经过修饰的流感病毒的制作方法

专利名称：经过修饰的流感病毒的制作方法
经过修饰的流感病毒本发明涵盖一种在M基因的N端附近(更具体地，在M基因核苷酸位置265-294 的任何一个处)包含至少一个核苷酸的修饰的B型流感病毒M基因，以及包含所述经修饰 M基因的B型流感病毒。
背景技术：
由病毒性疾病引起的地区流行病(印idemics)和全球大流行病(pandemics)仍然 威胁着人类的生命，并冲击着全球的经济。流感导致全世界数以百万计的工作日损失和看 医生，数以十万计的住院(Couch 1993，Ann. NY. Acad. Sci685 ;803)，数以万计的过度死亡 (Collins & Lehmann 1953 Public HealthMonographs 213:1；Glezen 1982 Am. J. Public Health 77 :712)及数十亿欧元的卫生保健费用(Williams et al. 1988, Ann. Intern. Med. 108 616)。在过去，A型和B型流感病毒均曾导致这些人类流行病，因此除了 A型流感 病毒以外，B型流感病毒表面抗原也是任何有效降低流感发病率的疫苗的重要成分。流感病毒属于正粘病毒科，以节段性负链RNA基因组为特征，合计总体大小分别 为13. 6-14. 6kb。基因组病毒RNA必须包装成病毒颗粒，以便使病毒传播。子代病毒颗粒的 组装过程和组装期间发生的蛋白/蛋白相互作用在RNA病毒中是相似的。病毒颗粒的形成 保证了 RNA基因组在单个宿主内或在不同宿主生物体之间从一个宿主细胞向另一个宿主 细胞的有效传播。流感病毒体由包含单链RNA基因组的核糖核蛋白内核(螺旋状的核壳)及内侧衬 有基质蛋白质(Ml)的脂蛋白外被膜组成。A型流感病毒的分节段基因组由8个线性、负极 性的单链RNA分子组成，编码11种(在一些A型流感病毒株中是10种)多肽，包括形成核 壳的依赖于RNA的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2或 BM2)；自含脂质被膜凸出的两种表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白 (NSl)和核外运蛋白(NEP)。大多数A型流感株还编码据认为有促凋亡性质的第11种蛋白 质(PB1-F2)，而只有B型流感病毒表达可能有助于病毒毒力的NB蛋白(Hattaand Kawaoka, 2003，J. Virol.，77，6050-6054)。A型和B型流感病毒进一步在由病毒NA和M基因节段编 码的基因产物的表达策略方面有微小的差异(Lamband Horvath, 1991, Trends Genet. 7 261-266)。显著的生物学和流行病学差异在于B型流感病毒几乎仅限于人类，尽管早就有 研究自海豹分离了 B型流感病毒，指示还可能存在更大的不同生物体的贮存库。A型流感病 毒则在许多鸟类和哺乳类物种中具有非常广泛的贮存库。基因组的转录和复制发生在细胞核内，组装通过从细胞质膜出芽而发生。在混合 感染期间，病毒能重排(reassert)基因。流感病毒通过HA吸附至细胞膜糖蛋白和糖脂中 的唾液酸寡糖。细胞内吞病毒体之后，HA分子在细胞的内体中发生构象改变，这有利于膜 融合，从而触发脱壳。核衣壳迁移至细胞核，在那里，病毒mRNA被转录。病毒mRNA通过一 种独特机制进行转录，其中病毒内切核酸酶自细胞异源mRNA切下带帽的5'端，再以其为 引物，通过病毒转录酶转录病毒RNA模板。转录终止于距其模板末端15-22个碱基的位点， 在那里，寡(U)序列作为添加聚(A)束的信号。在A型流感复制期间这样产生的8种病毒 RNA分子中，有6种是单顺反子信息，它们被直接翻译成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白，PB2、PBl和PA的蛋白。另外2种转录物经过剪接，每种都产生两种mRNA，它们按照不同的 阅读框进行翻译，产生Ml、M2、NSl和NEP。换言之，这8种病毒RNA节段编码11种蛋白9 种结构蛋白和2种非结构蛋白(NSl和最近鉴定出的PB1-F2)。B型流感为两种蛋白，即NB 和BM2，使用一种不同的编码策略。前者从NA基因的重叠阅读框翻译获得，后者通过一个重 叠终止_起始密码子从M基因表达。疫苗接种目前被看作是保护人类免于流感的最佳方法。当健康的成年人获得免疫后，当前可得的疫苗阻止70-90%的临床病例发生。在年 龄超过65岁的人群中，这个水平降低至30-70%，而在疗养院的65岁以上人群中，则降得更 低(Strategic Perspective 2001 :The Antiviral Market. Datamonitor. p. 59)。病毒步页 繁改变抗原性也造成大量死亡病例，因为即使是每年疫苗接种也不能保证保护作用。疫苗接种是用商业可得的、化学灭活的(杀死的)流感病毒疫苗或减毒的活流感 病毒疫苗实现的。不幸的是，灭活的疫苗几乎不能诱导交叉保护性免疫，因此疫苗株必须与 将来未知的全球大流行病毒株的抗原性质精确匹配。复制缺陷型A型流感病毒据信可以克服病毒散发方面的安全问题。这些可以是具 有NSl蛋白删除的A型流感突变体。缺失NSl蛋白使该病毒在接种疫苗的哺乳动物的呼吸 道内发生复制缺陷。在鼻内施用时，疫苗病毒能够在粘膜组织中引发无效感染，没有病毒散 发效果。同时，病毒刺激局部细胞因子应答，唤起B和T细胞介导的保护性免疫应答。B型流感病毒大多需要费力而耗时的适应，以实现在Vero细胞上的充分生长。 B型流感NSl突变体除了具有由于NSl功能丧失造成的干扰素敏感性表型之外，还能够 在Vero细胞上复制到高滴度，但是在文献中尚无介绍。目前，唯一已公开的完全缺少NSl ORF的B型流感病毒在Vero细胞中没有有效复制(使用0. Imoi，滴度为1. 