专利名称：一种固相氧化环合合成特利加压素的方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽的合成方法，特别是固相氧化环合合成多肽类化合物特利加
压素的方法。
背景技术：
特利加压素是一种新型的人工合成的长效血管加压素制剂，它是一种前体药物， 本身无活性，在体内经氨基肽酶作用，脱去其N末端的3个甘氨酰残基后，缓慢"释放"出有 活性的赖氨酸加压素，因此特利加压素相当于一个能以稳定速率释放出赖氨酸加压素的储 藏库。 特利加压素分子式为Gly-Gly-Gly-c [Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys] -Pro-Lys-Gly _NH2 目前国内和国外虽然有关于特利加压素合成工艺的报道，也多是液相合成或者固 液结合合成工艺。固液结合合成工艺反应时间长，总收率低，一般为20%左右，操作复杂，氧 化反应废液过多，不利于工业生产、应用价值不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种加快反应时间，提高了总收率的特利加压素合成工艺。
本发明提供一种固相氧化环合合成特利加压素的方法，包括以下步骤 1)用Fmoc-Gly-0H和氨基树脂，得到Fmoc-Gly-氨基树脂； 2)将Fmoc-Gly-氨基树脂逐一偶联得到线性特利加压素_氨基树脂； 3)线性特利加压素_氨基树脂采用碘固相氧化环合合成特利加压素_氨基树脂； 4)对特利加压素_氨基树脂进行裂解切割得到特利加压素的粗肽； 5)粗肽经过纯化、转盐、冻干得到醋酸特利加压素。
其中 步骤1)中所述的氨基树脂为RinkAmide树脂、RinkAmide-MBHA树月旨、 RinkAmide-BHA树脂、RinkAmide-AM树脂或Sieber树脂，优选Sieber树脂。因为Sieber 树脂具有较其他几种树脂偶联第一个氨基酸更高的偶联率，同时在最后的肽树脂裂解切割 时更容易。Fmoc-Gly-氨基树脂的制备优选如下操作将氨基树脂加入反应柱中，加入DMF 溶胀，溶胀结束，用20 %六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两次，每次10-20分钟，然后用DMF洗 六次，将Fmoc-Gly-0H、H0Bt和DIC用DMF溶解后加入至上述反应柱中，室温下氮气汩泡60 分钟，反应完成，真空抽去反应液，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次。
所述由Fmoc-Gly-0H、氨基树脂出发得到Fmoc-Gly-氨基树脂和由Fmoc-Gly-氨 基树脂采用Fmoc/tBu策略逐一偶联得到线性特利加压素_氨基树脂时，所使用的偶联剂体 系为DIC和H0Bt，或者偶联剂体系为PyB0P、 H0Bt和DIPEA。其中Fmoc/tBu策略是指氨基 酸的C端采用Fmoc保护，Tyr的活性基团使用tBu基团保护，例如Fmoc—Tyr (tBu)-OH。 其中步骤2)中线性特利加压素-氨基树脂的优选制备如下，将Fmoc-Gly-氨基树脂加入
3反应柱中，加入DMF溶胀后，用20%六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两次，每次10-20分钟， 然后用DMF洗六次，将Fmoc-Lys (R6) -OH， H0Bt， PyB0P和DIPEA用DMF溶解后加入至上述 反应柱中，室温下氮气汩泡120分钟，茚三酮检测反应完全，真空抽去反应液，用DMF洗三 次，用20%六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两次，每次10-20分钟，然后用DMF洗六次，重复偶 联Fmoc-Lys (R6) -OH的操作，接下来对Fmoc-Pro-0H、 Fmoc-Cys (R5) _0H、 Fmoc-Asn (R4) _0H、 Fmoc_Gln(R3)_0H、 Fmoc_Phe_0H、 Fmoc-Tyr (R2) _0H、 Fmoc-Cys (R》_0H、 Fmoc_Gly_0H、 Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Gly-OH进行偶联，最后得到Fmoc-Gly-Gly-Gly-Cys (R》-Tyr (R2) _P he-Gin (R3) -Asn (R4) -Cys (R5) -Pro-Lys (R6) -Gly-RinkAmide树脂，将得到的线性去氨加压 素-氨基树脂用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次，真空干燥得到肽树脂。其中Rp&、 R3、 R4、 R5、 R6的含义见反应方程式的定义。 所述特利加压素肽序偶联过程中半光氨酸Cys侧链巯基采用Trt或者Acm保护， 优选采用Acm保护。