抗原结合蛋白的制作方法

专利名称：抗原结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括抗体的抗原结合蛋白，其中所述的抗体结合β-淀粉样肽，尤其 是结合人β-淀粉样肽。本发明还涉及使用结合β-淀粉样肽，尤其是结合人β-淀粉样 肽的抗原结合蛋白治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征是β-淀粉状蛋白的水 平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加，尤其是阿尔茨海默病和特征是β-淀粉状蛋白水平升 高或β-淀粉状蛋白沉积增加而影响眼睛或视神经的疾病或病症(包括年龄相关性黄斑变 性、青光眼型疾病和β-淀粉状蛋白依赖的白内障形成)。通过以下的说明书的描述，本发 明的其它方面将会显而易见。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是与年龄相关的认知功能减退的最主要诱因，影响全球超过 一千两百万人(Citron M(2002) Nat. Neurosci 5，Suppl 1055-1057)。该病的最早阶段的 特征是与认知功能减退以及语言和行为缺陷相关的记忆力的渐进性丧失。在疾病的后期 阶段，病人发展到全面性遗忘，且行动能力大大减退。一般在确诊后9年内死亡，且该病通 常伴有其它病症，常见的是肺炎(Davis K. L.和 Samules S. C. (1998) in Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S. J. and Coyle J.T. (McGraw-Hill,New York pp267_316))。当前的治疗是根据病症进行治疗的方法，集中 在缓解认知障碍和改善与渐进性病因有关的行为症状。实践中，这些治疗仅对认知障碍的 水平提供短期益处，据报道，仅仅持续多达2年。减缓和可能阻止疾病的恶化的修正疾病的 疗法的可能性是很大的。这些方法将对患者的生活质量提供根本和持续的改善，重要的是 改善患者的护理者的生活质量，以及在整体上降低该病所需的巨大的卫生保健费用。尽管诊断性的生物标记物和成像正在研究中，但是诊断阿尔茨海默病的临床诊断 目前基于诊断有可能或很可能是阿尔茨海默病患者的体力和智力测试的组合(Sormen等 A (2007) Expert Rev Neurotherapeutics 7(8) 1021-1028 ；Lockhart ^A (2007) Brain 130 :2607-2615)。患者死亡后，通过在大脑中明确表征的神经特征以证实该疾病，该特征包 括在实质斑块和脑血管中的Αβ的沉积、神经原纤维缠结的神经内形成、突触损失和在特 定脑区的神经细胞亚群的损失(Terry, RD(1991) J Neural Trans Suppl 53:141-145)。尽管在死后的检测中观察到的实际Αβ沉积是否是认知衰退的真实原因近来变 得越来越不清楚(Ferreira ST (2007) Life 59(4-5) :332_345)，但是大量的遗传学、组织 学和功能性证据表明淀粉样肽(Αβ)对阿尔茨海默病的发展起重要作用(Selkoe， D.J. (2001)Physiological Reviews 81 :741_766)。业已知道，通过称作 BACEl 的天冬氨酸 蛋白酶(也称β -分泌酶、Asp2或Memapsin-2)来裂解β -淀粉样前体蛋白(也称作APP) 制备Αβ (De Strooper,B.和Konig，G. (1999)Nature 402 :471_472)。除了实质和血管的沉 积，已假定A β的可溶性低聚物形式有助于AD的发病，且它们可通过最初损害突触功能来 景i响神经功能(Lambert等人(1998)Proceedings of the National Academy of Science, U. S. A. 95 6448-6453 ；Kayed 等人(2003) Science 300 486-489 ；Cheng 等人(2007) J Biol
8Chem 282(33) :23818_23828 ;Ferreira 等人(2007) Life 59:332-345)。尽管很早就在 AD 和轻度认知障碍(MCI)中发现有不溶的淀粉样斑块，但是可溶的Aβ聚集(有时指低聚物 或Αβ衍生的离散配体(ADDLs))的水平在这些个体中也有增加，并且可溶的Αβ的水平 与神经原纤维退化和突触标记物的损失比淀粉样斑块都更相关(Naslimd等人(2000) J Am Med Assoc 283 1571-1577，Younkin，S. (2001) Nat. Med. 1 :8_19)。此外，这些低聚体在原纤 维形成的过程中可代表前体，清除或中和它们可阻止毒性效应和原纤维的形成(Ferreira ST(2007)Life59(4-5) 332-345 ；Gong Y(2003)PNAS 100:10417-10422)。尽管有这些发 现，但是高度促淀粉样变的Αβ 42和氨基末端截短形式的Αβ χ-42是在弥漫和衰老的斑 中发现的 Αβ 的最主要的种类(Iwatsubo, T(1994)Neuron. 13 :45_53，Gravina, SA(1995) J. Biol. Chem. 270 7013-7016)，且A β 42的相对水平似乎不仅是AD的生物标记，而且也是 Αβ聚集为淀粉样斑块的主要调节剂。