽载入HLA-A2.1-阳性T2细胞(2X107mL)2至3小时。将未与肽共同培养的T2细胞及表达IL-2/15RPyc的32D13细胞作为对照组。接着，将载入p53肽的T2细胞、对照组T2细胞或32DI3细胞(2X107100iiL)与320nM下列二聚体融合蛋白复合物于4C培养30分钟l)c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi、2)c264scTCR/huIL15D8A+c264scTCR/huIL15RaSushi、以及3)c264scTCR/huIL15D8N+c264scTCR/huIL15RaSushi。通过于4C培养160nM经纯化的c264scTCRhuIL15融合蛋白及160nM经纯化的c264scTCRhuIL15RaSushi融合蛋白3小时而生成此等复合物。染色之后，将细胞以洗涤缓冲液(含有0.5%BSA及0.05%叠氮化钠的PBS)洗涤一次，并于100yL洗涤缓冲液中以0.5iig生物素化小鼠单株抗人类TCRC13抗体(BF1)于4C染色30分钟。将细胞洗涤一次并于100yL洗涤缓冲液中以0.5g经R-藻红素共轭的链霉亲和素于4C染色30分钟。洗涤并再悬浮该细胞以供通过流式细胞仪进行分析。如图17A所示，对于特异性染色载入p53肽的T2细胞而言，c264scTCR/huIL15D8A+c264scTCR/huIL15RaSushi复合物及c264scTCR/huIL15D8N+c264scTCR/huIL15RaSushi复合物显现出与c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi复合物相等的活性。此等结果显示在此等融合复合物各者中的多价scTCR结构域具有完整的功能。然而，如图17B及图17C所示，对于对照组T2细胞(图17B)及IL-15RPyc-阳性32DP细胞(图17C)，相较于野生型c264scTCR/IL15融合蛋白复合物，突变的c264scTCR/huIL15融合蛋白复合物显现出较低的背景染色。因此，此等包括IL-15变异体(D8A及D8N)的融合蛋白复合物不会对呈递于32DP细胞的IL-15RPYc受体显现出结合活性。利用其他包括IL-15变异体的融合蛋白进行IL-15RPYc受体结合性的类似研究并总结于表l。结果显示包括IL-15变异体的本发明融合蛋白及融合蛋白复合物保有辨识肽/MHC复合物的活性并对IL-15RPyc受体展现出降低或增加的结合活性。为确认上述融合蛋白功能性TCR与IL-15结构域，通过ELISA分析测定肽/腿C及IL-15Ra结合活性。于4C，在3小时的期间，以于碳化缓冲液(pH9.1)(碳酸氢钠35mM，Na2C0317.5mM，NaCl50mM)的20nMBF1、抗TCRCP抗体、或20nMTCR/IL15RaSushi预先涂覆96孔微量滴定盘。将该盘以洗涤缓冲液(咪唑40mM，NaC1150mM)洗涤4次，并以1%BSA-PBS封阻(block)10分钟。添加浓度0.03-4nM的指定融合蛋白至该盘，并于室温培养30分钟。洗涤该盘4次。将经BF1捕捉的融合蛋白与1yg/mL经HRP共轭的p53/HLA-A2.1四聚体于室温培养45分钟，并将经TCR/IL15RaSushi捕捉的融合蛋白与50ng/mL生物素化小鼠抗人类IL-15于室温培养30分钟。洗涤4次后，将与生物素化小鼠抗人类IL-15共同培养的该盘与0.25i！g/mLHRP-链霉亲和素培养15分钟。将该盘洗涤4次，与过氧化酶受质ABT培养1至10分钟并显色，以供利用微量滴定盘判读机的405nm吸光度测定。如图18A及图18B所示，多种融合蛋白对p53/HLA-A2四聚体共有类似的TCR特异性结合活性，且对IL15RaSushi共有相等的IL-15结合活性。利用其他包括IL-15变异体的融合蛋白进行IL-15Ra结合性的类似研究并总结于表l。结果显示包括IL-15变异体的本发明融合蛋白及融合蛋白复合物保有辨识肽/MHC复合物及IL-15Ra受体的活性。实施例16-TCR/IL15突变体融合蛋白及融合蛋白复合物的功能定性如上所表明，包括IL-15拮抗剂或激动剂的融合蛋白可有用于作为靶向药剂，以用于在疾病位置抑制或剌激IL-15媒介的应答(亦即，T细胞或NK细胞活性)。为了测定此等融合蛋白影响免疫应答的IL-15生物活性，利用表达高亲和性IL-15R(a|3Yc链)的CTLL-2细胞及利用表达中间型IL-15R(PYc链)的32DP细胞进行细胞增生研究。于37C，在C02培养器中，将细胞(2X104/200iiL)与0.4至40nM的上述TCR/IL15融合蛋白于96孔盘中培养3天。将该细胞与10iiL的WST-1培养4小时之后，收取150yL的培养基，以利用微量滴定盘判读机进行440nm吸光度测定。如图19A及图19B所示，包括野生型IL-15结构域的c264scTCR/huIL15融合蛋白可分别以低至40pM或lnM的浓度维持CTLL-2及32DP细胞增生。令人感兴趣的是，相较于包括野生型IL-15结构域的融合蛋白，包括具有在位置72以氨基酸将天冬酰胺取代成天冬氨酸的IL15变异体的融合蛋白(c264scTCR/huIL15N72D)在维持32DP细胞系增生上更具活性，显示出低至80pM(图19B)浓度的生物活性。在此方面，包括IL-15变异体的融合蛋白(huIL15N72D)显示出极佳的激动剂活性。在具有一对一比例的c264scTCR/IL15RaSushi的复合物中，c26scTCR/huIL15N72D对T2细胞上的p53/HLA-A2.1复合物具有类似于c264scTCR/huIL15wt的结合能力(图17A)，但对32DP细胞上的IL-15RPYc受体则显现出增加的结合能力(图17C)。