专利名称：一种纯化艾塞那肽的方法
技术领域：
本发明属于HPLC技术领域，尤其是涉及一种规模化纯化艾塞那肽 (Exenatide)的方法。
背景技术：
糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，高血糖主要 由胰岛素分泌或作用的缺陷引起。糖尿病可分两种，胰岛素依赖型糖尿病(I
型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(n型糖尿病)，其中n型糖尿病患者占90%
以上。WHO统计结果显示，目前全球已经诊断的11型糖尿病达到1.3亿人，我 国己超过4000万人，是继印度之后的第二大糖尿病大国。
常用的II型糖尿病治疗药物包括双胍类、磺脲类、a-葡萄糖甘酶抑制剂、
噻唑烷二酮类及胰岛素等。但研究发现，这几类常用药物都有可能造成身体的
不良反应，特别是二甲双胍，有导致患者乳酸性酸中毒的危险性；而胰岛素治
疗也常导致低血糖的发生。因此，迫切需要研制出新的n型糖尿病治疗药物。
1995年，美国专利(US5424286)公开了一种从南美大毒蜥Gilka monster， Hdoderma Horridum)的唾液中分离出来的一种含有39个氨基酸的多肽， Exendin-4
(H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp國Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu陽Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro画Ser-Ser-Gly-Ala曙Pro-Pro-P ro-Ser-NH2)。其结构与人的胰高血糖素(Glucagon)有48%的同源性，与人的GLP-1(胰高血糖素样肽-l)有53%的同源性。
研究表明，作为GLP-1的类似物，Exendin-4能够与GLP-1受体作用，通过 刺激胰岛p细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放，减慢胃排空 速率，抑制食物摄入。其促胰岛素分泌作用是根据血糖水平进行的，故可降低 低血糖的发生率，且对其他促胰岛素分泌剂不敏感的II型糖尿病病人仍有降糖 作用，同时GLP-1还可以减轻II型糖尿病患者的体重，是一类全新的糖尿病治 疗药物。
2005年4月，美国礼来公司和Amylin公司共同开发的糖尿病药物倍它 (Byetta，化学名Exenatide (人工合成的Exendin-4))获美国FDA批准上市。 与此同时，国外许多制药公司如诺和诺德制药公司、默克制药公司也在争相研 发与倍它属于同类型的药物。另外，国内外也少有对Exendin-4进行固相直接合 成的相关文献，但还没有文献具体研究Exenatide相关纯化的方法，特别是规模 化纯化Exenatide的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一条适于产业化纯艾塞那肽的工艺方法，使用反相 高效液相色谱法纯化纯艾塞那肽，并用阴离子交换转盐，纯度高且收率好，达 到产业化要求，解决现有技术存在的缺陷。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案
一种纯化艾塞那肽的方法，包括以下步骤
1 )将固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相为四烷基硅垸键合硅胶、 八烷基硅垸键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽 溶液；
3)将纯化后的高纯度肽采用阴离子交换转成醋酸盐。 优选的方案是所述的步骤1)和步骤3)之间还包括步骤2)将收集目的 峰值的肽溶液减压旋蒸浓縮。
更为优选的方案是所述A相的磷酸盐缓冲溶液？11为3.0至5.3之间。 更为优选的方案是所述A相的磷酸盐缓冲溶液pH为3.5至4.3之间。 更为优选的方案是所述色谱纯乙腈的浓度为10-65%，检测波长为230 nm。 更为优选的方案是所述色谱纯乙腈的浓度为15-55%。 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果
本发明提出的一条适于产业化纯艾塞那肽的工艺方法，使用反相高效液相色 谱法纯化纯艾塞那肽，并用阴离子交换转盐，不仅能得到HPLC纯度大于98.0^ 的精肽，而且能够规模化生产，达到纯度高、收率高、产业化的要求。
具体实施方式
实施例l
1、 样品处理将合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为 50mg/mL，用孔径为0.45jim滤膜过滤后收集滤液备用。
2、 纯化
纯化条件色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和 长度为5 cm x25 cm 。流动相A相磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸 溶液调pH至3.5-4.3 ; B相:色谱纯乙腈。流速50-70 ml/min。检测波长 230 nm。梯度B%: 20% 48% 66-78 min。进样量为1.3-2 g 。
纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为26-40ml
5样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于不超过35"C下 减压旋蒸浓縮至约50-100 g/ml后备用。
3、转盐取55 g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯 漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样10-20 g，减压抽滤并收集滤液， 滤液于不超过35 'C下减压旋蒸浓缩至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻 干燥后即可'得到纯度大于98%的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达48%以上。
实施例2
1、 样品处理将合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为 50mg/mL，用孔径为0.45pm滤膜过滤后收集滤液备用。
2、 纯化
纯化条件色谱柱以四烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和
长度为5 cm x25 cm 。流动相A相磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸 溶液调pH至3.0-4.8 ; B相色谱纯乙腈。流速50-70 ml/min。检测波长 230 nm。梯度B%: 10% 35% 50-75 min。进样量为l.1-1.8 g 。
纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为26-40ml 样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于不超过35"C下 减压旋蒸浓縮至约50-100 g/ml后备用。
3、 转盐取50 g阴离子交换树脂Wofatit AD-41置于合适大小的砂芯漏斗 中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样10-20 g，减压抽滤并收集滤液，滤液 于不超过35 "C下减压旋蒸浓縮至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥 后即可得到纯度大于98%的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达45%以上。
实施例3