7-2. 5*102FFU/ ml,在 0. OOlmoi 、没有检 IlJ 至Ij 滴度。Dauber et. al Journal of Virology, Feb. 2004， p. 1865-1872)。B型流感NSl删除突变体由氨基端16aa组成，在复制方面也被高度削弱，最 大滴度为大约 104FFU/ml (Hai et. Al Journal of Virology ；Nov2008, p. 10580-90)。反映对开发含有B型流感抗原性化合物的高安全性疫苗配制剂的需求，非常需要 开发由于NS 1功能丧失而减毒但在细胞培养中仍然显示高生长性的B型流感病毒株。发明概述B型流感病毒的临床分离株通常需要费力而耗时的适应，以实现在Vero细胞上的 高生长。对于A型流感病毒，不仅野生型病毒，而且表达例如38个氨基酸的截短NSl蛋白 的突变体或者完全缺失NSl ORF的突变体，均能够在干扰素缺陷型Vero细胞上复制到高滴 度。该发现被用于产生复制缺陷型减毒A型流感活体疫苗。迄今为止，这个概念仍不能应用于B型流感病毒，因为具有无功能NSl蛋白的突变 体不能在组织培养中生长到高滴度。现在，本发明人令人惊讶地显示，通过对B型流感病毒基因组M基因N端区域附近 的所选核苷酸进行修饰，能大大增加生长能力。B型流感病毒M基因长度大约为l，076bp， 包含 Ml 禾口 BM2 ORF0进一步，本发明还涵盖包含所述经修饰M基因的重组B型流感病毒。优选地，该B 型病毒是复制缺陷型的或者至少是减毒的，例如由于NSl蛋白内的删除。具体地，本发明涵盖如下的重组B型流感病毒株，其包含在Ml蛋白氨基酸位置82-90的任何一处，优选地在氨基酸位置85-87的任何一处，优选地在氨基酸位置86处的修 饰，编码缺少功能性RNA结合域和羧基端结构域的NSl蛋白的经修饰NSl节段，和任意地位 于M基因核苷酸位置950处的沉默突变。进一步，涵盖含有本发明病毒的疫苗配制剂和用于预防性处理流感的方法以及制 备本发明病毒的方法。本发明还涵盖编码本发明流感病毒M基因的分离的核酸及其生成。附图简述

图1 野生型、NS14、NS38、NS57和NS80 (a)及野生型和ANSI (b)的B型流感病毒 NS基因的示意性翻译概览。图2 分别表达14、38、57、80个氨基酸的NSl蛋白或野生型NSl蛋白的所指病毒 NS基因的RT-PCR产物。图3 分别表达14、38、57或80个氨基酸的NSl蛋白或野生型NS 1的B/Malaysia 流感病毒在Vero细胞(a)和A549细胞(b)上的生长。图4 具有38或80个氨基酸的NSl蛋白或wt NS 1、含有wt M基因或M1-M86V基 因的B/Malaysia流感病毒突变体在转染后6天的病毒滴度(a)，及含有ANSI基因或具有 38或80个氨基酸的NSl蛋白或wt NS1、含有wtM基因或M1-M86V基因的B/Florida突变 体在转染后5天的病毒滴度(b)。图5 原始B/Malaysia/2506/04样拭子M基因与M1-M86V基因和基因库已公开的 其它序列的氨基酸比较。图6:含有ANSI基因或野生型NSl的B/Florida流感病毒在Vero细胞(a)和 A549细胞(b)上的生长。图7 含有M86V 突变的 B/Vienna/33/06Ml 蛋白(用粗体字标记，SEQ IDNo. 1) (a)， 和含有M86V突变的B/Thilringen/02/06Ml蛋白(用粗体字标记，SEQ ID No. 2) (b)的氨基
酸序列。图8:已构建B型流感病毒NS突变体概览。所有已构建B型流感病毒突变 体的遗传组成(a) ；B/Vienna/33/06M基因M1-M86V的核苷酸序列，SEQ ID No. 3 (b)； B/Vienna/33/06M 基因 M1-M86V 和 C950T 的核苷酸序列，SEQ ID No. 4(c) ；B/ Thiiringen/02/06M 基因 Ml-wt 的核苷酸序列，SEQ ID No. 5 (d) ；B/Thiiringen/02/06M 基因 M1-M86V 的核苷酸序列，SEQ ID No. 6 (e) ；B/Vienna/33/06M 基因 M1-C950T 的核苷酸序列， SEQ ID No. 7(f) ；NS14 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 8 (g) ；NS38 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 9 (h) ；NS57 的 B/Vienna/33/06NS 基因 的核苷酸序列，SEQ ID No.lO(i) ；NS64的B/Vienna/33/06NS基因的核苷酸序列，SEQ ID No.ll(j) ；NS80 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 12 (k) ；ANSl-B 的 B/ Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 13(1) ； Δ NS1-B 的 B/Thiiringen/02/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 14 (m)。图9 具有长度分别为38、80、104和145个aa的NSl蛋白的、表达IL2的B型 流感病毒载体的示意性翻译概览(a)；所有已构建的表达IL2的B型流感病毒载体的 遗传组成(b) ；NS1-38IL2 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQID No. 15(c)； NS1-80IL2 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 16(d) ；NS1-104IL2 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 17(c) ；NS1-145IL2 的 B/Vienna/33/06NS 基因的核苷酸序列，SEQ ID No. 18(f)。