受损伤口愈合的组合物和治疗的制作方法

专利名称：受损伤口愈合的组合物和治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及间隙连接并涉及伤口和伤口愈合，尤其是涉及并不以预期的速率愈合 的伤口，如延迟愈合伤口、不完全愈合伤口、慢性伤口、以及裂开性伤口。
背景技术：
以下包括可以有利于理解本发明的信息。这不是承认，这里提供的任何信息是现 有技术，或与目前描述或要求保护的发明有关，或明确地或暗示性地提及的任何出版物或 文件是现有技术。在人类和其它哺乳动物中，伤口损伤会触发有机物的复杂级联的细胞和生化事 件，其在大多数情况下将导致愈合的伤口。理想愈合的伤口是这样的伤口，其在细胞、组织、 器官和生物体水平上恢复正常解剖结构、功能、以及外观。伤口愈合，不管是通过创伤、微 生物或异物所引发，经由包括多个重叠阶段的复杂过程进行，该重叠阶段包括发炎、上皮形 成、血管生成以及基质沉积。通常，这些过程导致成熟伤口和一定程度的瘢痕形成。虽然 发炎和修复通常沿着规定的过程发生，但过程的敏感性取决于各种伤口愈合调节因子的平 衡，包括例如，调节细胞因子和生长因子的复杂网络。间隙连接是细胞膜结构，该结构可以促进直接的细胞间通信。间隙连接通道由两 个连接子(半通道)形成，每个连接子由六个连接蛋白亚单位构成。每个六聚连接子对接 (停靠，dock)于在反相膜中的连接子以形成单间隙连接。据报道，间隙连接通道存在于整 个身体中。组织如角膜上皮，例如，具有六至八个细胞层，还使用基底层中的连接蛋白43和 从基底至中翼细胞层的连接蛋白沈在不同层中表达不同的间隙连接通道。通常，连接蛋白 是一种蛋白质家族，通常按照它们的分子量加以命名或在系统发育的基础上分为α、β、以 及Y亚类。已鉴定了至少20种人和19种鼠同种型。据报道，不同的组织和细胞类型具有 连接蛋白表达的特征模式并且已表明在损伤或移植以后组织如角膜会改变连接蛋白表达 模式(Qui, C. et al.，(2003)Current Biology, 13 :1967-1703 ；Brander et al.，(2004)， J.Invest Dermatol. 122 :1310-20)。据报道，异常连接蛋白功能可能与某些疾病状态(例如，心脏病)有关(A.C.de Carvalho, et al.，(1994)J Cardiovasc Electrophysiol 5:686)。在某些连接蛋白 中，通过添加外源性药剂可以诱导周转和运输性能的改变，其中外源性药剂可以影响间 隙连接细胞间通讯的水平(Darrow et al. (1995)Circ Res 76 381 ；Lin et al. (2001) J Cell Bioll54(4) :815)。还已报道反义技术用于调节与病毒、真菌以及代谢性疾 病有关的基因的表达。参见，例如，美国专利第5，166，195号(HIV的寡核苷酸抑制剂 (oligonucleotide inhibitors of HIV))和美国专利第 5，004，810 号(寡聚体，用于杂 交于单纯抱疫病毒 Vmw65 mRNA 禾口 φ制复制(oligomers for hybridizing to herpes simplex virus Vmw65mRNA and inhibiting replication))。还参见授予 Becker 禾口 Green的美国专利第7，098，190号(至连接蛋白的包含反义核苷酸的制剂(formulations comprising antisense nucleotides to connexins))。还已报道了间隙连接禾口半通道的肽抑制剂。参见例如 Berthoud et al. (2000)Am J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279 :L619_L622 ；Evans, W. H. and Boitano, S.Biochem. Soc. Trans. 29 :606-612, 以及 De Vriese A. S.，et al. (2001) Kidney Int. 61 :177_185。还参见 Green 和 Becker， W02006/134494( "Anti-connexin compounds and methods of use，，)。尽管在理解成为伤口愈合过程基础的原理方面有进展，但是在用于伤口护理的合 适的治疗选项方面仍然存在显著的未满足的需要，其中所述伤口包括并不以预期的速率愈 合的伤口，如延迟愈合伤口、不完全愈合伤口、以及慢性伤口。本文描述并要求保护这样的 治疗性组合物和治疗。

发明内容
本文描述和要求保护的发明具有许多特征和实施方式，其包括但不限于在本发明 内容中陈述或描述或提及的那些特征和实施方式。它并不旨在包括一切并且本文描述和要 求保护的发明并不限于或受限于在本发明内容中确定的特点或实施方式，其包括的仅用于 说明目的而不是限制的目的。本发明披露内容的方面和实施方式一般涉及治疗受治疗者的并不以预期的速率 愈合的伤口如缓慢愈合伤口、延迟愈合伤口、不完全愈合伤口、裂开性伤口、以及慢性伤口 的方法，该方法包括将包含间隙连接调节剂(间隙连接调制剂，gap junction modulating agent)的组合物或配方给予伤口。连接蛋白43间隙连接调节剂是优选的。在一种实施方式中，本发明涉及一种治疗具有慢性伤口的受治疗者的方法，该方 法包括将包含有效量的间隙连接调节剂的组合物给予伤口。连接蛋白43间隙连接调节剂 是优选的。在一种实施方式中，慢性伤口是压迫性溃疡(压力性溃疡)。在一种实施方式 中，慢性伤口是褥疮性溃疡(褥疮)。在另一种实施方式中，慢性伤口是动脉性溃疡。在另 一种实施方式中，慢性伤口是静脉性溃疡(静脉曲张性溃疡)。在另一种实施方式中，慢性 伤口是静脉停滞性溃疡(静脉淤滞性溃疡)。在另一种实施方式中，慢性伤口是血管炎性溃 疡。在又一种实施方式中，慢性伤口是糖尿病性溃疡，如糖尿病足溃疡。在一种进一步的实 施方式中，慢性伤口是创伤性溃疡或烧伤性溃疡。在另一种实施方式中，慢性伤口是感染性 溃疡，以及在另一种实施方式中，慢性伤口的特点在于与坏疽性脓皮病有关的溃疡。在又一 种进一步的实施方式中，慢性伤口是混合性溃疡。在一种实施方式中，伤口是持续性上皮缺 损。在一种实施方式中，本发明涉及一种治疗具有裂开性伤口的受治疗者的方法，该 方法包括将包含有效量的间隙连接调节剂，优选连接蛋白43间隙连接调节剂的组合物给 予伤口。在一种实施方式中，受治疗者是哺乳动物。在另一种实施方式中，受治疗者是人。 在另一种实施方式中，受治疗者是糖尿病病人。在一个方面，受治疗者是1型糖尿病病人。 在另一个方面，受治疗者是2型糖尿病病人。在另一种实施方式中，哺乳动物是运动动物或宠物。在一个方面，运动动物是马或 狗。在另一个方面，宠物是狗或猫。在一种实施方式中，本发明涉及一种治疗具有延迟愈合伤口的受治疗者的方法， 该方法包括将有效量的间隙连接调节剂给予伤口。在另一种实施方式中，本发明涉及一种治疗具有不完全愈合伤口的受治疗者的方法，该方法包括将包含有效量的间隙连接调节剂 的组合物给予伤口。连接蛋白43间隙连接调节剂是优选的。根据另一个方面，提供了持续给予伤口一定量的间隙连接调节剂一段持续时间。 进一步根据此方面，可以促进并不以预期的速率愈合的伤口的伤口愈合，其中伤口包括延 迟愈合伤口、受损的愈合伤口(impaired healing wound)、以及慢性伤口。在一种实施方式 中，伤口是糖尿病性溃疡、糖尿病足溃疡、血管炎性溃疡(脉管炎性溃疡)、静脉性溃疡、静 脉停滞性溃疡、动脉性溃疡、压迫性溃疡、褥疮性溃疡、感染性溃疡、创伤引起的溃疡、烧伤 性溃疡、与坏疽性脓皮病有关的溃疡、或混合性一种或多种溃疡。本发明包括重复施加。优 选的是重复施加直到看到伤口闭合正在进行，接着在伤口愈合再次变得停顿或延迟的情况 下重复施加(或多次施加)。根据本发明的其它方面，可以促进伤口再上皮化和/或肉芽组织的形成。在另一个方面，本发明提供了一种在具有并不以预期速率愈合的伤口的受治疗者 中促进伤口愈合的方法，其中伤口包括延迟愈合伤口或不完全愈合伤口或慢性伤口，上述 方法包括给予抗连接蛋白43肽和抗连接蛋白31. 1肽。本发明包括重复施加。本发明的一个可替换方面涉及一种促进皮肤伤口的上皮再形成的方法，该方法包 括将有效量的间隙连接调节剂，例如，抗连接蛋白肽给予具有并不以预期速率愈合的伤口 (包括，例如，延迟愈合或不完全愈合伤口或慢性伤口)的受治疗者以促进上皮再形成。抗 连接蛋白肽可以靶向选自连接蛋白26、连接蛋白30、连接蛋白31. 1以及连接蛋白43的连 接蛋白。连接蛋白43是目前优选的靶。在另一个进一步的方面，本发明提供了一种在具有并不以预期速率愈合的伤口 (包括，例如，延迟愈合伤口或不完全愈合伤口或慢性伤口)的受治疗者中促进伤口愈合的 方法，该方法包括持续给予间隙连接调节剂，该间隙连接调节剂可有效调节上皮基底细胞 分裂和生长。在另一个进一步的方面，本发明提供了一种在具有并不以预期速率愈合的伤 口(包括，例如，延迟愈合伤口或不完全愈合伤口或慢性伤口)的受治疗者中促进伤口愈合 的方法，该方法包括持续给予间隙连接调节剂，该间隙连接调节剂可有效调节外层角蛋白 分泌。在一种实施方式中，可有效调节上皮基底细胞分裂或生长的间隙连接调节剂(例如， 抗连接蛋白肽)是抗连接蛋白沈肽或抗连接蛋白43肽或它们的混合物。根据一种可替换 的实施方式，所给予的用来调节外层角质化的间隙连接调节剂(例如，抗连接蛋白肽)是抗 连接蛋白31. 1肽。本发明包括重复施加。根据另一个方面，本发明提供了一种在具有并不以预期速率愈合的伤口(包括延 迟愈合伤口、不完全愈合伤口、以及慢性伤口)的受治疗者中增加伤口愈合或闭合速率的 方法，该方法包括将有效量的间隙连接调节剂给予受治疗者。在一个方面，间隙连接调节剂可以全部或部分地防止或减少细胞间通讯分子穿过 间隙连接通道的流动。在一个方面，通过闭合间隙连接(全部或部分地)，间隙连接调节剂 可以抑制细胞间通讯。在另一个方面，间隙连接调节剂可以通过半通道对接(半通道停靠， hemichannel docking)全部或部分地防止或减少间隙连接的形成。在另一个方面，间隙连 接调节剂可以诱导半通道或间隙连接的全部或部分闭合。在又一个方面，间隙连接调节剂 可以全部或部分地阻断或抑制半通道开放(敞开)。在一个方面，间隙连接调节剂可以全部 或部分地减少或防止半通道或间隙连接的开放。在一个方面，间隙连接调节剂可以防止或减少半通道或间隙连接的活性或功能。如本文描述的调节连接蛋白43间隙连接和半通道 的连接蛋白43间隙连接调节剂是优选的。在一个方面，本发明提供了一种包含一种或多种间隙连接调节剂的药物组合物。 优选地，该药物组合物进一步包含药用载体、稀释剂或赋形剂。例如，本发明包括药物组合 物，该药物组合物包含(a)治疗有效量的药用连接蛋白43间隙连接调节剂和(b)药用载体 或稀释剂。本发明还涉及间隙连接调节剂与敷料、绷带、基质以及覆盖物一起的应用。在一个 方面，本发明包括一种合成或天然存在的伤口愈合基质，该基质包含间隙连接调节剂，优选 连接蛋白43间隙连接调节剂。在某些实施方式中，间隙连接调节剂是连接蛋白43间隙连 接调节剂，例如，抗连接蛋白43肽或拟肽(肽模拟物，ρ印tidomimetic)。它们还涉及在重复施加中间隙连接调节剂单独地或与敷料、绷带、基质以及覆盖 物一起的应用，例如，每周一次直到愈合完成或如所期望的。在一个方面，间隙连接调节剂是肽化合物。在一个方面，肽化合物是拟肽、拟肽、抗 体或其抗原结合片段。在一个方面，抗原结合片段是F(V)、Fab、Fab，或F(ab，)2抗连接蛋 白43抗体片段。在一个方面，抗体是嵌合或人源化抗体。在一个方面，抗体片段是嵌合或 人源化抗体片段。在另一个方面，间隙连接调节剂是间隙连接磷酸化诱导剂，优选连接蛋白 43间隙连接磷酸化化合物。在本发明的一个方面，间隙连接调节剂被配制成用于局部给予。在本发明的一个 方面，间隙连接调节剂被配制成凝胶。在又一个方面，间隙连接调节剂被配制成用于缓慢或 延长释放。本发明包括重复施加间隙连接调节剂。连接蛋白43间隙连接调节剂是优选的。
具体实施例方式并不以预期速率愈合的伤口，包括缓慢愈合伤口、延迟愈合伤口、不完全愈合伤 口、裂开性伤口、以及慢性伤口，经常导致感染并且可以导致截肢或死亡。通过间隙连接的 细胞间通信在伤口愈合中发挥关键作用。已发现，使用某些化合物(包括本文描述或提及 的那些化合物)可以阻断、抑制、或改变细胞通讯，其可以促进并不以预期速率愈合的伤口 的闭合和愈合，其中伤口包括缓慢愈合伤口、延迟愈合伤口、不完全愈合伤口、裂开性伤口、 以及慢性伤口。对于所有的用途，连接蛋白43间隙连接调节剂是优选的。^X如在本文中所使用的，“障碍”是将受益于一种药剂的任何障碍、疾病、或病症，其 中所述药剂促进伤口愈合和/或减少瘢痕形成。例如，包括与神经病性、缺血性、和微血管 病变有关的伤口相关异常；骨区[尾骨(骶骨的)、髋关节(转节的)、臀(坐骨的)、或足 跟]上的压力；再灌注损伤；以及与瓣膜反流病因和相关病症有关的病症。如在本文中所使用的，“受治疗者”是指任何哺乳动物，包括人、家畜和农场动物、 以及动物园里的动物、运动动物、或宠物，如狗、马、猫、羊、猪、牛等。本文中优选的哺乳动物 是人，包括成年人、儿童、以及老年人。如在本文中所使用的，“预防”是指全部或部分地预防、或改善或控制。如在本文中所使用的，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防措施。如在本文中所使用的，关于本发明的化合物或组合物的“治疗有效量”是指足以诱
7导期望的生物、药物、或治疗结果的量。所述结果可以是疾病或障碍或病症的体征、症状、或 起因的缓和，或生物系统的任何其它期望的改变。在本发明中，所述结果将涉及全部或部分 地促进和/或改善伤口愈合，包括伤口愈合和伤口闭合的速率。其它益处包括全部或部分 地减少肿胀、发炎和/或瘢痕形成。如在本文中所使用的，“同时”用来指同时给予一种或多种间隙连接调节剂，例如， 肽或阻断剂，而术语“组合(联合)”用来指如果它们不是同时或以物理组合给予的话，那么 它们在一定时间范围内“依次”给予，使得它们均可用于治疗作用。因此，“依次”给予可以 允许在给予一种药剂以后的数分钟(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、30)或数小时、数天、 数周或数月内给予另一种药剂，只要一种或多种间隙连接调节剂同时以有效量存在。成分 的给予之间的时间延迟将取决于成分的确切性质、它们之间的相互作用、以及它们各自的 半寿期而变化。术语“拟肽”和“模拟物”包括天然存在的和合成的化合物，这些化合物可以具有 与它们模拟的蛋白区基本上相同的结构和功能特性。在连接蛋白的情况下，这些化合物可 以模拟，例如，涉及连接子-连接子对接(停靠)和细胞间通道形成的相反连接蛋白的细胞 外环、和/或半通道连接蛋白的细胞外环。如在本文中所使用的，术语“肽类似物”是指这样的化合物，其性能类似于模板 肽的性能并且可以是非肽类药物。包括基于肽的化合物的“拟肽”(还称作肽模拟物)， 还包括基于上述非肽的化合物如肽类似物。结构上类似于治疗上有用的肽的拟肽可以用 来产生相当或增强的治疗或预防效果。通常，拟肽是范例多肽(即，具有生物或药理功能 或活性的多肽)的结构或功能模拟物(例如相同或相似)，但还可以具有可选地被选自 由例如-CH2NH-、-CH2S-, -CH2-CH2-, -CH = CH-(顺式和反式)、-coch2-、-CH(OH)CH2-,以 及-CH2SO-组成的组中的键取代的一个或多个肽键。模拟物可以完全由天然氨基酸、合成 化合物、氨基酸的非天然类似物构成，或是部分天然肽氨基酸和氨基酸的部分非天然类似 物的嵌合分子。模拟物还可以包含任何量的天然氨基酸保守替代，只要这样的替代同样并 不显著改变模拟活性。在连接蛋白的情况下，这些模拟物可以模拟，例如，涉及连接子-连 接子对接(停靠)和细胞间通道形成的相反连接蛋白的细胞外环。例如，模拟组合物可以 用作间隙连接调节剂，如果它能够向下调节连接子的生物作用或活性，如，例如，预防连接 子的对接(停靠)以形成间隙连接介导的细胞间通信，或预防连接子的开放以将细胞质暴 露于细胞外环境。拟肽包括本文描述的那些拟肽、以及如本领域可以已知的那些拟肽，不管 是现在已知或以后开发的。通常，如在本文中以其不同形式所使用的，具有间隙连接活性的术语“调节剂”和 “调节”是指全部或部分地抑制间隙连接或半通道的作用或活性并且可以起间隙连接调节 剂的作用。如在本文中所使用的，术语“蛋白质”是指经由肽键连接的两种或更多种单独氨基 酸(不论是否是天然存在的)的任何聚合物，如当结合于一个氨基酸(或氨基酸残基)的 α-碳的羧酸基团的羧基碳原子变成共价结合于与相邻氨基酸的α-碳结合的氨基基团的 氨基氮原子时所发生的。这些肽结合键、以及构成它们的原子(即，α -碳原子、羧基碳原子 (以及它们的取代基氧原子)、以及氨基氮原子(和它们的取代基氢原子))形成蛋白质的 “多肽主链”。此外，如在本文中所使用的，术语“蛋白质”理解成包括术语“多肽”和“肽”(在本文中其有时可以交替使用)。类似地，在本文中，除非另有说明，否则蛋白质片段、类似物、 衍生物、以及变体可以称作“蛋白质”，并且将被视为“蛋白质”。