一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法

专利名称：一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法
技术领域：
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹 泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法。
背景技术：
猪传染性胃肠炎，猪流行性腹泻是目前证实的引起猪发生腹泻的重要的两个病毒 性传染性病。这两种疾病主要对仔猪的影响较大，是引起仔猪死亡的主要病毒性腹泻病。这 两种病常常混合感染，在流行病学、临床症状、病理解剖学变化上都非常相似，很难区别到 底是哪一种病毒感染，而且发病急速，在发病后近几个小时就可波及全群，主要是造成哺乳 期仔猪的大批死亡，给养猪生产造成巨大的损失。猪传染性胃肠炎(PorcineTransmissible Gastroenteritis, TGE)是由冠状 病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)引起的以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的传染 病，对新生仔猪具有高度致死率，通常为100%。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5 周龄以上的猪感染后，死亡率很低。1945年Doyle在美国首次报道了这一疾病以后，世界上 许多国家都相继报道了猪传染性胃肠炎。我国从1956年在广东省首次发生这种疾病后，全 国大多数省份也有猪传染性胃肠炎的发生，给养猪业带来了严重危害。猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhae, PED)是冠状病毒科 (Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhae virus，PEDV)引起的一种猪肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。各种年龄 的猪均易感，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100%，尤其哺乳仔猪受害最为严重。 猪流行性腹泻主要发生在冬季和早春天气较为寒冷的季节，但在夏季也可发生。上世纪70 年代初期许多国家相继报道了猪流行性腹泻的发生，我国上世纪80年代开始陆续有发生 猪流行性腹泻的报道。目前主要用疫苗免疫母猪来预防这两种疾病的发生。由于还没有针对病毒性疾病 的特效药物，因此在临床治疗上主要采取对症治疗和用抗生素类药物预防并发症的发生， 其治疗效果不理想。此外，由于这两种疾病发病急速，出现腹泻后，仔猪大多由于腹泻而脱 水，很快就会衰竭而死亡。因此，在生产中急需一种既具有特异性，疗效又确实，治疗效果迅 速显现的治疗制剂。

发明内容
本发明的目的是提供一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备 方法。本发明的免疫原采用细胞培养物加油佐剂乳化制备而成，其中猪传染性胃肠炎病 毒用猪肾细胞(PK15)传代细胞培养；猪流行性腹泻病毒用非洲绿猴肾细胞(Vero)传代细胞进行培养；这两种病毒的病毒含量都彡106_°TCID5(l/ml，将这两种病毒以体积比(1 3) (1 3)的比例混合后与油佐剂以1 2体积比乳化后作为免疫原，免疫非免疫产蛋 鸡，收集蛋黄进行蛋黄抗体效价检测，选择高效价的蛋黄提纯蛋黄抗体。该抗体经口服后直 接作用于仔猪肠道，以治疗和预防传染性胃肠炎病毒(TGEV)和流行性腹泻病毒(PEDV)感