1、 样品处理将合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为
50mg/mL，用孔径为0.45pm滤膜过滤后收集滤液备用。
2、 纯化
纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径 和长度为5 cm x25 cm 。流动相A相磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷
6酸溶液调pH至3.8-5.3 ; B相色谱纯乙腈。流速50-70 ml/min。检测波长 230 nm。梯度B%: 15% 55% 60-78 min。进样量为1.5-2.0 g 。
纯化过程将色谱柱用50°/。以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为30-35ml 样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于不超过35"C下 减压旋蒸浓縮至约50-100 g/ml后备用。
3、转盐取55 g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯 漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样10-20 g，减压抽滤并收集滤液， 滤液于不超过35 'C下减压旋蒸浓缩至约5-8 g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻 干燥后即可得到纯度大于98%的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达52%以上。
实施例4
1、 样品处理相合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为
50mg/mL，用孔径为0.45pm滤膜过滤后收集滤液备用。
2、 纯化
纯化条件色谱柱以十八烷基硅垸键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直 径和长度为15 cm x25 cm 。流动相A相磷酸二氢钠水溶液用分析纯的 磷酸溶液调pH至3.8-5.3; B相色谱纯乙腈。流速450-550 ml/min。检测波 长- 230nm。梯度B%: 15% 65°/。
70-88 min。进样量为8-15g 。
纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为 160ml-300ml样品溶液。线性梯度洗脱70-88 min，收集目的峰，将收集的目的 肽溶液于不超过37 "C下减压旋蒸浓縮至约80-200 g/ml后备用。
3、 转盐取105g阴离子交换树脂置WofatitAD-41于合适大小的砂芯漏斗 中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样30-40 g，减压抽滤并收集滤液，滤液 于不超过35 "下减压旋蒸浓縮至约5-8 g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥 后即可得到纯度大于98%的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达55%以上。
实施例5
1、样品处理相合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为
50mg/mL,用孔径为0.45pm滤膜过滤后收集滤液备用。
72、 纯化
纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直
径和长度为30cmx25cm 。流动相A相磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷 酸溶液调pH至3.8-5.3; B相色谱纯乙腈。流速1900-2200 ml/min。检测波 长230 nm。梯度B%: 15°/。 65% 85-100 min。进样量为45-65 g 。
纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为
900ml-1300ml样品溶液。线性梯度洗脱60-80 min，收集目的峰，将收集的目的 肽溶液于不超过35"C下减压旋蒸浓縮至约60-180 g/ml后备用。
3、 转盐取210g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯 漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样50-60 g，减压抽滤并收集滤液， 滤液于不超过35 。C下减压旋蒸浓縮至约5-8 g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻 干燥后即可得到纯度大于98%的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达57%以上。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不 能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替 换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1、一种纯化艾塞那肽的方法，包括如下步骤1)将固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相为四烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；3)将纯化后的高纯度肽采用阴离子交换转成醋酸盐。
2、 如权利要求1所述的纯化艾塞那肽的方法，其特征是所述的步骤l) 和步骤3)之间还包括步骤2)将收集目的峰值的肽溶液减压旋蒸浓缩。
3、 如权利要求1或者2所述纯化艾塞那肽的方法，其特征在于所述A相 的磷酸盐缓冲溶液pH为3.0 5.3。
4、 如权利要求3所述纯化艾塞那肽的方法，其特征在于所述A相的磷酸 盐缓冲溶液pH为3.5 4.3。
5、 如权利1或者2所述纯化艾塞那肽的方法，其特征在于所述色谱纯乙 腈的浓度为10-65%，检测波长为230nm。
6、 如权利5所述纯化艾塞那肽的方法，其特征在于所述色谱纯乙腈的浓 度为15-55%。
7、 如权利要求1或者2所述的纯化艾塞那肽的方法，其特征在于所述的 反相硅胶柱为四烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合 硅胶。
8、 根据权利要求1或者2所述方法，其特征在于所述的阴离子交换法为通过采用能够提供醋酸根的阴离子交换树脂进行离子交换实现，所述的阴离子 交换树脂是Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41 。
全文摘要
本发明公开了一种纯化艾塞那肽的方法，包括如下步骤1)将固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相为四烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；3)将纯化后的高纯度肽采用阴离子交换转成醋酸盐。本发明提出的一条适于产业化纯艾塞那肽的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化纯艾塞那肽，并用阴离子交换转盐，不仅能得到用PLC纯度大于98.0％的精肽，而且能够规模化生产，达到纯度高、收率高、产业化的要求。
文档编号C07K14/435GK101538323SQ20091010498
公开日2009年9月23日 申请日期2009年1月13日 优先权日2009年1月13日
发明者旭 康, 李红玲, 袁建成, 覃亮政, 马亚平 申请人:深圳市翰宇药业有限公司