业已表明Αβ42比其它的Αβ形式更容易在体外 聚集(Jarrett, JT (1993)Biochemistry. 32 :4693_4697)，且也已表明这种 A β 42 是 AD 发 病机理的启动分子(Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92 :289_292)。尽管 Αβ42 通常是APP代谢的少量产物，但是其产量的细微变化会给Αβ的沉积带来巨大的影响，因 此，已想到单独地减少A β 42可能是治疗AD的有效途径(Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92 289~292 ；Levites 等人(2007) J Clin Invest. 116(1) :193_201)。为支持该论 点，有报道指出淀粉样前体蛋白(APP)和早老素基因的突变显著地升高了 Αβ 42的相对水 平，因而缩短了阿尔茨海默病(AD)的发病时间(Selkoe D. J. ,Podlisny Μ. B. (2002)Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3 :67_99)。然而需要强调的是，淀粉状蛋白的沉积比例也取决 于整体的淀粉状蛋白的水平、分解代谢和从CNS中清除Αβ的效率，其中已表明，CNS受年 龄和AD病人中发现的淀粉状蛋白的水平升高的负面影响，(Deane等人(2005) J Neurosci 25(50) 11495-11503 ;Wang 等人(2006) Drug Discovery Today 11(19/20) :931_938)。在 该方面已越来越明显，Αβ在中枢神经系统(CNS)与血浆之间的输送对大脑淀粉状蛋白水 平的调节起着很重要的作用(Shibata，等人(2000)J Clin Invest 106 1489-1499)，A β 通过输送机制(如LRP-1)快速地从CNS输送到血浆中，且Αβ通过结合到RAGE的方式快 速地从血菜输入到 CNS 中(Zlokovic BV (2004) J Neurochem 89:807-811)。因此，正在开 发带Αβ肽的活性疫苗或结合周围的Αβ从而改变血浆、CSF与CNS之间的动力学平衡的 特异性A β抗体的被动给药。事实上，现在有很多研究都表明这些方法可降低A β的水平、 减轻A的病理，且在某些情况下对淀粉状蛋白病的多种转基因模型提供认知益处。也在更 高级的种属上作了有限的研究(Lemere，CA(2004)Am J Pathology 165 283-297 ；Gandy, S(2004)Alzheimer Dis Assoc Disord 18:44:46)。 通过在小鼠中过表达突变人转基因，以得到淀粉状蛋白沉积的动物模型。过量表 达单个人类APP转基因的小鼠通常从12个月龄发展类似大脑斑块状的β -淀粉状蛋白沉 积(Games D.等人·，(1995) Nature 373 :523_527 ；Hsiao K.等人·，(1996) Science 274 99-102))，而携带突变人类APP和早老因子-1 (PS-I)转基因的小鼠通常早在2个月龄时就 发展类似大脑斑块状的β-淀粉样沉积(Kurt Μ. Α.等人·，(2001) Exp. Neurol. 171 :59_71 ； McGowan Ε.等人.，(1999)Neurolbiol. Dis. 6 :231_244)。在多种用于转基因小鼠模型中 的这些巨大的生物差异导致很难比较不同方法的药理作用和效率。对于免疫疗法如何靶向 β-淀粉状蛋白以及它的各种形式如何实际工作，在该领域还没有真正达成共识。很有可能
9是带有不同结合特性的不同抗体在那些动物模型中具有可变化的结果。也有可能是抗体可 通过多种机制起作用，且已记述的不同作用模式并不相互排斥(Levites等人(2007) J Clin Invest. 116(1) :193_201)。临床使用的靶向大脑淀粉状蛋白的首个免疫疗法是Elan/Wyeth’ sAN_1792，一种 活性疫苗。在出现与脑膜脑炎一致的临床症状后停止上述治疗。亚群分析表明治疗使认知 功能的衰退减慢(Nature Clin Pract Neurol (2005) 1 :84_85)。病人的验尸分析也发现有 斑块被清除的证据(Gilman S.等人，(2005) Neurology 64(9) 1553-1562)。正在研发一种被动单克隆抗体-Bapineuzumab(AAB-001，Elan/Wyeth)。特征是β -淀粉状蛋白水平升高或β -淀粉状蛋白沉积增加的其它疾病或病症 包括轻度认知功能障碍(Kelley BJ(2007)Neurologic Clinics 25 (3)，577-609)、具有 荷兰(Dutch)型淀粉状蛋白病的遗传性脑出血、脑淀粉样血管病和各种类型的变性 痴呆如与帕金森病相关的那些疾病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性和弥漫性路易体型 (Lewis body) H/K(Mollenhauer B(2007)J Neural Transm e-published 23 Feb 2007，van Oijen, M Lancet Neurol. 20065 :655_60)、唐氏综合征(Mehta, PD(2007) J NeurolSci. 