^fe ο为达到上述目的，本发明采用下列技术步骤 一、TGEV抗原的制备将传染性胃肠炎病毒液接种在PK15单层细胞上，同时设立细胞对照，37°C CO2培 养箱中培养，24h后倒掉维持液进行换液，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明 显，则收获细胞悬液冻融后离心分离，取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第二代出现细 胞病变，至75%细胞出现细胞病变时收毒，冻融，离心分离，除去细胞碎片，收集上层清液， 浓缩后用作抗原。二、PEDV抗原的制备将流行性腹泻病毒液接种于Vero细胞单层上，同时设立细胞对照，37°C CO2培养 箱中培养，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则收获细胞悬液冻融后于离 心分离，取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第三代出现细胞病变，至75%细胞出现细胞 病变时，收获细胞悬液，冻融后于离心分离，收集上清液，浓缩后用作抗原。三、蛋黄抗体的制备1.动物免疫(1)免疫准备将TGEV和PEDV抗原以1 1的比例混合，按总量的0. 1 %加入饱 和甲醛水溶液(即市售40%甲醛水溶液)于37°C灭活24h后，作为首免用免疫原；取适量 的TGEV和PEDV抗原以1 1的比例混合，按总量的0. 加入甲醛溶液(40%水溶液)于 37°C灭活24h后，与2倍量的油佐剂乳化后，作为二免、三免和四免用免疫原。(2)免疫用上述制备的免疫原对非免疫产蛋鸡进行免疫，另设不免疫的空白对 照组。免疫程序为首免时对鸡胸肌多点注射，同时滴鼻、点眼共Iml ；2周后进行二免， 与初免时免疫剂量和途径相同；再隔2周后进行三免(免疫量为2ml，途径相同)，再隔4 8周后进行第四次免疫(免疫量为2ml，途径相同)。2.蛋黄液制备二免后1周开始每隔3天抽样用琼脂扩散方法测定高免鸡蛋蛋黄中抗TGEV、PEDV 特异抗体效价。若抗体效价达到1 8以上即可集蛋，蛋黄液用于制备TGEV、PEDV 二联蛋 黄抗体。3.抗体效价检测得到的TGEV、PEDV 二联蛋黄抗体通过琼脂扩散试验中的抗原抗体反应进行证明。 琼脂扩散试验中的抗原为浓缩的病毒，因为产蛋鸡免疫用的免疫原来自细胞感染物，其中 不纯成分可能为细胞碎片，而检测抗原中没有细胞成分，若该检测抗原与蛋黄抗体发生反 应，可证明蛋黄抗体中含有针对抗原即TGEV和PEDV的抗体。制备琼脂凝胶将步骤2收集的蛋黄液用0. 01mol/L的PBS (pH7. 4)倍比稀释后加 入琼脂凝胶周围孔中，中间孔中加入步骤一、二中经离心浓缩纯化的TGEV、PEDV抗原，置湿盒中37°C温箱反应24h，以出现沉淀带的最高稀释度蛋黄液为该蛋黄液的抗体效价。检测结果二免后1周采集蛋黄液检测TGEV和PEDV抗体效价都能达到1 8，再收集蛋黄一个月检测抗体效价都达到高峰1 64。4.蛋黄抗体的提纯蛋黄抗体的提纯采用酸化蒸馏水法提纯和辛酸法提纯相结合的方法。收集经抽样 检测合格的高免鸡蛋，将蛋壳消毒，采用手工或机械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系 带，收集蛋黄。充分搅拌使蛋黄呈均勻膏状，加入等体积经121°C 30min灭菌并冷却的蒸馏 水，搅拌混勻，62. 5°C加热灭活30min。然后先在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积 的PH值为4. 2的灭菌蒸馏水，并降温至1 4°C。然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌， 4 8°C静置4h。管式低温连续离心机14000rpm离心分离上清液并转入另一反应罐中。按 总量的0. 2%加入辛酸，搅拌均勻，室温放置2 4h。用滤布过滤后，再用K型多层板框过 滤至澄清，按总量的0. 加入甲醛溶液(40%水溶液)于上述滤液中，充分搅拌混勻，室温 放置24h，期间振摇数次。最后用0.22 μ m微孔滤芯过滤除菌，用截留分子量为IOOOKDa的 超滤膜过滤除病毒。得到提纯的蛋黄抗体，即TGEV、PEDV 二联蛋黄抗体。5.将提纯的蛋黄抗体液冻干，贮存于4°C。四、TGEV、PEDV 二联蛋黄抗体治疗试验实验动物为1日龄未吃初乳的仔猪，试验组动物用TGEV和PEDV病毒口服攻毒，然 后口服饲喂本发明的蛋黄抗体。另设攻毒未用抗体组、不攻毒未用抗体组、不攻毒用抗体组 3组作为对照。根据各组临床症状及死亡率来判断TGEV和PEDV 二联蛋黄抗体的治疗效果。试验结果表明本发明提供的TGEV和PEDV 二联蛋黄抗体对TGEV和PEDV引起的 仔猪腹泻具有明显的治疗作用，未出现任何毒副作用。猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒同属冠状病毒科，二者致病的临床症状 又极其相似，且一般呈混合感染，各个年龄的猪均可感染，最明显的特征就是水泻，发病率 较高，仔猪死亡率较高。