因为在其他条件相同的情况下，对比两种保护策略固相氧化的结果，采 用Acm保护固相氧化用时更短。 所述线性特利加压素_氨基树脂采用固相氧化环合的试剂是碘和DMF溶液，或者 碘和甲醇溶液，或者碘和二氯甲烷溶液，优选采用碘和DMF溶液。因为DMF具有对固体碘更 好的溶解性(相对于甲醇或二氯甲烷)，这样就可以采用较低碘用量的同时保证碘/DMF溶 液的浓度，减少废液排放；同时，甲醇对树脂的溶胀性能不如DMF或二氯甲烷好，二氯甲烷 的挥发性又比DMF或甲醇的挥发性大。固体碘加入至溶剂中搅拌溶解以形成碘和DMF溶 液，或者碘和甲醇溶液，或者碘和二氯甲烷溶液，将配好的上述碘溶液加入到溶胀好的肽树 脂中，实现多肽-SH氧化以形成二硫键。步骤3)中线性特利加压素-氨基树脂采用碘固相 氧化环合合成特利加压素_氨基树脂的方法如下，取线性特利加压素_氨基树脂加入到反 应柱中，用二氯甲烷溶胀，称取固体碘加入至溶液搅拌溶解以形成碘和DMF溶液，或者碘和 甲醇溶液，或者碘和二氯甲烷溶液，将配好的上述碘溶液加入到溶胀好的肽树脂中反应，反 应结束，用20%六氢吡啶的DMF溶液分两次洗涤，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三 次，真空干燥得到特利加压素-氨基树脂。其中采用20X六氢吡啶的DMF溶液洗涤有两方 面的作用，一是脱去Fmoc保护基；二是将未反应的碘完全洗去，如果不采用20%六氢吡啶 的DMF溶液洗涤，而使用其他溶液洗涤，残留的碘会带入粗肽中，粗肽颜色会很深。所述的 六氢吡啶的DMF溶液浓度可以是15-30之间，优选20%。 步骤4)中的裂解和步骤5)中的粗品纯化方法如下，配制裂解液，将配制好的裂解 液加入至树脂中，裂解反应1小时，反应结束，将裂解液过滤，滤液倒入至冰乙醇中，沉淀、 离心、干燥，沉重得粗肽，经过高效液相纯化得到特利加压素精肽。 所述对特利加压素_氨基树脂进行裂解切割的试剂体系是三氟乙酸水体积比 为95 : 5。不采用其他常用裂解试剂，如苯甲醚、苯甲硫醚、l，2-乙二硫醇和苯酚等等，是 为了保证裂解效果的同时降低对环境的污染。
其反应方程式如下所示
偶联剂
FmoC"CMy掘树脂频l:舒,,
歩骤2. 偶联
H《iy-氨基树脂F""gg^^OH ' F陽Lys(R^Gly-贫基树脂重复步驟1, 錢歩邻？
蝌
去Fmoc 裂解
I_I
纯化,,,軒.醋酸特利加压素其中； Fmoc-Gly-0H代表N_芴甲氧羰基甘氨酸； Fmoc-Lys (R6) _0H代表N_芴甲氧羰基_N' -R6基-赖氨酸； DIPCDI (或DIC)代表二异丙基碳二亚胺； PyB0P代表六氟磷酸苯并三唑_1_基_氧基三吡咯烷基磷； H0Bt代表1-羟基苯并三氮唑； DIPEA代表二异丙基乙胺； TFA代表三氟乙酸；&代表Trt(三苯基甲基)或者Acm(乙酰氨甲基)；
R2代表tBu (叔丁基)； [OO31] Rg代表Trt(三苯基甲基)；
R4代表Trt (三苯基甲基)；Rs代表Trt(三苯基甲基)或者Acm(乙酰氨甲基)；
R6代表Boc (叔丁氧羰基)； 相较于现有技术，本发明重点创新之处在于固相氧化降低了因液相氧化带来的大 量废液，同时加快了反应时间，降低了碘的用量(由通常的20倍量投料降低至5倍量投 料)，属工艺绿色化改造，同时大大提高了总收率。现有技术的总收率一般为20%左右，而 本发明可提高总收率至50%，在优选实施方式下可达到55%。利用固相假稀效应，本发明 的反应时间只有4小时左右，氧化反应时间縮短至液相反应的1/6-1/8 ;本发明氧化反应废 液量为O. 15mL/mg精肽，氧化反应废液降为液相反应的1/10。与现有技术相比，最后一个氨基酸采用Fmoc保护减少了产物中的一个少甘氨酸残基的缺损肽，提高了粗肽纯度，降低了 纯化成本，从而总体降低了成本。 本发明具有操作简单、后处理容易、收率高、成本低等特点，具有可观的经济实用 价值，同时在二硫键成环类多肽药物在设计合成领域具有广泛的应用前景。
具体实施例方式
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人 员根据本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1、 Fmoc-Gly-RinkAmide树脂的制备 在500ml的反应柱中加入30克RinkAmide树脂(1. 0mmol/g)，加入DMF溶胀30分 钟；溶胀完后，用20X六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两次，分别为10min和15min，然后用DMF 洗六次。将Fmoc-Gly-0H(8. 91g，30mmo1) ， HOBt (4. lg，30mmo1)和DICPDI (3. 78g， 30mmol) 用适量DMF溶解后加入至上述反应柱中，室温下氮气汩泡60min。反应完成，真空抽去反应 液，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次，取样测替代度0. 96mmol/g，收率96 % 。