术语蛋白质的“片断”是指 包含少于蛋白质的所有氨基酸残基的多肽。蛋白质的“结构域”也是片断，并且包含经常需 要以赋予活性或功能的蛋白质的氨基酸残基。术语“伤口敷料”是指用于局部施加至伤口的敷料并且排除适合于全身给药的组 合物。例如，可以将一种或多种间隙连接调节剂分散在伤口接触材料如编织或非编织纺织 材料的固体片中或之上，或可以分散在泡沫如聚氨酯泡沫的层中，或分散在水凝胶如聚氨 酯水凝胶、聚丙烯酸水凝胶、明胶、羧甲基纤维素、果胶、藻酸盐、和/或透明质酸酯水凝胶 中，例如分散在凝胶或软膏中。在某些实施方式中，将一种或多种间隙连接调节剂分散在生 物可降解片材料中或之上，其中上述片材料提供了活性组分持续释放到伤口中，例如冻干 胶原、冻干胶原/藻酸盐混合物(可从来自Johnson & Johnson Medical Limited的注册商 标FIBRAC0L获得)或冻干胶原/氧化再生纤维素(可从来自Johnson & Johnson Medical Limited的注册商标PR0M0GRAN获得)的片。如在本文中所使用的，“伤口促进基质，，包括例如，合成或天然存在的基质如胶原， 非细胞基质，交联生物支架分子，基于组织的生物工程结构框架，生物工程生物假体，以及 其它植入结构如例如，可用于促进伤口愈合的适合于细胞浸润和增殖的血管移植物。另 外合适的生物基质材料可以包括化学修饰的胶原组织以减少抗原性和免疫原性。其它合 适的实例包括用于伤口敷料的胶原片，无抗原或抗原减少的非细胞基质(Wilson G J et al. (1990) Trans Am Soc ArtifIntern 36 :340-343)，或其它生物基质，其已被设计成减少 对异种移植材料的抗原反应。可用于促进伤口愈合的其它基质可以包括例如，经处理的牛 心包蛋白，其包含不溶性胶原和弹性蛋白(Courtman Dff et al. (1994) J Biomed Mater Res 28 =655-666)，以及其它非细胞组织，其可以用来为宿主细胞迁移提供天然微环境以加速组 织再生(Malone J M et al. (1984) J Vasc Surg 1 :181-91)。本发明预期了包含本文描述 的一种或多种抗连接蛋白肽或拟肽(包括抗连接蛋白43肽和拟肽)的合成或天然基质。如在本文中所使用的，术语“伤口 ”包括对任何组织的损伤，包括，例如，延迟或难 以愈合的伤口、以及慢性伤口。伤口的实例可以包括开放性伤口和闭合性伤口。术语“伤 口”还可以包括例如，以不同方式引发的并具有不同特点的对皮肤和皮下组织的损伤(例 如，来自长期卧床休息的褥疮以及由创伤诱导的伤口)。伤口可以取决于伤口深度分为4个 等级之一 i)I级限于上皮的伤口 ；ii)II级延伸到真皮中的伤口 ；iii)III级延伸到皮 下组织中的伤口 ；以及iv) IV级(或全层伤口)其中骨被暴露的伤口(例如，骨压点如更 大的转节或骶骨)。术语“II度创面(部分厚度伤口，部分皮质受损伤口，partial thickness wound) ”是指包括I-III级的伤口 ；II度创面的实例包括褥疮、静脉停滞性溃疡、以及糖尿 病性溃疡。本发明预期治疗并不以预期速率愈合的类型的所有伤口，包括延迟愈合伤口、不 完全愈合伤口、以及慢性伤口。“并不以预期的速率愈合的伤口”是指对任何组织的损伤，包括延迟或难以愈合的 伤口(包括延迟或不完全愈合伤口)、以及慢性伤口。并不以预期速率愈合的伤口的实例包 括溃疡如糖尿病性溃疡、糖尿病足溃疡、血管炎性溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡、静脉停滞 性溃疡、烧伤性溃疡、感染性溃疡、创伤引起的溃疡、压迫性溃疡、褥疮性溃疡、与坏疽性脓皮病有关的溃疡、以及混合性溃疡。其它并不以预期速率愈合的伤口包括裂开性伤口。如在本文中所使用的，延迟或难以愈合的伤口可以包括，例如，至少部分地特征在 于以下的伤口 1)延长的发炎期，幻缓慢形成细胞外基质，和/或幻降低速率的上皮形成 或闭合。术语“慢性伤口，，是指未愈合的伤口。例如，在3个月内未愈合的伤口被认为是慢 性的。慢性伤口包括，例如，压迫性溃疡、糖尿病性溃疡、糖尿病足溃疡、静脉性溃疡、静脉停 滞性溃疡、动脉性溃疡、血管炎性溃疡、烧伤性溃疡、创伤引起的溃疡、感染性溃疡、混合性 溃疡、以及坏疽性脓皮病。慢性伤口可以是动脉性溃疡，该动脉性溃疡包括由完全或部分动 脉阻塞引起的溃疡。慢性伤口可以是静脉性或静脉停滞性溃疡，该静脉性或静脉停滞性溃 疡包括由静脉瓣功能不良和相关的血管疾病引起的溃疡。在某些实施方式中，提供了一种 治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于压迫性溃疡的以下AHCPR期中的一个或多 个1期、2期、3期、和/或4期。如在本文中所使用的，慢性伤口还可以包括，例如，至少部分地特征在于以下的伤 口 1)伤口发炎的慢性自我持续状态、2)不足和有缺陷的伤口细胞外基质、幻不良反应的 (衰老的)伤口细胞(包括成纤维细胞)、4)有限的细胞外基质产生、和/或幻部分由于缺 乏必要的细胞外基质安排和缺乏用于迁移的脚手架而导致上皮再形成衰退。慢性伤口的特 征还可以在于1)长期发炎和蛋白水解活性，其导致溃疡性病变，该溃疡性病变包括例如， 糖尿病性溃疡、压迫性溃疡(褥疮性溃疡)、静脉性溃疡、以及动脉性溃疡，幻在受影响的区 域中基质的逐步沉积，幻更长的修复时间，4)更小的伤口收缩，幻更慢的上皮再形成，以及 6)增加的肉芽组织厚度。示例性慢性伤口可以包括“压迫性溃疡”。示例性压迫性溃疡可以包括基于 AHCPR(Agency for Health Care Policy and Research, U. S. Department of Health and Human Services)指南的伤口分类的所有4个期，包括例如，1期。I期压迫性溃疡是可观 察到的完整皮肤的压力相关改变，与身体上的相邻或相反区域相比，其标志可以包括以下 一种或多种的变化皮肤温度(温暖或凉爽)、组织一致性(结实或松软潮湿感)和/或感 觉(疼痛、搔痒)。在轻色素沉着皮肤中，溃疡表现为限定区域的持续发红，而在较深的肤 色中，溃疡可以呈现持续的红色、蓝色、或紫色色调。1期溃疡形成可以包括完整皮肤的非 发白红斑(nonblanchable erythema)和皮肤溃疡的预示性病变。在具有较深肤色的个体 中，皮肤变色、温暖、水肿、硬化、或硬度也可以是1期溃疡的标志。2期2期溃疡形成的特 征可以在于部分皮肤层丧失，其涉及表皮、真皮、或两者。该溃疡是表面的并且临床上呈现 为磨损、水疱、或较浅的腔洞。3期3期溃疡形成的特征可以在于全层皮肤损失，该全层皮 肤损失涉及皮下组织的损伤或坏死，其可以向下延伸到但不通过下面的筋膜。该溃疡临床 上呈现为较深的腔洞并伴有或未伴有邻近组织的破坏。4期4期溃疡形成的特征可以在于 全层皮肤损失并伴有广泛的破坏、组织坏死、或对肌肉、骨、或支持结构(例如，腱、关节囊) 的损伤。在某些实施方式中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于压 迫性溃疡的以下AHCPR期中的一个或多个1期、2期、3期、和/或4期。示例性慢性伤口可以包括“褥疮性溃疡”。示例性褥疮性溃疡可以起因于对骨性隆 起的长期的和未被释放的压力的结果，其导致局部缺血。该伤口倾向于发生在相对于卸载 重量不能重新定位自己的患者，如瘫痪、无意识、或严重虚弱的人中。如由美国健康与人类服务部(D印artment of Health and Human Services)所定义的，主要预防措施包括高危 患者的鉴定；经常评估；以及预防措施如有计划的重新定位、适当的减压寝具、防潮、以及 适当的营养状况。治疗选项可以包括例如，减压、手术和酶清创术、湿润伤口护理、以及细菌 负荷的控制。在某些实施方式中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在 于褥疮性溃疡或溃疡形成，其由对骨性隆起的长期的、未被释放的压力产生，这导致局部缺 血。在某些实施方式中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于褥疮性 溃疡或溃疡形成，其由对骨性隆起的长期的、未被释放的压力产生，这导致局部缺血。示例性慢性伤口可以包括“动脉性溃疡”。慢性动脉性溃疡通常理解成这样的溃 疡形成，其伴随动脉硬化性和高血压性心血管病。它们是疼痛的、边界清晰的，并且经常在 外侧下肢和足趾上发现。动脉性溃疡可以包括那些特征在于完全或部分动脉阻塞的溃疡， 该动脉阻塞可以导致组织坏死和/或溃疡形成。动脉性溃疡的体征可以包括，例如，四肢无 脉；痛苦的溃疡形成；小穿刺性溃疡，其通常是边界清楚的；凉爽或寒冷的皮肤；延迟的毛 细管返回时间(简单地说，推动足趾的末端并释放，正常颜色应该在约3秒或更短时间内返 回足趾)；萎缩性外观皮肤(例如，磨损的、薄、干燥)；以及指和足发的损失。示例性慢性伤口可以包括“静脉性溃疡”。示例性静脉性溃疡可以包括最常见类型 的影响下肢的溃疡并且可以通过静脉瓣的功能不良来表征。正常静脉具有防止血液回流的 瓣膜。当这些瓣膜变得无能时，静脉血的回流会引起静脉充血。来自红细胞的血红蛋白会 逃逸并渗漏到血管外空间中，引起通常观察到的褐色变色。已表明，围绕静脉性溃疡的皮肤 的经皮氧分压会降低，这提示存在阻碍该区域的正常血管分布的力。淋巴管引流和流量在 这些溃疡中也发挥作用。静脉性溃疡可以出现在内踝附近并且通常与水肿和硬结下肢一起 发生；它可以是肤浅的、不太疼痛并且可以存在有来自受影响部位的渗出性排出。在某些实 施方式中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于起因于完全或部分 动脉阻塞的动脉性溃疡或溃疡形成。示例性慢性伤口可以包括“静脉停滞性溃疡”。瘀积性溃疡是与静脉功能不全有关 的病变并且更通常存在于内踝上，通常伴随压凹性水肿、静脉曲张、斑点状色素沉着、红斑、 以及不可触知的瘀点和紫癜。郁积性皮炎和溃疡通常是搔痒的而不是疼痛的。示例性静脉 停滞性溃疡的特征可以在于下肢的慢性被动性静脉充血，其导致局部缺氧。这些伤口发病 的一种可能的机制包括阻碍氧穿过粗血管周纤维蛋白套囊扩散到组织中。另一种机制是渗 入血管周组织的大分子捕获对维持皮肤完整性所需要的生长因子。另外，由于静脉充血，较 大白细胞的流动会放慢，阻塞了毛细血管，变得激活，并且损害血管内皮，以倾向于溃疡形 成。在某些实施方式中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由静脉 瓣的功能不良和相关的血管疾病引起的静脉性溃疡或溃疡形成。在某些实施方式中，提供 了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由下肢的慢性被动性静脉充血和/ 或导致的局部缺氧引起的静脉停滞性溃疡或溃疡形成。示例性慢性伤口可以包括“糖尿病性溃疡”。糖尿病患者倾向于由于神经和血管 并发症而引起的溃疡形成，包括足部溃疡。周围神经病可以引起脚和/或腿中改变的或完 全丧失的感觉。患有沉重期神经病的糖尿病患者会失去敏锐-迟钝辨别的所有能力。在患 有神经病的患者中，对足的任何切口或创伤可以完全未注意到达数天或数周。并非不常见 的是，当事实上溃疡已存在相当一段时间时，使患有神经病的患者注意到溃疡“刚刚出现”。对于神经病患者，已表明，严格的葡萄糖控制可以放慢该疾病的进展。作为降低的感觉的结 果，还可以发生沙尔科足畸形。在他们的足部具有“正常”感觉的人能够自动感到何时太大 压力正置于足部区域上。一旦确定，我们的身体本能地移动位置以缓解这种应力。患有沉 重期神经病的患者会失去这种感到持续的压力损伤的能力，结果，可以发生组织局部缺血 和坏死，其导致例如，足底溃疡。另外，在足骨中的微小骨折，如果被忽视和未治疗，则可以 导致外貌损伤、慢性肿胀以及另外的骨性隆起。微血管病是糖尿病患者的显著并发症之一， 其也可以导致溃疡形成。在某些实施方式中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤 口的特征在于由于糖尿病的神经和血管并发症引起的糖尿病足溃疡和/或溃疡形成。示例性慢性伤口可以包括“创伤性溃疡”。由于对身体的创伤性损伤可以形成示例 性的创伤性溃疡。这些损伤包括，例如，对动脉、静脉或淋巴系统的损害；对骨骼的骨结构的 改变；组织层-表皮、真皮、皮下软组织、肌肉或骨的损失；对身体部位或器官的损害以及身 体部位或器官的损失。在某些实施方式中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口 的特征在于与对身体的创伤性损伤有关的溃疡形成。示例性慢性伤口可以包括“烧伤性溃疡”，包括例如，由于烧伤而发生的溃疡形成， 其中烧伤包括1度烧伤(即，皮肤的表面的红色区域)；2度烧伤(起泡受伤部位，在已除去 水疱液以后，其可以自发愈合)；3度烧伤(烧伤，穿过整个皮肤并且通常需要外科手术干预 用于伤口愈合)；烫伤(可以起因于滚烫的热水、油脂或散热器用液)；热灼伤(可以起因于 火焰，通常为深度烧伤)；化学烧伤(可以起因于酸和碱，通常为深度烧伤)；电烧伤(房子 周围的低电压或工作中的高电压)；爆炸焰烧伤(通常为表面损伤)；以及接触烧伤(通常 为深度烧伤并且可以起因于消声器尾管、热熨斗以及火炉)。在某些实施方式中，提供了一 种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于与对身体的烧伤有关的溃疡形成。示例性慢性伤口可以包括“血管炎性溃疡”。血管炎性溃疡还发生在下肢上并且 是疼痛的、边界清晰的病变，其可以具有伴随的可触知的紫癜和出血性大疱。胶原病、败血 症、以及各种血液学病症(例如，血小板减少、异常蛋白血)可以是这种严重的急性病症的 起因。示例性慢性伤口可以包括坏疽性脓皮病。坏疽性脓皮病存在为小腿的单个或多 个、非常敏感的溃疡。深红色至紫色的、破坏的边界围绕化脓性中心缺陷。活检通常不能揭 示血管炎。在一半患者中，它伴随全身性疾病如溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、或白血病。在 某些实施方式中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于与坏疽性脓 皮病有关的溃疡。示例性慢性伤口可以包括眼溃疡，该眼溃疡包括角膜溃疡或顽固性(慢性)溃疡。 还包括眼的持续性上皮缺损。这些可以发生在人中并且也发生在运动动物(如马)和宠物 (包括狗)中。示例性慢性伤口可以包括感染性溃疡。感染性溃疡在用各种生物体直接接种后发 生并且可以伴随显著的局限性腺病。实例有分枝杆菌感染、炭疽病、白喉症、芽生菌病、孢子 丝菌病、土拉菌病、以及猫抓热。初期梅毒的生殖器溃疡通常是非敏感的并具有干净、坚实 的基质。软下疳和腹股沟肉芽肿的那些溃疡倾向于为粗糙的、暗淡的、以及更加无节制的病 变。在某些实施方式中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于与感染 有关的溃疡形成。