相反地，相较于c264scTCR/huIL15wt融合蛋白，包括在位置8(c264scTCR/huIL15D8N或c264scTCR/huIL15D8A)、位置65(c264scTCR/huIL15N65A)、位置108(c264scTCR/huIL15Q108A)具有取代的IL-15变异体，或在位置72(c264scTCR/huIL15N72R)具有不同取代的IL-15变异体的融合蛋白在维持CTLL-2及32DI3细胞的增生上皆具有较低的活性(图19A及图19B)。利用其他包括IL-15变异体的融合蛋白进行IL-15相依性增生活性的类似研究并总结于表1。该数据支持下述假设IL-15蛋白在位置8、61、65、72及108的突变可产生对IL-15R具有降低的结合性且对剌激免疫应答具有极少或不具有活性的IL-15拮抗剂。位置72取代的结果意外地得到一个突变体(c264scTCR/huIL15N72R)，其作用为IL-15拮抗剂，而不同的突变体(c264scTCR/huIL15N72D)则显示出对IL-15R增加的结合性及对剌激免疫应答增强的活性。于典型的情况中，IL-15由树突细胞表面上的IL15Ra转呈递(trans-present)至记忆T细胞、NKT细胞或NK细胞上的IL-15RPyc受体，以维持细胞存活及剌激免疫应答。拮抗剂应通过与IL15Ra结合而阻断IL-15的转呈递作用。为评估拮抗剂融合蛋白是否可与c264scTCR/huIL15wt竞争以阻断其维持CTLL-2细胞生长的活性，在50nM(100倍摩尔过量)的各种c264scTCR/huIL15突变体融合蛋白存在或不存在下，将4X104个CTLL-2细胞与0.5nM的c264scTCR/huIL15wt于37C在C02培养器中培养24小时。将该细胞与10iiL的WST-1培养4小时之后，收取150iiL的培养基，以利用微量滴定盘判读机进行440nm吸光度测定。如图19C所示，c264scTCR/huIL15wt维持CTLL-2细胞增生的能力在100倍以上的c加4scTCRyhuILlSDSN、c加4scTCR/huILlSDSA、c加4scTCR/huILlSDSA/Q108A、c264scTCR7huIL15Q108A或c264scTCR/huIL15D8N/N65A的存在下被完全地阻断，而在c264scTCR/huIL15N72R融合蛋白的存在下则下降62%。此结果显示此等融合蛋白为c264scTCR/IL15融合蛋白的拮抗剂。基于此等蛋白与IL-15Ra结合但不与IL-15RPyc受体结合的能力所预期，此数据指出c264scTCR/huIL15突变体融合蛋白为IL-15活性的功能性拮抗剂。利用此处所述其他TCR/IL15融合蛋白与IL-15变异体进行类似研究，以证实IL-15拮抗剂及激动剂活性。如表1所总结，IL-15在位置8、61、65、72及108的取代显示出影响IL-15对IL-15R(PYc链)结合性的能力。IL-15在位置92、101及111的其他取代亦将作为IL-15R相互作用的可能结合位置而予以评估。此外，包含所有或数个此等残基的取代的变化组合可创造有效的IL-15拮抗剂或激动剂。包含上述的分子，欲加以评估的IL-15变异体包含彼等具有下列改变者在位置8改变成丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸或酪氨酸；在位置61改变成丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸或酪氨酸；在位置65改变成丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸；在位置72改变成丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸；以及在位置92、101、108或111改变成丙氨酸或丝氨酸。实施例17-通过TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白及融合蛋白复合物的细胞-细胞接合及免疫细胞再标靶(retargeting)为证实融合蛋白或融合蛋白复合物可将承载有IL-15受体的细胞与承载有肽/MHC的靶细胞桥联，将T2细胞载入p53(aa264-272)肽或对照组CMV卯65(aa495-503)肽，接着以二氢乙啶(dihydroethidium)标记。将CTLL-2细胞以f丐黄绿素AM(calceinAM)标记，将两个经标记的细胞族群混合并在融合蛋白或融合蛋白复合物的存在或不存在下培养。在融合蛋白复合物不存在下或将T2细胞载入对照组肽时，通过流式细胞仪评估时，预期细胞会保持两个清楚区别的族群。然而，当将T2细胞载入p53(aa264-272)并在融合蛋白或复合物的存在下与CTLL-2细胞培养时，双重染色的细胞族群外观为T2细胞经由融合蛋白或融合蛋白复合物接合至CTLL-2细胞的指标。同样地，可进行研究来证实融合蛋白复合物可桥联承载有IL-15受体的免疫细胞与承载有肽/MHC的靶细胞，并将免疫细胞毒性导向靶细胞。举例而言，将T2细胞载入p53(aa264-272)肽或对照组CMVpp65(aa495-503)肽，接着以f丐黄绿素AM标记。以不同的比例混合承载IL-15受体的免疫效应物细胞(亦即，经活化的NK细胞或T细胞)，并在融合蛋白复合物的存在或不存在下于适当条件培养(亦即，于37C培养2至4小时)。通过标准方法，基于钙黄绿素从T2靶细胞至培养基的释放而评估细胞毒性。