254 :22-7)、年龄相关性黄斑变性(AMD) (Johnson LV 等人(2002)PNAS USA 99 11830-11835 ；Anderson DH 等人(2004) Exp Eye Res 78 :243_256)，“青光眼型，，疾病 (Guo L 等人(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104 13444-13449)以及 Aβ 依赖的白内障 形成(Goldstein LE 等人(2003) Lancet 361 :1258_1265 ；Li G 等人(2003)Mol Vision 9 179-183)。在发达地区，年龄相关性黄斑变性(AMD)是导致失明的主要原因。AMD有两种 主要的临床表现。萎缩性(干的)AMD的特征是视网膜色素上皮(RPE)和视神经视网膜 (neuroretina)的变性。萎缩性AMD的初期阶段与在RPE细胞层下的玻璃疣的形成有关。 早期的萎缩性AMD可逐渐发展到疾病的末期，其中RPE完全退化并在黄斑区急剧形成RPE 萎缩的标定区域“地理萎缩”。在这种形式的疾病中，RPE的退化导致黄斑视网膜杆和视锥 的二次死亡，且在这些情况下将导致严重的与年龄相关的视力丧失。一部分AMD患者发展 成可被认作不同的形式，或者更进一步发展成更复杂的疾病。大约10-20%的AMD患者演变 成脉络膜新生血管病(CNV)。当这种情况发生时，这种疾病称作“湿AMD”，且这可与一些最 严重的视力丧失相关。在湿AMD中，新的脉络膜血管生成，其穿过布鲁赫(Bruch)膜的破裂 处并在RPE和视神经视网膜中及其下层进行增殖。在通常情况下，萎缩性AMD在湿的形式 发展之前就在眼中进展，然而，虽然不常见，但可在没有先前的萎缩形式形成之前发展新生 血管形式。在该疾病的两种形式中，由于感光细胞的死亡而导致视力丧失，尽管在湿的AMD 形式中，从CNV阶段形成的渗漏血管的内部出血也会导致视力丧失。鉴于AMD的治疗，已经 研究出新颖的治疗方法来解决一些湿AMD的问题，尤其是通过抑制VEGF(血管内皮生长因 子)或VEGF受体信号路径的各种分子以减少从CNV渗漏血管的出血。然而，目前仍然没有 确定的治疗方法来治疗非常普遍的AMD萎缩形式或者预防早期的干AMD进展成地理萎缩或 MW AMD (Petrukhin K (2007) Expert Opin Ther Targets 11:625_639)。尽管还没有完全理解导致RPE中的A β产生的确切机理和A β影响AMD的确切机 理，但是有证据表明通过结合且可能中和或仅仅除去Aβ的药剂来清除Aβ可能提供清除 AMD中的玻璃疣的一条可能的途径，从而减少AMD的互补的激活作用，减少RPE萎缩并可能
10减少RPE中的VEGF表达的诱导和在玻璃疣附近以高水平定位。因此，由于AMD及其发展到 地理萎缩和/或渗出性AMD，这种疗法可预防、延缓、减轻或者是逆转视力丧失。这将导致含 有玻璃疣的Αβ和或RPE的周围环境中的局部Αβ的水平降低，从而干扰早期和晚期AMD 并治疗导致视力丧失的潜在的细胞衰亡。近来，一些出版物清楚地表明补体蛋白与在AMD形成中的淀粉状蛋白β有相互 作用(Wang，J.等人.，(2008)J. Immunol. 181 16651-6)。业已显示，淀粉状蛋白β结合 到补体因子I，与因子H结合的辅因子负责将C3b从补体蛋白C3裂解成它的不活跃的形式 iC3b(ffang, J.等人.，2008)。近期出版的体外研究结果表明支持这一假设，其中淀粉状蛋 白β通过阻止补体因子I的功能，从而引起视网膜下组织的低级、慢性炎症来激活玻璃疣 中的补体系统；因而其连接与AMD形成相关的四个因素炎症、补体激活、淀粉状蛋白β沉 积和玻璃疣(Wang，J.等人.，2008)。这种淀粉状蛋白β通过与补体因子H潜在竞争与补 体因子I结合对激活可替代的补体路径的效应的直接证据在以前还没有记载(Wang，J.等 人.，2008)。“青光眼型疾病”是用于导致眼睛的视神经损伤并引起失明的一组疾病的总称。世 界上最终引起失明的主要原因是眼内压升高(IOP)和视力下降。眼内压升高与如何导致视 网膜神经节细胞(RGC)的凋亡之间的联系还没有完全清楚。仅仅是高的IOP可诱导凋亡 (Cordeiro M F 等人(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101 :13352_13356 ；Quigley H A 等 人(1995) InvestOphtalmol Visual Sci 36 :774_786)，但其本身并非视神经细胞死亡的唯 一因素。此外，业已发现视力会持续变坏，即使在使用降低眼压的药剂治疗后，IOP正常以 后也会持续变坏(Oliver JE 等人(2002)Am J Ophthamol 133 :764_772)。