如在本文中所使用的，术语“裂开性伤口，，是指这样的伤口，通常为已破裂或裂开 的手术伤口。在某些实施方式中，提供了一种治疗并不以预期速率愈合的伤口的方法，其中 伤口的特征在于裂开。间隙连接调节剂本文描述的某些药剂能够调节或影响分子转运到细胞之内和之外(例如阻断或 抑制)。因此，本文描述的某些间隙连接调节剂可以调节细胞通讯(例如细胞与细胞)。某 些间隙连接调节剂可以调节或影响分子在细胞质和周质间隙或细胞外间隙之间的传递。这 样的药剂通常靶向半通道(还称作连接子)，该半通道可以独立参与小分子在细胞质和细 胞外间隙或组织之间的交换。因此，本文提供的化合物可以直接或间接减少细胞之间(经 由间隙连接)或细胞与细胞外间隙或组织之间(经由半通道)的偶联，并且对分子从细胞 转运到细胞外间隙中的调节是在本发明的某些化合物和实施方式的范围之内。在本发明的实施方式中，可以使用任何分子，该分子能够诱导对分子通过间隙连 接或半通道的通道(例如转运)的所期望的抑制。在特定实施方式中，还提供了调节分子 通过间隙连接或半通道的通道的化合物(例如，调节分子从细胞的细胞质进入细胞外间隙 的通道的那些化合物)。在有或没有间隙连接解偶联的情况下，上述化合物可以调节分子 通过间隙连接或半通道的通道。上述化合物包括，例如，结合蛋白、多肽、以及其它有机化合 物，其可以，例如，全部或部分地阻断间隙连接或半通道的功能或活性。某些间隙连接抑制剂列在Evans，W. H. and Boitano, S. Biochem. Soc. Trans. 29 606-612(2001)中。已报道了间隙连接和半通道的肽抑制剂(包括拟肽)。参见例如 Berthoud,V. M. et al. ,Am J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279 :L619-L622 (2000) ；De Vriese et al. , Kidney Int.61 177-185(2001) ；Boitano S. and Evans W.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279 :L623_L63(K2000)。如在本文中所使用的，“间隙连接调节剂”可以广泛地包括可以全部或部分地防 止、减少或调节半通道或间隙连接的活性、功能、或形成的那些药剂或化合物。在某些实施 方式中，间隙连接调节剂可以全部或部分地防止或减少半通道或间隙连接的功能。在某些 实施方式中，间隙连接调节剂诱导半通道或间隙连接的全部或部分闭合。在其它实施方式 中，间隙连接调节剂可以全部或部分地阻断半通道或间隙连接。在某些实施方式中，间隙连 接调节剂可以全部或部分地减少或防止半通道或间隙连接的开放。在某些实施方式中，通 过间隙连接调节剂进行的间隙连接或半通道的所述阻断或闭合通过预防或减少小分子通 过开放通道流入和流出细胞外间隙或周质间隙而可以减少或抑制细胞外半通道通讯。阻断 半通道和/或间隙连接开放的拟肽、以及间隙连接磷酸化化合物目前是优选的。在某些实施方式中，间隙连接调节剂可以防止、减少或改变半通道或间隙连接的 活性或功能。如在本文中所使用的，间隙连接活性或功能的改变可以包括闭合间隙连接、 闭合半通道、和/或分子或离子通过间隙连接和/或半通道的通道。在某些另外的方面，间隙连接调节剂可以包括，例如，脂族醇；辛醇；庚醇；麻醉 药(例如氟烷)、恩氟烷、氟烷、丙泊酚以及硫喷妥(戊硫代巴比妥)；花生四烯酸乙醇胺 (anandamide)；芳氨基苯甲酸酯(FFA 氟芬那酸和类似的衍生物，其是亲脂的)；甘珀酸； 查耳酮(2'，5' - 二羟基查耳酮)；CHF(氯羟基呋喃酮)；CMCF(3-氯-4-(氯甲基)-5-羟 基-2(5H)_呋喃酮)；地塞米松；多柔比星(以及其它蒽醌衍生物)；类花生酸血栓烷A(2)(TXA(2))模拟物；NO(—氧化氮)；脂肪酸(例如花生四烯酸、油酸以及脂肪氧合酶代谢产 物；芬那酸(氟芬那酸(FFA)、尼氟酸(NA)以及甲氯芬那酸(MFA))；染料木黄酮；甘草次酸 (GA) :18a-甘草次酸和18-β-甘草次酸、以及它们的衍生物；林旦；溶血磷脂酸；甲氟喹； 甲萘醌；2-甲基-1，4-萘醌、维生素K (3)；萘酚平；网田酸；油酰胺；油酸；通过细胞内酸化 的PH调节剂；例如酸化剂；多不饱和脂肪酸；脂肪酸GJIC抑制剂(例如油酸和花生四烯 酸)；奎尼定；奎宁；所有反式视黄酸；以及他莫昔芬。示例性间隙连接调节剂可以包括但不限于多肽(例如拟肽、抗体、它们的结合 片段、以及合成构建物)、和其它间隙连接封闭剂、以及间隙连接蛋白磷酸化剂。在授予 Jensen等人的美国专利第7，153，822号、美国专利第7，250，397号、以及各类专利公开 中已报道了用于闭合间隙连接的示例性化合物(例如磷酸化连接蛋白43酪氨酸残基)。 在Green等人，W02006134494中报道了示例性的肽和拟肽。还参见Gourdie等人，参见 W02006069181,以及 Griffith，参见 W02003032964。如在本文中所使用的，“间隙连接磷酸化剂”可以包括那些药剂或化合物，该药剂 或化合物能够诱导连接蛋白氨基酸残基上的磷酸化以便诱导间隙连接或半通道闭合，因而 诱导间隙连接调节。磷酸化的示例性部位包括在连接蛋白上的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残 基中的一种或多种。在某些实施方式中，磷酸化的调节可以发生在一种或多种连接蛋白上 的一个或多个残基上。示例性的间隙连接磷酸化剂在本领域中是众所周知的并且可以包 括，例如，c-Src酪氨酸激酶或其它G蛋白偶联受体激动剂。参见Gi印mans B (2001) J. Biol. Chem.，Vol. 276，Issue 11,8544-8549 在一种实施方式中，在一种或多种这些残基上的磷 酸化的调节会影响半通道功能，尤其通过闭合半通道。在另一种实施方式中，在一种或多种 这些残基上的磷酸化的调节会影响间隙连接功能，尤其通过闭合间隙连接。靶向连接蛋白 43间隙连接和半通道的闭合的间隙连接磷酸化剂是优选的。包括结合蛋白(例如抗体、抗体片段等)、肽、拟肽、以及拟肽的多肽化合物是间隙 连接的合适的调节剂。结合蛋白包括，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(包括，例如，Fab、 F(ab' )2以及Fv片断)；单链抗体；单链Fv;以及单链结合分子如那些单链结合分子，其 包含，例如，结合结构域、铰链、CH2以及CH3结构域、重组抗体以及抗体片段，其能够结合抗 原决定簇(即，通常称作表位的分子的部分)，该抗原决定簇与特定抗体或其它结合分子接 触。包括抗体、抗体片段等的这些结合蛋白可以是嵌合的或人源化的或以其它方式变得在 它们将给予的受治疗者中是较少免疫原性的，并且可以合成、重组生产、或在表达文库中产 生。设想本领域中已知的或以后发现的任何结合蛋白，如本文提及的和/或本领域中更详 细地描述的那些结合蛋白。例如，结合蛋白不仅包括抗体等，而且还包括配体、受体、拟肽、 或其它结合片段或分子(例如，通过噬菌体展示产生的)，其结合于靶(例如连接蛋白、连接 子、间隙连接、或相关分子)。结合分子将通常具有期望的特异性，包括但不限于结合特异性、以及期望的亲和 力。亲和力，例如，可以是大于或等于约lof1、大于或等于约ιο 1、大于或等于约ιο 1、 大于或等于约IO8M4的Ka。甚至大于约IO8M4的亲和力是合适的，如等于或大于约lOl1、 约ΚΓΜ—1、约ΙΟ1^1、以及约IO1I1的亲和力。利用常规技术，可以容易地确定根据本发明 的结合蛋白的亲和力，例如 *katchard et al.，(1949) Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660 描述的那些常规技术。本发明包括使用肽(包括一种和多种拟肽)来调节间隙连接和半通道。通过使用 获自水疗法图的数据，已提出，连接蛋白含有四个跨膜-跨越区以及两个短细胞外环。连接 蛋白的第一和第二胞外区的定位的进一步特征在于用于在分裂间隙连接上相应表位的免 疫定位的抗肽抗体的所报道的生产。Goodenough D. A. (1988) J Cell Bioll07 :1817-1824 ； Meyer R. Α. (1992) J Cell Biol 119:179-189。可以体外合成肽或它们的变体，例如，通过固相肽合成方法或通过酶催化肽合成 法或借助于重组DNA技术。固相肽合成方法是一种已确立和广泛使用的方法，该方法描 述在如以下的参考文献中Stewart et al.，(1969) Solid Phase Peptide Synthesis, Ε.H. Freeman Co. , San Francisco ；Merrifield, (1963)J.Am. Chem. Soc. 85 2149 ； Meienhofer in"Hormonal Proteins and Peptides,，，ed. ；C. H. Li, Vol. 2 (Academic Press, 1973), pp.48-267 ； VX R Bavaay and Merrifield，“The Peptides, "eds.E. Gross and F. Meienhofer，Vol. 2 (Academic Press，1980)pp. 3-285。可以通过以下来进一步纯化这些 肽在免疫亲和或离子交换柱上的分馏；乙醇沉淀；反相HPLC ；在硅胶(silica)或在阴离 子交换树脂如DEAE上的层析；色谱聚焦；SDS-PAGE ；硫酸铵沉淀；使用例如kphadex G-75 的凝胶过滤；配体亲和层析；或从非极性溶剂或非极性/极性溶剂混合物结晶或沉淀。通过 结晶或沉淀进行的纯化是优选的。由两个相邻细胞贡献的半通道的胞外结构域彼此“对接(停靠)”以形成完整的间 隙连接通道。干扰这些胞外结构域的相互作用的试剂可以削弱细胞间通讯，或干扰对细胞 外环境的半通道开放。间隙连接调节剂包括这样的肽，该肽包含对应于连接蛋白(例如连接蛋白45、43、 26、30、31. 1、以及37)的跨膜区(例如第一至第四)的氨基酸序列。在本发明中，优选使用 包括这样的肽的间隙连接调节剂，所述肽包含对应于连接蛋白43的部分跨膜区的氨基酸 序列。间隙连接调节剂可以包含这样的肽，该肽包含对应于连接蛋白45的部分跨膜区 的氨基酸序列。间隙连接调节剂包括具有包含SEQ. ID. NO 1的约5至20个邻接氨基酸 的氨基酸序列的肽、具有包含SEQ. ID. NO 1的约8至15个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽、 或具有包含SEQ. ID. NO :1的约11至13个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽。其它实施方式涉 及这样的间隙连接调节化合物，该化合物是具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列 包含SEQ. ID. NO 1的至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约 11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、或至少约30个邻接 氨基酸。在本文提供的某些间隙连接调节化合物中，对应于SEQ ID NO :1的位置46-75和 199-2 处的氨基酸的连接蛋白45的胞外结构域可以用来开发特定的肽序列。本文描述的 某些肽具有对应于在SEQ. ID. NO 1的位置46-75和199-2 处的区的氨基酸序列。这些肽 并不需要具有与SEQ. ID. NO 1的那些部分相同的氨基酸序列，并且可以进行保守氨基酸变 化，使得这些肽保留结合活性或功能活性。可替换地，该肽可以靶向连接蛋白而不是胞外结 构域的区(例如并不对应于位置46-75和199-228的SEQ. ID. NO 1的部分)。此外，合适的间隙连接调节剂可以包括这样的肽，该肽包含对应于连接蛋白43的 部分跨膜区的氨基酸序列。间隙连接调节剂包括具有包含SEQ. ID. NO 2的约5至20个邻
15接氨基酸的氨基酸序列的肽、具有包含SEQ. ID. NO 2的约8至15个邻接氨基酸的氨基酸序 列的肽、或具有包含SEQ. ID. NO 2的约11至13个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽。其它间 隙连接调节剂包括具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包含SEQ. ID. NO 2的至少 约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至 少约14、至少约15、至少约20、至少约25、或至少约30个邻接氨基酸。其它间隙连接调节 剂包含对应于SEQ. ID. NO 2的位置37-76和178-208处的氨基酸的连接蛋白43的胞外结 构域。间隙连接调节剂包括本文描述的肽，这些肽具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列对 应于在SEQ. ID. NO 2的位置37-76和178-208处的区。这些肽不需要具有与SEQ. ID. NO 2的那些部分相同的氨基酸序列，并且可以进行保守氨基酸变化，使得这些肽保留结合活性 或功能活性。可替换地，肽可以靶向连接蛋白而不是胞外结构域的区(例如并不对应于位
置 37-76和 178-208 的 SEQ. ID. NO 2 的部分)O
其它间隙连接调节剂包括羧基末端多肽。
连接蛋白 45 (SEO. ID. NO 1)
MetSerTrpSerPheLeuThrArgLeuLeuGluGlulieHisAsnHis
151015
SerThrPheValGlyLyslieTrpLeuThrValLeulieValPheArg
202530
IleValLeuThrAlaValGlyGlyGluSerlieTyrTyrAspGluGln
354045
SerLysPheValCysAsnThrGluGlnProGlyCysGluAsnValCys
505560
TyrAspAlaPheAlaProLeuSerHisValArgPheTrpValPheGln
65707580
IlelieLeuValAlaThrProSerValMetTyrLeuGlyTyrAlalie
859095
HisLyslieAlaLysMetGluHisGlyGluAlaAspLysLysAlaAla
100105110
ArgSerLysProTyrAlaMetArgTrpLysGlnHisArgAlaLeuGlu
115120125
GluThrGluGluAspAsnGluGluAspProMetMetTyrProGluMet
130135140
GluLeuGluSerAspLysGluAsnLysGluGlnSerGlnProLysPro
145150155160
LysHisAspGlyArgArgArglieArgGluAspGlyLeuMetLyslie
165170175
TyrValLeuGlnLeuLeuAlaArgThrValPheGluValGlyPheLeu
180185190
lieGlyGlnTyrPheLeuTyrGlyPheGlnValHisProPheTyrVal
195200205
160105]CysSerArgLeuProCysProHisLyslieAspCysPhelieSerArg0106]2102152200107]ProThrGluLysThrliePheLeuLeulieMetTyrGlyValThrGly0108]2252302352400109]LeuCysLeuLeuLeuAsnlieTrpGluMetLeuHisLeuGlyPheGly0110]2452502550111]ThrlieArgAspSerLeuAsnSerLysArgArgGluLeuGluAspPro0112]2602652700113]GlyAlaTyrAsnTyrProPheThrTrpAsnThrProSerAlaProPro0114]2752802850115]GlyTyrAsnlieAlaValLysProAspGlnlieGlnTyrThrGluLeu0116]2902953000117]SerAsnAlaLyslieAlaTyrLysGlnAsnLysAlaAsnThrAlaGln0118]3053103153200119]GluGlnGlnTyrGlySerHisGluGluAsnLeuProAlaAspLeuGlu0120]3253303350121]AlaLeuGlnArgGlulieArgMetAlaGlnGluArgLeuAspLeuAla0122]3403453500123]ValGlnAlaTyrSerHisGlnAsnAsnProHisGlyProArgGluLys0124]3553603650125]LysAlaLysValGlySerLysAlaGlySerAsnLysSerThrAlaSer0126]3703753800127]SerLysSerGlyAspGlyLysAsnSerValTrplie0128]3853903950129]连接蛋白43(SEQ.ID. NO 2)0130]MetGlyAspTrpSerAlaLeuGlyLysLeuLeuAspLysValGlnAla0131]1510150132]TyrSerThrAlaGlyGlyLysValTrpLeuSerValLeuPheliePhe0133]2025300134]ArglieLeuLeuLeuGlyThrAlaValGluSerAlaTrpGlyAspGlu0135]3540450136]GlnSerAlaPheArgCysAsnThrGlnGlnProGlyCysGluAsnVal0137]5055600138]CysTyrAspLysSerPheProlieSerHisValArgPheTrpValLeu0139]657075800140]GlnlieliePheValSerValProThrLeuLeuTyrLeuAlaHisVal0141]8590950142]PheTyrValMetArgLysGluGluLysLeuAsnLysLysGluGluGlu0143]1001051100144]LeuLysValAlaGlnThrAspGlyValAsnValAspMetHisLeuLys0145]1151201250146]GlnIleGlulieLysLysPheLysTyrGlylieGluGluHisGlyLys0147]1301351400148]ValLysMetArgGlyGlyLeuLeuArgThrTyrlielieSerlieLeu0149]1451501551600150]PheLysSerliePheGluValAlaPheLeuLeulieGlnTrpTyrlie0151]1651701750152]TyrGlyPheSerLeuSerAlaValTyrThrCysLysArgAspProCys0153]1801851900154]ProHisGlnValAspCysPheLeuSerArgProThrGluLysThrlie0155]1952002050156]PheIleliePheMetLeuValValSerLeuValSerLeuAlaLeuAsn0157]2102152200158]IleIleGluLeuPheTyrValPhePheLysGlyValLysAspArgVal0159]2252302352400160]LysGlyLysSerAspProTyrHisAlaThrSerGlyAlaLeuSerPro0161]2452502550162]AlaLysAspCysGlySerGlnLysTyrAlaTyrPheAsnGlyCysSer0163]2602652700164]SerProThrAlaProLeuSerProMetSerProProGlyTyrLysLeu0165]2752802850166]ValThrGlyAspArgAsnAsnSerSerCysArgAsnTyrAsnLysGln0167]2902953000168]AlaSerGluGlnAsnTrpAlaAsnTyrSerAlaGluGlnAsnArgMet0169]3053103153200170]GlyGlnAlaGlySerThrlieSerAsnSerHisAlaGlnProPheAsp0171]3253303350172]PheProAspAspAsnGlnAsnSerLysLysLeuAlaAlaGlyHisGlu0173]3403453500174]LeuGlnProLeuAlalieValAspGlnArgProSerSerArgAlaSer0175]3553603650176]SerArgAlaSerSerArgProArgProAspAspLeuGlulie0177]3703753800178]间隙连接调节肽可以包含对应于部分连接蛋白胞外结构域(具有保守氨