图10 :B/NSl-wt、B/NSl-38和B/NS1-38IL2流感病毒在Vero细胞上传代5次后的 RT-PCR 产物。发明详述本发明提供了一种B型流感病毒M基因的核苷酸序列改变，其能增加B型流感病 毒株的生长能力。这些改变可以包括删除和替代。本发明人已经成功显示，B型流感病毒M 蛋白内的至少一处单氨基酸改变能导致在细胞培养中，尤其是在Vero细胞内的高生长性。 这具体地能够挽救所表达NSl蛋白与wt NSl蛋白相比长度变短的病毒或带有完全缺失NSl ORF的突变体。具体地，根据本发明的B型流感病毒M基因在M基因核苷酸位置265-294的任何 一处包含至少一个核苷酸修饰，优选地在核苷酸位置277-285的任何一处包含至少一个核 苷酸修饰，更优选地在核苷酸位置280-282的任何一处包含至少一个核苷酸修饰。具体地，经过修饰的M基因在位置280-282处包含核苷酸GTG，而不是所分离病毒 相应序列的ATG。可选择地，经过修饰的M基因在位置280-282也可以包含核苷酸GTA、GTC、 GTT0当然，实施方案也涵盖相应的RNA密码子，GUG、GUA、⑶C、GUU。根据本发明的一个可选择实施方案，B型流感病毒M基因包括至少一个核苷酸修 饰，其导致在Ml蛋白氨基酸位置82-90的任何一处，优选地在氨基酸位置85-87的任何一 处，优选地在氨基酸位置86处产生至少一个氨基酸替代。替代的氨基酸可以是任何氨基 酸；非极性疏水氨基酸是优选的。具体地，氨基酸改变导致氨基酸位置86处甲硫氨酸变成 缬氨酸。在Ml蛋白氨基酸位置82-90的任何一处，优选地在氨基酸位置85_87的任何一 处，优选地在氨基酸位置86处包含至少一个氨基酸替换的Ml蛋白当然也涵盖在本发明的 范围之内。替代的氨基酸可以是任何氨基酸；非极性疏水氨基酸是优选的。具体地，氨基酸 改变导致氨基酸位置86处甲硫氨酸变成缬氨酸。该Ml蛋白可以通过本领域已知的任何方 法产生。术语“氨基酸替代”是指在该分子亲本氨基酸序列的特定位置处存在经过修饰的 或不同的氨基酸。氨基酸替代相对于可占据该位置的任何其它氨基酸而发生。由氨基酸序 列改变产生的多肽可以包括翻译后修饰的改变，例如糖基化、乙酰化、磷酸化，或者任何其 它氨基酸修饰以及氨基酸替代。包含本发明流感病毒M基因的重组B型流感病毒也涵盖在本发明的范围之内。在其它方面中，含有根据本发明的经修饰M基因的复制缺陷型流感病毒可以进一 步在NS基因内含有修饰，具体地缺少部分或者缺少整个NSl蛋白(ANSI)。由于NSl蛋白 的截短或缺少NSl蛋白的表达，这些病毒只能在干扰素缺陷型细胞中复制，但在常见宿主 或生物体内丧失生长能力。A型流感病毒的NSl蛋白是一种多功能蛋白，由大约230个氨基酸构成，在感染中 被较早并且大量合成。它对抗细胞的抗病毒活性，是一种毒力因子。通过其羧基端区域的 活性，NSl蛋白能够抑制宿主mRNA加工机制。第二，它通过直接与细胞翻译起始因子相互 作用，有助于病毒mRNA的优先翻译。第三，通过与dsRNA结合并与推定的细胞激酶相互作用，NSl蛋白能够阻止可被干扰素(IFN-)诱导的、dsRNA-激活的激酶(PKR)，2' 5'寡腺苷 酸合成酶系统和细胞因子转录因子的激活。第四，NSl的N端部分与RIG-I结合，并抑制下 游IRF-3的激活，阻止IFN-β的转录诱导。因此，NSl蛋白抑制INF-α或INF-β基因的 表达，延迟被感染细胞内的凋亡发生，并阻止相邻细胞内的抗病毒状态的形成。B型流感病毒从病毒NS节段的未剪接转录本表达一种281个氨基酸的非结构蛋 白，称作NS1-B，其与其NSl-A对应物(counterpart)均具有结合相同RNA靶标和体外抑制 PKR激活的能力。与A型流感病毒相反，B型流感病毒NSl不抑制前mRNA剪接，但与干扰素 刺激基因15(ISG15)产物结合，并抑制其与细胞靶标的结合。在NSl蛋白内含有修饰的A型流感病毒是本领域已知的。例如，W099/64571介绍 了 NSl基因节段的完全敲除，WO 99/64068公开了被部分删除的各种NSl基因节段。本文引 用这些出版物的全部内容作为参考。目前仅知道少数在NSl蛋白内含有修饰的B型流感病 毒，并且在这些由于NSl功能缺失而具有干扰素敏感表型的病毒中，没有一种可以在Vero 细胞内生长到高滴度。在这里，介绍了这些在NSl蛋白内具有修饰的病毒的构建。根据本发明，NSl蛋白内的修饰可以是至少一个氨基酸的删除、插入或替代，其导 致形成复制缺陷型流感病毒。优选地，经过修饰的B型流感病毒NSl蛋白包括至少50% NSl氨基酸，优选地至少 70%，更优选地至少90%的删除。可选择地，NSl蛋白的功能性可以被完全消除。根据本发明的流感病毒NSl蛋白可以缺少功能性RNA结合域。该位于NSl蛋白氨 基端(氨基酸1-93)的结构域的主要功能是结合dsRNA并抑制PKR的激活(Dauber et al, J Virol. 2006 Dec ；80 (23) 11667-77) 根据本发明，术语功能性羧基端结构域可以包括NSl蛋白的如下区域，其能够抑 制宿主mRNA加工机制，也就是其活性是抑制宿主细胞的IFN应答。流感B-NSl似乎缺少具有与流感A-NSl相似功能的羧基端效应器结构域。B型流感 病毒NSl蛋白的C端结构域(氨基酸位置84-281)主要负责抑制IFN-α / β应答(Dauber et al,J Virol. 