近期有报道指出β -淀粉状蛋白的潜在的细胞毒效应与青光眼中的RGCs的细胞 凋亡有关(McKinnon SJ 等人(2002) Invest Ophtamol Visual Sci43 1077-1087)。在青光 眼的动物模型中，已证明胱天蛋白酶-3蛋白酶在RGCs中被激活，其通过胱天蛋白酶_3产 生的包括淀粉状蛋白的APP的潜在的有毒片段，引起淀粉样前体蛋白(APP)的异常加 工(McKinnon等人(2002) ；Cheung ZH等人(2004)Mol Cell Neurosci 25 :383_393)。在其 它细胞中，RGCs已显示表达APP，因此这看起来是β-淀粉状蛋白的可信来源。尽管主要在 体外系统中发现，但是APP水平的升高与淀粉状蛋白水平的升高都表明与激活胱天蛋 白酶-3有关。但对以下的问题还是不清楚，即是否RGCs中的APP水平也在青光眼中升高， 从而有助于在正反馈机制中产生更多的淀粉状蛋白。即使是在最近，在青光眼的大鼠 模型中的RGCs的细胞凋亡也表明涉及β-淀粉状蛋白(Guo等人(2007))。对靶向β-淀 粉状蛋白或β-淀粉状蛋白生成的几种药剂做了试验，得出当所有的3种治疗一起进行时， 体内的视网膜神经节细胞的死亡以可能轻度的增强效应减少。通过使用抗淀粉状蛋白 的抗体，能观察到最大效应，该效应几乎与一起使用3种药剂所观察到的效应相当。尽管导致RGCs中β-淀粉状蛋白产生的确切机理以及其与IOP联系还没有完 全明白，但证据表明通过使用结合并可能中和或仅仅除去淀粉状蛋白的药剂以清除 β -淀粉状蛋白可提供一条可能的途径来预防青光眼的RGC细胞凋亡，由此得到延迟、减轻 或逆转青光眼的视力丧失的方法。这将导致RGCs和周围环境中的β-淀粉状蛋白的水平 降低，藉此解决了引起视力丧失的可能的细胞衰亡。β -淀粉状蛋白可在其它的眼病中起作用，且其与超核性白内障(尤其是在AD患者中观察到的那些)的形成有关，Αβ产生的成分和加工途径呈现在透镜中(Goldstein LE，等人.，(2003) ；Li G，等人.，(2003))。因此，所述用于干扰AMD和青光眼型疾病的治 疗方法可用于预防Αβ依赖的白内障的形成。WO 2008/110885涉及用针对淀粉样-β肽的抑制剂以治疗眼科疾病的方法。具体 地，该发明公开了结合在似乎包括25-34和40的Αβ 1-40上的表位的抗体6G。

发明内容
根据本发明的一方面，本发明提供一种治疗性抗原结合蛋白，其识别含有淀 粉状蛋白的残基28-35的β -淀粉样肽的表位。在具体的实施方式中，所述治疗性的抗原结合蛋白识别含有淀粉状蛋白的残 基28-34的β-淀粉样肽表位。在更具体的实施方式中，所述治疗性抗原结合蛋白识别含有淀粉状蛋白的残 基28-33的β -淀粉样肽的表位。在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种治疗性抗原结合蛋白，其识别在 β -淀粉状蛋白的残基28-35的区内的β -淀粉样肽的表位。在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种治疗性抗原结合蛋白，其识别由 β -淀粉状蛋白的残基28-33、28-34或28-35组成的β -淀粉样肽的表位。在本发明的实施方式中，本发明提供结合需要的β _淀粉状蛋白的残基32和33 的治疗性抗原结合蛋白。在本发明的实施方式中，所述治疗性抗原结合蛋白是抗体或抗原结合片段和/或 其衍生物。在本发明的实施方式中，本发明提供一种治疗性抗原结合蛋白，其是抗原结合蛋 白，如抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，该抗原结合蛋白结合β “淀粉样肽且包括以下 的 CDRs CDRHl =VYYVH (SEQ ID No 1)CDRH2 :RIDPENGETIYTPKFQD(SEQ ID No 2)CDRH3 :SGY (SEQ ID No 3)CDRLl :RSSKSLLHRNGITYLY(SEQ ID No 4)CDRL2 :QMSNLAS (SEQ ID No 5)CDRL3 =AQNLELffT (SEQ ID No 6)在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种抗原结合蛋白，如抗体或其抗原结 合片段，该抗原结合蛋白特异性结合淀粉样肽并包括为上述的序列的变体的CDR’ S0⑶R变体包括通过以下方式得到的⑶R氨基酸序列的部分变化通过⑶R的一个 至多个氨基酸缺失或置换，或者通过在CDR的一个至多个氨基酸添加或插入，或前述的组 合方式。⑶R变体可包含在⑶R的氨基酸序列中的1、2、3、4、5或6个氨基酸置换、添加或缺 失。⑶R变体可包含在⑶R氨基酸序列中的1、2或3个氨基酸置换、插入或缺失。氨基酸残 基中的置换物可以是保守性置换，例如将一个疏水性氨基酸用另一个疏水性氨基酸酸进行 置换。例如，可用缬氨酸或异亮氨酸置换亮氨酸。包含变体CDR的抗原结合蛋白与上述讨论的那些包含CDRs的抗原结合蛋白的功能特性相同或相似。因此，包含变体CDR的抗原结合蛋白将以与上述的CDR的相同或相似 的结合亲和力结合到相同的靶蛋白或表位。例示性的抗体是6F6鼠科单克隆抗体。在本发明的一个实施方式中，本发明提供 一种包括前述的6F6的CDRs的人源化或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可包括6F6鼠科抗体的 可变区，即SEQ ID No 19 (Vh)和SEQ ID No 21 (Vl)。基于鼠科6F6的人源化抗体的例子是 包含具有SEQ ID No 27的重链或具有SEQ ID No 28的轻链的抗体。在整份说明书中，术语"CDR"、'‘CDRLl “、'‘ CDRL2"、'‘ CDRL3"、“ CDRHl “、“ CDRH2“禾口〃 CDRH3根据Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH，1987阐释的Kabat编号系统定义。因此，以下是本发明的⑶Rs的定义CDR 残基CDRHl 31-35CDRH2 50-65CDRH3 95-97CDRLl 24-34CDRL2 50-56CDRL3 89-97IGHV1-24(SEQ ID No 13)是人类种系序列，其是移植Vh CDRs的合适的接受者构 架。