代)的序列，使得该肽是功能上活性的间隙连接调节化合物。示例性的保守氨基酸替代包 括例如用另一种非极性氨基酸替代非极性氨基酸、用另一种芳族氨基酸替代芳族氨基酸、 用另一种脂族氨基酸替代脂族氨基酸、用另一种极性氨基酸替代极性氨基酸、用另一种酸 性氨基酸替代酸性氨基酸、用另一种碱性氨基酸替代碱性氨基酸、以及用另一种可电离氨
18基酸替代可电离氨基酸。靶向连接蛋白43的示例性肽示出在以下表1中。Ml、2、3以及4分别是指连接蛋 白43蛋白的第一至第四跨膜区。E2分别是指第一和第二细胞外环。表1.细胞间通讯的肽类抑制剂(cx43)
0181]FEVAFLLIQffIM3&E2(SEQ.ID.NO:3)0182]LLIQffYIGFSLE2(SEQ.ID.NO:4)0183]SLSAVYTCKRDPCPHQE2(SEQ.ID.NO:5)0184]VDCFLSRPTEKTE2(SEQ.ID.NO:6)0185]SRPTEKTIFIIE2&M4(SEQ.ID.NO:7)0186]LGTAVESAffGDEQM1&E1(SEQ.ID.NO:8)0187]QSAFRCNTQQPGEl(SEQ.ID.NO:9)0188]QQPGCENVCYDKEl(SEQ.ID.NO:10)0189]VCYDKSFPISHVREl(SEQ.ID.NO:11) 表2提供了在抑制半通道或间隙连接功能中所使用的另外的示例性连接蛋白肽。 在其它实施方式中，对肽或它们的片断进行保守氨基酸变化。
0191]表2.细胞间通讯的另外的肽类抑制剂(CX32、CX43)0192]连接蛋白位置AA' s和序列0193]Cx32E139-7 MESVWGDEIKSSFICNTLQPGCNSVCYDHFFPISHVR (SEQ. ID. NO 12)0194]Cx32E141-52ESVffGDEKSSFI(SEQ.ID.NO:13)0195]Cx32E152-63ICNTLQPGCNSV(SEQ.ID.NO:14)0196]Cx32E162-73SVCYDHFFPISH(SEQ.ID.NO:15)0197]Cx32E264-188RLVKCEAFPCPNTVDCFVSRPTEKT(SEQ.ID.NO:16)0198]Cx32E2166-177VKCEAFPCPNTV(SEQ.ID.NO:17)0199]Cx32E2177-188VDCFVSRPTEKT(SEQ.ID.NO:18)0200]Cx32E163-75VCYDHFFPISHVR(SEQ.ID.NO:19)0201]Cx32E145-59VffGDEKSSFICNTLQPGY(SEQ.ID.NO:20)0202]Cx32E146-59DEKSSFICNTLQPGY(SEQ.ID.NO:21)0203]Cx32E2182-192SRPTEKTVFTV(SEQ.ID.NO:22)0204]Cx32/Cx43E2182-188/ SRPTEKT0205]201-207(SEQ.ID.NO:23)0206]连接蛋白位置M's和序列0207]Cx32El 52-63ICNTLQPGCNSV(SEQ. ID. NO24)0208]Cx40E2 177-192FLDTLHVCRRSPCPHP(SEQ. ID. NO25)0209]Cx43E2 188-205KRDPCHQVDCFLSRPTEK(SEQ. ID. NO26)0210]表3提供了用于连接蛋白家族成员的细胞外环，其用来开发本文描述的肽抑制
剂。在某些非限制性实施方式中，在表4中提供的肽、以及它们的片断用作肽抑制剂。在 其它非限制性实施方式中，该表中包含肽的约8至约15、约11至约13个邻接氨基酸的肽 是本发明的肽抑制剂。可以对肽或它们的片断进行保守氨基酸变化。参见Boitano S. and Evans W. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279 :L623_L63(K2000)。
表3.用于各种连接蛋白家族成员的细胞外环ElhuCx26KEVWGDEQADFVCNTLQPGCKNVCYDHYFPISHIR(SEQ. ID.NO:27)huCx30QEVWGDEQEDFVCNTLQPGCKNVCYDHFFPVSHIR(SEQ. ID.NO:28)huCx30.3EEVWDDEQKDFVCNTKQPGCPNVCYDEFFPVSHVR(SEQ. ID.NO:29)huCx31ERVWGDEQKDFDCNTKQPGCTNVCYDNYFPISNIR(SEQ. ID.NO:30)huCx31.1ERVWSDDHKDFDCNTRQPGCSNVCFDEFFPVSHVR(SEQ. ID.NO31)huCx32ESVWGDEKSSFICNTLQPGCNSVCYDQFFPISHVR(SEQ. ID.NO32)huCx36ESVWGDEQSDFECNTAQPGCTNVCYDQAFPISHIR(SEQ. ID.NO33)huCx37ESVWGDEQSDFECNTAQPGCTNVCYDQAFPISHIR(SEQ. ID.NO34)huCx40.1RPVYQDEQERFVCNTLQPGCANVCYDVFSPVSHLR(SEQ. ID.NO35)huCx43ESAWGDEQSAFRCNTQQPGCENVCYDKSFPISHVR(SEQ. ID.NO36)huCx46EDVWGDEQSDFTCNTQQPGCBNVCYBRAFPISHIR(SEQ. ID.NO37)huCx46.6EAIYSDEQAKFTCNTRQPGCDNVCYDAFAPLSHVR(SEQ. ID.NO38)huCx40ESSffGDEQADFRCDTIQPGCQNVCTDQAFPISHIR(SEQ. ID.NO39)huCx45GESIYYDEQSKFVCNTEQPGCENVCYDAFAPLSHVR(SEQ. ID.NO40)E2huCx26MYVFYVMYDGFSMQRLVKCNAWPCPNTVDCFVSRPTEKT(SEQ.ID.NO 41)huCx30MYVFYFLYNGYHLPWVLKCGIDPCPNLVDCFISRPTEKT(SEQ.ID.NO 42)huCx30.3LYIFHRLYKDYDMPRVVACSVEPCPHTVDCYISRPTEKK(SEQ.ID.NO 43)huCx31LYLLHTLWHGFNMPRLVQCANVAPCPNIVDCYIARPTEKK(SEQ.ID.NO 44)huCx31.1LYVFHSFYPKYILPPVVKCHADPCPNIVDCFISKPSEKN(SEQ.ID.NO 45)huCx32MYVFYLLYPGYAMVRLVKCDVYPCPNTVDCFVSRPTEKT(SEQ.ID.NO 46)huCx36LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKT(SEQ.ID.NO 47)huCx37LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKT(SEQ.ID.NO 48)huCx40.1GALHYFLFGFLAPKKFPCTRPPCTGVVDCYVSRPTSKS(SEQ.ID.NO 49)huCx43LLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVDCFLSRPTEKT(SEQ.ID.NO 50)huCx46IAGQYFLYGFELKPLYRCDRWPCPNTVDCFISRPTEKT(SEQ.ID.NO 51)huCx46.6LVGQYLLYGFEVRPFFPCSRQPCPHVVDCFVSRPTEKT(SEQ.ID.NO 52)hucx40IVGQYFIYGIFLTTLHVCRRSPCPHPVNCYVSRPTEKN(SEQ.ID.NO 53)huCx45LIGQYFLYGFQVHPFYVCSRLPCHPKIDCFISRPTEKT(SEQ.ID.NO 54)不同连接蛋白同种型的E2结构域的序列示出在表3中。注意，肽SEQ. ID. NO :7的
最后4个氨基酸是第四膜结构域的一部分。表4提供了用于连接蛋白家族成员的胞外结构域，其可以用来开发肽间隙连接调 节齐U。在表4中提供的肽、以及它们的片断还可以用作肽间隙连接调节剂。上述肽可以包 含该表4中肽序列的约8至约15、或约11至约13个邻接氨基酸。可以对肽或它们的片断 进行保守氨基酸变化。表4.胞外结构域肽VDCFLSRPTEKT (SEQ. ID. NO 6)
肽SRPTEKTIFII(SEQ. ID. NO7)
huCx43LLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVDCFLSRPTEKTIFII(SEQ. ID. NO:55)
huCx26MYVFYVMYDGFSMQRLVKCNAWPCPNTVDCFVSRPTEKTVFTV(SEQ. ID.NO56)
huCx30YVFYFLYNGYHLPWVLKCGIDPCPNLVDCFISRPTEKTVFTI(SEQ. ID.NO57)
huCx30.3LYIFHRLYKDYDMPRVVACSVEPCPHTVDCYISRPTEKKVFTY(SEQ. ID.NO58)
huCx31LYLLHTLWHGFNMPRLVQCANVAPCPNIVDCYIARPTEKKTY(SEQ. ID.NO59)
huCx31.1LYVFHSFYPKYILPPVVKCHADPCPNIVDCFISKPSEKNIFTL(SEQ. ID.NO60)
huCx32MYVFYLLYPGYAMVRLVKCDVYPCPNTVDCFVSRPTEKTVFTV(SEQ. ID.NO61)
huCx36LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKTIFII(SEQ. ID.NO62)
huCx37LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKTIFII(SEQ. ID.NO63)
huCx40.IGALHYFLFGFLAPKKFPCTRPPCTGVVDCYVSRPTEKSLLML(SEQ. ID.NO64)
huCx46IAGQYFLYGFELKPLYRCDRWPCPNTVDCFISRPTEKTIFII(SEQ. ID.NO65)
huCx46.6LVGQYLLYGFEVRPFFPCSRQPCPHVVDCFVSRPTEKTVFLL(SEQ. ID.NO66)
huCx40IVGQYFIYGIFLTTLHVCRRSPCPHPVNCYSRPTEKNVFIV(SEQ. ID.NO67)
huCx45LIGQYFLYGFQVHPFYVCSRLPCHPKIDCFISRPTEKTIFLL(SEQ. ID.NO68)表5提供了参照连接蛋白40的细胞外环(El和E2)示出的连接蛋白40的肽抑制 剂。粗体氨基酸定向于连接蛋白40的跨膜区。表5. Cx40肽抑制剂ElLGTAAESSffGDEQADFRCDTIQPGCQNVCTDQAFPISHIRFffVLQ(SEQ.ID.NO:69)
LGTAAESSffGDEQA(SEQ.ID.NO:70)
DEQADFRCDTIQP(SEQ.ID.NO:71)
TIQPGCQNVCTDQ(SEQ.ID.NO:72)
VCTDQAFPISHIR(SEQ.ID.NO:73)
AFPISHIRFffVLQ(SEQ.ID.NO:74)
E2
MEVGFIVGQYFIYGIFLTTLHVCRRSPCPHPVNCYVSRPTEKNVTIV(SEQ.ID.NO:75)
MEVGFIVGQYF(SEQ.ID.NO:76)
IVGQYFIYGIFL(SEQ.ID.NO:77)
GIFLTTLHVCRRSP(SEQ.ID.NO:78)
RRSPCPHPVNCY(SEQ.ID.NO:79)
VNCYVSRPTEKN(SEQ.ID.NO:80)
SRPTEKNVFIV(SEQ.ID.NO:81)表6提供了参照连接蛋白45的细胞外环(El和E2)示出的连接蛋白45的肽抑制 剂。粗体氨基酸定向于连接蛋白45的跨膜区。表6. Cx45肽抑制剂El LTAVGGESIYYDEQSKFVCNTEQPGCENVCYDAFAPLSHVRFWVFQ
LTAVGGESIYYDEQS
(SEQ. ID. NO 82) (SEQ. ID. NO 83)
DEQSKFVCNTEQP(SEQ.ID.NO:84)
TEQPGCENVCYDA(SEQ.ID.NO:85)
VCYDAFAPLSHVR(SEQ.ID.NO:86)
APLSHVRFffVFQ(SEQ.ID.NO:87)
E2
FEVGFLIGQYFLYGFQVHPFYVCSRLPCHPKIDCFISRPTEKTIFLL(SEQ.ID.NO:88)
FEVGFLIGQYF(SEQ.ID.NO:89)
LIGQYFLYGFQV(SEQ.ID.NO:90)
GFQVHPFYVCSRLP(SEQ.ID.NO:91)
SRLPCHPKIDCF(SEQ.ID.NO:92)
IDCFISRPTEKT(SEQ.ID.NO:93)