其作用机理一般都是吸附于小肠粘膜上，感染上皮细胞而使小肠吸 收和代谢紊乱，造成腹泻的发生。因此，提高猪小肠局部免疫能力，抑制病原对小肠粘膜的 吸附和增值是治疗和预防传染性胃肠炎和流行性腹泻的关键。本TGEV-PEDV 二联蛋黄抗体 通过口服直接被小肠吸收，提高了小肠的局部免疫力，抑制了病原对小肠粘膜的吸附和增 殖。本发明方法制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，采用两种免 疫原制备预防和治疗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻这两种疾病，具有特异性高，针对性强 的特点，对治疗和预防猪传染性胃肠炎、流行性腹泻有重要意义。
具体实施例方式为了举例说明，以非限制性的方式提供下面的实施例。实施例1猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)增殖及抗原制备1. TGEV病毒增殖及抗原的制备将传染性胃肠炎病毒液接种3瓶PK15细胞(瓶底面积25cm2)，每瓶细胞接种 Iml病毒液，盖好瓶盖，横卧瓶管轻轻转动，使病毒液与整个细胞单层充分接触，37°C吸附40min，其间每隔IOmin晃动1次，无需吸弃病毒液，直接加含2%胎牛血清的DMEM细胞维持 培养液5ml，同时设立细胞对照，37°C CO2培养箱中培养。24h后倒掉维持液进行换液。逐 日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变(CPE)不明显，则收获细胞悬液-20°C 20°C反复 冻融3次后在4°C条件下3000rpm离心30min取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第二代 出现细胞病变，至75%细胞出现细胞病变时收毒，-20°C 20°C反复冻融3次，然后在4°C 条件下，3000rpm离心30min，除去细胞碎片，收集上层清液，浓缩后用作抗原。2. PEDV病毒增殖及抗原的制备将流行性腹泻病毒液接种于Vero细胞单层上，同时设立细胞对照，37°C CO2培养 箱中培养。逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则收获细胞悬液-20°C 20°C反复冻融3次后于4°C条件下3000rpm离心30min，取上层清液继续在细胞上盲传，盲 传至第三代出现细胞病变，至75%细胞出现细胞病变时，表现为细胞融合和圆缩，部分细胞 脱落，出现空斑化。此时收获细胞悬液，_20°C 20°C反复冻融3次后在4°C条件下，3000rpm 离心30min，除去细胞碎片，收集上清液，浓缩后用作抗原。实施例2 TGEV-PEDV 二联蛋黄抗体的制备1.免疫原制备取收获的TGEV抗原和PEDV抗原以1 1的比例混合后，按总量的0. 1 %加入甲 醛溶液(40%水溶液)，37°C灭活24h，作为首免用免疫原。将上述灭活的抗原96份加4份 吐温-80混合后作为水相(用前现配)；油相制备94份白油+6份司盘-80，再按0.015g/ ml的量加入硬脂酸铝，水浴加热混合后，121°C高压灭菌30min，备用；乳化先加入油相， 3000rpm预搅拌5min，然后慢慢加入水相，边加边摇晃，搅拌30s后，将转速调至12000rpm， 搅拌5min即可，放4°C备用。取乳化后的灭活苗IOml于15ml离心管中，3000rpm离心15min， 下层分层液体量小于0.5ml即表明乳化成功。乳化成功后的免疫原作为二免、三免和四免 用免疫原。2.免疫首免时对鸡胸肌、腿肌多点注射，同时滴鼻、点眼共Iml ；2周后进行二免，用乳化 后的油苗，与初免时免疫剂量和途径相同；再隔2周进行三免(免疫量为2ml，途径相同)， 再隔6周后进行第四次免疫(免疫量为2ml，途径相同)。3.蛋黄液的制备3. 1.蛋黄的收获及灭活二免后1周开始收集经抽检合格的免疫鸡所产高免鸡蛋，将蛋壳消毒，采取手工 或机械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。充分搅拌使蛋黄呈均勻膏状，力口 入等体积经121°C 30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混勻，62. 