在特殊的方面，人接受者重链构架是源自IGHV1-24。在本发明的替代性实施方式中， 所述人接受者构架包括人重链可变区序列，其中该序列相对于整条鼠科6F6重链可变序列 (排除CDR序列)具有90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。对于氨基酸和核酸序列，术语“相同”或“序列的同一性”是指当最佳排列并与适当 的插入部分或缺失部分进行比较时，两个氨基酸或两个核酸序列之间的同一性程度。或者， 当在可选择的杂交条件下，DNA片段与链的补体杂交时，存在基本同一性。考虑到需要被引 入以得到两个序列的最佳排列的间隙(gap)数量和每个间隙的长度，两个序列之间的同一 性百分比随着序列共用的相同位置的数量而变(即％同一性=相同位置的数量/位置总数 量，再乘以100% )。如下所述，使用数学算法可完成两个序列之间的序列比较和同一性百 分比测定。使用GCG软件包中的GAP程序和使用NWSgapdna. CMP矩阵和40、50、60、70或80 的间隙重量和1、2、3、4、5或6的长度重量，可计算出两个核苷酸序列之间的同一性百分比。 使用PAM120重量残基表，间隙长度损失(penalty) 12和间隙损失(gap penalty)4，两个核 苷酸或氨基酸序列的同一性百分比也可以使用Ε. Meyers和W. Miller的算法测定(Comput. Appl. Biosci.，4 11-17 (1988))，其已并入 ALIGN程序(2.0 版)中。此外，使用 Blossum 62 矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的间隙重量和1、2、3、4、5或6的长度重量， 并使用Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48 444-453 (1970))算法可确定两个氨基酸序列 的同一性百分比，该算法已并入GCG软件包的GAP程序中。举例说明，多核苷酸序列可与所述的参考多核苷酸序列相同，也就是有100%的同 一性，或者与参考序列比较，它包括多达某个整数的核苷酸改变，例如至少50、60、70、75、 80、85、90、95、96、97、98或99%的同一性。这样的改变选自至少一个核苷酸缺失、置换(包 括转换或颠换)或插入，其中，所述的变化可在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置发生，
13或在那些末端位置之间的任何位置发生，该变化单独地分散在参考序列的核苷酸中或在参 考序列中的一个或多个相邻的组中。核苷酸变化的数量通过如下方法得到参考多核苷酸 序列中的核苷酸的总数量乘以各自的同一性百分比的百分比数值(除以100)并从参考多 核苷酸序列中的所述核苷酸的总数量减去得到的上述结果，或者xn_(xn · y)，式中，nn是核苷酸变化的数量，Xn是参考多核苷酸序列中的核苷酸的总数量，对于 50% y 为· 50、60%则 y 为 0. 60,70%PJ y 为 0. 70,75%PJ y 为 0. 75、80%则 y 为 0. 80,85% 则 y 为 0. 85,90%PJ y 为 0. 90,95%PJ y 为 0. 95,98%PJ y 为 0. 98,99%PJ y 为 0. 99 或者 100%则y为1. 00， 表示乘号，且其中Xn和y的任何的非整数结果都四舍五入到最接近的 整数，再用Xn减去该四舍五入的结果。类似地，正如本文所述，多肽序列也可能与多肽参考序列相同，即是100%的相同， 或者它可与参考序列相比含有多达某一整数值氨基酸的变化，以至于同一性百分比小于 100%，例如至少是50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%的同一性。这种变化选自 以下的方式至少一个氨基酸缺失、置换(包括保守性的和非保守性的置换)、或者插入，且 其中所述的变化可以发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置上，或者发生在那些末端 位置之间的任何位置，其单独地分散在参考序列的氨基酸中或在参考序列中的一个或多个 相邻的组中。对于给定的同一性百分比值的氨基酸变化数量通过如下方法得到由本文所 述的多肽参考序列编码的多肽序列中的氨基酸总数量乘以各自的同一性的百分比值(除 以100)，再从所述多肽参考序列中的氨基酸总数中减去得到的数值，或者xa-(xa · y),式中，~是氨基酸变化的数量，xa是多肽序列中氨基酸的总数量，对于50%则y为 0. 50,60%PJ y 为 0. 60,70%PJ y 为 0. 70,75%PJ y 为 0. 75,80%PJ y 为 0. 80,85%PJ y 为 0. 85、90%则 y 为 0. 90、95%则 y 为 0. 95、98%则 y 为 0. 98、99%则 y 为 0. 99 或者 100%则