2006Dec ；80(23) 11667-77) 根据本发明，B型流感病毒NSl蛋白的羧基端结构域可以被导致没有功能。该结 构域可以被完全或部分删除，以及可以替代或插入氨基酸，并且可以对剩余结构域的功能 性进行测试，如本领域中所述(Dauber et al, J Virol. 2006Dec ；80(23) 11667-77) M基因的本发明突变能够产生如下的B型流感病毒突变体，其表达一种截短的NSl 蛋白(例如小于80个氨基酸)，因此具有干扰素敏感表型。这些突变体能特别用作具有高 安全性和效力的活减毒疫苗株。M基因内的本发明修饰具体地能增加所述复制缺陷型B型流感病毒的生长能 力。例如，含有M1-M86V突变的、表达80个氨基酸的NSl蛋白(NS1-80)的B型流感病 毒可以获得范围在5*105-5*107TCID5Q的滴度，而具有wt Ml蛋白的相似病毒仅能生长到 3*103-3*105TCID5Q。含有短于80个氨基酸，也就是含有14、38、57或64个氨基酸的NSl蛋白 的病毒只能够用M基因内的本发明修饰加以挽救，并生长到1*104-3*108TCID5(I的滴度范围。 M1-M86V突变也可以被引入到另一种不同遗传亚型的B型流感病毒(例如Jiangsu/10/03 样)的主链(backbone)内，以证明特别是NSl截短突变体的提高的生长能力是具有普遍性 的，而不是菌株特异性的。在该主链中，本发明M1-M86V突变产生了一种ANSl-B病毒，其
8中NSl ORF被完全删除，可以在Vero细胞内生长到107-108TCID5(1/ml的高滴度范围。根据本发明的具体实施方案，重组流感病毒可以包括a)位于Ml蛋白氨基酸位置86处的修饰，b)经过修饰的NSl节段，其编码缺少功能性RNA结合域和功能性羧基端结构域的 NSl蛋白，和c)任意地，位于M基因核苷酸位置950处的沉默突变。作为本发明的一个可选择实施方案，重组复制缺陷型B型流感病毒也可以用作表 达异源序列的载体(vehicle)，例如用于表达趋化因子或细胞因子或其片段。更具体地，它可以是一种重组流感病毒，包括a.位于Ml蛋白氨基酸位置86处的修饰，b.经过修饰的NSl节段，其编码缺少功能性RNA结合域和功能性羧基端结构域的 NSl蛋白，和c.插入在NSl基因节段剪接供体位点和剪接受体位点之间的异源序列。任意地，位于M基因核苷酸位置950处的沉默突变。根据本发明的优选实施方案，该异源序列表达细胞因子或趋化因子或其片段或衍 生物。细胞因子是小分泌蛋白，其介导和调节免疫、炎症和造血。最大一群细胞因子是促 进免疫细胞增殖和分化的细胞因子。这群细胞因子包括白介素，它们是由白细胞产生的细 胞因子，和干扰素，它们可以由多种类型的细胞产生。干扰素(IFN)是一族由脊椎动物(包括哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类)的免疫系统 细胞响应抗原(例如细菌、病毒、寄生物和肿瘤细胞)攻击而产生的天然存在糖蛋白。在人 体内有三大类干扰素。I型干扰素包括14个IFN-α亚型和一个IFN-β、ω、Κ和ε同等 型(isoform)。II型干扰素包括IFN-γ，而新近发现的第三类包括IFN-λ，其具有三个不 同的同等型。Thl细胞主要分泌IL-2、IFN_ γ、和TNF-β，而与体液免疫应答有关的Th2细胞分 泌细胞因子，例如IL-4、IL-5、和IL-10。Th2型细胞因子介导针对细胞内病原体的迟发型 超敏反应，并抑制Thl应答。最初衍生自化学引诱物细胞因子的趋化因子实际上包括超过50个成员，代表一 个可诱导的低分子量(其单体形式为6-12kDa)小分泌蛋白家族，在免疫监视和炎症过程中 发挥决定性作用。根据它们在免疫和炎症中的功能，它们可以被分成两类。炎症趋化因子 由许多不同的组织细胞以及移行白细胞响应细菌毒素和炎症细胞因子如IL-1、TNF和干扰 素而产生。它们的主要功能是为宿主防御和在炎症过程中招募白细胞。另一反面，归巢趋 化因子在淋巴组织的限定区域内组成性表达。它们指导淋巴细胞和树突细胞在免疫系统 内的运输(traffic)和归巢。这些趋化因子，例如80々-1，50 -1或5冗，控制淋巴细胞在成 熟、分化、激活中的重定位(relocation)和再循环(recirculation)，并保证它们在次级淋 巴器官内正确归巢。根据本发明，已经显示，生物学活性细胞因子或趋化因子或其衍生物或片段能用 与表达NSl蛋白的ORF不同的可读框稳定而高效地表达。可选择地，天然信号肽之外的其 它前导序列可以和细胞因子或趋化因子融合，这可以进一步支持蛋白质的有效分泌，并显示在体内高效诱导免疫响应。令人惊讶的是，当与成熟细胞因子/趋化因子相应的氨基酸序列通过用作信号肽 的氨基酸序列，例如可以是小鼠IgKappa信号肽的一部分，与NSl蛋白的一部分融合时，趋 化因子和细胞因子也能够被高效表达。根据本发明，异源序列优选地编码白介素2(IL_2)或其片段或衍生物。IL-2包含 分泌信号序列，是一种免疫调节性τ细胞衍生分子，是抗原激活T细胞克隆扩增(clonal expansion)必需的。⑶4+T淋巴细胞分泌IL-2具有多种生物学作用，例如诱导T辅助细胞 和T杀伤细胞的增殖和刺激T细胞产生其它细胞因子。而且，IL-2还能激活B细胞、NK细 胞和巨噬细胞。当从感染非淋巴细胞的重组病毒表达IL-2时，其分泌能显著降低病毒感染 的发病，并修饰免疫应答。还已知IL-2可发挥免疫佐剂的作用。根据本发明，所包含的细胞因子和趋化因子的任何片段或衍生物仍具有生物学活 性，也就是，显示免疫调节活性。可选择地，细胞因子/趋化因子还可以从下组中选出IL_15，GM-CSF, CCL3或 CCL20或其衍生物或片段。可选择地，它还可以是衍生自结核分枝杆菌，例如ESAT-6，的任何表位或免疫调节 区域。