SRPTEKTIFLL(SEQ.ID.NO:94)在某些实施方式中，优选的是，某些肽抑制剂阻断半通道而没有间隙连接的 期望的阻断。虽然不希望受限于任何特定理论或机制，但还是认为，某些拟肽(例 如VCYDKSFPISHVR(SEQ.ID.NO :11))会阻断半通道而没有引起间隙连接的解偶联。肽 SRPTEKTIFIKSEQ. ID. NO 7)还可以例如用来阻断半通道而没有间隙连接的解偶联。肽 SRGGEKNVFIV(SEQ. ID. NO :95)可以用作对照序列(DeVriese et al. ,Kidney Internat. 61 177-185 (2002)) ο用于连接蛋白45的肽抑制剂的实例是YVCSRLPCHP(SEQ. ID. NO :96)、 QVHPFYVCSRL(SEQ. ID.NO :97)、FEVGFLIGQYFLY(SEQ.ID.NO :98)、GQYFLYGFQVHP (SEQ. ID. NO 99)、GFQVHPFYVCSR(SEQ. ID. NO :100)、AVGGESIYYDEQ (SEQ. ID. NO :101)、 YDEQSKFVCNTE (SEQ. ID. NO :102)、NTEQPGCENVCY (SEQ. ID. NO :103)、CYDAFAPLSHVR (SEQ. ID. NO :104)、FAPLSHVRFffVF (SEQ. ID. NO :105)禾口 LIGQY (SEQ. ID. NO :106)、QVHPF (SEQ. ID. NO :107)、YVCSR (SEQ. ID. NO :108)、SRLPC (SEQ. ID. NO :109)、LPCHP (SEQ. ID. NO 110)禾口 GESIY (SEQ. ID. NO :111)、YDEQSK (SEQ. ID. NO :112)、SKFVCN (SEQ. ID. NO :113)、 TEQPGCEN(SEQ. ID. NO :114)、VCYDAFAP (SEQ. ID. NO :115)、LSHVRFffVFQ (SEQ. ID. NO :116)。 肽在长度上可以仅为3个氨基酸，包括SRL、PCH、LCP、CHP、IYY、SKF、QPC、VCY、APL、HVR, 或更长，例如:LIQYFLYGFQVHPF(SEQ. ID. NO :117)、VHPFYCSRLPCHP (SEQ. ID. NO :118)、 VGGESIYYDEQSKFVCNTEQPG (SEQ. ID. NO :119)、TEQPGCENVCYDAFAPLSHVRF (SEQ. ID. NO :120)、 AFAPLSHVRFffVFQ(SEQ. ID. NO :121)。示例性的肽还可以包括在属于Griffith的W0200303^64中报道的那些 肽，包括，例如，与连接蛋白的一种或多种间隙沈和27细胞外环部分同源的合成肽、 VCYDQAFPISHIR(SEQ. ID. NO 122)、VCYDKSFPISHVR (SEQ. ID. NO :123)、SRPTEKTIFII (SEQ. ID. NO :124)、SRPTEKNVFIV(SEQ. ID. NO :125)、RVDCFLSRPTEK (SEQ. ID. NO :126)、 PVNCYVSRPTEK(SEQ. ID. NO :127)、IVDCYVSRPTEK(SEQ. ID. NO :128)、SRPTEKT(SEQ. ID. NO :129)、VCYDQAFPISHIR(SEQ. ID. NO :130)、VCYDKSFPISHVRI (SEQ. ID. NO :131)、 SRPTEKTIFII(SEQ. ID. NO :132)、SRPTEKNVFIV (SEQ.ID.NO :133)、RVDCFLSRPTEK(SEQ. ID. NO :134)、PVNCYVSRPTEK (SEQ. ID. NO :135)、以及 IVDCYVSRPTEK (SEQ. ID. NO :136)、 SRPTEKT(SEQ. ID. NO :137)。本文讨论了同源性和同源物。这样的多肽通常与相关序列具有至少约70%同源性、优选至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%的同源性，所述 相关序列例如在至少约15、至少约20、至少约40、至少约100个更多连续多肽的区上。可以基于本领域中的任何方法来计算同源性。例如UWGCGPackage (软件包)提供 了 BESTFIT程序，该程序可以用来计算同源性(例如基于它的默认设置而使用)(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12:387-395)。PILEUP 和 BLAST 算法可以用来计算 同源性或将序列排成一行(通常基于它们的默认设置)，例如如在Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36 :290-300 ；Altschul, S, F et al(1990)J Mol Biol 215 :403-10 中所描述的。通过 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)可以公开获得用于进行BLAST分析的软件。这种算法涉及首先通过识别在 查询序列中长度W的短字来识别高得分序列对(HSP)，当对比在数据库序列中相同长度的 字时，上述短字匹配或满足一定的正估值阈值得分Τ。T被称作邻近字得分阈值(Altschul 等人，上文)。这些初始邻近字命中(hits)作为种子，用于引发搜索以发现包含它们的HSP。 沿着每个序列在两个方向扩展字命中，直到可以增加累计序列对比得分。当累计序列对比 得分从其最大达到值下降量X时，当由于一个或多个负得分残基序列对比的累积而引起累 积得分变成零或以下时；或达到任一序列的末端时，则停止在每个方向上的字命中的扩展。BLAST算法参数W、T以及X确定了序列对比的敏感性和速度。BLAST程序使用11 的字长(W)、BL0SUM62 得分矩阵(参见 Henikoff and Henikoff (1992)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89 :10915-10919)、50 的序列对比(B)UO 的期望值(E)、M = 5、N = 4、以及两条 链的比较作为默认值。 BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；参见例如，Kar 1 in and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787。由 BLAST 算法提供的相似性的 一种度量是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的 指示。例如，如果在比较第一序列与第二序列时最小总和概率小于约1、优选小于约0. 1、更 优选小于约0. 01、以及最优选小于约0. 001，则一序列被认为类似于另一序列。同源序列通常不同于相关序列至少约(或不大于)2、5、10、15、20个更多突变(其 可以是替代、缺失或插入)。可以穿过与计算同源性有关的上述任何区来测量这些突变。同源序列通常以显著高于背景的水平来选择性地杂交于原始序列。通常利用中等 至高严格性的条件来实现选择性杂交。然而，可以在本领域已知的任何合适条件下来进行 这样的杂交( 参见 Sambrook et al. (1989) ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual) 间隙连接调节剂包括这样的药剂，其可以关闭或阻断间隙连接和/或半通道或以 其它方式防止或减少经由间隙连接的细胞与细胞通讯或防止或减少经由半通道与细胞外 环境的细胞通讯。它们包括可以全部或部分地防止、减小或抑制半通道或间隙连接的活性、 功能、或形成的药剂或化合物。在某些实施方式中，间隙连接调节剂会诱导半通道或间隙连接的全部或部分闭 合。在其它实施方式中，间隙连接调节剂会全部或部分地阻断半通道或间隙连接。在某些 实施方式中，间隙连接调节剂会全部或部分地减少或防止半通道或间隙连接的开放。在某些实施方式中，通过防止或减少小分子通过开放通道流向和流出细胞外间隙 或周质间隙，间隙连接或半通道通过间隙连接调节剂的所述阻断或闭合可以减少或抑制细胞外半通道通讯。在授予Jensen等人的美国专利第7，153，822号、美国专利第7，250，397号、以及 各类专利公开中已报道了用于闭合半通道或间隙连接的间隙连接调节剂(例如磷酸化连 接蛋白43酪氨酸残基)。还参见Gourdie等人，参见W02006069181，关于连接蛋白羧基末 端多肽，据说其可以，例如，抑制ZO-I蛋白结合。Gourdie等人，W02006069181描述了包含 这样的肽的配方的应用。如在本文中所使用的，“间隙连接磷酸化剂”可以包括能够诱导连接蛋白氨基酸残 基上的磷酸化以便诱导间隙连接或半通道闭合的那些药剂或化合物。磷酸化的示例性部位 包括在连接蛋白上的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基中的一种或多种。在某些实施方式中，磷 酸化的调节可以发生在一种或多种连接蛋白上的一种或多种残基上。示例性间隙连接磷 酸化剂在本领域中是众所周知的并且可以包括，例如，c-Src酪氨酸激酶或其它G蛋白偶联 受体激动剂。参见 Gi 印 mans B, J. Biol. Chem.，Vol.276，Issue 11,8544-8549, March 16, 2001。在一种实施方式中，在一种或多种这些残基上的磷酸化的调节会影响半通道功能，尤 其通过闭合半通道。在另一种实施方式中，在一种或多种这些残基上的磷酸化的调节会影 响间隙连接功能，尤其通过闭合间隙连接。靶向连接蛋白43间隙连接和半通道的闭合的间 隙连接磷酸化剂是优选的。还有的其它抗连接蛋白剂包括连接蛋白羧基末端多肽。参见Gourdie等人， W02006/069181。在某些另外的方面，间隙连接调节剂可以包括，例如，脂族醇；辛醇；庚醇；麻醉药 (例如氟烷)、恩氟烷、氟烷、丙泊酚以及硫喷妥；花生四烯酸乙醇胺；芳氨基苯甲酸酯(FFA : 氟芬那酸和类似的衍生物，其是亲脂的)；甘珀酸；查耳酮(2'，5' - 二羟基查耳酮)； CHF (氯羟基呋喃酮)；CMCF (3-氯-4-(氯甲基)-5-羟基-2 (5H)-呋喃酮)；地塞米松；多柔 比星(以及其它蒽醌衍生物)；类花生酸血栓烷AO) (TXA(2))模拟物；NO(—氧化氮)；脂 肪酸(例如花生四烯酸、油酸以及脂肪氧合酶代谢产物；芬那酸(氟芬那酸(FFA)、尼氟酸 (NFA)以及甲氯芬那酸(MFA))；染料木黄酮；甘草次酸(GA) :18a_甘草次酸和18-β-甘草 次酸、以及它们的衍生物；林旦；溶血磷脂酸；甲氟喹；甲萘醌；2-甲基-1，4-萘醌、维生素 K(3)；萘酚平调田酸；油酰胺；油酸；通过细胞内酸化的PH调节剂；例如酸化剂；多不饱和 脂肪酸；脂肪酸GJIC抑制剂(例如油酸和花生四烯酸)；奎尼定；奎宁；所有反式视黄酸； 以及他莫昔芬。剂型、配方以及给药本发明的间隙连接调节剂(通常以本文所讨论的配方的形式)可以给予需要治疗 的受治疗者，如具有本文提及的任何伤口的受治疗者。因此可以改善受治疗者的伤口。因 此，通过治疗，间隙连接调节剂和配方可以用于治疗受治疗者的身体。它们可以用于制造药 物以治疗本文提及的任何伤口。因此，根据本发明，提供了这样的配方，通过该配方可以以瞬时和部位特异性方式 向下调节细胞间和/或半通道通讯。可以方便地使用药用载体配制间隙连接调节剂以产生 所期望的最终浓度。间隙连接调节剂可以以基本上分离的形式存在。应当理解，产品可以与载体或稀 释剂混合，该载体或稀释剂将不会干扰产品的预期目的，并且仍然被看作基本上分离的。本发明的产品还可以以基本上纯化的形式，在这种情况下，它将通常包含约80%、85%、或 90%，例如至少约95%、至少约98%或至少约99%的肽(或其它间隙连接调节剂)或制剂
的干质量。
取决于预期的给药途径，本发明的药物产品、药物组合物、联合制剂以及药物可 以，例如，采取以下形式溶液、混悬剂、滴注剂、药膏、乳膏剂、凝胶剂、泡沫、喷雾剂、软 膏剂、乳剂、洗剂、涂剂、缓释剂型、或粉剂，并且通常包含0.01%至约的活性组分、约 1% -50%的活性组分、约2% -60%的活性组分、约2% -70%的活性组分、或高达约90%的 活性组分。其它合适的剂型包括基于Pluronic (普流尼克)凝胶的剂型、基于羧甲基纤维 素(CMC)的剂型、以及基于羟丙基甲基纤维素(HPMC)的剂型。合适的剂型(包括pluronic 凝胶)，例如包含约10%至约15%，合适地约12%的pluronic凝胶。其它有用的剂型包括 缓慢或延迟释放制剂。可以利用包括但不限于明胶、黄芪胶、或纤维素衍生物的合适的胶凝剂来制备凝 胶剂或胶冻剂，并且凝胶剂或胶冻剂可以包括甘油(作为保湿剂)、软化剂、以及防腐剂。软 膏剂是半固体制剂，该半固体制剂由加入到脂肪基质、蜡基质、或合成基质中的活性组分构 成。合适的乳膏剂的实例包括但不限于油包水乳剂和水包油乳剂。通过利用合适的乳化剂 可以配制油包水乳膏剂，其中乳化剂的性能类似但不限于脂肪醇如十六醇或十六醇十八醇 混合物以及乳化蜡的性能。可以利用乳化剂如聚西托醇乳化蜡来配制水包油乳膏剂。合适 的性能包括在广泛的PH值范围内改进乳状液的粘度以及物理和化学稳定性的能力。水溶 性或水溶混性膏基质(膏用底物)可以包含防腐剂体系并且还可以加以缓冲以维持可接受 的生理PH值。可以配制泡沫制剂以利用惰性推进剂经由合适的涂药器从加压的气雾罐进行递 送。用于配制泡沫基质的合适的赋形剂包括但不限于丙二醇、乳化蜡、十六醇、以及硬脂酸 甘油酯。潜在的防腐剂包括羟苯甲酯和羟苯丙酯。优选地，间隙连接调节剂与药用载体或稀释剂组合以产生药物组合物。合适的载 体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲液。合适的稀释剂和赋形剂还包括，例如， 水、盐水、葡萄糖、甘油等、以及它们的组合。此外，如果需要的话，还可以存在一些物质如湿 润剂或乳化剂、稳定剂或PH值缓冲剂。术语“药用载体”是指任何药物载体，该药物载体本身并不诱导对接受组合物的个 体有害的抗体的产生，并且其可以给予而没有过分的毒性。合适的载体可以是较大的、缓慢 代谢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、以及氨基酸共聚物。还可以存在药用盐，例如，无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及 有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。合适的载体材料包括任何载体或媒介物(赋形剂)，其通常用作用于乳膏剂、 洗剂、喷雾剂、泡沫、凝胶剂、乳剂、洗剂或涂剂(用于局部给药)的基质。实例包括乳化 齐 、包括烃基质的惰性载体、乳化基质、非毒性溶剂或水溶性基质。特别合适的实例包括 pluronics, HPMC、CMC以及其它基于纤维素的组分、羊毛脂、硬石蜡、液体石蜡、黄软石蜡或 软性白石蜡、白蜂蜡、黄蜂蜡、十六醇十八醇混合物、十六醇、二甲基硅氧烷、乳化蜡、肉豆蔻 酸异丙酯、微晶蜡、油醇以及硬脂醇。优选地，药用载体或媒介物是凝胶，合适地非离子型聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物凝胶，例如，Pluronic凝胶，优选PluronicF-127 (BASF Corp.)。该凝胶是特别优选的，因为 它在低温下是液体但在生理温度下会快速凝固，这可以将ODN成分的释放限制于施加部位 或紧邻上述部位。在本发明的剂型(配方)中还可以包括助剂如酪蛋白、明胶、白蛋白、胶剂、藻酸 钠、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素或聚乙烯醇。其它合适的剂型(配方)包括基于pluronic凝胶的剂型、基于羧甲基纤维素 (CMC)的剂型、以及基于羟丙基甲基纤维素(HPMC)的剂型。组合物可以被配制成用于递送 的任何所期望的形式，其包括局部、滴注、胃肠道外、肌内、皮下、或经皮给予。其它有用的剂 型包括缓慢或延迟释放制剂。对于给定受治疗者或伤口的有效剂量可以通过例行试验或本领域已知或以后开 发的其它方法来确定。例如，为了配制一定范围的剂量值，可以使用细胞培养试验和动物研 究。上述化合物的剂量优选在这样的剂量范围内，其对于至少50%的群体是治疗有效的，并 且在该水平下呈现很少或不呈现毒性。在本发明的方法和组合物中采用的每种间隙连接调节剂的有效剂量可以取决于 许多因素而变 化，这些因素包括所采用的一种或多种特定的间隙连接调节剂、给药方式、给 药频率、正治疗的伤口、正治疗伤口的严重性、给药途径、待治疗患者亚群体的需要或个别 患者的需要，上述不同需要可以起因于年龄、性别、体重、患者特有的有关医疗伤口。给予患者的间隙连接调节剂的剂量将取决于各种因素如患者的年龄、体重和一般 伤口情况、正治疗的伤口、以及正给予的特定间隙连接调节剂。合适的剂量可以基于间隙连接调节剂的量/kg受治疗者的体重，并且包括约 0. 001至约100mg/kg体重如约0. 01至约40mg/kg体重。然而合适的剂量可以是约0. 001 至约0. lmg/kg体重如约0. 01至约0. 050mg/kg体重。合适的剂量可以是约0. 001至约0. lmg/kg体重如约0. 01至约0. lmg/kg体重。 然而，合适的剂量可以是约0. 001至约0. 25mg/kg体重，包括约0. 001至约0. 050mg/kg体 重。可替换地，例如，在某些实施方式中，每种受治疗者化合物的剂量将通常在约Ing至约1 微克/kg体重、约Ing至约0. 1微克/kg体重、约Ing至约10ng/kg体重、约IOng至约0. 1 微克/kg体重、约0. 1微克至约1微克/kg体重、约20ng至约lOOng/kg体重、约0. OOlmg 至约100mg/kg体重、约0. Olmg至约10mg/kg体重、或约0. Img至约lmg/kg体重的范围内。 在某些实施方式中，每种受治疗者化合物的剂量将通常在约0. OOlmg至约0.0lmg/kg体重、 约0. Olmg至约0. lmg/kg体重、约0. Img至约lmg/kg体重、或约Img至约10mg/kg体重的 范围内。如果使用多于一种的间隙连接调节剂，则每种间隙连接调节剂的剂量无需在与其 它相同的范围内。约1至100、200、300、400、500微克、以及高达1毫克/施加的剂量是合适的。间 隙连接调节剂剂量包括，例如，约1、约2、约3、约4、或约5微克、约5至约10微克、约10至 约15微克、约15至约20微克、约20至约30微克、约30至约40微克、约40至约50微克、 约50至约75微克、约75至约100微克、约100微克至约250微克、以及250微克至约500