5°C加热灭活30min。3. 2.抗体的酸化蒸馏水法提纯先在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH值为4. 2的灭菌蒸馏水，并降 温至1 4°C。然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4 8°C静置4h。管式低温连续离 心机HOOOrpm离心分离上清液并转入另一反应罐中。3. 3.抗体的辛酸法提纯按总量的0. 2%加入辛酸，搅拌均勻，室温放置4h。用滤布过滤后，再用K型多层 板框过滤至澄清，再按总量的0. 加入甲醛溶液(40%水溶液)于上述滤液中，充分搅拌混勻，室温放置24h，期间振摇数次。3.4.过滤除菌
用0. 22 μ m微孔滤芯过滤除菌。用截留分子量为IOOOKDa的超滤膜过滤除病毒。4.抗体效价检测(琼脂扩散法)4. 1.实验准备TGEV和PEDV标准阳性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 提供；抗原，由实施例1制备；琼脂糖、打孔器、16#针头、剪刀、镊子、酒精灯、记号笔、洁净平 皿、水浴锅。4. 2. TGEV琼扩抗原的制备用聚乙二醇(PEG-20000)干粉包埋透析袋进行抗原浓 缩。透析袋的处理方法4. 2. 1. 0. 5mol/LEDTA-2Nalml 加 IOg 碳酸氢钠，补蒸馏水至 500ml，调 pH 至 8. 0。4. 2. 2.透析袋放上述液体中煮沸lOmin。4. 2. 3.取出透析袋蒸馏水清洗干净，再放蒸馏水中煮沸lOmin。4.2.3.冷却后可用。(如果暂时不用，可放苯钾酸钠或叠氮化钠中保存)4.2.4.用过的透析袋同法处理，放50%甘油水溶液或50%乙醇水溶液中保存，下 次用前蒸馏水洗净即可。4. 2. 5.注意取透析袋一定要戴手套。将40ml病毒液倒入处理后的透析袋中，扎紧袋口，放在干净铝盒中，用聚乙二醇 (PEG-20000)干粉包埋透析袋，放4°C透析。观察透析袋中液体剩余3_4ml时取出，吸出浓 缩的抗原即为制备的琼扩抗原。用同样的方法制备PEDV琼扩抗原。4. 3. 1 %琼脂糖平板的准备取0. Olmol/L 的 PBS (pH7. 0)液 100ml，加琼脂糖 lg, Nacl 8. 0g，煮沸融化后滤去 沉淀，加0. 01%的硫柳汞防腐，冷却到50°C左右倒置琼脂板。在直径90mm的平皿中注加融 化的琼脂糖16ml。琼脂糖厚度不少于2. 8mm，4°C冷却后打孔。4. 4.操作步骤4. 4. 1.取琼脂糖平板用六角形七孔模具打孔，孔径5mm，孔距为3mm。琼脂用打孔 器打孔后，在酒精灯外焰上过一下，对孔的底部进行封口，以防蛋黄液渗漏。4. 4. 2.抗原标定中间孔加TGEV (或PEDV)标准阳性血清，周围孔从最上方孔开始依次加入抗原原 液、2倍稀释的抗原、4倍稀释的抗原、8倍稀释的抗原、16倍稀释的抗原、32倍稀释的抗原。 每孔加液40 μ 1，加样完毕后，将琼脂糖板放在铺有湿纱布的带盖容器中，并用支持物将琼 脂糖平板放稳，置37°C温箱湿盒内反应24 72h，直至沉淀线产生。以出现沉淀线最明显 的稀释度的抗原作为标准抗原。4. 4. 3.抗体效价的测定将收获的待测定抗体效价的卵黄用0. 01mol/L的PBS(pH7. 0)作倍比稀释，稀释度 分别为1X、4X、8X、16X、32X、64X及更高的稀释倍数。中间孔中加入标定的TGEV(或 PEDV)抗原，周围孔中加入不同稀释度的抗体，其中1孔加入标准阳性血清，每孔加液 40 μ 1，加样完毕后，将琼脂糖板放在铺有湿纱布的带盖容器中，并用支持物将琼脂糖平板 放稳，置37°C温箱湿盒内反应24 72h，直至沉淀线产生。以观察到沉淀线的抗体最大稀 释倍数为检测样品的抗体效价。