实施例2、 Fmoc-Gly-RinkAmide-MBHA树脂的制备 在1000ml的反应柱中加入75克RinkAmide-MBHA树月旨(0. 8mmol/g)，加入DMF溶 胀30分钟；溶胀完后，用20%六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两次，分别为lOmin和15min，然 后用DMF洗六次。将Fmoc-Gly-0H(17. 82g， 60mmol) ， HOBt (8. 2g，60mmo1)和DICPDI (7. 56g， 60mmol)用适量DMF溶解后加入至上述反应柱中，室温下氮气汩泡60min。反应完成，真空抽 去反应液，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次，取样测替代度O. 76mmol/g，收率95X。
实施例3、 Fmoc-Gly-RinkAmide-BHA树脂的制备 在1000ml的反应柱中加入70. 59克RinkAmide-BHA树脂(0. 85mmol/g)，加入 DMF溶胀30分钟；溶胀完后，用20%六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两次，分别为lOmin和 15min，然后用DMF洗六次。将Fmoc-Gly-0H(17. 82g，60mmo1) ， HOBt (8. 2g，60mmo1)和 DICPDI (7. 56g，60mmo1)用适量DMF溶解后加入至上述反应柱中，室温下氮气汩泡60min。 反应完成，真空抽去反应液，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次，取样测替代度 0. 79,1/g，收率93%。 实施例4、 Fmoc-Gly-RinkAmide-AM树脂的制备 在1000ml的反应柱中加入80克RinkAmide-AM树脂(0. 75mmol/g)，加入DMF溶胀 30分钟；溶胀完后，用20%六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两次，分别为lOmin和15min，然后 用DMF洗六次。将Fmoc-Gly-0H(17. 82g，60mmo1) ， HOBt (8. 2g， 60mmol)和DICPDI (7. 56g， 60mmol)用适量DMF溶解后加入至上述反应柱中，室温下氮气汩泡60min。反应完成，真空 抽去反应液，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次，取样测替代度O. 73mmol/g，收率 97. 5%。 实施例5、 Fmoc-Gly-Sieber树脂的制备 在1000ml的反应柱中加入100克Sieber树脂(0. 6mmol/g)，加入DMF溶胀30分 钟；溶胀完后，用20X六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两次，分别为10min和15min，然后用DMF 洗六次。将Fmoc-Gly-0H(17. 82g， 60mmol) ， HOBt (8. 2g，60mmo1)和DICPDI (7. 56g，60mmo1)用适量DMF溶解后加入至上述反应柱中，室温下氮气汩泡60min。反应完成，真空抽去反应 液，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次，取样测替代度0. 594mmol/g，收率99%。
实施例6、线性特利加压素-Sieber树脂的制备 在500ml的反应柱中加入实施例5中制备的20.41克Fmoc-Gly-Sieber树脂 (0. 594mmol/g)，加入DMF溶胀30分钟；溶胀完后，用20%六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两 次，分别为10min禾P 15min，然后用DMF洗六次。将Fmoc-Lys (R6) _0H(18. 74g) ，H0Bt(5. 41g) 和DICPDI (5. 04g)用适量DMF溶解后加入至上述反应柱中，室温下氮气汩泡120min。茚三 酮检测反应完全，真空抽去反应液，用DMF洗三次，用20%六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两 次，分别为10min和15min，然后用DMF洗六次。