微克。还提供了约0. 5至约1. 0毫克或更大的剂量。可替换地，在本发明的组合物中每种间隙连接调节剂的剂量可以通过参照相对于 将施加区域的大小、长度、深度、面积或体积的组合物的浓度来确定。例如，在某些局部施加中，可以基于在药物组合物中的质量(例如克)或浓度(例如yg/ul)/施加区域的长度、 深度、面积、或体积来计算药物组合物的剂量。因此，其它有用的剂量范围为约ι至约 ο微 克/平方厘米伤口大小。某些剂量将是约1-2、约1-5、约2-4、约5-7、以及约8_10微克/平 方厘米伤口大小。其它有用的剂量是大于约10微克/平方厘米伤口大小，其包括约15微 克/平方厘米伤口大小、约20微克/平方厘米伤口大小、约25微克/平方厘米伤口大小、 约30微克/平方厘米伤口大小、约35微克/平方厘米伤口大小、约40微克/平方厘米伤口 大小、约50微克/平方厘米伤口大小、以及约100至约150微克/平方厘米伤口大小。其 它剂量包括约150-200微克/平方厘米、约200-250微克/平方厘米、约250-300微克/平 方厘米、约300-350微克/平方厘米、约350-400微克/平方厘米、以及约400-500微克/ 平方厘米。还有其它的剂量包括500-1000微克/平方厘米范围的剂量。其它剂量可以是 1-10毫克/ 平方厘米。缓释剂型可以特别适用于抗连接蛋白肽和拟肽。在某些实施方式中，可以在治疗部位和/或邻近治疗部位，以约0. 01微摩尔(μ Μ) 或0. 05 μ M至约200 μ Μ、或高达300 μ M或高达1000 μ Μ、或高达2000 μ M或高达3200 μ M 或更大的最终浓度、以及在这些剂量数值范围内的任何剂量和剂量范围来施加间隙连接调 节剂组合物。优选地，以约0. 05 μ M至约100 μ M的最终浓度来施加间隙连接调节剂(包括 抗连接蛋白肽或拟肽组合物)，更优选地，以约1. 0 μ M至约50 μ M的最终浓度来施加间隙 连接调节剂组合物，并且更优选地，以约5-10 μ M至约30-50 μ M的最终浓度来施加间隙连 接调节剂组合物。另外，以约8μΜ至约20 μ M的最终浓度来施加组合的间隙连接调节剂 组合物，以及可替换地，以约10 μ M至约20 μ M的最终浓度、或以约10至约15 μ M的最终 浓度，来施加间隙连接调节剂组合物。在某些其它实施方式中，以约ΙΟμΜ的最终浓度来 施加间隙连接调节剂。在其它实施方式中，以约20μΜ、30μΜ、40μΜ、50μΜ、60μΜ、70μΜ、 80 μ Μ,90 μ Μ、100 μ Μ、10-200 μ Μ、200-300 μ Μ,300-400 μ Μ,400-500 μ Μ、500-600 μ Μ、 600-700 μ Μ, 700-800 μ Μ、800_900 μ Μ、或 900-1000 μ M 或 1000-1500 μ Μ、或 1500-2000 μ M 或2000-3000 μ M或更大的最终浓度、或这些范围内的任何剂量，来施加抗连接蛋白剂。在又一种另外的实施方式中，以约1-15 μ M的最终浓度来施加间隙连接调节剂组 合物。间隙连接调节剂的剂量包括，例如，约0. 1-1、1-2、2-3、3_4、或4-5微克(μ g)、约5 至约10μ g、约10至约15μ g、约15至约20μ g、约20至约30μ g、约30至约40μ g、约40 至约50 μ g、约50至约75 μ g、约75至约100 μ g、约100 μ g至约250 μ g、以及250 μ g至约 500 μ g。如上文所述，还提供了 0. 5至约1. 0毫克或更大的剂量。剂量体积将取决于待治疗部位的大小，并且可以在，例如，约25-100 μ L至约 100-200 μ L、约200-500 μ L至约500-1000 μ L的范围。毫升剂量还适用于更大的治疗部位。方便地，以足够的量给予组合物，以在给予以后，向下调节所述连接蛋白的表达、 或调节间隙连接形成或连接子开放至少约0. 5至1小时、至少约1-2小时、至少约2-4小时、 至少约4-6小时、至少约6-8小时、至少约8-10小时、至少约12小时、或至少约24小时。在本发明的组合物和方法中，每种间隙连接调节剂的剂量还可以通过参照相对于 将施加区域的大小、长度、深度、面积或体积的组合物的浓度来确定。例如，在某些局部和 其它用途中，例如，滴注法中，可以基于药物组合物的质量(例如微克)或浓度(例如yg/ μ 1)/施加区域的长度、深度、面积、或体积来计算药物组合物的剂量。
若干种间隙连接调节剂的组合使用可以减少任何个别成分需要的剂量，因为不同 成分的作用的起始和持续时间可以是互补的。在这样的组合疗法中，可以一起或分别地、以 及同时或在一天内的不同时间递送不同的活性剂。
可以以单独的或分开的施加来给予剂量。可以一次给予剂量，或可以重复施加。通 常，每周进行重复施加约一次，或当伤口愈合可能似乎停止或放慢时进行重复施加。可以相 隔1至7天或更长时间施加剂量。可以进行重复施加，例如，每周、或每两周、或每月或以其 它频率，例如如果和当伤口愈合放慢或停止时。可替换地，对于一些适应症，如某些眼部应 用，可以采用更加频繁地给予剂量，直到每小时。可以通过相同或不同的途径来给予一种或多种间隙连接调节剂。优选地，通过局 部给予(外周或直接到部位)来递送一种或多种间隙连接调节剂，包括但不限于利用载体 (如敷料和其它基质)和药物剂型(如凝胶剂、混合剂、混悬剂以及软膏剂)来局部给予。 在一种实施方式中，载体包含生物相容膜或进入治疗部位中的插入物。在另一种实施方式 中，载体包含敷料或基质。在本发明的一种实施方式中，载体组合物可以是缓释载体组合 物，其中一种或多种间隙连接调节剂被分散在缓释固体基质如藻酸盐、胶原、或合成可生物 吸收聚合物的基质中。优选地，载体组合物是无菌的或低生物负荷的。在一种实施方式中， 可以使用包含一种或多种间隙连接调节剂的洗液。配方的间隙连接调节剂成分的递送可以发生在一段时间内，在一些情况下为约 1-2小时、约2-4小时、约4-6小时、约6-8、或约24小时或更长时间，在某些矫形治疗或更 加严重损伤或伤口或在慢性或延迟愈合伤口的治疗中，可以是特别有利的。在一些情况下， 细胞损失可以充分扩展到手术部位以外至周围细胞。这样的损失可以发生在最初手术的24 小时内并且通过间隙连接细胞间通信来介导。因此，间隙连接调节剂的给予，例如，用于连 接蛋白表达的向下调节、或连接子开放的阻断，将调节细胞之间的通讯、或进入细胞外间隙 的损失(在连接子调节的情况下)，以及使另外的细胞损失或损伤或损伤的后果降至最小 程度。虽然递送期将取决于要诱导向下调节的部位和所期望的治疗效果，但提供了连续 或缓释递送约1-2小时、约2-4小时、约4-6小时、约6-8、或约24小时或更长时间。根据本 发明，这是通过在剂型中包含间隙连接调节剂、以及药用载体或赋形剂来实现的。根据一个方面，间隙连接调节剂可以局部给予(在待治疗部位)。在一个方面，间 隙连接调节剂与药用载体或稀释剂组合以产生药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗 盐水溶液，例如磷酸盐缓冲液。在另一个方面，组合物可以配制成用于肌内、皮下、或经皮给 予。本文描述的给药途径和剂量旨在仅作为用于任何特定患者和伤口的剂量的指导。敷料和基质在一个方面，以敷料或基质的形式提供了一种或多种间隙连接调节剂。在某些实 施方式中，以液体、半固体或固体组合物的形式提供了一种或多种间隙连接调节剂，用于直 接施加，或将组合物施加至固体接触层如药用纱布或基质的表面、或加入固体接触层如药 用纱布或基质中。可以例如以液体或凝胶剂的形式提供敷料组合物。可以连同用于局部施 加的常规药物赋形剂一起提供一种或多种间隙连接调节剂。合适的载体包括=Pluronic凝 胶，泊洛沙姆凝胶，包含纤维素衍生物的水凝胶，其中纤维素衍生物包括羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素以及它们的混合物；以及包含聚丙烯酸的水 凝胶(卡波普)。合适的载体还包括用于局部药物制剂的乳膏/软膏，例如，基于聚西托醇 乳化软膏的乳膏。上述载体可以包括藻酸盐(作为增稠剂或刺激剂)，防腐剂如苯甲醇，控 制PH值的缓冲剂如磷酸氢二钠/磷酸二氢钠，调节同渗浓度的药剂如氯化钠，以及稳定剂 如 EDTA0在一种实施方式中，在天然或合成基质上给予一种或多种抗连接蛋白肽或拟肽， 例如抗连接蛋白43肽或拟肽。合适的敷料或基质可以包括，例如，以下制剂并连同一种或多种间隙连接调节剂。 连接蛋白43间隙连接调节剂是优选的1)吸收剂合适的吸收剂可以包括,例如，吸收件敷料,其可以提供，例如，半附着 质量或非附着层，并结合于纤维的高度吸收层，如例如，纤维素、棉花或人造丝。可替换地， 吸收剂可以用作主要或辅助敷料。2)合适的藻酸盐包括，例如，敷料，该敷料是非编织、非粘附垫子和系带， 其由来源于海藻的天然多糖纤维或干凝胶构成。合适的藻酸盐敷料可以，例如，在与渗出物 接触以后通过离子交换过程而形成湿凝胶。在某些实施方式中，藻酸盐敷料被设计成软的 和适合的、容易填塞、盖住(tuck)或施加于不规则形状区域上。在某些实施方式中，藻酸盐 敷料可以与第二敷料一起使用。3)抗微牛物敷料在需要或期望的情况下，合适的抗微生物敷料可以包括，例如， 可以促进生物活性剂递送的敷料，如，例如，银和聚六亚甲基双胍(PHMB)，以维持抵抗感染 的效力。在某些实施方式中，合适的抗微生物敷料可以例如，作为海绵、浸渍编织纺布、薄膜 敷料、吸收性产品、岛状敷料、尼龙织物、非粘附阻挡层、或上述材料的组合而获得。4)生物及生物合成材料合适的生物敷料或生物合成敷料可以包括，例如，凝胶、 溶液或半透片，其来自天然来源。在某些实施方式中，将凝胶或溶液施加至治疗部位并用敷 料覆盖，用于屏障保护。在另一种实施方式中，原位放置片，其可以作为膜，并在单次施加以 后保留在适当位置。5)胶原合适的胶原敷料可以包括，例如，凝胶、垫子、颗粒、糊剂、粉剂、片或溶 液，其来源于例如，牛、猪或禽源或其它天然来源或供体。在某些实施方式中，胶原敷料可以 与治疗部位渗出物相互作用以形成凝胶。在某些实施方式中，胶原敷料可以连同辅助敷料
一起使用。 6) ff合物合适的复合物敷料可以包括,例如，这样的敷料,其将物理上不同的成 分结合成单一产品以提供多种功能，如，例如，细菌屏障、吸收和附着。在某些实施方式中， 复合物敷料由例如多层构成并且结合半或非附着垫子。在某些实施方式中，复合勉还可以 包括例如，非编织织物带或透明薄膜的粘附边缘。在某些其它实施方式中，复合物敷料可以 作为例如，主要或辅助敷料起作用，以及在又一种实施方式中，可以连同局部药物组合物一 起使用敷料。7)^MM:合适的接触层敷料可以包括，例如，薄的非粘附片，其被放置在一个区 域上以防止组织例如与施加于治疗部位的其它药剂或敷料直接接触。在某些实施方式中， 接触层可以被展开以符合治疗部位的区域形状并且是多孔的以便于渗出物穿过，从而被覆 盖的辅助敷料吸收。在又一种实施方式中，可以连同局部药物组合物一起使用接触层敷料。
8)弹 件绷带合适的弹性绷带可以包括，例如，伸展并符合身体轮廓的敷料。在某 些实施方式中，织物成分可以包括例如，棉花、聚酯纤维、人造丝或尼龙。在某些其它实施方 式中，弹性绷带可以例如，提供吸收剂作为第二层或敷料，以将覆盖物保持在适当位置、施 加压力或保护治疗部位。9) Μ:合适的泡沫敷料可以包括，例如，具有能够保持流体的较小开放单元 (open cell)的片和其它形状泡沫聚合物溶液(包括聚氨酯)。示例性的泡沫可以例如连 同其它材料一起进行浸渍或层压。在某些实施方式中，可以基于泡沫的厚度和组成来调节 吸收能力。在某些其它实施方式中，与治疗部位接触的区域可以是非粘附的，以易于去除。 在又一种实施方式中，可以连同可用作抗感染屏障的粘附边缘和/或透明薄膜涂层一起使 用泡沫。10)纱布以及非编织敷料合适的纱布敷料和编织敷料可以包括，例如，具有不同 吸收程度的干编织或非编织海绵和包裹材料。示例性的织物成分可以包括，例如，棉花、聚 酯纤维或人造丝。在某些实施方式中，纱布和非编织敷料可以是无菌或非无菌地可用的 (散装)并且具有或没有粘附边缘。示例性的纱布敷料和编织敷料可以用于清洁、填塞以及 覆盖各种治疗部位。11)亲水胶合适的亲水胶敷料可以包括,例如，糯米纸、粉剂或糊剂，其由明胶、 果胶或羧甲基纤维素构成。在某些实施方式中，糯米纸是自粘的并且在有或没有粘附边缘 的情况下可用以及以各种形状和大小。示例性的亲水胶可用于需要外形修复的区域上。在 某些实施方式中，可以连同辅助敷料一起使用粉剂和糊剂亲水胶。12)水凝胶(无定形)合适的无定形水凝胶敷料可以包括，例如，水、聚合物以及 其它组分的没有形状的配方，其被设计成提供水分和维持湿性愈合环境和/或再水化治疗 部位。在某些实施方式中，可以连同辅助敷料覆盖物一起使用水凝胶。13)水凝胶浸渍敷料合适的浸渍水凝胶敷料可以包括，例如，用无定形水凝胶 饱和的纱布和非编织海绵、绳子以及条带。无定形水凝胶可以包括例如，水、聚合物以及 其它组分的没有形状的配方，其被设计成向干燥的治疗部位提供水分以及维持湿性愈合环
^Mi ο14)水凝胶片合适的水凝胶片可以包括例如，交联亲水性聚合物的三维网络，其 中聚合物不溶于水并通过溶胀与水溶液相互作用。示例性的水凝胶是高度适合的和可渗透 的并且取决于它们的组成可以吸收不同量的引流物。在某些实施方式中，水凝胶相对于治 疗部位是非粘附的，以易于去除。15)浸渍敷料合适的浸渍敷料可以包括，例如，用溶液、乳状液、油、凝胶或一些 其它药物活性化合物或载体试剂(包括例如，盐水、油、锌盐、凡士林、三溴酚铋和猩红以及 本文描述的化合物)饱和的纱布和非编织海绵、绳子和条带。16)硅凝胶片合适的硅凝胶片敷料可以包括，例如，软覆盖物，该软覆盖物由交 联聚合物构成，其中交联聚合物用网状物或织物增强或结合于网状物或织物。17)溶液合适的液体敷料可以包括，例如，多蛋白材料和其它要素(在细胞外基 质中发现的)的混合物。在某些实施方式中。可以在清创术和清洁以后将示例性溶液施加 于治疗部位，然后用吸收性敷料或非粘附垫子覆盖。18)透明薄膜合适的透明薄膜敷料可以包括不同厚度的聚合物膜，该聚合物膜借助于粘合剂涂布在一侧上。在某些实施方式中，透明薄膜对于液体、水以及细菌是不可渗 透的，但对于水蒸汽和大气气体是可渗透的。在某些实施方式中，透明性便于治疗部位的可 视化。19)填 料合适的填料敷料可以包括，例如，珠、乳膏、泡沬、凝胶、软膏、垫子、糊 齐U、枕垫、粉剂、丝状体或其它配方。在某些实施方式中，填料是非粘附的并且可以包括随时 间释放的抗微生物剂。示例性的填料可以用于维持湿环境、管理渗出物、以及用于治疗例 如，局部和全层伤口、感染伤口、引流伤口以及需要填塞的深部伤口。治疗患有或怀疑患有本文提及或描述的疾病、障碍、和/或病症的受治疗者的任 何方法可以利用本文描述的任何剂量、剂型、配方、和/或组合物的给予。肽和其它间隙连接调节组合物本发明涉及包含间隙连接调节化合物(包括拟肽)的药物组合物。该组合物可用 于加强或促进例如慢性伤口和延迟或难以愈合的伤口(包括如本文描述的其它伤口)的愈 合。同样地，在其它组织损伤的情况下，本发明的方法和组合物可有效促进伤口愈合过程和 减少发炎。因此，本发明的配方和组合物可以明显有利于治疗慢性和缓慢愈合伤口、以及如 本文描述的其它伤口。在某些实施方式中，本发明的组合物包含有效量的一种或多种间隙连接调节剂。 在一种实施方式中，组合物包含间隙连接调节剂，该间隙连接调节剂靶向仅与一种连接蛋 白有关的间隙连接。最优选地，该间隙连接与连接蛋白43蛋白有关。可替换地，组合物可以包含靶向间隙连接的一种或多种间隙连接调节剂，其中上 述间隙连接与多于一种连接蛋白有关。优选地，调节剂所定向的连接蛋白之一是连接蛋白 43。调节剂所定向的其它间隙连接可以包括，例如，与连接蛋白26、30、30·3、31· 1、32、36、 37,40,40. 1,44. 6、45以及46有关的间隙连接。在其它实施方式中，本发明的组合物包含(a)有效量的一种或多种间隙连接调节 剂以及(b)药用载体或稀释剂。在一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含(a) 一种或多种多肽以及(b)药用载体或稀释剂。在一种优选的实施方式中，多肽是连接蛋白 26、31. 1、32、37、40、43或45拟肽或它们的同系物。在其它实施方式中，多肽是连接蛋白30、 30. 3、36、40. 1、44. 6、45或46拟肽或它们的同系物。在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含(a) —种或多种 结合蛋白以及(b)药用载体或稀释剂。在一种实施方式中，结合蛋白是抗体。在一种优选 的实施方式中，结合蛋白是单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、单链抗体、单链Fv、或单链 结合分子。在一种实施方式中，结合蛋白，例如抗体，特异性地结合于连接蛋白多肽，优选连 接蛋白26、连接蛋白30、连接蛋白31. 1、连接蛋白32、连接蛋白37、连接蛋白40或连接蛋白 45多肽或它们的任何部分。在一种优选的实施方式中，结合蛋白，例如抗体，特异性地结合 于连接蛋白43多肽或其任何部分。在一种实施方式中，结合蛋白特异性地结合于连接蛋白 多肽并且具有大于或等于约104M_\大于或等于约106Μ_\大于或等于约107Μ_\或大于或等 于约IO8M4的亲和力。