4. 5.结果判定 阳性血清与对应抗原孔中间形成一条清晰、致密的沉淀线时，才能进行判定。阳性被检蛋黄液与抗原孔中间形成沉淀线，并与阳性血清沉淀线弯曲环连，判为 阳性⑴。可疑沉淀线不清晰或阳性对照沉淀线向被检血清孔微弯时，判为可疑(士)。可 疑样品应予重检，重检结果相同时应判为阳性(+)。阴性无沉淀线出现为阴性。沉淀线与阳性对照沉淀线交叉或不相连时，均属非特 异性反应。判为阴性(_)。5.提纯的蛋黄抗体冻干将提纯并经检验合格的蛋黄抗体液小量分装于西林瓶，于冻干机上冻干过夜，冻 干过程中温度最低降至_38°C，维持3 4h至完全冻干，然后逐渐恢复至室温，取出贮存于 4°C。实施例3 TGEV-PEDV 二联蛋黄抗体治疗试验取1日龄未吃初乳无TGEV和PEDV发病史的仔猪16头，试验动物房温度控制在 25 30°C，采用人工哺乳方法，每隔2h饲喂1次牛奶，饲喂观察1天后随机分为4个小组， 分别为攻毒治疗组(4头)、攻毒不治疗组(4头)、治疗不攻毒组(4头)和不治疗不攻毒 组(4头)。攻毒所用病毒为超滤的TGEV和PEDV经0. 01mol/L的PBS (pH7. 4) 10倍稀释后 直接口服，攻毒剂量为最小发病量的5倍，每头仔猪攻毒剂量相同，观察仔猪攻毒后的腹泻 情况。待仔猪刚开始出现腹泻症状时治疗组饲喂TGEV-PEDV 二联蛋黄抗体，治疗所用蛋黄 抗体为提纯级样品，琼脂扩散试验测定蛋黄抗体效价为1 64。不抬疗组饲喂等量生理盐 水，逐日观察每头仔猪腹泻症状和TGEV-PEDV 二联蛋黄抗体治疗效果，以粪便指数和死亡 率2个指标判断TGEV-PEDV 二联蛋黄抗体的治疗效果。粪便指数按照Sherman等(Sherman D Μ, Acres S D, Sadowski P L, et al. Protection of calvesagainst fatal enteric colibacillosis by orally administered Escherichiacoli K99_specipic monoclonal antibody [J], Infectlmmun, 1974，10 :770_782.)制定的标准判定，即0分为正常；2分为中 度腹泻，粪便呈黄色水样；3分为重度腹泻，粪便呈水样喷射。攻毒后12 24h所有仔猪均出现不同程度的黄色水泻，攻毒治疗组在口服 TGEV-PEDV 二联蛋黄抗体1天后腹泻症状减轻，2天后变为黄色稀粪，3天后粪便变粘稠， 4 5天后变为成形的软粪；不攻毒治疗组与不攻毒不治疗组仔猪精神状态正常，无腹泻症 状；攻毒不治疗组仔猪腹泻呈水样喷射，2 3天后因极度脱水死亡。结果见表1。表1仔猪攻毒治疗后不同天数死亡情况及粪便指数 注分母为存活仔猪数，分子为腹泻仔猪数；括号内为平均粪便指数试验结果表明两不攻毒组仔猪生长正常，未出现腹泻症状，饲喂TGEV-PEDV 二联 蛋黄抗体与否对其生长没有影响；而两攻毒组仔猪均出现严重的腹泻症状，表现为黄色水泻，仔猪迅速消瘦，不用蛋黄抗体治疗组仔猪3天全部死亡，而蛋黄抗体治疗组仔猪腹泻症 状则明显减轻，粪便由水泻变为软粪，并逐渐成形，一周左右逐渐恢复，未出现死亡情况。结论通过本发明所制的TGEV-PEDV 二联蛋黄抗体进行治疗试验，结果显示能有效的的 降低仔猪死亡率和腹泻症状，并逐步好转，直至康复，具有完全的保护作用，对于防治猪腹 泻具有明显的效果。上列详细说明系针对本发明之一可行实施例之具体说明，惟该实施例并非用以限 制本发明之专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为之等效实施或变更，均应包含于本案 之专利范围中。
权利要求
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法，猪传染性胃肠炎病毒用猪肾细胞传代细胞培养，猪流行性腹泻病毒用非洲绿猴肾细胞传代细胞进行培养，将这两种病毒以体积比(1～3)∶(1～3)的比例混合后与油佐剂以1∶2体积比乳化后作为免疫原，免疫非免疫产蛋鸡，从其蛋黄中提取猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒蛋黄抗体。
2.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方 法，其特征在于包括以下步骤(1)TGEV抗原的制备将传染性胃肠炎病毒液接种在PK15单层细胞上，同时设立细胞对照，37°C CO2培养箱 中培养，24h后倒掉维持液进行换液，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则 收获细胞悬液冻融后离心分离，取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第二代出现细胞病 变，至75%细胞出现细胞病变时收毒，冻融，离心分离，除去细胞碎片，收集上层清液，浓缩 后用作抗原；(2)PEDV抗原的制备将流行性腹泻病毒液接种于Vero细胞单层上，同时设立细胞对照，37°C CO2培养箱 