重复偶联Fmoc-Lys (R6)-OH的操作，接下 来对Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Cys (R5) _0H、 Fmoc-Asn (R4) _0H、 Fmoc-Gln (R3) _0H、 Fmoc-Phe-0H、 Fmoc-Tyr (R2) -0H、Fmoc-Cys (R》-0H、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Gly-0H和Fmoc-Gly-OH进行偶联， 最后得到Fmoc"Gly"Gly"Gly-Cys (R》-Tyr (R2) -Phe"Gln (R3) -Asn (R4) -Cys (R5) -Pro-Lys -Gly-RinkAmide树脂。将得到线性去氨加压素-RinkAmide树脂用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收 縮三次，真空干燥得到47. 18g肽树脂，树脂增重收率97. 4% 。
实施例7、线性特利加压素-Sieber树脂的制备 在500ml的反应柱中加入实施例5中制备的51.05克Fmoc-Gly-Sieber树脂 (0. 594mmol/g)，加入DMF溶胀30分钟；溶胀完后，用20%六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc两 次，分别为10min禾口 15min，然后用DMF洗六次。将Fmoc-Lys (R6) _0H(9. 37g)，H0Bt(2. 71g)， PyBOP(lO. 42g)和DIPEA(2. 58g)用适量DMF溶解后加入至上述反应柱中，室温下氮气汩 泡120min。茚三酮检测反应完全，真空抽去反应液，用DMF洗三次，用20%六氢吡啶的DMF 溶液脱Fmoc 10min+15min，然后用DMF洗六次。重复偶联Fmoc-Lys (R6)-OH的操作，接下 来对Fmoc-Pro-0H、 Fmoc-Cys (R5) _0H、 Fmoc-Asn (R4) _0H、 Fmoc-Gln (R3) _0H、 Fmoc-Phe-0H、 Fmoc-Tyr (R2) -0H、Fmoc-Cys (R》-0H、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Gly-0H和Fmoc-Gly-OH进行偶联， 最后得到Fmoc"Gly"Gly"Gly-Cys (R》-Tyr (R2)-Phe"Gln(R3)-Asn(R4)-Cys (R5)-Pro-Lys ~Gly-RinkAmide树脂。将得到线性去氨加压素-RinkAmide树脂用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮 三次，真空干燥得到119. 50g肽树脂，树脂增重收率99. 8 % 。
实施例8、线性特利加压素-Sieber树脂的固相氧化环合 取实施例7中制备的线性特利加压素-Sieber树脂20g加入到500ml反应柱中，用 二氯甲烷溶胀30min。称取固体碘30. 69g，加入至200ml 二氯甲烷搅拌溶解，将配好的碘/ 二氯甲烷溶液加入到溶胀好的肽树脂中反应4小时。反应结束，用20X六氢吡啶的匿F 溶液分两次洗涤，时间分别为10min和15min，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三 次，真空干燥得到17. 23g环肽树脂，氧化反应收率97. 84% 。
实施例9、线性特利加压素-Sieber树脂的固相氧化环合 取实施例7中制备的制备的线性特利加压素-Sieber树脂20g加入到500ml反应 柱中，用二氯甲烷溶胀30min。称取固体碘30. 69g，加入至200ml甲醇搅拌溶解，将配好的 碘/甲醇溶液加入到溶胀好的肽树脂中反应4小时。反应结束，用20%六氢吡啶的DMF溶 液分两次洗涤，时间分别为10min和15min，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次，真空 干燥得到17. 12g环肽树脂，氧化反应收率97. 28%。
实施例10、线性特利加压素-Sieber树脂的固相氧化环合
取实施例7中制备的制备的线性特利加压素-Sieber树脂20g加入到500ml反应 柱中，用二氯甲烷溶胀30min。称取固体碘6. 37g，加入至100mlDMF搅拌溶解，将配好的碘/ DMF溶液加入到溶胀好的肽树脂中反应4小时。反应结束，用20X六氢吡啶的DMF溶 液分两次洗涤，时间分别为10min和15min，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三 次，真空干燥得到17. 35g环肽树脂，氧化反应收率98. 69%。 在现有技术中，O. 55 1. 55mmo1线性粗肽需要1升溶液进行液相氧化；而本发明 在进行固相氧化的合成规模的约5mmol，加上洗涤所用到的溶剂，平均氧化lmmol线性粗肽 需要的溶剂量不足100ml。 实施例11 、氧化特利加压素-Sieber树脂的裂解和粗品纯化 配制裂解液(三氟乙酸水=90 : 10)200ml，将配制好的裂解液加入至17. 35g 环肽树脂中，裂解反应1小时。反应结束，将裂解液过滤，滤液倒入至2000ml冰乙醇中， 沉淀、离心、干燥，沉重得粗品6.60g，粗肽重量收率110. 1%，合成收率65. 1% (粗肽纯度 93%，粗肽含量59. 18% )。 经过高效液相纯化得到醋酸特利加压素精肽3. 31g，总收率55. 2%。