甚至大于约IO8M4的亲和力也是合适的，如等于或大于约IO9M^约 ΙΟ1、—1、约ΙΟ^Μ—1、以及约ΙΟ1、—1的亲和力。在另一种实施方式中，药物组合物包含(a) —种或多种结合蛋白以及(b)药用载 体或稀释剂，其中结合蛋白是肽抑制剂。在一种实施方式中，肽抑制剂包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列对应于连接蛋白26、连接蛋白30、连接蛋白31. 1、连接蛋白32、连接蛋白 37、连接蛋白40或连接蛋白45的跨膜区。在一种优选的实施方式中，肽抑制剂包含对应于 连接蛋白43的跨膜区的氨基酸序列。在另一种实施方式中，肽抑制剂包含在SEQ. ID. NO 1中列出的约5-20个邻接氨基酸。在另一种实施方式中，肽抑制剂包含在SEQ. ID. NO 2中 列出的约5-20个邻接氨基酸。在另一种实施方式中，肽抑制剂包含一种氨基酸序列，该氨 基酸序列对应于在SEQ. ID. NO 2的位置37-76和178-208处的区。在另一种实施方式中， 肽抑制剂包含在 SEQ. ID. NO :3、SEQ. ID. NO :4、SEQ. ID. NO :5、SEQ. ID. NO :6、SEQ. ID. NO :7、 SEQ. ID. NO :8、SEQ. ID. NO :9、SEQ. ID. NO :10、SEQ. ID. NO :11、SEQ. ID. NO :12、SEQ. ID. NO 13、SEQ. ID. NO :14、SEQ. ID. NO :15、SEQ. ID. NO :16、SEQ. ID. NO :17、SEQ. ID. NO :18、SEQ. ID. NO :19、SEQ. ID. NO :20、SEQ. ID. NO :21、SEQ. ID. NO :22、SEQ. ID. NO :23、SEQ. ID. NO :24、 SEQ. ID. N0:25、或SEQ. ID. NO :26中列出的约5_20个邻接氨基酸。在另一种实施方式中，肽 抑制剂包含在SEQ. ID. NO 27-54中列出的约8至约11个邻接氨基酸。在另一种实施方式 中，肽抑制剂包含在SEQ. ID. NO 18、19、或55-68中列出的约8至约15个邻接氨基酸。在 又一种实施方式中，肽抑制剂具有一种或多种保守氨基酸变化。Μ 本发明包括用于全部或部分治疗和/或预防各种疾病、障碍以及伤口的方法，包 括，例如，治疗并不以预期速率愈合的伤口的方法。这些伤口包括延迟或难以愈合的伤口 (包括延迟或不完全愈合的伤口)、以及慢性伤口。并不以预期速率愈合的伤口的实例包括 溃疡如糖尿病性溃疡、血管炎性溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡(静脉曲张性溃疡)、静脉停 滞性溃疡、烧伤性溃疡、感染性溃疡、创伤引起的溃疡、压迫性溃疡以及褥疮性溃疡。并不以 预期速率愈合的其它伤口包括裂开性伤口。本发明还包括用于全部或部分地治疗和/或预防慢性伤口的方法，所述慢性伤口 的特征全部或部分地在于(a)伤 口发炎的慢性自我持续状态，(b)不足和有缺陷的伤口细 胞外基质，(C)不良反应的(衰老的)伤口细胞(包括成纤维细胞)，有限的细胞外基质产 生，(d)部分由于缺乏必要的细胞外基质安排和缺乏用于迁移的脚手架而导致上皮再形成 的衰退，(e)长期发炎和蛋白水解活性，导致溃疡性病变，包括例如，糖尿病性溃疡、压迫性 溃疡(褥疮性溃疡)、静脉性溃疡、以及动脉性溃疡，(f)在受影响的区域中基质的逐步沉 积，(g)更长的修复时间，(h)更小的伤口收缩，(i)更慢的上皮再形成和/或(j)增加的肉 芽组织厚度，上述方法包括给予一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释剂。本发明还包括用于全部或部分地治疗和/或预防延迟或难以愈合的伤口的方法， 所述伤口的特征全部或部分地在于(a)长期发炎期，(b)缓慢形成细胞外基质，和/或(c) 降低速率的上皮形成，上述方法包括给予一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释 剂。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防动脉性溃疡或溃疡形成的方法，该方 法包括给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释 齐U。在一种实施方式中，动脉性溃疡或溃疡形成是由完全或部分动脉阻塞引起的。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防静脉性溃疡或溃疡形成的方法，该方 法包括给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释 齐U。在一种实施方式中，静脉性溃疡或溃疡形成是由静脉瓣的功能不良和相关的血管疾病引起的。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防静脉停滞性溃疡或溃疡形成的方法， 该方法包括给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀 释剂。在一种实施方式中，静脉停滞性溃疡或溃疡形成是由下肢的慢性被动性静脉充血和 /或形成的局部缺氧引起的。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防糖尿病性溃疡(包括糖尿病足溃疡或 溃疡形成)的方法，该方法包括给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节 剂以及药用载体或稀释剂。在一种实施方式中，糖尿病足溃疡或溃疡形成是由糖尿病的神 经系统并发症和/或血管并发症引起的。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防创伤性溃疡或溃疡形成的方法，该方 法包括给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释 齐U。在一种实施方式中，创伤性溃疡或溃疡形成与对身体的创伤性损伤有关。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防烧伤性溃疡或溃疡形成的方法，该方 法包括给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释 齐U。在一种实施方式中，烧伤性溃疡或溃疡形成与对身体的烧伤有关。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防褥疮性溃疡或溃疡形成的方法，该方 法包括给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释 剂。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防感染性溃疡或溃疡形成的方法，该方 法包括给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释 剂。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防坏疽性脓皮病的方法，该方法包括给 予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释剂。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防裂开性伤口的方法，该方法包括给予 一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释剂。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防持续性上皮缺损的方法，该方法包括 给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释剂。本发明还包括全部或部分地治疗和/或预防压迫性溃疡或溃疡形成的方法，该方 法包括给予一种组合物，该组合物包含一种或多种间隙连接调节剂以及药用载体或稀释 齐U。在某些实施方式中，所述压迫性溃疡或溃疡形成是AHCPR 1期、2期、3期、和/或4期 溃疡或溃疡形成。在又一个另外的方面，本发明提供了一种在患者中促进伤口愈合的方法，该方法 包括以下步骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速 率愈合的伤口，以在和/或紧邻所述伤口的部位关闭间隙连接或半通道。在另一个方面，本发明提供了一种在患者中减少发炎的方法，该方法包括以下步 骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速率愈合的伤 口，以在和/或紧邻所述伤口的部位关闭间隙连接或半通道。 在又一个另外的方面，本发明提供了一种在患者中促进伤口愈合的方法，该方法 包括以下步骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速率愈合的伤口，以在和/或紧邻所述伤口的部位阻断间隙连接或半通道。在另一个方面，本发明提供了一种在患者中减少发炎的方法，该方法包括以下步 骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速率愈合的伤 口，以在和/或紧邻所述伤口的部位阻断间隙连接或半通道。在又一个另外的方面，本发明提供了一种在患者中促进伤口愈合的方法，该方法 包括以下步骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速 率愈合的伤口，以在和/或紧邻所述伤口的部位全部或部分地防止或减少间隙连接或半通 道活性。在另一个方面，本发明提供了一种在患者中减少发炎的方法，该方法包括以下步 骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速率愈合的伤 口，以在和/或紧邻所述伤口的部位全部或部分地防止或减少间隙连接或半通道活性。在又一个另外的方面，本发明提供了一种在患者中促进伤口愈合的方法，该方法 包括以下步骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速 率愈合的伤口，以在和/或紧邻所述伤口的部位全部或部分地防止或减少间隙连接或半通 道的开放。

在另一个方面，本发明提供了一种在患者中减少发炎的方法，该方法包括以下步 骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速率愈合的伤 口，以在和/或紧邻所述伤口的部位全部或部分地减小或防止间隙连接或半通道的开放。在又一个另外的方面，本发明提供了一种在患者中促进伤口愈合的方法，该方法 包括以下步骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速 率愈合的伤口，以在和/或紧邻所述伤口的部位全部或部分地防止或减少细胞外半通道通 讯。在另一个方面，本发明提供了一种在患者中减少发炎的方法，该方法包括以下步 骤将包含一种或多种间隙连接调节剂的组合物以有效的量给予并不以预期速率愈合的伤 口，以在和/或紧邻所述伤口的部位全部或部分地减小或防止细胞外半通道通讯。根据一个方面，间隙连接调节剂可以通过促进上皮再形成通过调节上皮基底细胞 分裂和生长而促进伤口愈合。在一个方面，本发明涉及一种在受治疗者中促进或改善伤口愈合的方法，该方法 包括以有效的量给予一种或多种间隙连接调节剂，以调节上皮基底细胞分裂和生长。在一 种实施方式中，间隙连接调节剂是抗连接蛋白肽或拟肽，其可有效调节上皮基底细胞分裂 和生长。在一种实施方式中，间隙连接调节剂是连接蛋白26间隙连接调节剂、连接蛋白43 间隙连接调节剂、或它们的混合物。在一个方面，本发明涉及一种促进或改善伤口愈合的方法，该方法包括以有效的 量给予一种或多种间隙连接调节剂，以调节外层角蛋白分泌。在一种实施方式中，间隙连接 调节剂是抗连接蛋白肽或拟肽，其可有效调节外层角蛋白分泌。在一种实施方式中，间隙连 接调节剂是连接蛋白43间隙连接调节剂、31. 1间隙连接调节剂、或它们的混合物。试剂盒以及制品在一个方面，本发明提供了一种用于治疗并不以预期速率愈合的伤口的试剂盒。试剂盒可以包括本文描述的一种或多种组合物。例如，试剂盒可以包括一种组合物，该组合物包含有效量的一种或多种间隙连接调节剂。在一种实施方式中，试剂盒包括一 种组合物，该组合物包含有效量的一种或多种多肽。在一种实施方式中，试剂盒包括一种组 合物，该组合物包含有效量的一种或多种多肽同源物。在一种实施方式中，试剂盒包括一种 组合物，该组合物包含有效量的一种或多种连接蛋白磷酸化化合物。在另一个方面，本发明包括一种制品，该制品包括容器和使用说明，其中上述容器 包含有效量的一种或多种间隙连接调节剂，上述使用包括用于治疗具有并不以预期速率愈 合的伤口的受治疗者。因此，根据本发明，提供 了方法、组合物、剂型、配方、试剂盒、以及制品，通过其可 以以瞬时和部位特异性方式来向下调节细胞间通信和/或半通道通讯、对接(停靠)或开 放。因此配方具有在治疗方法以及在其它治疗方面的应用。现在将参照以下实施例来描述本发明的各个方面，应当理解，所述实施例仅通过 示例的方式提供而不是构成对本发明范围的限制。
实施例实施例1肽的亲和结合分析沉降分析(Pull-down assay)可以用来证实蛋白质-肽相互作用。在这种分析中， 测试间隙连接调节剂(例如肽)标记有蛋白质活性或融合标签，即，GST(谷胱甘肽-S-转 移酶)，其通过附着于纤维素、琼脂糖或镍珠而用于捕捉和‘沉降’蛋白结合配偶体。在利 用SDS-PAGE加载缓冲或可替换地竞争性分析物洗脱来洗脱复合物以后，通过在SDS-PAGE 凝胶上的电泳以及利用蛋白质(Western)分析检测方法来显现复合物。本领域已知的 进行结合分析的方法描述在 Einarson，M. B. and Orlinick, J. R. ,"Identification of Protein-Protein Interactions with Glutathione S-Transferase Fusion Proteins，，in Protein-Protein Interactions :A Molecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 37-57(2002) ；Einarson, Μ. B. , "Detection of Protein-Protein Interactions Using the GST FusionProtein Pulldown Technique,，，in Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 18. 55-18. 59 (2001)；以及 Vikis，H. G. and Guan, K. L.，"Glutathione-S-Transf erase-Fusion Based Assays for Studying Protein-Protein Interactions,，，in Protein-Protein Interactions, Methodsand Applications, Methods in Molecular Biology, 261, Fu, H. Ed. Humana Press, Totowa, N. J.，pp. 175-186(2004)中，每个文献的全 部内容均以引用方式结合于本文。利用表面等离子体共振技术来评估蛋白质和测试肽的相互作用和亲和力，该表面 等离子体共振技术能够实时测量这些相互作用(可通过BIAcore获得)。这种方式具有检 测低亲和力蛋白质相互作用的优点。表面等离子体共振依赖于一种光学现象，该光学现象 用来测量在生物特异性表面上分子的溶液浓度的变化。在全内反射的条件下，在薄金属膜 中产生此信号。此信号取决于与表面接触的溶液的折射率。如果发生生物特异性相互作用， 则溶液中的分子呈现折射率的变化，因而产生可测量的信号。通常，通过若干可能的方法之一将蛋白质固定到羧甲基化葡聚糖金表面上。将感兴趣的相互作用肽注射到表面上并实时测量结合动力学。本领域已知的进行结合分析的 方法描述在 Schuck, P. , "Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface ρlasmon resonance biosensors",Currrent Opinion in Biotechnology, 8(4) 498-502(1997)；以及 Zhang, X. , Oglesbee,M. "Use of surface ρ lasmon resonance for the measurement of low affinity binding interactions between HSP72 and measles virus nucleocapsid protein. "Biological Procedures Online. 