测定钙黄绿素-AM的特异性释放或与自然释放钙黄绿素-AM的非特异性对照组进行比较。在融合蛋白复合物不存在下或将T2细胞载入对照组肽时，预期得到低浓度的靶细胞细胞毒性。然而，当将T2细胞载入p53(aa264-272)并在融合蛋白或复合物的存在下与免疫效应物细胞培养时，T2细胞的特异性裂解(lysis)为免疫效应物细胞经由融合蛋白复合物再标靶p53肽呈递细胞的指标。利用呈递p53(aa264-272)/HLA-A2.1复合物的肿瘤细胞系作为靶细胞进行类似研究。实施例18-活体内证实IL-15变异体激动剂、TCR/IL15融合蛋白及融合蛋白复合物的抗肿瘤功效使用实验性异体移植肿瘤模型来测定融合蛋白复合物或IL-15变异体激动剂是否具有活体内抗肿瘤活性。已利用于其他TCR为主的融合蛋白的类似动物功效研究(5至7)中使用的表达p53(aa264-272)/HLA-A2.1复合物的人类肿瘤细胞系(例如，A375黑色素瘤、MDA-MB-231乳腺癌、PANC1胰腺癌)。举例而言，将A375人类黑色素瘤细胞皮下注射至裸小鼠侧腹，并使肿瘤建立3天。对荷肿瘤小鼠静脉每日注射c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi复合物或IL-15变异体激动剂(剂量范围-O.1至2mg/kg)、或等剂量体积(dosevolumeequivalent)的PBS，共注射4天或更多天。研究期间，测量肿瘤尺寸并计算肿瘤体积。预期所有经PBS处理的小鼠会发展出肿瘤。在某些或所有经融合蛋白复合物或IL-15变异体激动剂处理的小鼠中，肿瘤生长的抑制作用或完全的肿瘤退化(tumorregression)为该处理的抗肿瘤效果的指标。其他替代性给药计画(包含多周期给药(multi-cycledosing))亦可证实融合蛋白或IL-15变异体激动剂的抗肿瘤功效。对于通过融合蛋白复合物的c264scTCR-结构域的抗原特异性辨识作用，可使用缺乏p53(aa264-272)/HLA-A2.1复合物的肿瘤细胞系(例如，HT-29或AsPC-1(5，9))作为对照组。可使用包括其他TCR结构域的替代性融合蛋白复合物(亦即，对CMVpp65(aa495-503)肽具特异性者(9))作为非肿瘤靶向对照组。此外，在异体移植荷肿瘤小鼠中进行授受性细胞转移研究。举例而言，将承载有IL-15受体的免疫细胞(例如，原初(nai've)或经活化(或记忆型)脾细胞、NK细胞或T细45胞)从小鼠中单离，并与c264scTCR/huIL15+c264scTCR7huIL15RaSushi复合物或激动剂IL-15变异体于容许结合至该细胞的条件下培养。于某些情形中，将使用融合蛋白复合物或激动剂IL-15变异体来活化免疫细胞。接着，将经IL-15变异体活化的细胞或经融合蛋白复合物包覆的细胞转移至荷A375肿瘤的裸小鼠。对照组包含转移未经处理的免疫细胞、单独的融合蛋白复合物、及PBS。监测到肿瘤生长，且预期所有经PBS处理的小鼠会发展出肿瘤。在某些或所有经IL-15变异体活化的细胞或经融合蛋白复合物包覆的细胞中，肿瘤生长的抑制作用或完全的肿瘤退化为该处理的抗肿瘤效果的指标。或者，IL-15变异体或融合蛋白复合物及免疫细胞是同时给予，或同时或不同时分开给予。对于荷肿瘤宿主，免疫细胞可为自体性(autologous)或异源性(allogeneic)。改变所转移的细胞数及给药计画以评估及最佳化抗肿瘤功效。如上所述，利用其他肿瘤细胞系或融合蛋白复合物来测定抗原靶向在任何所观察的抗肿瘤活性中所扮演的角色。实施例19-以TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白复合物活体外处理免疫细胞，随后进行授受性细胞转移而在异体移植肿瘤动物模型中提供增进的存活率为证实预先与TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白复合物共同培养的经富集化异源小鼠NK细胞对肿瘤生长的抗肿瘤功效，使用人类NSCLCA549A2肿瘤细胞于裸小鼠的实验性转移模型中进行下列研究。将无胸腺裸小鼠(每组n=4，雌性，5至6周龄)经由侧尾静脉以5X106个细胞/小鼠静脉内(IV)注射人类NSCLC肿瘤细胞系A549-A2。A549-A2细胞系代表带有表达人类HLA-A2.1cDNA的载体的p53阳性A549亲本的转染株。收集来自A2小鼠(B6背景)的脾脏，并使用得自MiltenyiBiotech,Inc.的NK细胞单离套组依据制造者的操作指南单离NK细胞。简言之，通过通过金属筛网(60网目)于HBSS中均质化脾脏而制备脾细胞的单一细胞悬浮液。于ACK红细胞裂解缓冲液中使红细胞裂解。将细胞与生物素_抗体调和液(10yL，对于107细胞)于4至8C培养10分钟。测定白细胞的数目，并对每l(^个细胞添加30iiL的缓冲液(PBSpH7.2，0.5%BSA及2mMEDTA)及20iiL的抗生物素微珠(anti-biotinMicroBead)，并将混合物于4至8C培养15分钟。将细胞于2mL缓冲液中洗涤并以300xg离心10分钟。将细胞再悬浮于500yL缓冲液中，以用于载入MACS管柱。收集流通物(flowthrough)并使用FACScan分析测定NK细胞的纯度。为了活化细胞，在c264scTCR/IL15:c264scTCR7IL15Ra融合蛋白复合物、TCR-IL2融合蛋白或rhlL-2的存在或不存在下，将NK细胞(5X106)于T25瓶中在补充有10%FBS的10mlRPMI1640于37C培养一整夜。