可选择地，异源序列还可以包括嵌合蛋白，作为与抗原蛋白或抗原肽融合的细胞 因子或趋化因子或其片段或衍生物。融合可以是直接的，或者通过长度是至少4个氨基酸， 优选地至少5个氨基酸的肽接头序列。例如，根据本发明的接头序列是GGGS或GGGGS。IL-2嵌合蛋白的实例是本领域已知的。例如，可以是IL-2_PE40(其中PE是假单 胞菌外毒素A)、DAB389-IL-2 (其中DAB是白喉毒素)或IL_2Bax (其中Bax是人类来源的 促凋亡蛋白)(Aqeilan R. et al.，Biochem. J.，2003，129-140)。根据本发明，引入到复制缺陷型流感病毒载体内的异源序列的核苷酸序列与其天 然序列显示至少80%的同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性。包括 核苷酸序列在密码子使用方面的任何优化。可选择地，异源序列可以包括B细胞或T细胞表位，例如来自流感病毒血凝素的B 细胞表位(HATB)，例如来自流感病毒血凝素(HA)的A环表位或其部分，或者代表与氨基酸 序列150-159对应的HA免疫显性表位之一的肽(Catonet al.，1982，Cell,417-427)。表位还可以衍生自与黑素瘤相关的内源逆转录病毒(MERV)，如W006/119527所 述。根据一个具体的实施方案，NSl基因节段可以包含一个功能性天然剪接供体和受 体剪接位点，也就是剪接供体和受体位点被保持为天然位点，即核苷酸没有被人工技术所 修饰。基于环境适应或自然病毒株形成，由于流感病毒修饰而自然发生的，剪接位点处 的任何核苷酸修饰均是天然修饰，不在术语合成或人工修饰的范围内。可选择地，剪接供体周围和/或受体位点上游的序列可以被改变。优选地，改变或 修饰可以在NS内含子5’边界的5’处3个核苷酸和/或3’处8个核苷酸内执行，以及在 NS内含子3’边界的5’处100个核苷酸和/或3’处2个核苷酸内执行。这优选地通过引 入合成序列来进行，以便修饰剪接活性。
如果例如异源序列的插入会增大NS内含子大小，可以优选地修饰剪接供体和/或 受体位点的周围序列，以提高剪接效力，从而提高重组NS节段的遗传稳定性。例如，可以进行修饰，改变剪接供体位点周围的序列，以增加与人UlsnRNA的5’端 的同源性，和 / 或含有分支点(branch point) (Plotch et al. 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83 5444-8 ；Nemeroff et al. 1992，Mol Cell Biol. 12 :962_70)和嘧啶串的剪接受体 位点上游序列用提高NS节段剪接的序列替换。为了优化剪接，引入剪接受体位点5’处的优选序列包括套索样共有序列和嘧啶
串ο考虑到病毒载体的稳定性和异源序列的表达速度，重要的是在NS基因内的特定 位置，例如剪接受体位点的直接上游，引入含有套索样共有序列和嘧啶串的合成/修饰序 列。而且，改变套索样共有序列与嘧啶串间的距离以修改NS节段的剪接速度可能是 必需的(Plotch S. and Krug R. ,1986, Proc. Natl. Acad. Sci. ,83,5444-5448 ；Nemeroff Μ. et al.，1992，Mol. Cell. Biol.，962-970)。例如，重组B型流感病毒株可以包括如SEQ ID. No. 1或2所示的氨基酸序列，或者 如SEQ ID Nos. 3-18中任何一个所示的核苷酸序列，或者其具有至少98%序列同一性，优选 地至少99%序列同一性，优选地至少99. 5%序列同一性的衍生物。根据本发明，术语“重组”包括所有的用重组技术，例如反向遗传技术，产生的流感 病毒株。因此，根据本发明的流感病毒株包括M基因内的修饰，但不需要包括与亲本株相比 核苷酸或氨基酸序列内的任何进一步修饰。还包括疫苗组合物，其包括与药学可接受的载体混合的免疫原性诱导有效量的病 毒。组合物中还可以包含佐剂。根据本发明，术语“免疫原性”的意思是病毒能够引发体液或细胞免疫应答，优选 地引发这两者。免疫原性实体(entity)也是抗原性的。当施加给动物，优选地人类时，免 疫原性诱导有效量的病毒引发体液或细胞免疫应答，或者引发两者。疫苗组合物可用于预防性处理流感疾病，包括向需要治疗的人类患者施加免疫原 性诱导有效量的组合物。疫苗组合物可以含有根据本发明的整个B型流感病毒，也可以含有重排 (reassortant)病毒株，其中部分的病毒节段来源于不同的B型流感病毒株，而且节段，特 别地Ml蛋白来源于根据本发明的重组B型流感病毒。本发明M1-M86V突变可以被进一步 引入到任何其它的B型流感病毒株。组合物可以用于预防、管理、中和、治疗和/或改善流感病毒感染的方法或者作为 药剂。当然还包括根据本发明的流感病毒M分子在制造用于治疗流感病毒感染的药剂中的 用途。免疫原性组合物可以包含本发明的活或失活B型流感病毒。病毒可以通过本领域 技术人员众所周知的方法加以失活。通用的方法使用福尔马林和加热进行失活。活免疫原性制剂可能是优选的，因为它具有更高的免疫原性。这类活的重组免疫 原性制剂的产生可以用传统的方法完成，其涉及病毒在细胞培养物或含胚的卵(例如含胚 的鸡蛋)内的繁殖，随后进行纯化。