5(1) 170-181(2003)中。实施例2功能分析功能分析可以用来确定测试间隙连接调节拟肽是否能够阻断间隙连接或半通 道的开放。用Cx43、Cx45、或另一种感兴趣的特定连接蛋白来稳定转染HeLa人宫颈癌 细胞系。在零钙溶液(HBSS-HEPES，包含ImM EGTA)中温育细胞，其中零钙溶液已表明 可以激活连接蛋白半通道(参见 Braet，K.，et al.，‘‘Pharmacological sensitivity of ATP release triggered by photoliberation ofinositol-1,4,5-trisphosphate and zero extracellular calcium in brainendotheIial cells, "Journal of Cellular Physiology,197(2) :p. 205-213(2003) ；DeVries, S. H. and E. A. Schwartz, "Hemi-gap-junction channels in solitary horizontal eelIs of the catfish retina, "Journal of Physiology 445 :p. 201-230(1992) ； VX R Li, H. , et al., "Properties and regulation of gap junctional hemichannels in the plasma membranes of cultured cells,"Journal of Cell Biology l34(4) :p. 1019-1030(1996))。 在包含ImM EGTA和2mM碘化丙啶的HBSS-HEPES溶液中温育细胞30分钟。碘化丙啶是一 种荧光染料，该荧光染料是膜不可渗透的，但由于它的小分子量，能够通过间隙连接/半通 道进入。将利用荧光显微镜检术来确定碘化丙啶摄取。在有拟肽存在的条件下用碘化丙啶 温育细胞，以确定是否这些拟肽能够防止染料摄取。实施例3拟肽设计与测试可以将拟肽设计成具有与连接蛋白43细胞外环区相同的氨基酸序列，其中连 接蛋白43细胞外环区被认为与连接子对接(停靠)过程有关(Foote et al. , J Cell Bioll40(5) :1187-97，(1998))。一些肽包括氨基酸，该氨基酸匹配α螺旋跨膜亚单位的外 部，其可以显示增强的功能抑制。由于在细胞外环区中连接蛋白序列的保守，所以并不需要 所有这些肽是连接蛋白特异性的。可以体外合成肽或其变体，例如，通过固相肽合成方法，如在Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis,W. H. Freeman Co. ,San Francisco(1969) ；Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 852149 (1963) ；Meienhofer in"Hormonal Proteins and Peptides,，，ed.； C. H. Li, Vol. 2 (Academic Press, 1973), pp. 48-267 ； L^l ^ Bavaay and Merrifield, "The Peptides, "eds. E. Gross and F. Meienhofer，Vol. 2 (Academic Press, 1980) pp. 3—285 中所 描述的。可以通过以下来进一步纯化这些肽在免疫亲和或离子交换柱上的分馏；乙醇沉 淀；反相HPLC ；在硅胶或在阴离子交换树脂如DEAE上的层析；色谱聚焦；SDS-PAGE ；硫酸铵 沉淀；使用例如Si^phadex G-75的凝胶过滤；配体亲和层析；或从非极性溶剂或非极性/极性溶剂混合物结晶或沉淀。
可以利用测试肽进行两种功能测试。这些功能测试是⑴在脊髓切片中阻断细胞 对染料(萤光黄(Lucifer Yellow))的摄取，以及(ii)防止脊髓段中的水肿(使用连接蛋 白43特异性反义odn作为阳性对照)。肽由Sigma-Genosys (澳大利亚)合成。阳._胞碰米斗(棘H) _耳又萤光黄是较小的水溶性、可固定的染料，其能够经由间隙连接通道从细胞传递到 细胞，但不能穿过细胞膜。将萤光黄加入胞外介质使得可以检查开放间隙连接/半通道的 存在。染料将出现在正表达开放通道的细胞的细胞质中。用二氧化碳麻醉Wistar p7大鼠并立即断头。切除脊髓并转移到pH值为7. 4的 冷Hank平衡盐溶液(HBSS)。除去过量的支神经和韧带并将脊髓转移到人工组织切片机， 然后切割成一系列500微米厚的切片。由切片引起的损伤会诱导在整个切片中的连接蛋白 43向上调节(通过间隙连接介导的旁观者效应而得到加剧)，并导致连接蛋白半通道的表 达。将切片放置在24孔板中的3cm直径的微孔插入物(Millipore insert)上并在介质中 有拟肽存在的条件下进行培养。所有测试的9种肽的最终浓度是500微摩尔。对照是没 有加入肽，或添加有乙醇或DMS0,因为一些肽可以被重新溶解在这些化合物中(收 到的肽是冻干的)。在37摄氏度下温育切片4小时，然后将2. 5mg/ml萤光黄加入每个孔中30分钟 (在黑暗中)。然后在PBS中冲洗组织两次，并进一步洗涤三次，每次10分钟，接着用4%多 聚甲醛来固定切片。然后利用Leica TCS4D激光扫描共聚焦显微镜对它们进行观测，以评 估进入细胞中的染料摄取、或没有。通过进入每个样品中的染料摄取的量来测量效力。预防脊髓中的水肿在属于 Becker, D.禾口 Green. C.的题目为"Formulations Comprising Antisense Nucleotides to Connexins”的W02000/44409的实施例1中描述的系统用来检查测试肽对 培养的脊髓节段的影响，以测试它们阻断肿胀的能力。DMSO用作对照。将5mm长的脊髓节段放置在HBSS中在24孔板的分开的孔中。禾0 用一小滴超强力胶水(Superglue)将脊髓节段保持在孔的底部。除去HBSS并将500微摩 尔测试肽(最终浓度)加入到介质(对于仅介质或DMSO对照，没有肽)中。温育孔板24 小时，除去介质，然后用布安(Bouin)固定剂固定组织24小时。分析涉及从上面为脊髓节 段拍照，利用图像Jdmage J)来计算脊髓节段的总面积，其与在节段的切口端处的肿胀面 积相比。肿胀(水肿)计算为(培养面积-原始面积再除以原始面积)以产生肿胀％。单 因素方差分析用来确定统计显著性，其中显著性的截止水平为P = 0. 05。使用剂量反应曲线利用相同规程来进行用于在脊髓节段中阻断水肿的测试肽的 最有效浓度的确定。一个示例性的剂量反应曲线利用以5、10、50、250以及500微摩尔使用 的肽的最终浓度来确定。实施例4本文披露的方法和组合物用来治疗具有慢性伤口(例如，血管炎性溃疡)的人受 治疗者。患有糖尿病、或潜在外周血管或动脉疾病的人受治疗者首先呈现来自非闭合腿部 伤口的并发症。用抗连接蛋白肽SRPTEKTIFII(SEQ ID NO 7)的合适的单剂量或多个剂量，例如，100-500 微克来治疗伤口。基于约7cmX5cm的伤口大小(约35cm2)以及约3_4mm 的深度，给予在pluronic凝胶中的SEQ ID NO 7的2mL的20 μ M制剂(例如，总剂量 200-400 μ g)(根据伤口大小，熟练的医师可以容易地确定要给予的其它适当的剂量)。包扎伤口部位并覆盖7天的时间。在第7天露出伤口并评估伤口愈合结果。必要或需要时，重复上面概述的治疗(以适当的剂量)。在这种治疗以后，评估伤 口和伤口外观。在第二周、第一个月、和/或第二月，再次评估患者，并再次评估伤口(减小， 如果有的话)。实施例5本文披露的方法和组合物用来治疗患有慢性静脉性下肢溃疡的人受治疗者。按照溃疡大小以及最小和最大溃疡面积(例如，2cm2和50cm2)对人试验受治疗者 进行分组。确定患者的休息踝肱多普勒动脉压指数作为基线(例如等于或大于0.80)。所有患者接受加压包扎。通过描记法确定溃疡的面积，并给予在pluronic凝胶制 剂中测试抗连接蛋白肽SRPTEKTIFII(SEQ ID NO 7)的合适的剂量，例如，100-500微克。要求患者斜躺在检查床上，同时将测试制剂施加至伤口表面，并在进行加压包扎 以前保持在那里15分钟。在第7天露出伤口并评估伤口愈合结果。利用生物测定，分析伤口液和血液样品 的有关伤口愈合生物标志物。重复上面概述的治疗(以适当的剂量)。在这种治疗以后，评估伤口和伤口外观。 每周或每两周、或鉴于愈合状态的合适的时间，重复这种过程，直到伤口闭合。实施例6以下用来确定顺序给予示例性制剂在加快糖尿病性和其它慢性溃疡的愈合速率 方面的治疗效力。主要效力终点是在12-20周内患者达到充分伤口闭合的百分比。次要终点包括达 到100 %闭合的时间、达到80 %闭合的时间、达到50 %闭合的时间，以及在第3、5、10、15、以 及20周伤口闭合的量，其作为离基线伤口大小的百分比变化。卡-迈生存分析技术用来检 查时间至事件终点(时间变数评估指标)。所有患者接受标准糖尿病性(或其它)溃疡护理的方案，该方案包括初步尖锐清 仓|J、伤口清洗、伤口敷料、以及伤口压力卸载。通过初步尖锐清创和伤口清洗来治疗溃疡。 顺序地给予在pluronic凝胶制剂中的100-500微克的抗连接蛋白肽SRPTEKTIFII (SEQ ID NO :7)。用不粘绷带和压迫绷带包扎伤口。每周两次评估伤口，长达12-20周或直到伤口闭合(以较早者为准)。如果患者发 展了临床感染或如果伤口状况显著恶化，则从研究中除去该患者。在每次伤口评估(每周 两次)时，绘出伤口周边以确定伤口面积，并用数码相机对伤口拍照。在患者登记时，以及 在第5、10、15、以及20周，进行血液化学和血液学测试。可以每5周进行放射线评估以研究 对下面的骨组成的影响。实施例7 将抗连接蛋白药剂方便地配制成适合于根据本发明的方法给予的形式。
合适的配方包括以下配制药剂的混合物。个别抗连接蛋白药剂或多种药剂以及配 制药剂的量将取决于所期望的特定用途。
权利要求
1.一种治疗具有慢性伤口的受治疗者的方法，包括将包含有效量的连接蛋白43间隙 连接调节剂的一种组合物给予所述伤口。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述慢性伤口是压迫性溃疡。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述慢性伤口是褥疮性溃疡。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述慢性伤口是动脉性溃疡。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述慢性伤口是静脉性溃疡。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述慢性伤口是静脉停滞性溃疡。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述慢性伤口是糖尿病足溃疡。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述慢性伤口是创伤性溃疡。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述慢性伤口是烧伤性溃疡。
10.一种治疗具有并不以预期速率愈合的伤口的受治疗者的方法，所述方法包括将有 效量的连接蛋白43间隙连接调节剂给予所述伤口。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述伤口是延迟愈合伤口或不完全愈合伤口。
12.—种治疗具有裂开性伤口的受治疗者的方法，包括将包含有效量的连接蛋白43间 隙连接调节剂的一种组合物给予所述伤口。
13.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂全部或 部分地防止或减少分子通过间隙连接的流动。
14.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂全部或 部分地防止或减少分子通过半通道的流动。
15.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂全部或 部分地关闭间隙连接。
16.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂全部或 部分地关闭半通道。
17.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂全部或 部分地阻断间隙连接。
18.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂全部或 部分地阻断半通道。
19.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂诱导间 隙连接的全部或部分闭合。
20.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂诱导半 通道的全部或部分闭合。
21.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂全部或 部分地减少或防止间隙连接的开放。
22.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂全部或 部分地减少或防止半通道的开放。
23.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂防止或 减少间隙连接的活性或功能。
24.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂防止或 减少半通道的活性或功能。
25.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂是肽化 合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述肽化合物是拟肽。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂是抗体或其抗原结合片段。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述抗原结合片段是F(V)、Fab、Fab’或 F(ab，)2抗连接蛋白43抗体片段。
30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述抗体是嵌合或人源化抗体。
31.根据权利要求27所述的方法，其中，所述抗体片段是嵌合或人源化抗体片段。
32.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述间隙连接调节剂是间隙 连接磷酸化诱导剂。
33.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，将所述间隙连接调节剂配制成用于局部给予。
34.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，将所述间隙连接调节剂配制 为凝胶。
35.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述受治疗者是人。
36.根据权利要求1、10或12中任一项所述的方法，其中，所述受治疗者是非人动物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述非人动物是运动动物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述运动动物是马。
39.根据权利要求37所述的方法，其中，所述运动动物是狗。
40.根据权利要求36所述的方法，其中，所述非人动物是宠物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述宠物是狗。
42.根据权利要求40所述的方法，其中，所述宠物是猫。
43.根据权利要求1所述的方法，其中，所述慢性伤口是持续性上皮缺损。
全文摘要
本发明提供了方法、化合物、组合物、试剂盒以及制品，其包含一种或多种间隙连接调节剂，用于在需要其的受治疗者中治疗并不以预期速率愈合的伤口，该伤口包括慢性伤口、延迟愈合伤口、不完全愈合伤口、以及裂开性伤口。
文档编号C07K16/18GK102105492SQ200880126533
公开日2011年6月22日 申请日期2008年12月11日 优先权日2007年12月11日
发明者布拉德福德·J·杜夫特, 戴维·L·贝克尔, 科林·R·格林 申请人:科达治疗公司