添加浓度为0.8iig/mL的c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra融合蛋白复合物及TCR-IL2融合蛋白，以及添加浓度为0.2yg/mL的rhlL-2。培养一整夜后，收取细胞，并将细胞于100yL的0.5mg/mLc264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra融合蛋白复合物或TCR-IL2融合蛋白或O.125mg/mLrhlL-2在冰上预先培养30分钟。于PBS(lmL)中洗涤后，将细胞以10Xl(f个/mL再悬浮于PBS中以供授受性转移。于第1天，经由尾静脉对小鼠静脉内注射A549A2肿瘤细胞(5X106)以建立肺肿瘤。肿瘤细胞注射后第14天，将小鼠随机分配成5组(n-4)。于第14及21天，经由腹膜内注射以200mg/kg的剂量以环磷醯胺(CTX)处理小鼠。于第16及22天，以经不同融合蛋白或rhlL-2预先培养的NK细胞(1Xl(f个/小鼠)进行静脉内注射，并将接收PBS的小鼠作为对照组。处理计画总结如下组别CTXNK细胞剂量(mg/kg)注射(腹膜内)剂量(x106)注射(静脉内)CTX200第14及2t天0箄16及22天CTX+NK/r亂2200第14及21天1第16及22天CTX+NK/MART-1scTCR-IL2200第14及21天1第16及22天CTX+NK/c264scTCR-IL2200第14及21天1第16及22天CTX+NK/c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra融合蛋白复合物200第14及21天1第16及22天每天监测荷肿瘤小鼠的存活率。牺牲垂死的小鼠并计为死亡。肿瘤注射后存活超过100天的小鼠视为已痊愈。在CTX、CTX+NK/rhlL-2、CTX+NK/MARTlscTCR-IL2、CTX+NK/c264scTCR-IL2及c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra融合蛋白复合物处理组中的小鼠存活中间值分别为52、67.5、64.5、85.5及80天(图20)。因此，相较于在单独经化学疗法处理或在经非靶向MARTscTCR-IL2或rhlL-2活化的NK细胞处理的荷肿瘤动物中所观察到的存活时间中间值，授受性转移经c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra活化的NK细胞得到较长的存活时间中间值。此试验性实验的结果指出以c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra活化及标靶至小鼠NK细胞可提供增强的抗肿瘤活性。实施例20-通过延长的细胞表面滞留时间证明TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白复合物对承载有IL-15R的免疫细胞增强的结合性融合蛋白复合物在承载有IL-15R的细胞上的细胞表面滞留时间可能影响融合蛋白将效应物细胞标靶至及桥联TCR特异性肿瘤细胞的能力。为探讨此，通过流式细胞仪直接比较scTCR/IL-15融合蛋白、TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白复合物及重组IL-15对承载有IL-15RapyC受体的CTLL-2细胞及承载有IL-15RPyC受体的CTLL-2细胞32DP细胞的结合性。与各种蛋白质培养后，将细胞加以洗涤并在培养基中于37t:培养高达180分钟，利用经PE标记的抗IL-15单株抗体检测留在细胞表面上的蛋白质浓度。比较初始时间零染色与后续的各时间以测定各蛋白结合至IL-15R的细胞表面滞留时间。相较于IL-15,scTCR/IL-15融合蛋白或TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白复合物的细胞表面滞留时间增加为受体结合活性增强且更安定的指标。实施例21-相较于IL-15而言，小鼠中的TCR/IL15融合蛋白及TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白复合物的活体内半衰期增加于HLAA2.1/Kb_基因转殖小鼠品系中评估c264scTCR/IL-15、c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra复合物、重组IL-15或可溶性IL-15:IL-15Ra复合物的药物动力学参数。HLA-A2.1结构域(c264scTCR/IL-2限定)的存在可能影响此融合蛋白的药物动力学，而可提供比其他小鼠品系更相关的〃人类化〃观点药物动力学。对小鼠静脉内注射等摩尔量的c264scTCR/IL-15、c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra复合物、重组IL-15或可溶性IL-15:IL-15Ra复合物，在注射后5分钟至2周的多个不同时间点收集血液。使用上述ELISA模式评估融合蛋白的血清浓度。利用标准IL-15特异性ELISA检测IL-15的浓度。使用曲线嵌合软体(例如，WinNonlin)测定c264scTCR/IL-15、c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra复合物、重组IL-15或可溶性IL-15:IL-15Ra复合物的活体内药物动力学参数。