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术语“药学可接受的”意思是经联邦或州政府管理机构批准的或在美国药典 (U.S.)中列出的。术语“载体”是指与药物组合物(例如免疫原性或疫苗制剂)伴随施加的稀释 剂、佐剂、赋形剂、或载体。盐水溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别 是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面 粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、(乙) 二醇、水、乙醇等等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin编写的〃 Remington' s PharmaceuticalSciences "中有介绍。制剂应当根据给药方式加以选择。具体的制剂还可 以取决于病毒是活的还是失活的。术语佐剂是指能提高对抗原的免疫应答的化合物或混合物。本发明免疫原性制剂的预防和/或治疗效果部分地基于获得或诱发免疫应答(例 如体液免疫应答)。在一个方面中，免疫原性制剂在受试者或其动物模型(例如小鼠、雪貂、 大鼠或犬模型)中诱导可检测血清滴度的针对B型流感病毒抗原的抗体。抗体的血清滴度 可以用本领域技术人员已知的技术加以确定，例如免疫测定，例如ELISA或血凝素抑制试 验。根据本发明，还包括产生病毒的方法，其中该方法包括使用表达本发明流感病 毒M分子的重组表达系统。根据本发明，表达系统可以是任何有用的质粒，例如Hoffmann 等((Hoffmann et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97 :6108_13)所述，或者是根据 EP07450177的线性表达构建体。为了开发重排体和/或表达经过修饰的流感病毒株，可以使用Vero细胞上的 反向遗传系统。该技术是本领域早就众所周知的(Pleschka S. et al. , 1996, J.Virol., 70(6),4188-4192,Neumann and Kawaoka,1999,Adv. Virus Res.，53，265-300，Hoffmann et al. 2000，Proc Natl Acad Sci USA. 97 :6108_13)。用于使用培养基培养病毒的细胞可以是任何细胞，其能够在体外在合成培养基内 生长，并可用于病毒的繁殖。在本发明的范围内，术语“细胞”是指各细胞、组织、器官、昆虫 细胞、鸟类细胞、哺乳类细胞、杂交瘤细胞、原代细胞、连续细胞系和/或遗传工程细胞，例 如表达病毒的重组细胞的培养。这些可以是例如BSC-I细胞、LLC-MK细胞、CV-I细胞、CHO 细胞、COS细胞、鼠科动物细胞、人细胞、HeLa细胞、293细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细 胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、W1-38细胞、MRC-5 细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0、PerC6 (人视网膜细胞)、鸡胚细胞或衍生物、 含胚的卵细胞、含胚的鸡蛋或其衍生物。优选地，细胞系是VERO细胞系。用于产生病毒的培养基可以是来自现有技术的、可用于病毒培养的任何已知培养 基。优选地，培养基是合成培养基。这可以是例如基础培养基，如经修饰Eagle培养基MEM、 极限必需培养基MEM、Dulbecco修饰Eagle培养基D-MEM、D-MEM-F12培养基、William氏 E培养基、RPMI培养基及其类似物和衍生物。这些也可以是专业细胞培养和病毒生长培养 基，如 VP-SFM、OptiPro SFM, AIM V .培养基、HyQ SFM4MegaVir , EX-CELL VeroSFM、 EPISERF、ProVero、任何293或CHO培养基及其类似物和衍生物。这些培养基可以补充任何 先现有技术已知的、可用于细胞和病毒培养的添加剂，例如动物血清及其组分或类似物、氨 基酸、生长因子、激素、缓冲液、微量元素、胰蛋白酶、丙酮酸钠、维生素、L-谷氨酰胺和生物学缓冲液。优选的培养基是补充了 L-谷氨酰胺和胰蛋白酶的OptiPRO SFM。使用本发明的M基因修饰，在比较未修饰和改良M基因的病毒滴度(TCID5tl)时，B 型流感病毒NSl截短突变体的生长速度可以增加至少大约100-1000倍，如NS1-38病毒已 证明的。对于表达分别含有14、57或80个氨基酸的NSl蛋白的B型流感病毒，M基因中的 突变是产生这些病毒绝对需要的。这些病毒可以生长到大约IO6-IO8TCID5ci的滴度。本发明进一步的实施方案是编码本发明流感病毒M基因的分离的核酸和/或含有 该经修饰M基因的重组B型流感病毒。进一步，用于制备所述核酸的方法包括将核苷酸序列引入到编码本发明M分子的 载体内。如果使用DNA载体，所述载体是反义(minus sense)流感RNA的转录系统。例如， 它可以是如 Hoffmann et al. ,2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97 :6108_13 使用的载体。通过参考如下的实施例可以对前述介绍有更完全的理解。然而，这些实施例仅仅 代表实践本发明一个或多个实施方案的方法，不应看作对本发明的范围具有限制。