中培养，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则收获细胞悬液冻融后离心分 离，取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第三代出现细胞病变，至75%细胞出现细胞病变 时，收获细胞悬液，冻融后离心分离，收集上清液，浓缩后用作抗原；(3)蛋黄抗体的制备将TGEV和PEDV抗原以1 1的比例混合，灭活24h后，作为首免用免疫原；取适量的 TGEV和PEDV抗原以1 1的比例混合，灭活24h后，与2倍量的油佐剂乳化，作为二免、三 免和四免用免疫原；用上述制备的免疫原对非免疫产蛋鸡进行免疫，另设不免疫的空白对 照组；二免后1周开始每隔3天抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗TGEV、PEDV特异抗体效价；若抗 体效价达到1 8以上即可集蛋，收集蛋黄；充分搅拌使蛋黄呈均勻膏状，加入等体积经灭 菌并冷却的蒸馏水，搅拌混勻，灭活；然后先在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的 pH值为4. 2的灭菌蒸馏水，并降温至1 4°C，然后将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4 8°C静置4h;离心分离上清液并转入另一反应罐中，按总量的0.2%加入辛酸，搅拌均勻，室 温放置2 4h ；用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，按总量的0. 加入饱和甲 醛水溶液于上述滤液中，充分搅拌混勻，室温放置24h，期间振摇数次，过滤除菌，用截留分 子量为IOOOKDa的超滤膜过滤除病毒，得到提纯的蛋黄抗体，即TGEV、PEDV 二联蛋黄抗体；(4)将提纯的蛋黄抗体液冻干贮存
3.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方 法，其特征在于所用猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的病毒含量都> IO6 0TCID50/ ml ο
4.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方 法，其特征在于TGEV抗原的制备程序是将传染性胃肠炎病毒液接种3瓶PK15细胞，瓶底 面积25cm2，每瓶细胞接种Iml病毒液，盖好瓶盖，横卧瓶管轻轻转动，使病毒液与整个细胞 单层充分接触，37°C吸附40min，其间每隔IOmin晃动1次，无需吸弃病毒液，直接加含2% 胎牛血清的DMEM细胞维持培养液5ml，同时设立细胞对照，37°C CO2培养箱中培养；24h后倒掉维持液进行换液，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变(CPE)不明显，则收获细 胞悬液-20°C 20°C反复冻融3次后在4°C条件下3000rpm离心30min取上层清液继续在 细胞上盲传，盲传至第二代出现细胞病变，至75%细胞出现细胞病变时收毒，-20°C 20°C 反复冻融3次，然后在4°C条件下，3000rpm离心30min，除去细胞碎片，收集上层清液，浓缩 后用作抗原。
5.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方 法，其特征在于PEDV抗原的制备程序是将流行性腹泻病毒液接种于Vero细胞单层上，同 时设立细胞对照，37°C CO2培养箱中培养；逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明 显，则收获细胞悬液-20°C 20°C反复冻融3次后于4°C条件下3000rpm离心30min，取上层 清液继续在细胞上盲传，盲传至第三代出现细胞病变，至75%细胞出现细胞病变时，表现为 细胞融合和圆缩，部分细胞脱落，出现空斑化；此时收获细胞悬液，-20°C 20°C反复冻融3 次后在4°C条件下，3000rpm离心30min，除去细胞碎片，收集上清液，浓缩后用作抗原。