相较于重组IL-15或可溶性IL-15:IL-15Ra复合物，c264scTCR/IL_15或c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra复合物升高的Cmax值、增加的血清半衰期或降低的清除率为下述者的指标TCR-IL15融合物或TCR/IL15:TCR/IL-15Ra复合物的生成将提供相较于单独的IL-15所观察到的药物动力学而言更有利的药物动力学。实施例22-活体内证实IL-15变异体拮抗剂、TCR/IL15融合蛋白及融合蛋白复合物的免疫抑制效果使用实验性自体免疫关节炎模型来测定融合蛋白复合物或IL-15变异体拮抗剂是否具有活体内免疫抑制活性。已证实在HLA-DR4-基因转殖小鼠中给予第II型胶原蛋白(CII)之后可引发自体免疫关节炎(Rosloniecetal.1998.JImmunol.160:2573-8)。此外，已对涉及此疾病病理学的CII特异性T细胞定性。如先前实施例所述，使用来自此等T细胞的TCR基因来构筑适当的表达载体及宿主细胞系，以生成包括IL-15变异体拮抗剂的CIIscTCR/IL15以及CIIscTCR/IL15RaSushi融合蛋白。通过给予CII而引发关节炎后，对HLA-DR4-基因转殖小鼠每日静脉内给予CIIscTCR/IL15-拮抗剂+CIIscTCR/IL15RaSushi复合物或IL-15变异体拮抗剂(剂量范围-0.1至2mg/kg)，或等剂量体积的PBS，共注射4天或更多天。研究期间，对小鼠足关节的发炎程度予以评估及计分，等级为0至4。预期所有经PBS处理的小鼠皆发展出关节炎。在某些或所有经融合蛋白复合物或IL-15变异体处理的小鼠中的关节炎抑制作用(例如，降低的发病率或临床评分)为该处理的免疫抑制效果的指标。其他替代性给药计画(包含多周期给药)亦可证实融合蛋白或IL-15变异体的免疫抑制功效。可使用包括其他TCR结构域的替代性融合蛋白复合物(亦即，对p53肽具特异性者)作为非疾病靶向对照组，以证实靶向TCR融合蛋白的特异性具有将免疫抑制活性导向疾病位置的能力。参考资料的并入48本申请案全文所引用的所有参考资料、专利、申请中的专利案及已公开专利的内容均藉此特地以参考资料的方式并入。等价物熟习此技艺者使用不超出例行的实验将了解或能够确定此处所述本发明的特定具体例的许多等价物。这些等价物意图涵括于权利要求书中。参考资料1.Mortier，E.，A.Quemener，P.Vusio，I.Lorenzen，Y.Boublik，J.Grotzinger，A.Plet，andY.Jacques.2006.Solubleinterleukin-15rec印toralpha(IL-15Ralpha)-sushiasaselectiveandpotentagonistofIL_15actionthroughIL-15Rbeta/gamma.HyperagonistIL_15xIL_15Ralphafusionproteins.JBiolChem281:1612-1619.2.Stoklasek，T.A.，K.S.Schl墜，andLLefrancois.2006.CombinedIL-15/IL_15RalphaimmunotherapymaximizesIL—15activityinvivo.JImmunol177:6072-6080.3.Rubinstein,M.P.，M.Kovar，J.F.Purton，J.H.Cho，0.Boyman，C.D.Surh，andJ.Sprent.2006.ConvertingIL_15toasuperagonistbybindingtosolubleIL-15R{alpha}.ProcNatlAcadSciUSA103:9166-9171.4.Waldma皿，T.A.2006.Thebiologyofinterleukin_2andinterleukin-15:implicationsforcancertherapyandvaccinedesign.NatRevImmunol6:595—601.5.Belmont，H.J.，S.Price—Schiavi，B.Liu，K.F.Card,H.I.Lee，K.P.Han，J.Wen，S.Tang，X.Zhu，J.Merrill,P.A.Chavillaz，J.L.Wong，P.R.Rhode,andH.C.Wong.2006.Potentantitumoractivityofatumor-specificsolubleTCR/IL-2fusionprotein.ClinImmunol121:29-39.6.Card,K.F.，S.A.Price-Schiavi，B.Liu，E.Thomson,E.Nieves，H.Belmont，J.Builes，J.A.Jiao，J.Hernandez,J.Weidanz，LSherman,J.LFrancis,A.Amirkhosravi，andH.C.Wong.2004.Asolublesingle_chainT_cellreceptorIL—2fusionproteinretainsMHC_restrictedpeptidespecificityandIL_2bioactivity.CancerImmunolImm皿other53:345_357.7.Mosquera，L.A.