实施例实施例1 表达截短NSl蛋白、用作复制缺陷型减毒活流感疫苗的B型流感病毒产生了 一种反向遗传系统，用于构建适合Vero的B型流感病毒株(B/ Vienna/33/06 亚型为 B/Malaysia/2506/04)，作为 B/Victoria/2/87 谱系的一个 代表(Hoffmann et. al 2000，PNAS 97(11) :6108_13)。HA 和 NA 从流感病毒 B/ ThUringen/02/06(B/JiangSu/10/03样)克隆。通过在Ml蛋白内引入编码突变(在氨基 酸位置86将甲硫氨酸变为缬氨酸)，可以获得表达截短形式的，14、38、57和80个氨基酸的 NSl蛋白的流感病毒突变体，并分别命名为B/MalaysiaNSl-14、NSl-38、NSl-57或NS1-80。 NSl的翻译被两个连续的框内(in frame)终止密码子终止，位于终止密码子的下游直到 NEP剪接信号的非翻译部分被删除(图la)。由于NS基因的不同长度，含有不同长度NSl 蛋白的病毒可以通过RT-PCR根据它们的大小加以区分(图2)。所有已产生的突变体均可 在干扰素缺陷型Vero细胞上复制到高滴度(图3a)，但在干扰素有效的(competent) A549 细胞上被减弱(图3b)。M基因内的本发明修饰能特异地增加所述复制缺陷型B型流感病毒的生长能 力。例如，在转染后6天进行分析时，含有M1-M86V突变的、表达80个氨基酸的NSl蛋白 (NS1-80)的B型流感病毒生长到大约5. 62*104TCID5Q的滴度，相比之下，在Ml中不含任何 修饰的相似病毒的滴度为大约1. 33*104TCID50(图4a)。在没有适应性Ml突变时，表达38 个氨基酸的NSl蛋白(NS1-38)的B型流感病毒根本不能被挽救，但是当引入了 M1-M86V突 变时，可生长到大约3. 16*102 TCID50的平均滴度(图4a)。根据滴度显示，这种作用在转染 后第二次传代中甚至更加显著(表1)。用表达分别为14或57个氨基酸的B型流感病毒 观察到相同的挽救效率，其仅在存在M1-M86V突变时被挽救(数据未显示)。在Vero细胞 上的进一步适应性传代(adaptive passage)导致所有NSl突变体产生6. 5-8. 51og TCID50 的高滴度范围，这是有效产生疫苗所需要的(图3a)。本发明突变对wt NSl病毒的生长没 有影响或者仅有微弱的影响。在转染6天(图4a)和转染后第二次传代中(表1)，含有未 修饰M基因的wt NSlB型流感病毒甚至生长到比含有M1-M86V突变的相似病毒略微更高的滴度。这可以解释为不同传代之间的生长差异，如转染后第一次传代的生长所证明的(比 较而言，具有wt M基因的为1.78*107 TCID5tl，具有M1-M86V的为2. 82*107TCID5Q，它们均含 有wt NS基因)。表1 具有wt、NS80或NS38NS1蛋白与wt或M1-M86V M基因的组合的B型流感病毒在 转染后第二次传代中于感染后4天的病毒滴度(TCID50)。因此，只有该新型突变能够产生表达短NSl蛋白(即包含少于N端头80个氨基 酸)的B型流感病毒突变体，其具有无功能性NS1，因此具有干扰素敏感表型。因此，这些突 变体能用作疫苗株。该突变在先前没有介绍，在NIBSC序列数据库中也没有发现。图5显 示了 M基因原始B/Malaysia/2506/04样拭子(swab)与M1-M86V基因和基因库中公开的其 它序列的序列比较。实施例2 :M1蛋白中的本发明突变(M86V)能够在不同B型流感病毒谱系中在Vero 细胞上产生具有截短NSl蛋白的B型流感病毒为了测试M1-M86V突变在其它B型流感病毒株中的影响，产生了一个反向遗传系 统，用于产生流感病毒 B/Thiiringen/02/06 (B/Jiangsu/10/03 样)，作为 B/Yamagata/16/88 谱系的一个代表，并在Ml蛋白内引入所述突变(M86V)。为了遵循WHO关于北半球 2008/2009季流感疫苗株的推荐，使用B/Florida/04/06样病毒的HA和NA。获得了表达截 短形式的、38和80个氨基酸的NSl蛋白的B型流感突变体或者完全删除NSl ORF ( Δ NS1-B) 的突变体(图lb)，其中NS2/NEP被表达作为单顺反子RNA，并分别命名为B/Florida NS1-38、NS1-80 或 ANS1-B。与 B/Victoria/2/87 谱系的一个代表，B/Malaysia 的突变体 的情况相同，M1-M86V突变对Yamagata谱系的一个代表，B/Florida的NS1-80和NSl-wt病 毒的挽救效力仅有很小的影响(图4b)。这可以被如下地证明，即与含有wtM基因的突变体 相比，转染后5天的滴度有略微的增加(图4b)。含有M1-M86V突变的NS1-38突变体的病 毒滴度比wt Ml类似物高大约41og。由于M1-M86V突变，我们能够挽救Δ NSl-B病毒，在转 染后5天使滴度到达几乎41og(图4b)。为了证明ANSl-B病毒的复制缺陷表型，我们检查了它在IFN缺陷型Vero细胞 (图6a)和IFN有效型A549细胞(图6b)上生长的能力，并与相应的wt病毒进行比较。两 种病毒在Vero细胞上显示相当的生长动力学，达到107-108TCID5(1/ml的滴度范围。ANSl-B 病毒的复制在IFN有效型A549细胞中被完全限制，没有展示超过检出极限2xl02TCID5(l/ml 的生长，而NSl-wt病毒复制到了 3. 15xl08TCID50/ml的高滴度。突变病毒NS1-80和NS1-38 显示中间的复制能力(数据未显示)。