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权利要求
一种固相氧化环合合成特利加压素的方法，包括以下步骤1)用Fmoc-Gly-OH和氨基树脂，得到Fmoc-Gly-氨基树脂；2)将Fmoc-Gly-氨基树脂逐一偶联得到线性特利加压素-氨基树脂；3)线性特利加压素-氨基树脂采用碘固相氧化环合合成特利加压素-氨基树脂；4)对特利加压素-氨基树脂进行裂解切割得到特利加压素的粗肽；5)粗肽经过纯化、转盐、冻干得到醋酸特利加压素。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤1)中所述的氨基树脂为RinkAmide树脂、RinkAmide-MBHA树脂、RinkAmide-BHA树脂、RinkAmide-AM树脂或Sieber树脂。
3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述由Fmoc-Gly-OH、氨基树脂出发得到Fmoc-Gly-氨基树脂和由Fmoc-Gly-氨基树脂采用Fmoc/tBu策略逐一偶联得到线性特利加压素_氨基树脂时使用的偶联剂体系为DIC和HOBt，或者偶联剂体系为PyB0P、 H0Bt和DIPEA。
4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述特利加压素肽序偶联过程中半光氨酸Cys侧链巯基采用Trt或者Acm保护。
5. 根据权利要求1至4任意一项所述方法，其特征在于所述线性特利加压素-氨基树脂采用固相氧化环合的试剂是碘和DMF溶液，或者碘和甲醇溶液，或者碘和二氯甲烷溶液。
6. 根据权利要求1至4任意一项所述方法，其特征在于步骤3)中线性特利加压素-氨基树脂采用碘固相氧化环合合成特利加压素_氨基树脂的方法如下，取线性特利加压素-氨基树脂加入到反应柱中，用二氯甲烷溶胀，称取固体碘加入至溶液搅拌溶解以形成碘和DMF溶液，或者碘和甲醇溶液，或者碘和二氯甲烷溶液，将配好的上述碘溶液加入到溶胀好的肽树脂中反应，反应结束，用20X六氢吡啶的DMF溶液分两次洗涤，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次，真空干燥得到特利加压素-氨基树脂。
7. 根据权利要求5所述方法，其特征在于步骤3)中线性特利加压素-氨基树脂采用碘固相氧化环合合成特利加压素_氨基树脂的方法如下，取线性特利加压素-氨基树脂加入到反应柱中，用二氯甲烷溶胀，称取固体碘加入至溶液搅拌溶解以形成碘和DMF溶液，或者碘和甲醇溶液，或者碘和二氯甲烷溶液，将配好的上述碘溶液加入到溶胀好的肽树脂中反应，反应结束，用20X六氢吡啶的DMF溶液分两次洗涤，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收縮三次，真空干燥得到特利加压素-氨基树脂。
8. 根据权利要求1至4任意一项所述方法，其特征在于步骤4)中所述对特利加压素-氨基树脂进行裂解切割的试剂体系是三氟乙酸水体积比为95 : 5。
9. 根据权利要求5所述方法，其特征在于步骤4)中所述对特利加压素-氨基树脂进行裂解切割的试剂体系是三氟乙酸水体积比为95 : 5。
10. 根据权利要求6所述方法，其特征在于步骤4)中所述对特利加压素-氨基树脂进行裂解切割的试剂体系是三氟乙酸水体积比为95 : 5。
全文摘要
本发明公开了一种固相氧化环合合成特利加压素的方法，包括以下步骤1)用Fmoc-Gly-OH和氨基树脂，得到Fmoc-Gly-氨基树脂；2)将Fmoc-Gly-氨基树脂逐一偶联得到线性特利加压素-氨基树脂；3)线性特利加压素-氨基树脂采用碘固相氧化环合合成特利加压素-氨基树脂；4)对特利加压素-氨基树脂进行裂解切割得到特利加压素的粗肽；5)粗肽经过纯化、转盐、冻干得到醋酸特利加压素。本发明重点创新之处在于固相氧化降低了因液相氧化带来的大量废液，同时加快了反应时间，属工艺绿色化改造，同时大大提高了总收率。
文档编号C07K1/00GK101693738SQ20091011035
公开日2010年4月14日 申请日期2009年10月29日 优先权日2009年10月29日
发明者刘建, 李红玲, 袁建成, 马亚平 申请人:深圳市翰宇药业有限公司;