，K.F.Card,S.A.Price-Schiavi，H.J.Belmont,B.Liu，J.Builes，X.Zhu，P.A.Chavaillaz，H.I.Lee，J.A.Jiao，J.LFrancis,A.Amirkhosravi,R.LWong，andH.C.Wong.2005.InVitroandInVivoCharacterizationofaNovelAntibody-LikeSingle-ChainTCRHumanlgGlfusionProtein.JImmunol174:4381-4388.8.Penichet，M.L，E.T.Harvill，andS.LMorrison.1997.Antibody_IL_2fusionproteins:anovelstrategyforimmuneprotection.HumAntibodies8:106—118.9.Zhu，X.，H.J.Belmont，S.Price-Schiavi，B.Liu，H.I.Lee，M.Fer鍾dez，R丄Wong，J.Builes，P.R.Rhode,andH.C.Wong.2006.Visualizationofp53264-272/HLA-A柳201ComplexesNaturallyPresentedonTumorCellSurfacebyaMultimericSolubleSingle—ChainTCellReceptor.JImmunol176:3223—3232.49权利要求一种可溶性融合蛋白复合物，包括至少两种可溶性融合蛋白，其中，第一融合蛋白包括(a)第一生物性活性多肽，所述第一生物性活性多肽共价连结至(b)介白素-15(IL-15)多肽或其功能性片段；以及第二融合蛋白包括(c)第二生物性活性多肽，所述第二生物性活性多肽共价连结至(d)可溶性介白素-15受体α(IL-15Ra)多肽或其功能性片段；其中第一融合蛋白的IL-15结构域结合至第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域以形成可溶性融合蛋白复合物。2.根据权利要求l的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一与第二生物性活性多肽的一个包括第一可溶性T-细胞受体(TCR)或其功能性片段。3.根据权利要求2的可溶性融合蛋白复合物，其中所述生物性活性多肽的另一个包括权利要求2的第一可溶性TCR或其功能性片段，因而创造具有增加的结合活性的多价TCR融合蛋白复合物。4.根据权利要求2的可溶性融合蛋白复合物，其中所述生物性活性多肽的另一个包括不同于所述第一可溶性TCR的第二可溶性TCR或其功能性片段。5.根据权利要求2至4的可溶性融合蛋白复合物，其中所述TCR对于特定抗原的识别有特异性。6.根据权利要求2至4的可溶性融合蛋白复合物，其中所述TCR为包括a与b链TCR的异二聚体。7.根据权利要求2至4的可溶性融合蛋白复合物，其中所述TCR包括单链TCR多肽。8.根据权利要求7的可溶性融合蛋白复合物，其中所述单链TC包括TCRV-a链，所述TCRV-a链通过肽接头序列共价连结至TCRV-b链。9.根据权利要求8的可溶性融合蛋白复合物，其中所述单链TCR进一步包括共价连结至TCRV-b链的可溶性TCRCb链片段。10.根据权利要求8或9的可溶性融合蛋白复合物，其中所述单链TCR进一步包括共价连结至TCRV-a链的可溶性TCRCa链片段。11.根据权利要求l的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一与第二生物性活性多肽中的一个或两个包括抗体或其功能性片段。12.根据权利要求ll的可溶性融合蛋白复合物，其中所述抗体对于特定抗原的识别有特异性。13.根据权利要求11或12的可溶性融合蛋白复合物，其中所述抗体为单链抗体或单链Fv。14.根据权利要求13的可溶性融合蛋白复合物，其中所述单链抗体包括免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区通过多肽接头序列共价连结至免疫球蛋白重链可变区。15.根据权利要求1的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15多肽为包括不同于天然IL-15多肽的氨基酸序列的IL-15变异体。16.根据权利要求15的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15变异体作用为IL-15激动剂或拮抗剂。17.根据权利要求15的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15变异体，与所述天然IL-15多肽相比，对于IL-15RPYC受体具有增加或减少的结合活性。18.根据权利要求15至17中任一项的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15变异体的序列，与所述天然IL-15序列相比，具有至少一个氨基酸改变。19.根据权利要求18的可溶性融合蛋白复合物，其中所述氨基酸改变为与IL-15RI3和/或YC相互作用的IL-15结构域中的氨基酸取代或删除。20.根据权利要求18的可溶性融合蛋白复合物，其中所述氨基酸改变为成熟人类IL-15序列(SEQIDN0:1)的位置8、61、65、72、92、101、108或111的一个或多个氨基酸取代或删除。21.根据权利要求18的可溶性融合蛋白复合物，其中所述氨基酸改变为所述成熟人类IL-15序列的位置8的D取代为N或A、位置61的D取代为A、位置65的N取代为A、位置72的N取代为R或位置108的Q取代为A，或所述取代的任何组合。22.根据权利要求21的可溶性融合蛋白复合物，其中所述氨基酸改变产生IL-15变异体，其具有IL-15拮抗剂活性，或者其与所述天然IL-15多肽相比，对于IL-15RPYC受体具有减少的结合活性。23.根据权利要求18的可溶性融合蛋白复合物，其中所述氨基酸改变为所述成熟人类IL-15序列的位置72的N取代为D。