y为1. 00， 表示乘号，且其中xa和y的任意的非整数结果都四舍五入到最相近的整数，然 后再用xa减去该整数。%同一性可与序列的长度交叉(across)。为了构建完整的V-区，构架4必须被加入到V-基因IGHV1-24编码的种系中。合 适的构架4序列包括人类JH4小基因(Kabat)编码的序列YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID No 15)本领域的技术人员应该理解，种系V基因和J基因不包括重链⑶R3的完整性的编 码序列。然而，在本发明的抗体中，完整的重链CDR3由供体免疫球蛋白提供。因此，VH基因 (如 IGHV1-24)、JH 小基因(如 JH4)与一系列的重链 CDRs (如 SEQ ID No :1,SEQ ID No 2 和SEQ ID No :3，其以模仿成熟的完全重新排列的重链可变区的方式组合)的结合足以限 定本发明的重链可变区。IGKV2-28 (SEQ ID No 16)是人类种系序列，是一种移植八CDRs的合适的接受者 构架。在一特定的方面，人接受者轻链构架源自IGKV2-28。在本发明的替代性的实施方式 中，人接受者构架包括人的轻链可变区序列，相对于整个长度(排除CDR序列)，其与鼠科 6F6的轻链可变序列具有至少90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的序列同一性。为了构建完整的V-区，构架4必须被加入到V-基因IGKV2-28编码的种系中。合
14适的构架4序列包括人类JK-I小基因编码(Kabat)的序列WIFGQGTKVEIK (SEQ ID No 18)本领域的技术人员应该理解，种系V基因和J基因不包括轻链⑶R3的完整性的编 码序列。然而，在本发明的抗体中，CDR3序列由供体免疫球蛋白提供。JK-I小基因残基的首 两个残基在⑶R3区的范围内。对于JK-I小基因，这些残基与轻链⑶RL3 (SEQ ID No 6)的 最后两个残基相同。因此，Vl基因(如IGKV2-28)、FR4(如JK-1)与一系列的轻链⑶Rs (如 SEQ ID No :4、SEQ ID No :5和SEQ ID No :6，其以模仿成熟的完全重新排列的轻链可变区 的方式组合)的结合足以限定本发明的轻链可变区。在本发明具体的实施方式中，人接受者重链构架源自IGHV1-24和JH4小基因，且 人接受者轻链构架源自IGKV2-28和JK-I小基因，基于在具有序列SEQ ID No 19的供体Vh 结构域和具有序列SEQ ID No :21的&结构域中发现的相应的残基，所述的小基因任选包 含一个或多个氨基酸残基取代，其中，所述的Vh结构域和\结构域维持供体抗体对β _淀 粉样肽的全部或基本上全部的结合亲和力。“基本上全部的结合亲和力”是指与供体抗体相 比，治疗抗体的结合亲和力减少最多减小5倍，更具体的是减少到1/2。在本发明更具体的实施方式中，源自IGHV1-24和JH4的人接受者重链构架具有 一个或多个，例如是1-15个，更具体的是2-15个氨基酸残基取代，该取代选自以下的残基 (或其保守性的取代)
残基的Kabat编号人类构架残基(供 体 IGHV1-24)在鼠科6F6中相应 的残基1QE5VQ
13KE24VG27YF28TN29LI30TK37VL40AL
权利要求
一种治疗性抗原结合蛋白，其识别含有β 淀粉状蛋白的残基28 35的β 淀粉样肽的表位。
2.根据权利要求1所述的治疗性抗原结合蛋白，其识别含有淀粉状蛋白的残基 28-34或28-33的β -淀粉样肽的表位。
3.一种治疗性抗原结合蛋白，其识别在淀粉状蛋白的残基28-35的区内β-淀粉 样肽的表位。
4.根据权利要求1-3中任一所述的治疗性抗原结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合 蛋白是抗体或者抗原结合片段和/或其衍生物。
5.一种治疗性抗体，其为结合了 淀粉样肽的抗体或者抗原结合片段和/或其衍生 物，并包括以下的⑶Rs或其⑶R变体CDRHl =VYYVH(SEQ ID No 1)CDRH2 :RIDPENGETIYTPKFQD(SEQ ID No 2)CDRH3 SGY (SEQ ID No 3)CDRLl :RSSKSLLHRNGITYLY(SEQ ID No 4)CDRL2 QMSNLAS(SEQ ID No 5)CDRL3 =AQNLELffT(SEQ ID No 6)
6.根据权利要求5所述的治疗性抗体，其特征在于，人接受者重链构架源自 IGHV1-24(SEQ ID No 13)和构架 4。
7.根据权利要求6所述的治疗性抗体，其特征在于，所述构架4的序列由人JH4小基因 (Kabat)YFDYffGQGTLVTVSS(SEQ ID No 15)编码，并且其中整个重链⑶R3序列由供体免疫球蛋白提供。
8.根据权利要求5所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者轻链构架源自 IGKV2-28 (SEQ ID No 16)和构架 4。
9.根据权利要求8所述的治疗性抗体，其特征在于，所述构架4的序列通过人JK-I小 基因(Kabat)WTFGQGTKVEIK(SEQ ID No 18)编码。
10.根据权利要求5所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者重链源自IGHV1-24 和JH4小基因，且人接受者轻链构架源自IGKV2-28和JK-I小基因，并基于在具有序列SEQ ID No 19的供体Vh结构域和具有序列SEQ ID No 21的Vl结构域中发现的相应残基，所述 的IGHV1-24和JH4小基因以及IGKV2-28和JK-I小基因任选含有一个或多个氨基端残基 取代，其中所述的Vh结构域和\结构域对β -淀粉样肽的供体抗体保持全部或基本上全部 的结合亲和性。