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这些数据显示，适应性Ml突变不仅在一种病毒株内具有生长优化效果，而且在其 它流感B谱系中似乎也有效。而且，数据证明，此突变对于挽救其中NSl ORF被完全删除的 ANSl-B病毒，使之在Vero细胞内生长到高滴度是至关重要的。因此，这是一个广泛适用 的用于产生复制缺陷型B型流感病毒的概念，其中减毒机制是基于NSl (主要的干扰素拮抗 剂)的除去。实施例3 使用双顺反子表达策略从NS基因表达人白介素2的B型流感病毒载体， 作为具有改善的免疫原性(特别是在老年人中)的潜在减毒活流感疫苗分别在B型流感病毒NSl蛋白的氨基酸位置38、80、104或145之后插入重叠的终 止-起始密码子盒(TAATG)，之后是人IL2的编码序列。此外，用一段29个核苷酸的合成 序列替换IL2终止密码子和NS2剪接受体位点(EP7450176. 8)之间的部分，该合成序列包 含套索样共有序列和之后的优化剪接位点，一个20个碱基的嘧啶串节段(优化剪接)(图 9a)。通过在Ml蛋白内引入本发明突变(M86V)，我们成功地挽救了流感B/ Thuringen/02/06 (B/Jiangsu/10/03样)主链内的B型流感病毒/NS1-38IL2。没有本发明 Ml蛋白内的修饰，病毒不被挽救。尽管B/NS1-38IL2的生长比“空载体”B/NS1-38略低，但 也实现了超过61ogl0TCID50/ml的滴度(表2)。将此储备物(stock)在Vero细胞上进一 步传代5次，以检查遗传稳定性。没有发现删除突变体的出现，因为存在NS基因预期大小 的RT-PCR条带，而没有出现潜在反映删除突变体的较小PCR条带(图10)。用B/NS1-38IL2感染的Vero细胞分泌高水平的超过2. 5 μ g/ml的IL2，而在未感 染细胞(模拟)、用B/NS1-38或B/NSl-wt感染的细胞内则没有可检测的IL2水平(表2)。 这些载体能用作具有升高免疫原性(特别是在老年人中)的活流感疫苗，这已经为A型流 感所证明(Ferko, Kittel et al 2006)。表2 指定病·I在Vero细胞内的复制和人IL2的表达水平
病毒滴度人 IL2 ELISA
[TCID50/ml][pg/ml]
B/NSl-wt2. 88E+07< 19
B/NS1-381. 78E+08< 19
B/NS1-38IL22，31E+062687
模拟-< 19
我们研究了全部3个实施例中所产生病毒的免疫原性。从这些
论，本发明的M1-M86V突变对所构建病毒的免疫原性没有负面影响，例如通过相应A型流感 病毒的相当免疫原性数据所证明的。
权利要求
一种B型流感病毒M基因，其包含M基因核苷酸位置265 294任何一个处至少一个核苷酸的修饰，优选核苷酸位置277 285任何一个处至少一个核苷酸的修饰，更优选核苷酸位置280 282任何一个处至少一个核苷酸的修饰。
2.依照权利要求1的B型流感病毒M基因，其在位置280-282处包含核苷酸GTG、GTA、 GTC、GTT、⑶G、GUA、⑶C、GUU。
3.—种B型流感病毒M基因，其包含至少一处核苷酸修饰，其导致Ml蛋白氨基酸位置 82-90任何一个处，优选氨基酸位置85-87任何一个处，优选氨基酸位置86处的至少一处氨 基酸替代。
4.依照权利要求1-3中任一项的B型流感病毒M基因，其中替代所用的氨基酸是非极 性疏水氨基酸。
5.依照权利要求1-4中任一项的B型流感病毒M基因，其中所述氨基酸是缬氨酸。
6.一种重组B型流感病毒，其包含权利要求1-5中任一项的流感病毒M基因。
7.依照权利要求6的重组病毒，其中所述病毒是重排病毒。
8.依照权利要求6或7的重组流感病毒，其中所述病毒是减毒的或复制缺陷的，优选是 完全复制缺陷的。
9.依照权利要求6-8中任一项的重组流感病毒，其中所述病毒包含NS基因内的修饰。
10.依照权利要求6-9中任一项的重组流感病毒，其中它包含经修饰的NSl节段，其编 码缺少功能性RNA结合域和功能性羧基端结构域的NSl蛋白。
11.一种重组流感病毒，其包含a.Ml蛋白氨基酸位置86处的修饰，b.经修饰的NSl节段，其编码缺少功能性RNA结合域和功能性羧基端结构域的NSl蛋 白，和c.任意地，M基因核苷酸位置950处的沉默突变。
12.—种重组流感病毒，其包含a.Ml蛋白氨基酸位置86处的修饰，b.经修饰的NSl节段，其编码缺少功能性RNA结合域和功能性羧基端结构域的NSl蛋 白，和c.插入在所述NSl基因节段剪接供体位点和剪接受体位点之间的异源序列，d.任意地，M基因核苷酸位置950处的沉默突变。
13.一种重组B型流感病毒，其包含如SEQ ID No. 3-18中任一项所示的核苷酸序列。
14.一种重组B型流感病毒，其包含如SEQ ID No. 1或2所示的氨基酸序列或其具有至 少98 %序列同一性的衍生物。
15.一种疫苗组合物，其包含与药学可接受载体混合的免疫原性诱导有效量的权利要 求6-14中任一项的病毒。
16.一种用于预防性处理流感的方法，包括向需要治疗的人类患者施用免疫学诱导有 效量的权利要求15的组合物。
17.一种制备依照权利要求6-14中任一项的病毒的方法，其中该方法包括在反向遗传 系统中引入表达依照权利要求1-5中任一项的流感病毒M分子的重组载体。
18.一种提高复制缺陷型B型流感病毒的生长速率的方法，其中所述B型流感病毒含有2依照权利要求1-5中任一项的M基因。
19.一种分离的核酸，其编码权利要求1-5中任一项的流感病毒M基因。
20.一种用于制备依照权利要求19的核酸的方法，该方法包括将核苷酸序列引入编码 依照权利要求1-5中任一项的M分子的核酸中。
21.权利要求1-5中任一项的流感病毒M分子，用作治疗或预防流感病毒感染的药剂。
22.权利要求1-5中任一项的流感病毒M分子在制造用于治疗流感病毒感染的药剂中 的用途。
全文摘要
本发明提供了在M基因N端附近，更具体地，在M基因核苷酸位置265-294任何一个处具有至少一个核苷酸的修饰的B型流感病毒M基因，以及包含这种经修饰M基因的B型流感病毒。进一步，公开了它用于制备疫苗的用途及用于制备所述经修饰流感病毒的方法。
文档编号C07K14/11GK101903043SQ200880122161
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月22日 优先权日2007年12月21日
发明者克里斯琴·基特尔, 妮娜·雷斯尼格 申请人:阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司