24.根据权利要求23的可溶性融合蛋白复合物，其中所述氨基酸改变产生IL-15变异体，其具有IL-15激动剂活性，或者其与所述天然IL-15多肽相比，对于IL-15RPYC受体具有增加的结合活性。25.根据权利要求1至24的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一生物性活性多肽为通过多肽接头序列共价连结至IL-15多肽(或其功能性片段)。26.根据权利要求1至25的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第二生物性活性多肽为通过多肽接头序列共价连结至IL-15Ra多肽(或其功能性片段)。27.根据权利要求5的可溶性融合蛋白复合物，其中所述TCR结构域的抗原包括呈递于MHC或HLA分子的肽抗原。28.根据权利要求27的可溶性融合蛋白复合物，其中所述肽抗原来自于肿瘤相关多肽或病毒编码多肽。29.根据权利要求12的可溶性融合蛋白复合物，其中所述抗体结构域的抗原包括细胞表面受体或配体。30.根据权利要求12或29的可溶性融合蛋白复合物，其中所述抗原包括CD抗原、细胞因子或趋化因子受体或配体、生长因子受体或配体、细胞黏合分子、MHC/MHC样分子、FC受体、Toll样受体、NK受体、TCR、BCR、正向/负向协同剌激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤相关抗原或病毒编码抗原。31.根据权利要求1至30与73至74的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15Ra多肽包括能结合IL-15多肽的IL-15受体a的细胞外结构域。32.根据权利要求1至31与73至74中任一项的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15Ra多肽包括IL-15asushi结构域或IL-15aAE3结构域。33.—种核酸序列，其编码权利要求1至30与73至74中任一项的第一融合蛋白。34.—种核酸序列，其编码权利要求1至32与73至74中任一项的第二融合蛋白。35.根据权利要求33或34的核酸序列，其中所述核酸序列进一步包括可操作性地连结至所述编码融合蛋白的序列的启动子、翻译起始信号与前导序列。36.—种DNA载体，包括权利要求33的核酸序列。37.—种DNA载体，包括权利要求34的核酸序列。38.—种DNA载体，包括权利要求33与34的核酸序列。39.—种制造权利要求1的可溶性融合蛋白复合物的方法，所述方法包括a)将编码第一融合蛋白的权利要求36的DNA载体导入第一宿主细胞；b)在足以表达细胞或培养基中的所述第一融合蛋白的条件下，在培养基中培养所述第一宿主细胞；c)由所述宿主细胞或培养基中纯化所述第一融合蛋白；d)将编码第二融合蛋白的权利要求37的DNA载体导入第二宿主细胞；e)在足以表达细胞或培养基中的所述第二融合蛋白的条件下，在培养基中培养所述第二宿主细胞；禾口f)由所述宿主细胞或培养基纯化所述第二融合蛋白；以及g)在足以使所述第一融合蛋白的IL-15结构域与所述第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域之间结合的条件下，混合所述第一与第二融合蛋白以形成所述可溶性融合蛋白复合物。40.—种制造权利要求1的可溶性融合蛋白复合物的方法，所述方法包括a)将编码第一融合蛋白的权利要求36的DNA载体与编码第二融合蛋白的权利要求37的DNA载体导入宿主细胞；b)在足以表达细胞或培养基中的所述融合蛋白的条件下，在培养基中培养所述宿主细胞，且使所述第一融合蛋白的IL-15结构域与所述第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域之间联合，以形成所述可溶性融合蛋白复合物；以及c)由宿主细胞或培养基纯化所述可溶性融合蛋白复合物。41.一种制造权利要求1的可溶性融合蛋白复合物的方法，所述方法包括a)将编码第一与第二融合蛋白的权利要求38的DNA载体导入宿主细胞；b)在足以表达细胞或培养基中的所述融合蛋白的条件下，在培养基中培养所述宿主细胞，且使所述第一融合蛋白的IL-15结构域与所述第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra结构域之间联合，以形成所述可溶性融合蛋白复合物；以及c)由宿主细胞或培养基纯化可溶性融合蛋白复合物。42.—种杀死靶细胞的方法，所述方法包括a)使多种细胞与权利要求1至32的可溶性融合蛋白复合物接触，其中所述多种细胞进一步包括承载有权利要求1的IL-15结构域所识别的IL-15R链的免疫细胞，以及承载有权利要求1的生物性活性多肽中的至少一个所识别的抗原的靶细胞；b)在所述靶细胞的抗原与所述免疫细胞的IL-15R链之间形成足以结合与活化所述免疫细胞的特异性结合复合物(桥联)；以及c)通过所述经结合活化的免疫细胞杀死所述靶细胞。43.根据权利要求42的方法，其中所述靶细胞为肿瘤细胞或病毒感染细胞。44.根据权利要求42或43的方法，其中所述生物性活性多肽包括TCR。45.根据权利要求44的方法，其中所述靶细胞的抗原包括呈递于MHC或HLA分子且可为所述TCR所识别的肿瘤或病毒编码肽抗原。46.根据权利要求42的方法，其中所述免疫细胞为T-细胞、LAK细胞或NK细胞。47.