6.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方 法，其特征在于免疫原的制备程序是取收获的TGEV抗原和PEDV抗原以1 1的比例混合 后，按总量的0. 加入饱和甲醛水溶液，37°C灭活24h，作为首免用免疫原；将上述灭活的 抗原96份加4份吐温-80混合后作为水相，现配现用；油相制备94份白油+6份司盘-80， 再按0. 015g/ml的量加入硬脂酸铝，水浴加热混合后，121°C高压灭菌30min，备用；乳化先 加入油相，3000rpm预搅拌5min，然后慢慢加入水相，边加边摇晃，搅拌30s后，将转速调至 12000rpm，搅拌5min即可，放4°C备用；取乳化后的灭活苗IOml于15ml离心管中，3000rpm 离心15min，下层分层液体量小于0. 5ml即表明乳化成功；乳化成功后的免疫原作为二免、 三免和四免用免疫原。
7.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方 法，其特征在于免疫非免疫鸡时所用免疫程序为首免时胸肌多点注射免疫原，同时滴鼻、 点眼共Iml ；2周后进行二免，注射免疫原Iml ；再隔2周后进行三免，免疫原2ml ；再隔4 8周后进行四免，免疫原2ml。
8.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方 法，其特征在于蛋黄液的制备是二免后1周开始收集经抽检合格的免疫鸡所产高免鸡蛋， 将蛋壳消毒，采取手工或机械打蛋，充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄，充分搅拌 使蛋黄呈均勻膏状，加入等体积经121°C 30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混勻，62. 5°C加 热灭活30min。
9.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方 法，其特征在于二联抗体提纯方法是先在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH 值为4. 2的灭菌蒸馏水，并降温至1 4°C ；然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4 8°C静置4h ；管式低温连续离心机HOOOrpm离心分离上清液并转入另一反应罐中；按总量 的0.2%加入辛酸，搅拌均勻，室温放置4h。用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清， 再按总量的0. 1 %加入饱和甲醛水溶液于上述滤液中，充分搅拌混勻，室温放置24h，期间 振摇数次；用0. 22 μ m微孔滤芯过滤除菌；用截留分子量为IOOOKDa的超滤膜过滤除病毒。
10.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备 方法，其特征在于提纯的二联蛋黄抗体冻干贮存程序是将提纯并经检验合格的蛋黄抗体液小量分装于西林瓶，于冻干机上冻干过夜，冻干过程中温度最低降至_38°C，维持3 4h 至完全冻干，然后逐渐恢复至室温,,取出贮存于4°C。
全文摘要
本发明公开了一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法。将猪传染性胃肠炎病毒在猪肾细胞(PK15)上增殖，将猪流行性腹泻病毒在非洲绿猴肾细胞(Vero)上增殖，取这两种细胞培养物作为抗原，与油佐剂乳化后制备免疫原，即将这两种病毒按照(1～3)∶(1～3)的比例混合制备免疫原，免疫非免疫产蛋鸡，在收集蛋黄并提纯的基础上获取了可用于预防和治疗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的二联蛋黄抗体。使用本发明的蛋黄抗体治疗试验攻毒猪，试验临床症状比对照组明显减轻，且试验组的死亡率显著低于对照组。将本发明提供的蛋黄抗体在猪传染性胃肠炎、流行性腹泻高发病率的猪场实地应用，产生了明显的预防和治疗作用。
文档编号C07K16/10GK101845095SQ201010166530
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者乔荣岑, 习向锋, 孙进忠, 张海洋, 张许科, 李三, 郭丽霞, 陶家权 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司