11.根据权利要求10所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者重链构架具有一 个或多个选自下列残基(或其保守性取代)的氨基酸残基取代
12.根据权利要求11所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者重链构架包括以 下的残基(或其保守性取代)
13.根据权利要求10-12中任一项所述的治疗性抗体，其特征在于，人接受者轻链构架 具有一个或多个选自以下残基(或其保守性取代)的氨基酸取代
14.根据权利要求13所述的治疗性抗体，其特征在于，所述人接受者轻链构架包括以 下的残基(或其保守性取代)残基的Kabat 人构架残基(供 残基取代 编号_体 IGHV1-24)__
15.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :24所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 26所示的序列的\结构域。
16.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :59所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 67所示的序列的\结构域。
17.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :61所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 67所示的序列的\结构域。
18.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :63所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 67所示的序列的\结构域。
19.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :65所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 67所示的序列的\结构域。
20.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :59所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 69所示的序列的\结构域。
21.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :61所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 69所示的序列的\结构域。
22.—种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :63所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 69所示的序列的\结构域。
23.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :65所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 69所示的序列的\结构域。
24.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :59所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 71所示的序列的\结构域。
25.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :61所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 71所示的序列的\结构域。
26.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :63所示的序列的Vh结构域和具有SEQ IDNo 71所示的序列的\结构域。
27.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :65所示的序列的Vh结构域和具有SEQ ID No 71所示的序列的\结构域。
28.一种治疗性抗体，其包括具有SEQ ID No :27所示的序列的重链和具有SEQ ID No: 28所示的序列的轻链。
29.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-4中任一项所述的治疗性抗原结合蛋白 或者根据权利要求5-28中任一项所述的治疗性抗体。
30.一种治疗患有与淀粉样肽相关的疾病的人类患者的方法，所述的方法包括步 骤给予所述的患者治疗有效量的根据权利要求1-4中任一项所述的治疗性抗原结合蛋白 或者根据权利要求5-28中任一项所述的治疗性抗体。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述的疾病是阿尔茨海默病、年龄相关 性黄斑变性(AMD)、青光眼或淀粉状蛋白依赖的白内障形成。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其特征在于，所述抗原结合蛋白或抗体与补体 路径抑制剂或补体路径激活剂的抑制剂联合给药。