—种于患者预防或治疗疾病的方法，其中所述疾病细胞表达疾病相关抗原，所述方法包括a)对患者给予包括有识别疾病相关抗原的生物性活性多肽的权利要求1至32及73至74中任一项的可溶性融合蛋白复合物；b)在表达抗原的所述疾病细胞与表达IL-15R的免疫细胞之间形成足以定位所述免疫细胞的特异性结合复合物(桥联)；以及c)伤害或杀死所述疾病细胞，足以于所述患者预防或治疗所述疾病。48.—种于患者预防或治疗疾病的方法，其中所述疾病细胞表达疾病相关抗原，所述方法包括a)将承载IL-15R链的免疫细胞与包括识别疾病相关抗原的生物性活性多肽的权利要求1至22与73中任一项的可溶性融合蛋白复合物混合；b)对所述患者给予所述免疫细胞-融合蛋白复合物的混合物；c)在表达抗原的所述疾病细胞与表达IL-15R的所述免疫细胞之间形成足以定位所述免疫细胞的特异性结合复合物(桥联)；以及d)伤害或杀死所述疾病细胞，足以于所述患者预防或治疗所述疾病。49.根据权利要求47或48的方法，其中所述疾病为癌症或病毒感染。50.根据权利要求47或48的方法，其中所述疾病相关抗原为肽/MHC复合物。51.—种于哺乳动物剌激免疫应答的方法，包括对所述哺乳动物给予有效量的权利要求1至32与73至74中任一项的可溶性融合蛋白复合物。52.—种于哺乳动物抑制免疫应答的方法，包括对所述哺乳动物给予有效量的权利要求1至32与73至74中任一项的可溶性融合蛋白复合物。53.根据权利要求1至32与73至74中任一项的可溶性融合蛋白复合物，其中所述可溶性融合蛋白的至少一个包括可检测标记。54.根据权利要求53的可溶性融合蛋白复合物，其中所述可检测标记为生物素、链霉亲和素、酶或其催化性片段、放射性核素、纳米粒子、顺磁金属离子或荧光、磷光或化学发光分子。55.—种检测细胞或组织的方法，所述细胞或组织包括呈递于所述细胞或组织的抗原，所述方法包括a)使所述细胞或组织与权利要求54的至少一种可溶性融合蛋白在使所述抗原与所述可溶性融合蛋白的生物性活性多肽之间形成特异性结合复合物的条件下接触；b)在适合于去除未结合至所述抗原的可溶性融合蛋白的条件下清洗所述细胞与组织；以及c)检测所述特异性结合复合物，作为包括所述抗原的细胞或组织的指标。56.根据权利要求55的方法，其中所述生物性活性多肽包括TCR且所述抗原包括呈递于MHC或HLA分子且为所述TCR所识别的肽抗原。57.—种IL-15变异体，包括不同于天然IL-15氨基酸序列的氨基酸序列，其中所述IL-15变异体，与所述天然IL-15多肽相比，对于IL-15RPYC受体具有增加或减少的结合活性。58.根据权利要求57的IL-15变异体复合物，其中所述IL-15变异体作用为IL-15激动剂或拮抗剂。59.根据权利要求57的IL-15变异体复合物，其中所述IL-15变异体的序列，与所述天然IL-2序列相比，具有至少一个氨基酸改变。60.根据权利要求59的IL-15变异体复合物，其中所述氨基酸改变为与IL-15RP和/或YC相互作用的IL-15结构域的氨基酸取代或删除。61.根据权利要求59的IL-15变异体复合物，其中所述氨基酸改变为成熟人类IL-15序列的位置8、61、65、72、92、101、108或111的一个或多个氨基酸取代或删除。62.根据权利要求59的IL-15变异体复合物，其中所述氨基酸改变为所述成熟人类IL-15序列的位置8的D取代为N或A、位置61的D取代为A、位置65的N取代为A、位置72的N取代为R或位置108的Q取代为A，或所述取代的任何组合。63.根据权利要求62的IL-15变异体复合物，其中所述氨基酸改变产生IL-15变异体，其具有IL-15拮抗剂活性，或者其与天然IL-15多肽相比，对于IL-15RPYC受体具有减少的结合活性。64.根据权利要求59的IL-15变异体复合物，其中所述氨基酸改变为所述成熟人类IL-15序列的位置72的N取代为D。65.根据权利要求64的IL-15变异体复合物，其中所述氨基酸改变产生IL-15变异体，其具有IL-15激动剂活性，或者其与天然IL-15多肽相比，对于IL-15RPYC受体具有增加的结合活性。66.—种核酸序列，其编码权利要求57至65的IL-15变异体。67.—种DNA载体，其包括权利要求66的核酸序列。68.—种宿主细胞，其包括权利要求67的载体。69.—种制造权利要求57的IL-15变异体的方法，所述方法包括b)在足以表达所述IL-15变异体的条件下培养权利要求68的宿主细胞；从而制造所述IL-15变异体。70.根据权利要求70的方法，进一步包括纯化所述IL-15变异体。71.—种于哺乳动物剌激免疫应答的方法，包括对所述哺乳动物给予有效量的权利要求57至65的IL-15变异体。72.—种于哺乳动物抑制免疫应答的方法，包括对所述哺乳动物给予有效量的权利要求57至65的IL-15变异体。73.根据权利要求l的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一生物性活性多肽包括TCRa多肽或其功能性片段，以及所述第二生物性活性多肽包括TCRI3多肽或其功能性片段。74.根据权利要求l的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一生物性活性多肽包括抗体重链多肽或其功能性片段，以及所述第二生物性活性多肽包括抗体轻链多肽或其功能性片段。全文摘要本发明提供具有治疗与诊断用途的可溶性融合蛋白复合物与IL-15变异体，以及制造该等蛋白的方法。本发明另外提供使用本发明之融合蛋白复合物与IL-15变异体刺激或抑制免疫应答的方法。文档编号C07K14/00GK101743249SQ200880024119公开日2010年6月16日申请日期2008年5月9日优先权日2007年5月11日发明者H·C·王,K·韩,P·罗德,X·朱申请人:阿尔托生物科学有限公司