33.一种药物组合物，其特征在于，该组合物包括如权利要求1-4中任一项所述的抗原 结合蛋白或者如权利要求5-28中任一项所述的抗体，以及补体路径抑制剂或补体路径激 活剂的抑制剂。
34.如权利要求30所述的方法或者如权利要求33所述的药物组合物，其特征在于，所 述补体路径抑制剂是补体因子H(CFH)或者可溶的补体受体1 (sCRl)。
35.如权利要求30所述的方法或者如权利要求33所述的药物组合物，其特征在于，所 述补体路径激活剂的抑制剂是补体因子D(CFD)抑制剂。
36.如权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白或者如权利要求6-28中任一项所述 的治疗性抗体在制备治疗与β“淀粉样肽相关的疾病的药物中的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其特征在于，所述的疾病是阿尔茨海默病、年龄相关 性黄斑变性(AMD)、青光眼或淀粉状蛋白依赖的白内障形成。
38.一种双特异性抗体或其双特异性片段，其具有针对以下的第一特异性a)含有β-淀粉状蛋白的残基28-35的β -淀粉样肽的表位；b)含有β-淀粉状蛋白的残基28-34的β -淀粉样肽的表位；c)含有β-淀粉状蛋白的残基28-33的β -淀粉样肽的表位；或者d)在β-淀粉状蛋白的残基28-35的区内的表位；以及针对补体路径激活剂的第二特异性。
39.如权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白，如权利要求6-28中任一项所述的 抗体或者如权利要求38所述的双特异性抗体或其双特异性片段，用于治疗与β -淀粉样肽 相关的疾病。
40.如权利要求39所述的抗原结合蛋白、抗体或双特异性抗体或其双特异性片段，其 特征在于，所述与β-淀粉样肽相关的疾病是阿尔茨海默病或影响眼睛或视神经的疾病或 病症，所述影响眼睛或视神经的疾病或病症的特征是β-淀粉状蛋白水平升高或β-淀粉 状蛋白沉积增加。
41.一种抗体或其片段，其特征在于，该抗体或其片段包括具有序列SEQ ID No 19的Vh结构域和具有序列=SEQ ID No :21的Vl结构域。
42.一种抗原结合蛋白(抗原结合蛋白A)，其在ELISA测定中与包括具有序列SEQ ID No :27所示的重链和具有序列SEQ ID No :28(抗体B)所示的轻链的抗体竞争结合到β-淀 粉状蛋白。
43.根据权利要求42所述的抗原结合蛋白Α，其特征在于，所述的抗原结合蛋白A和抗 体B以等摩尔量存在。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的抗原结合蛋白Α，其特征在于，所述抗原结 合蛋白A的存在使抗体B与β -淀粉状蛋白的结合在ELISA测定中降低超过10 %、20 %、 30%、40%或 50%。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的抗原结合蛋白Α，其特征在于，在ELISA测定 中，淀粉状蛋白结合到免疫测试板中。
46.根据权利要求45所述的抗原结合蛋白Α，其特征在于，所述抗原结合蛋白A使抗体 B与固定到板上的淀粉状蛋白的结合性降低，而无淀粉状蛋白特异性的对照物则没 有降低。
47.一种抗体，其包括含有多肽的重链和轻链，所述多肽分别与SEQID Νο:27和SEQ ID No 28的氨基酸序列同一性至少是90%、95%、96%、97%、98%或99%，其特征在于，所述 的抗体与淀粉状蛋白结合。
48.一种与C-末端生物素化的β-淀粉样肽结合的抗原结合蛋白，其中，所述的β-淀 粉样肽包括由表面等离子体共振确定的β-淀粉状蛋白的残基24-35 (SEQ ID No 10)或 28-39 (SEQ ID No :11)，所述的肽结合到链霉亲和素传感器芯片上。
49.一种抗原结合蛋白，其与淀粉状蛋白特异性结合，并且对于结合，需要在淀 粉状蛋白的28-35区中的至少一个残基。
50.根据权利要求49所述的抗原结合蛋白，其特征在于，对于结合，所述的抗原结合蛋 白还需要至少一个残基，该残基在所述的在淀粉状蛋白的28-35区中的至少一个残基 的一侧或结构上相邻。
全文摘要
本发明公开一种结合β-淀粉样肽，尤其是人β-淀粉样肽的抗原结合蛋白；公开使用所述的抗原结合蛋白治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征是β-淀粉状蛋白的水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加，尤其是阿尔茨海默病，和特征是β-淀粉状蛋白的水平升高或β-淀粉状蛋白沉积增加而影响眼睛或视神经的疾病或病症(包括年龄相关性黄斑变性、青光眼型疾病和β-淀粉状蛋白依赖的白内障形成)；还公开一种包括所述的抗原结合蛋白的药物组合物；以及还公开了制备方法。
文档编号C07K16/18GK101970484SQ200880126884
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月9日 优先权日2007年12月11日
发明者A·P·路易斯, G·W·高夫, I·R·卡奇波尔, J·H·艾利斯, P·E·索登, P·J·托马斯, P·M·L·阿拉德, S·K·福特, T·A·K·瓦塔姆, V·格尔马谢夫斯基 申请人:葛兰素集团有限公司